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文檔簡介

PCR引物設計流程詳解本文目的：復制出IL-4基因片段一、 查找基因序列1、 進入NCBI主頁，下拉選框選擇Nucleotide，在搜索欄輸入要查找的目的基因，即IL-4，點擊搜索2 、在搜索結果選擇靈長類（Homo sapiens）2、 在靈長類IL-4基因中選擇需要的mRNA序列3、 查看基因的相關信息外顯子區域CDs區域4、 點擊FASTA格式，并將序列保存到文檔二、 使用primer premier 5.0設計引物1、 建立新文件，將所得的序列復制進輸入框內2、 點擊搜索按鈕，搜索引物3、 設置引物設計參數（因為在之前查找基因序列的時候獲知，外顯子區域分別為：1-200、201-248、249-425、426-618，又知在引物設計時引物位置最好跨越一個內含子，PCR產物長度通常為100-150bp，故設定上游引物位置為201-248，下游引物位置為249-425，產物長度為100-150bp）4、確認條件后，顯示搜索結果4、 雙擊選中得分最高的引物查看引物情況（上圖為上游引物情況，下圖為下游引物情況）5、 將設計的上下游引物復制出來，保存到文檔中三、 使用oligo 6.0對設計的引物進行評價1、 建立新文件，將從cnki上獲得的cDNA復制進輸入框，并點擊accept接收2、 接收后顯示出該序列的相關信息3、 點擊edit按鈕錄入用primer設計的上游引物，每一次輸入新數據后都需要點擊accept按鈕接收4、 同理，錄入下游引物5、 分析上下游引物二聚體形成情況6、 分析上下游引物發卡形成情況7、 分析上下游引物GC%8、 檢測上下游引物與PCR模板其它位置錯配情況9、 分析PCR整體情況四、 引物特異性檢驗（primer blast）1、 進入NCBI主頁，并選擇blast2、 選擇primer blast3、 在輸入框內輸入模板序列和上下游引物，并設定對比數據庫，點擊get primer進行對比4、 查看blast結果Blast 結果顯示，盡管IL

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