中文摘要 中文摘要 乳鏈菌肽 n i s i n 是一種天然食品防腐劑 能夠抑制許多革蘭氏陽性致病菌 的生長 是唯一一種允許商業化生產的天然食品防腐劑 目前 我國只有少數企 業生產n i s i i l 且產量與純度都遠低于國外同類產品 本論文旨在通過優化發酵條 件和代謝調控的手段提高n i s i n 的產量 并通過分析了解n i s i i l 代謝過程的調控機 制 本研究通過從五種乳酸菌發酵培養基中選出c m 培養基作為初始發酵培養進 行優化 在此基礎上摸索出了n i s i i l 發酵生產的最適初始p h 值為7 0 最適種量為 3 最佳接種種齡為1 2 h 隨后 本研究從營養調控 氨基酸代謝調控和乳酸的反饋調控三種手段對 n i s i l l 的代謝進行了調控 營養調控通過單因素的摸索 決定在c m 培養基的基礎上添加玉米漿作為補 充氮源 磷酸二氫鉀作為磷源進行發酵 然后利用p l a c k e n b u 冊鋤試驗確定影響 n i s i i l 效價的三個主要因素為蔗糖 酵母膏和磷酸二氫鉀的濃度 并使用 b o x b e h n k e n 試驗分析方法確定了三個主要因素最佳發酵濃度分別為3 9 9 l l8 5 9 l 和2 0 5 9 l 優化后的培養基發酵生產n i s i n 的效價為16 8 7 士5 提高了 7 4 0 i i m i 氨基酸的調控通過分析得出a r g c y s 唧對n i s i l l 的生產有正調控作用 添 加1 9 l 的這三種氨基酸分別使n i s i n 的效價提高了2 2 4 士5 砌恤l 1 3 q 士5 n m i 1 1 8 士5 i u m l 而1 9 l 的p r o 對n i s 訪的合成有負調控作用使n i s i n 效價降低了1 3 8 5 i u m l 三口c d c d 淞腸c 咖在延滯期大量利用游離態的氨基酸 進入對數生長期 后主要利用分解蛋白質產生的氮源 試驗證明三口c f d c d c c 淞腸甜括利用的主要靠從周 圍環境中吸收船 而不依賴自身合成 在n i s i n 代謝過程中精氨酸的消耗量最大 隨a 唱添加量的增加n i s i n 的產量不斷增加 但增加幅度降低 當精氨酸添加量高 于8 9 l 時 n i s i n 產量基本不再增長 此時效價增加了4 5 0 i u n 兒 黑龍江大學碩士學位論文 最后本試驗研究了乳酸的反饋調控 計算得出發酵過程中蔗糖代謝轉化為乳 酸的轉化率為8 3 3 經驗證 乳酸的抑制作用一方面來自于p h 值的下降 另一 方面來自于乳酸根的累積 通過流加5 mn a o h 控制發酵液p h 值為7 o 左右時 使n i s i l l 發酵產量在優化的培養基的基礎上又提高4 2 0 士5 i u m l 而當發酵液中乳 酸根的含量達到7 時n i s i n 停止生產并由此推斷出乳酸根的積累是補糖發酵的限 制性因素 經過以上培養條件的優化和代謝調控過程之后 n i s i i l 的效價共提高了近 1 4 l o m n 兒 約為未進行調控時的1 5 倍 關鍵詞 n i s i n 發酵條件 代謝調控 a b s t r a c t a b s t r a c t n i s i i li sal i n do fn a t u r a lf o o dp r e s e r v a t i v en l a ti sa l l o 耽dt 0c o m m e r c i a l i z e d p r o d u c t i o n n i s i nc a i li n h a b i tm o s t0 f 恤伊鋤p o s i t i v ep a m o g 商cb a c t e t i a n 盯ea r e 0 1 1 l yaf e wc o m p a n yp r o d u c en i s i ni nc t l i i l ab m t l l eo u t p u ta r l dp u r i 哆a r el o w c r 也a i l f 0 r e i g nc o 嘶e s t h ep u r p l o s co ft l l i sa n i c l ei st 0 刪 億et l l em e t a b o l i cp 帥c e s sa n d r e g u l 撕o nm e c h a 血s mo fn i s i nb y 廿l em e t h o do ff e i m e 觚l t ec o n d i t i o no p t i n l i z a t i o n c mm e d i aw a ss e l e c t e d 鶴o r i g 砌m e 擊u m 五的mf i v el a c t i ca c i d eb a c t e r i a 詫舯e n t i o nm e d i 啪si n s 咖d y 0 1 1 l eb 嬲i so f t h i ss t u d y n i s i l lp r o d u 0 no f 也e b e s ti n j t i a p h 砌u eo f7 0 t h e0 p 血 l 蛐鋤0 u n to fi 1 1 0 c u l a t i o ni s 3 t h eb e s t i n o c m a t i o na g e 細1 2 hw e r ee x p l o r e d s u b s e q u e n t l y n i s i nm o 乞l b l i s mw a sc o m o l l e db yt l l em e t l l o do fn u t r i t i o n a l m 撕p u l a t i o n 鋤i n oa c i dm e 例b o l i cr e g l l l a t i o n 鋤d1 a c t i ca c i df e e d b a c kr e g u l a t i o n b y n u t r i t i o n a lm 枷p u l a t i o nm e t l l o d m a i z el i q 試dw a ss e l e c ta si l i 仃d g e ns o u r c e 鋤d k h 2 p 0 4a sp h o s p h o n 峪s o u r c et o 佗徹e n t a t i o n 1 1 1 e nb yp l a c k e n b u 咖a nt e s t s t h r e c m a i nf a c t o r sm l p a c to fn i s i l lt i t e ri ss u c r o s e y e a s te x t r a c t 趾dt 1 1 ec o n c e n t r a t i o no f k h 2 p 0 4 b yb o x b e l l l l l e nt e s ta 1 1 a l y s i s 也eb e s tc o n c e i l 們t i o no f 也en e em a i nf a c t o r s f o rf e n n e n t a t i o n e r e3 9 9 l l8 5 9 la n d2 0 5 9 l o p t i 面z a t i o no ft l l em e d j 啪a f i e r f e 肌e m a t i o nn i s i ne 伍c i e n c ya t16 8 7 士5 i u i i l c r e a s e d7 4 0i u n l l 1 1 啪u 曲t 1 1 er e g u l a t i o no f 鋤i n oa c i d s a 唱 c y sa 1 1 d1 卻h a v ep o s i t i v er e g u l a t i o n o nn i s i l l w h e na d d e d1g la 唱 c y s 鋤d1 砷 t l l ep o t e n c yw 嬲i n c r e a s e db y2 2 4 士 5 i u m l 1 3 0 士5 i u 珈 la i l d1 18 士5 砌 札 a n dlg lo fp r on i s i np l a yan e g a t i v er o l e i i lr e g u l a t i o nt 0n i s i np o t e n c y w l l i c hm a k ei tr e d u c eb yl38 士5 i u m i l a l c t o c o c c u s l a c t i si i le 殖e r l s i o no fd e m u l t a g e 疔e eu s eo fal a r g em m l b e ro f 枷n oa c i d s 硫ot 1 1 e 黟o w i i l gn u m b e ro fd e c o m p o s i t i o 瑪t 1 1 ei l i t r o g e ns o u r c eo fd e c o m p o s e dp r o t e i i lw a s m a i l l l yu s e d l a c t o c o c c u sl a c t i s t e s t sp r o v e dt l l a tt l l eu s eo fr e l y i n gm a j i l l yo nt 1 1 e s u r r o u n d i n ge n v i r o 舯e n t 丘d mt l l ea b s o 叩t i o ni 1 1t 1 1 ea 唱 r a t h e rm 鋤s e l f s y n t h e s i z i n g i i i 黑龍江大學碩士學位論文 c o n s u i i l l 炬o no fa 哂血1 ew 嬲t h el a r g e s ti i lt 1 1 ep r o c e s so fn i s i nm e t a b 0 1 i s m 謝t l lt h e i i l c r e a s eo f 孤翟j 血n e o u t p u t 鋤o u n to fn i s i ni 1 1 c r e a s e d b u tt h em t eo fm c r e a s ew a s1 0 礬 w 1 1 e nt l l e 鋤 咖o f 盯g i l l i n ew a s8g l p r o d u c t i o no f n i s i l ln ol o n g e ri i l c r e a s e d f i n a l l yf e e d b a c kc o n 昀lo fi a 嘶ca c i d v 嬲s t i l d i e di i lt 1 1 ea n i c l e b yc a l c u l a t h l g c o n v 貧s i o nr a t eo fp r o c e s ss a c c h a r o s e 硫ol a c t i ca c i dm e t a b o l i s mi i lf e m e n 嘶o n 弱 8 3 3 h l et 0t l l ed e c l i l l eo fp h 鋤dl a c t i ca c i da c c u m u l a t i o n i i b i t i o n0 c c u r e d f e d e d b y5mn a o h b r o t hp h 啷c o n 仃o la r o u l l d7 0 0 n 也eb a s i so fo p t i i n i 蒯o n f e m e n t 嘶0 n p r o d u c t i o no fn i s i i li 1 1t h em e d i u mr a i s e d4 2 0 士5 i i7 西i m e nc o n t e n to f l a c t i ca c i d 咖ti i lf e r i n e n t a t i o n i 嬲7 p r o d u c t i o no fn i s i i l v a s 咖p p e d 鋤di tw a s c o n c l u d e d 也a t 廿l et l l ea c c 啪u l a t i o no fl a c t i ca c i dr o o l tw a st h el i i l l i tf k t o rf o r e q 砌i z h 塢一s u g a rf e 鋤e 1 1 t a t i o i l a r e ro 洶i z a t i o nc o n d i t i o n s i l l c r e 鷦e dn e a d y14lo i u m l a b o u t1 5t 油e sf o rn o n r e g u l 撕o n 鋤dc o n 仃0 1 1 e yw o r d s n i s i i l f e 衄e m a t i o nc o n d i t i o n m o t a b o l i s hr e 剛a t i o n l v 獨創性聲明 獨創性聲明 本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研 究成果 據我所知 除了文中特別加以標注和致謝的地方外 論文中不包含其他 人已經發表或撰寫過的研究成果 也不包含為獲得墨蕉婆太堂或其他教育機構的 學位或證書而使用過的材料 學位論文作者簽名 二聲名況影 簽字日期 x 即亨暈 a 2 黽 學位論文版權使用授權書 本人完全了解墨蕉塹太堂有關保留 使用學位論文的規定 同意學校保留并 向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版 允許論文被查閱和借閱 本 人授權墨蕉塹太堂可以將學位論文的全部或部分內容編入有關數據庫進行檢索 可以采用影印 縮印或其他復制手段保存 匯編本學位論文 1 靴做儲攤 例聊鶴 穆她 j 7 弋 簽字日期 彩廬多月 一2 日簽字日期 切口8 年6 月f 日 學位論文作者畢業后去向 工作單位 通訊地址 電話 郵編 第1 章前言 1 1nisin 的簡介 1 1 1nisin 的發現 第1 章前言 乳酸鏈球菌素 n i s i n 是從乳品發酵微生物三口c 幻 淞脅m 譬墨驢腸c 出發酵產 物提取制備的一類小分子多肽化合物 這種微生物過去稱為勛印肋 卯螂 口c 廊 r o g e r s 和w h i t t i e r 1 9 2 8 最先發現乳酸鏈球菌的代謝產物能夠抑制部分革蘭氏陽 性菌的生長 蚴 m a t t i c k 和h i r s c h 1 9 4 4 發現血清學n 群中的一些乳酸鏈球菌能 產生蛋白類抑菌物質 命名為n i l l h i b i t o 巧s u b s t a i l c e 即n 群抑菌物質 簡稱為n i s i n 3 1 n i s i l l 才正式命名 1 9 6 9 年 隨著第一批商品在英國面世 f a o o 食品添 加劑聯合專家委員會批準n i s i n 作為一種生物型防腐劑應用于食品工業 1 9 8 8 年美 國食品和藥物管理局 f a d 也正式批準將n i s i n 應用于食品中 1 9 9 0 年3 月2 9 日中國衛生部在g b 2 7 6 卜8 6 中批準n i s i n 可用于罐藏食品 植物蛋白食品 乳制 品 肉制品中 4 迄今為止 n i s i l l 已在全世界約6 0 多個國家和地區被用作防腐 劑 表1 1 n i s i n 在不同國家的使用狀況 t h eu s eo fn i s i ni nd i f i e r e n tc o n t r y f o o d i n 訥赫t i 王暑i n p 帥刪 j 主m 哪k 砌i i 蚴 r 弘睢l 舶 a u s 姚目囊 眥蜮u m c m 瓜 e u f n 硼t e i 嘶 知k 撕 p r o c e s 3 e dc h e c 基e c h 紀蛹諍牦c e s 棗dd 犍e 姥拉 機e d 啪鼬 檔 c b e 髓 e f l c 螄i o 喇d 話矗鼻臼蒯垤翻擻i 瞌3 4 蔭 跏姍嘲e d 薯勺咖嘲弦睜e 哺f 妒 p 眥曩剃d 讎 c h 蹙磚 n b 輛l s 僻m i 鼬d l f 垤 o o n o 酗喝黏 l n o h 憎秘 1 v 酗e a 旺o i d l i bbp 帕如d 疆一即鼎脅b 日弛塘 n o l 蛔k 知日 5 0 0 注 來自a p i i n 和b a r r e t t 公司 f r o ma p l i na n db a r r e t tc o m p a n y 黑龍江大學碩士學位論文 1 1 2nisin 的結構 成熟的n i s i n 分子由3 4 個氨基酸殘基組成 分子式為c 1 4 3 h 2 2 8 n 4 2 0 3 7 s 7 1 5 j 分子 量為3 5 1 0 其n i s i n 分子結構中包含5 種稀有氨基酸即a b a 氨基丁酸 d h a 脫氫丙氨酸 d h b b 一甲基脫氫丙氨酸 a l a s 一刖墉 羊毛硫氨酸 和 a l a s a b a b 一甲基羊毛硫氨酸 它們通過硫醚鍵形成五個內環 除了這五個 環外 在臺聯的c 端和n 端的頂端區都有一定的彎曲性 分子高級立體結構中a b c 環在一邊 d 和e 環在另一邊 形成 絞鏈區 其活性分子常為二聚體或 四聚體 二聚體分子量為7 0 0 0 四聚體分子量為1 4 0 0 0 n i s i n 的前體肽由5 7 個氨 基酸組成 其中n 端2 3 個殘基構成信號肽 信號肽在在細胞表面被太沒水解去除 后 釋放除成熟的 有生物活性的n i s i l l 經過幾十年的研究 人們己發現n i s i n 分子有6 種類型 它們分別是a b c d e f 其中以n i s 姒和n i s i i 億兩種 類型的研究最為活躍 兩者的差異僅在于氨基酸順序上第2 7 位氨基酸的種類不同 州s i i 認是組氨酸 瑚s 而n i s i n z 是天門冬酰胺 a s n n i s i n z 是n s i n a 的天然 變異體 它與n i s i i 認有相同的抗菌活性 但比n i s 姒有更好的擴散性 在p h 值 高于6 的溶液中有更好的溶解度 5 7 1 圖l l 乳酸菌素的結構嗍 f i g l ls t 瑚c t u r eo f n i s i n m n 脫氫丙氨酸 d b 一甲基脫氫丙氨酸 a l a 母a i a 羊毛硫氨酸 a i a 母a b a b 一甲基羊毛硫氨酸 1 1 3nisin 形成的分子機制 乳鏈菌肽生物合成十分復雜 涉及1 1 個基因 9 1 以證s z n i s b 試s t i l i s c 2 第1 章前言 1 1 i s i 1 1 i s p i l i s r i l i s k i l i s f i l i s e 和n i s g 的順序成簇排列在乳鏈菌肽 蔗糖轉座子左端約1 4 k b 的d n a 片段上 圖1 2 其中i l i s z 是編碼乳鏈菌肽前 體的結構基因 1 1 i s i i l i s f l l i s e 和i l i s g 與菌體自身免疫有關 n i s r 和n i s k 是 雙組分調節基因 其余是與乳鏈菌肽成熟有關的基因 依據n i s i i l 生物合成基因的 遺傳分析的結果 勾畫出了n i s i n 生物合成的模型 l l i s p 將前導序列切除 釋放有 活性的n i s i l l 分子 圖1 3 n i s i n 的生物合成 首先由胞外的信號激活位于膜上 的組氨酸激酶 由i l i s k 編碼 i l i s k 基因自身磷酸化作用之后 轉移磷酸基到相 關的調節因子 1 1 i s r n i s r 將前肽分子調節到位于膜上的修飾復合蛋白質 n i s b 和i l i s c 進行修飾 修飾肽與轉運蛋白 n i s t 相結合 將修飾肽通過膜的轉運 附在膜外表面的1 1 i s p 將前導序列切除 釋放有活性的n i s i n 分子 i l 仉1 4 喃 箍西曩卜l 螂i 赫 m 岫t k 啪 一 娃硇鼓 一 虞柚畸 7 坼枷4 粥嗷搿橢貓2 4 j2 由認 膏冀疊 膏魚魔鼉自 蕾囊愛 圖1 2n i s 矗基因簇的結構示意圖1 1 習 f i 9 1 2s c h e m a n c 他p 懈蚰t a 6 0 no f t h eo r g a i 翻t i 仰o ft h en i s i ng e n ed u s t 盯 一一 一一v i 工蹬1 3 等引 之目蹬l 一二 r v 酉 p r e p c p l i d c r 圖l 3n i s i n 的生物合成模型1 1 5 l f i g l 3b i o s y n t h 髂i sm o d e lo fn i s i 黑龍江大學碩士學位論文 1 1 4nisin 的性質 1 1 4 1nisin 抑菌性 n i s i n 主要抑制大部分g 菌 特別是細菌的芽孢 n i s i n 能抑制葡萄球菌屬 鏈 球菌屬 小球菌屬和乳桿菌屬的某些菌種 抑制大部分梭菌屬和芽孢桿菌屬的芽孢 1 6 1 例如能有效抑制肉毒梭狀芽孢桿菌 金黃色葡萄球菌 溶血性鏈球菌 枯草 芽孢桿菌 嗜熱脂肪芽孢桿菌等引起的食品腐敗 早期的研究認為 n i s i i l 一般對 霉菌 酵母菌和g 一菌是無效的 但近期的研究表明 在一定條件下 如冷凍 加 熱 降低p h 和e d t a 處理 一些曠菌 如沙門氏菌 大腸桿菌 假單胞菌等 對n i s i i l 敏感 表l 2 n i s i n 的抑菌譜0 1 7 l t a m e 1 2a n 6 b a c t e r i a is p 鉀t r u mo fn i s i n 試驗菌株 i d i c a t o rs t r a i n s n i s i n 抑菌圈直徑 m m d i a m e t e ro fi n b i b i t i o nz o n e b a c i i l u ss u b t i l i sd b l 0 4 b a c 1 1 u sp u m i l u sa s l 9 4 0 b a c i l l u ss l r a r o t h e m o p h 釘u sc u 2l m i c r o c o c c u sf l a v u sn i c b 816 6 c o d r n e b a 咖耐啪g l u t 鋤i c u n 出9 l a c t o b a c i l l u sp l a n t a 兀 1 1 1a s1 5 5 5 7 l a c t o c o c c u sc a s e ia s1 5 3 9 l a c t o c o c c u sl a c t i sm gl614 i a c t o c o c c u sl a c t i sa t c c l l 4 5 4 l a c t o c o c c u sl a c t i s7 9 6 2 e s c h e r i c h i ac o l id h 5a s a h n o n e l l ae n t e r i l d i sl t 2 s a c c h a r o m y c e sc c r e v i s i a ea s 2l8 2 g e o t r i c h u mc a n d i d u ma s2 10 8 0 抑茵直徑d i a m e t e r o f i n b i b i t i o n 趵n e m m 1 0 o 1 5 o 1 5 1 2 0 0 卅 2 0 o 沒有抑茸作用 什 卅 一 卅 什 卅 第1 蘋前言 n i s i n 對g 菌營養細胞和芽孢有不同的抗菌機理 對營養細胞的抗菌機理的看 法有兩種 一種觀點認為 n i s i l l 吸附于細胞膜上 可以抑制細胞壁中肽聚糖的生 物合成 使細胞膜和磷脂化合物的合成受阻 導致細胞內物質外泄 引起細胞裂 解 另一觀點認為n i s i n 的抗菌機理與d h a 和d h b 密切相關 1 8 1 因為n i s i l l 中的 d h a 和d 皿能夠與敏感菌株細胞膜中某些酶的巰基發生作用 釋放細胞質 造 成敏感細胞裂解 n i s i n 對芽孢的作用是在其萌發前期及膨脹期破壞其膜 以抑制 其發芽過程 1 1 4 2n i s i n 的溶解性與穩定性 n i s i n 是一種白色易流動的粉末 使用時需溶于水或液體中 n i s i i l 的溶解度主 要取決于溶液的p h 值 在p h 值較低的情況下 溶解性較好 其溶解度隨p h 值的 降低而升高 p h 5 0 時溶解度為4 0 9 6 p h 為2 5 時溶解度為1 2 1 9 1 n i s i n 在中 性和堿性條件下幾乎不溶解 所以在應用時 一般先用0 0 2 m 鹽酸溶解 再加入 到食品中 n i s 證的穩定性主要取決于溫度 p h 值 基質等因素 n i s i n 在酸性條件下呈 現最大的穩定性 隨著p h 的升高其穩定性大大降低 在p h 為2 o 或更低的稀鹽 酸中 經1 1 5 6 高壓滅菌 仍能穩定存在 在p h 為5 時 其活力損失4 0 在p h 為9 8 時其活力損失超過9 0 在一定溫度范圍內 隨著溫度的升高 它的活性喪 失增加 當n i s i i l 加入到食品中 則受到介質的保護 一些大分子食物如牛奶 肉 湯等可使其穩定性大大增強 另外 n i s i n 的穩定性還與熱處理時間 食品保藏的 溫度及時間等有關 2 0 1 1 4 3n is i n 的安全性 n i s i n 對蛋白酶特別敏感 在消化道中很快被旺一胰凝乳蛋白酶分解 它對人體 基本無毒性 也不與醫用抗生素產生交叉抗藥性 能在腸道中無害的降解 對n i s i n 的毒性 致癌性 存活性 再生性 血液化學 腎功能 應激反應以及動物器官 病毒學等生物學研究證明 n i s i n 是安全的 2 1 9 9 4 年 f a o 陽o 規定其最大 耐受值為3 3 0 0 0 i l j 瓜g 半致死計量為7 9 l g 黑龍江大學碩士學位論文 1 1 4 4nisin 的作用模式 n i s 血抑菌作用機理尚未完全清楚 唯一可以肯定的是n i s i n 的作用位點是敏 感菌株的細胞膜 目前最為合理的學說是 孔道形成模型 該學說認為n i s h l 孔道的形成有 桶板 和 楔入 兩種模式 兩種模式都認為n i s i n 最初通過一定 程度的經典相互作用于靶細胞膜結合 質子動勢的成分增強插入作用 桶板模式 或作為引起插入作用的沒接 楔入模式 在兩種模式中多個n i s i l l 分子排列在孔 道的周圍 n i s i l l 的疏水的側面朝向脂質雙層膜 n i s i l l 的親水側面軍朝向孔道的內 腔 桶板 模式認為n i s i n 屬于通過 桶一板 機制起作用的細胞通道形成蛋白 n i s i n 通過與膜磷脂的靜電作用在膜表面聚集 n i s i i l 的出現引起該區域磷脂局部移 位 導致細胞膜明顯變薄 n i s i l l 分子以電勢依賴方式插入脂質膜 通過多個分子 與膜作用聚集而形成孔道 有直接證據表明n i s i l l 的c 末端插入脂質雙層膜的疏 水核心 這與n i s i n 物理化學性質的推論吻合 也有研究認為主要是n i s i n 分子的 c 末端插入脂相 而c 末端部分是造成n i s i n 與目標膜結合的原因 楔入 模式認為n i s i n 擔當陰離子載體 1 0 n o p h o r e 孔道的形成是山于與 n i s i l l 分子相結合的脂質雙層膜的局部擾動引起的 然后n i s i n 通過p 姍的成分被 引入膜內 形成多n i s i l l 分子的楔形孔 n i s i l l 分子相對于脂質頭部基團的方位小 變 因而n i s i n 不與膜的疏水核心相連接 而是n i s i i l 的疏水殘基淺淺地插入脂質 體雙層膜的外葉 在 楔一孔 模式中 帶正電的n i s i n 分子與目標細胞膜上陰性 磷脂間最初的靜電相互作用 膜結合和孔道形成所需的相互作用等仍末研究清楚 1 2nisin 的應用 n i s i n 不但在乳制品 灌裝食品 酒精飲料中大量應用 在肉制品中的應用也 日趨廣泛 引起肉制品腐敗的細菌相當多 而且這些細菌多屬于耐熱性病原菌 普通的加熱方式難以將他們殺死 殘余的細菌常引起肉制品的腐敗 造成肉制品 腐敗的大多數細菌 n i s i n 皆能有效抑制 故可用于肉類 魚類制品的防腐保鮮 延長食品的貨架期 與其他鹽 鰲合劑 防腐劑復配效果更佳 3 l j 6 第l 章前言 1 2 1 在肉制品中的應用 傳統的火腿 熏肉和香腸產生中 普遍使用亞硝酸鹽 硝酸鹽等發色劑來產 生典型的腌制紅色和腌制風味 并抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長 但這些添加劑 同時對人體具有潛在的致癌危險 n i s i i l 能有效控制肉制品中微生物的生長 尤其 是抑制產生毒素的肉毒梭狀芽孢桿菌的活性 并且n i s i i l 本身呈酸性 能降低周圍 介質的p h 值 因而能降低殘留的亞硝酸鹽的含量 減少亞硝胺的形成惻 n i s i i l 可作為一種有效的替代物 減少火腿中發色劑的用量 另外 在加工過程中 過 分的熱處理會明顯改變肉制品的質地及外觀 加入n i s i n 后僅需4 5 的熱處理即可 延長其貯存期 孔保華等 1 9 9 7 將n i s i n 添加于紅腸中可顯著降低細菌總數 并 延長產品保存期 3 2 1 袁秋萍 1 9 9 8 等研究表明 在香腸中n i s 洫添加量為0 3 9 k g 絕大多數的革蘭氏陽性菌受到抑制 而且產品色 香 味不受影響 豬肉絲中添加 o 4 8 9 k gn i 血 可取代山梨酸鉀作防腐劑 并能提高產品質量 羅欣等將n i 妣 首次用于牛肉冷卻肉的保鮮p 3 1 還連棟 2 0 0 0 等將n i s 訪用于扒雞的生產 1 7 1 研 究表明 添加n i s i n 可降低殺菌溫度 保質期達半年以上 并且使扒雞的口感得到 改善 1 2 2 在乳制品中的應用 乳制品營養豐富 極易腐敗變質 經巴氏滅菌和冷藏可延長保存期 但其中 肉毒梭狀芽孢桿菌仍能存活 并產生一定毒素 n i s i n 可用于巴氏滅菌牛奶 添加 量為3 0 5 0 m g k g 通常在3 5 下產品貨架期可延長一倍 罐裝煉乳中添加8 0 1 0o f i l g k g 的n i s i i l 能減少10 i i l i n 滅菌時間 u h t 奶中添加2o i i l g k g 的n i s i n 能完 全抑制滅菌乳中嗜熱細菌芽孢的生長 3 4 1 郭清泉等通過試驗證明 添加4 0 i u l l 的n i s i i l 于酸奶中 將酸奶的后酸化推遲了3 天 且菌數保持在1 0 7 個仙以上 而且感官質量良好 3 5 黑龍江大學碩士學位論文 1 2 3 在罐頭制品中的應用 n i s i n 在酸性條件下易溶 穩定 抑菌活力也高 可用于高酸性 p h 4 6 罐頭 的保鮮 如西紅柿罐頭中 添加n i s i n 可防止因耐酸的g 菌群如巴氏梭菌 浸淋 芽孢桿菌引起的腐敗 添加量一般為1 0 0 2 0 0 i u g 在低酸性 p h 4 6 罐頭如馬 鈴薯 蘑菇 水果罐頭中 即使經高熱處理 仍有一些嗜熱菌的芽孢幸存 以致 引起罐頭的腐敗 并且高熱處理對食品的感官質量有一定影響 添加適量的n i s i l l 不僅可以有效地抑制芽孢的生長 還可減少罐頭的熱處理時間 保持其新鮮度 并延長保存期 錢平等采用沸水殺菌和添加n i s i n 相結合的方法 對蔬菜罐頭進行 殺菌 結果表明 經過處理的罐頭感官特性大為改善 且在室溫下貯藏期達到兩 年f 3 6 1 2 4 在醬菜中的應用 瓶裝醬菜是可供長期貯存的方便食品 瓶裝醬菜一般采用巴氏滅菌 殘存的 細菌主要為梭狀芽孢菌及少數耐熱的g 菌 傳統的抑制雜菌的方法主要依賴于產 品的高滲透壓 高鹽 高糖 低氧環境及添加化學防腐劑 目前 各類醬菜中 含鹽量偏高 約在1 0 2 0 之間 但高鹽食品易誘發高血壓等疾病 加入1 0 0 m g k g n i s i n 可抑制雜菌生長 并使鹽的濃度下降為7 9 由于一些國家在食品中不準 使用苯甲酸鈉 所以n i s i n 用于瓶裝醬菜出口 具有現實意義 1 2 5 在酒精飲料中的應用 腐敗乳酸菌對n i s i i l 敏感 但酵母幾乎不受其影響 因此 n i s i n 可與酵母一 起在生產啤酒 果酒 烈性乙醇等酒精飲料時加入 用來抑制g 菌 啤酒生產中 易受乳桿菌和啤酒片球菌的污染 發生混濁 變酸 發粘等現象 o g d e n 等 1 9 8 5 用平板打孔法檢測得出 啤酒常見腐敗菌幾乎均能被1 0 0 i u i i l ln i s i n 所抑制 3 7 捌 添加n i s i n 的啤酒 可以降低巴氏滅菌的時間和溫度 并能延長啤酒 尤其是非巴 氏滅菌和瓶裝啤酒的貨架期 對照不加n i s i n 的啤酒 存放期延長了一倍的時間 第1 章前言 r a d l e r 1 9 8 1 曾把n i s i i l 應用于白酒釀造中 有效地阻礙了腸膜狀明串珠菌 啤 酒片球菌和乳酸桿菌的生長 防止了雜菌的污染 3 9 1 1 2 6 在其它方面應用 n i s i n 也可用于焙烤食品中 以防止蠟狀芽孢桿菌生長 用n i s i n 作防腐劑 在制作烤餅的面團中 添加不同濃度的n i s i n 作試驗 結果顯示 n i s i i l 添加量為 6 2 5 p g g 即可有效地抑制蠟狀芽孢桿菌的生長 n i s i i l 還可用于對n i s i l l 不敏感的 微生物發酵過程中 以防止革蘭氏陽性菌的污染 如單細胞蛋白 有機酸 氨基 酸和維生素等工業發酵過程h 近年來 新的研究發現證實n i s i n 和萬古霉素有 相同的作用位點 特別是以n i s i n 為主要形式的羊毛硫細菌素家族在治療老鼠葡萄 球菌引起的傳染性疾病和人類的痤瘡上所取得的成功 致使n i s i n 在醫藥方面的作 用又重新引起了人們的關注 4 2 1 3nisin 的國內外需求 從產銷規模看 1 9 8 8 年全球食品添加劑市場的總產值為1 5 0 億美元 2 0 0 0 年 增加到1 6 0 億美元 到2 0 0 3 年 食品添加劑全球銷售額達2 0 0 億美元 與1 9 8 8 年相比 增長了3 3 3 3 在我國 2 0 0 0 2 0 0 4 年間 國內食品工業迅速發展 工業產值年平均增長率在 2 3 左右 食品工業的快速發展 造就了食品防腐添加劑行業的高速發展 目前食 品防腐添加劑已經進入到糧油 肉禽 果蔬加工各領域 包括飲料 調料 釀造 甜食 面食 乳品 營養保健品等各工業部門 并進入了尋常百姓的一日三餐 2 0 0 0 2 0 0 4 年間國內食品添加劑銷售額平均增長速度為1 7 1 9 9 8 年國內食品添加 劑產量只有1 3 7 4 萬噸 2 0 0 4 年飆升至3 3 4 萬噸 國內銷售額也從1 9 9 9 年的1 7 0 億元增長到2 0 0 4 年的3 3 5 億元 2 0 0 5 年已經達到3 8 0 億元的規模 而隨著國內農 產品深加工的需要 并綜合考慮我國食品工業的發展速度 新技術的推動以及消 費者對綠色有機食品消費增加的消費趨勢等眾多因素的影響 我國食品防腐添加 劑在未來的很長一段時間都還將呈現出快速增長的勢頭 黑龍江大學碩士學位論文 1 4nisin 發酵生產的研究現狀 1 4 1nisin 代謝的動力學模型 n i s i n 的生產是和生長密切相關 它通常發生在整個生長階段 從新陳代謝的 角度看 n i s i n 通常被認為是基礎代謝物 也就是說 產率僅依賴生長率 但即使 n i s i n 的生產和生長相聯系 由于許多影響其生產和吸附的因子之間的相互作用 細胞達到最大生物量時并不一定會使n i s i l l 有最大產量 這可通過細菌素積累模型 方程式1 進行說明 y p a y b x 1 式中 y p 和y x 分別指細菌素的產率和菌體的生長率 a 和b 是需要在試驗中確定的參數 將 1 式變形 即得 y p a y x b 2 生物代謝可以分為3 類 基礎代謝 當b 0 時 細菌素產率僅由菌體生長率所決定 二級代謝 當a o 時 細菌素產率僅由菌體數量所決定 綜合代謝 當b o a o 時 細菌素產率由菌體生長率和數量共同決定 4 3 1 對于某些細菌素而言 產率和細胞的生長率確實是呈近似的線性關系的 也 就是說 它們是近似符合基礎代謝的 但是 人們觀察到 不論是連續生產還是分批 間歇發酵 n i s i n 的產率和細胞的生長的非線性關系非常明顯 分批發酵中 菌體 指數生長階段后期 n i s i n 的合成增加 顯然和細胞生長不一致 由于m s 基因在 指數生長初期就有表達 因此n i s i n 產量在生長后期的增長 是基于碳源對n i s i i l 前體修飾基因的表達與活性調節 第1 章前言 1 4 2 培養條件對 sin 發酵的影響 研究發現除n i s i n 產生菌性能 培養基成分 碳源 氮源 磷源和陽離子 發酵條件 時間 p h 溫度 攪拌 通風 發酵類型 分批發酵 連續發酵 等許多因素對n i s i n 的生成量均有影響f 4 4 1 楊博等曾以乳酸乳酸球菌 a c 手d c d c c 船j a c 芒如s 帕印 j a c 芒婦 y 一7 2 為研 究材料 令y 一7 2 的發酵培養基在不同的溫度下進行發酵 以發酵液o d 值不再增 加為發酵終了的標志 測發酵液的效價 約在3 0 時發酵液效價和菌體產生量均 達最大值 高于此溫度 菌體生長量急速下降 發酵液效價也隨之下降 原因可 能是因為在高溫時菌體產酸快從而抑制了菌體生長 乳鏈菌肽的合成也受到了抑 制f 4 5 溫度達到4 5 時菌體于此溫度發酵速度慢且發酵不能生長 乳酸鏈球菌是同型發酵菌種 在其生長過程中會產生大量的乳酸導致p h 值的 大幅下降 雖然較低的p h 值有利于n i s i n 的合成和從菌體上解離 但高的p h 值 有利于茵體的生長 因此在發酵過程中控制p h 值在 個合理的范圍內能過得到最 高的產量 另外 p h 值對n i s i n 的效價也有影響 侯革飛等研究表明n i s i n 的活性與p h 值成反比 但這很可能是由于n i s i n 在水中的溶解度受p h 值的影響引起的 蚓 h i r o s h is h i m i z i l 等將婦f o c o 搬加出和腳e m 叼 c 船撐搬搿婦以凇共同培養 通過 尉z 緲廠d 眇甜的代謝控制發酵p h 值 與流加堿控制p h 值比較得到了更高的n i s i i l 產量1 3 7 1 m l c 加等人提出了一個假設 即真正決定n i s i n 產量的是p h 值的下降 梯度 p h 這個梯度越陡 對生產越有利 生產可以通過將最后穩定的酸性p h 反復 堿化至初始p h 中間的間隔時間大概是6 小時 而使n i s i n 產量翻倍 這個假設在其 用菌株i im l b l 1 3 進行的相關的對比試驗中得到了比較吻合的結果 但這個結論 是否對其它菌株也有效 還需要進一步的研究 在決定最優的p h 問題上 大多數認 為p h 應在5 8 6 o 之間對于恒定p h 值生產n i s h l 是合適的 這通常低于最佳生長 p h 但是這個p h 值范圍不能推廣到所有其他細菌素的生產 比如有幾種細菌素的 生產只有在低p h 5 o 處才最佳 這也是隨菌株或菌種而定的 而在m l c a b 0 的反 黑龍江大學碩士學位論文 復堿化的生產方法中 起始p h 為6 5 7 5 時 n i s i n 的生物合成達為最大 4 7 1 張秀明等在對上口c 幻 c c 姍 口c 廊n 3 0 2 進行發酵培養時 最佳的接種量為3 最佳發酵時間為2 1 h 但由于菌種間的差異 但由于菌種的差異 不同菌種的代時 和接種量對產量的影響是不同的 1 5 微生物的代謝調控 微生物的代謝可分為初級和次級代謝 為了在生長勢頭減緩后能維持一定的 碳流 以便一旦條件有利于生長時可以隨時恢復生長 細胞將碳流流向次級代謝 產物的合成 這樣做也有利于細胞維持其生命活動的要素 如關鍵蛋白質的周轉 的修補和的維護等 初級代謝與細胞生存相關 涉及到產能代謝和耗能代謝 次 級代謝是細胞為了避免在初級代謝過程中某種中間代謝產物積累所造成的不利作 用而產生的一類有利于細胞生存的代謝類型 初級代謝產物如糖衍生物 核苷酸 和脂肪酸等單體以及由它們組成的大分子物質如多糖 核酸和脂類等通常都是細 胞生存不可缺少的物質次級代謝產物不是細胞生存所必需的物質 它們通常被細 胞分泌至胞外 并在同其它生物的生存競爭中起著重要作用 初級代謝是次級代 謝的基礎 它為次級代謝產物合成提供所需要的能量和前體物質 4 引 次級代謝是 初級代謝在特定條件下的發展 是為了避免初級代謝過程中某種中間體或產物過 量積累對細胞產生毒害作用或是為了提高細胞相對于其它競爭物種的生存優勢 代謝過程調控目的是增加限速步驟的代謝通量 通過研究產物的代謝途徑 能得知或預知產物生物合成過程 然后運用遺傳操作方法或改變培養環境使流向 產物合成的代謝流增加 從而使產物的產率大幅度提高 同時減少分叉代謝途徑 的代謝通量即可以提高目標代謝途徑的碳流量 細胞的代謝通量除了直接由胞內 酶決定之外 還間接受到了轉錄與轉譯的控制 具體表現在五個不同的水平上轉 錄水平控制降解翻譯水平蛋白質激活或失活異構酶調節 胞內遺傳物質或培養環 境因子的變化將導致酶活力或酶量的變化 代謝物濃度也隨之改變 這進一步影 響到調節蛋白 致使在轉錄水平及蛋白組水平發生級聯效應 通常認為目標產物 的產率偏低是由于相關酶系或酶級聯反應限制了產物的合成能力 盡管與特定產 1 2 一 第l 章前言 物合成途徑相匹配的全部酶活性控制著產物的合成速率 但產物的最終產量卻是 各種中間代謝物分支點處流量分配的綜合結果 細胞內同時進行的數千個生化反 應構成了錯綜復雜的細胞代謝網