,中國人禽流感（H5N1）病例的 實驗室診斷及結果分析,2007年流感培訓 中國疾病預防控制中心 病毒病預防控制所 國家流感中心,全球人禽流感（H5N1）病例數,Total number of cases includes number of deaths. WHO reports only laboratory-confirmed cases.,16 August 2007,呼吸道標本的采集 血清標本的采集 組織標本的采集 消化道標本的采集,第一部分 檢測標本的采集,人禽流感病例呼吸道標本的采集,鼻拭子 鼻咽拭子 鼻咽吸取物 鼻洗液 咽洗液 氣管吸取物 氣管肺灌洗液,人禽流感病例呼吸道標本的采集,盡量采集深部呼吸道標本 肺穿刺液 深部吸取液,血清標本的采集,采集急性期和恢復期血清； 急性期血清應該在病人發病后立即采集，一般不要超過7天，如果沒有采集到7天內血清，在能夠采集的時候立即采集； 恢復期血清在病人發病后2-3周采集，如果病人死亡，在死亡前應采集一份血清； 病人恢復后應定期采集血清； 采集血清時不能少于5ml； 最好采集全血和血清標本。,組織標本的采集,肺活檢組織 尸檢組織，尸檢組織標本應盡可能采集各種器官組織，在采集過程中應盡可能避免交叉污染，每種尸檢組織標本可分為兩部分，一部分立即用于病毒的分離檢測，如果不能馬上進行，應該保存于-70oC；另外一部分保存于福爾馬林中，用于病理的研究。,消化道標本的采集,糞便標本 特別是有腹瀉癥狀的糞便標本 PBS 或者細胞培養液 加入以下抗菌素和0.5%BSA -氨芐青霉素 (2 x 106 IU/litre) - 鏈霉素 (200 mg/litre) - 多粘菌素 B (2 x 106 IU/litre) - 慶大霉素 (250 mg/litre) - 制霉菌素 (0.5 x 106 IU/litre) - 鹽酸氧氟沙星 (60 mg/litre), and - sulfamethoxazole (0.2 g/litre),標本的保存和運輸,用于病毒分離的標本應保存于4oC,并且立即送往實驗室進行接種，如果在48小時內不能進行接種，應該保存于-70oC；標本應避免反復的凍融（降低分離率）； 血清標本可以在4oC保存7天，否則應保存于-20oC； 標本的保存和運輸應遵守國家生物安全的相關規定。,任何成功的流感大流行的準備都依賴于對新出現毒株的正確的診斷。 對于可能是A型流感病毒的每個樣品最初的實驗室檢測應該快速并且能夠排除其它常見的呼吸道病毒感染。最理想檢測方法是24小時內能出結果。,第二部分：H5N1檢測方法的建立,符合以下標準之一的病例可以診斷為疑似或可能的H5N1病例 H5N1 病毒分離陽性。 兩種不同的引物針對不同的片段檢測H5病毒的PCR結果為 陽性。 微量中和實驗恢復血清(發病后2-4周)比急性期血清(發病后7日內) H亞型抗體滴度升高4倍或以上， 且恢復期的血清的微量中和抗體滴度在1:80以上。 單份恢復期血清(癥狀出現后的14天或以后)的微量抗體滴度在1:80或 以上,這以陽性結果采用不同的血清學方法可以驗證,如馬血球實驗凝集抑制實驗抗體滴度在1:160 以上或 H5特異的 westerblot 檢測結果陽性。,確認人禽流感病例(notify WHO),H5N1病毒的檢測方法,2005年以來中國人禽流感病例的實驗室診斷結果,2005年以來中國人禽流感病例的實驗室診斷結果（續）,RT-PCR技術的建立,臨床標本的RT-PCR檢測,Real-time PCR 靈敏度檢測,臨床標本的Real-time PCR檢測,Luminex xMAP technology,MDD 對呼吸道病毒的診斷,MDD對流感病毒亞型的鑒別,1號為氣管吸取物標本,一臨床病例的MDD檢測結果,NASBA H5N1 標本的檢測結果,NASBA 與Real-time RT-PCR敏感性的比較,NASBA技術的特點,NASBA 技術, 與Real-PCR 方法靈敏度相當。 NASBA 技術操作簡便，而且是一種高通量的方法。 與PCR 的產物DNA 分子不同，RNA 分子不易對實驗儀器和環境造成污染。,血清學檢測方法,HI( HRBC) ELISA SRH MN,HI assay,不同種屬 紅細胞HI實驗的比較,RBC,Serum (USCDC),Serum (CNIC),Chicken,Turkey,Horse,160,160,160,320,5120,5120,H5 HI titer using different red blood cell,Antigen: A/chicken/hunanxiangtan-he/21/2005(H5N1)(provided by HARBIN Veterinary Research Institute ) Serum: HS: Chicken serum from HARBIN Veterinary Research Institute USCDC: goat serum from USCDC,HI(HRBC) assay,使用U型板 4 代替室溫孵育。 每次病毒的滴度要回滴 馬血球要新鮮采集，一周內使用。,SRH原理示意圖,SRH 實驗的優化,最適的抗原濃度是常規血凝板滴定 的1000 HAI。 1% agarose。 雞血球更適合于SRH實驗中的溶血圈的產生。,SRH技術的特點,簡便、可靠、重復性好、特異性強、敏感性高，不受血清中非特異性抑制素影響。 血清用量少, 并不必進行稀釋。 可對大量血清標本進行測定。 一般實驗室均可開展，特別適用于我國基層地區。,單擴溶血的特異性對H5N1 患者血清的測定,微量中和實驗 (MN）的特點,微量中和實驗 是診斷人感染禽流感的最好的血清雪方法。 敏感性高。 特異性強( strain selection) 。 每次實驗要設病毒和細胞對照，病毒要回滴,MN assay of confirmed human cases,第三部分: 檢測結果和分析,The antigenic ratio of Human H5N1 isolates by HI assay,The antigenic ratio of Human H5N1 isolates by MN assay,Antigenic analysis of human H5N1isolates by HI assay,Antigenic analysis of human H5N1isolates by HI assay using chicken serum,South China,North China,Viet Nam,Antigenic assay of human H5N1 isolates By MN assay using confirmed human case serum,case1 is a survived confirmed human H5N1 case from Anhui province(southern china), the serum was collected 4 weeks after the illness onset. #Case 2 is a survived confirmed human H5N1 case from Liaoning province(northern china), the serum was collected 4 weeks after the illness onset.,Human H5N1 confirmed cases in mainland of china since Nov,2005,death(15),survival(9),China CDC,Clade 1,Clade2.1,Clade2.3,Clade 2.2,HA Phylogenetic tree generated by the neighbor-joining method using the Mega3.1 program and the boottrap value 1000, the result showing the relationships of HA genes of representative influenza A H5N1 virus from different regions. The red dots denote viruses isolated from humans in China; green dots denote viruses isolated from Viet Nam and were recommended as vaccine strains by the WHO.,NA,PB2,PB1,NP,NS,PA,M,Receptor Specificity (HA 226-228),Drug surveillance (M2 inhibitor drugs),Drug surveillance ( NA inhibitor drugs),HA connecting peptide,WHO recommended candidate H5N1 vaccine viruses for potential use as pre-pandemic vaccines,A/Hongkong/213/03 A/Vietnam/1194/04 A/Vietnam/1203/04 A/Indonesia/5/2005 A/BHG/QH/1A/2005 A/WPS/Mongolia/244/2005 A/Turkey/Turkey/1/2005 A/AH/1/2005,中國目前流行的人 禽流感病毒的特征,所有的基因序列特征均是禽源的，沒有發現禽流感病毒與人流感病毒重組或重配的證據； 所有病毒的受體特異性和血凝素抗原連接肽特性仍然是禽源的，與人流感病毒不同；,中國目前流行的人 禽流感病毒的特征,與我國禽中分離的病毒高度同源，因此推測目前我國人的感染仍然來自于禽及其污染環境中循環的禽流感病毒； 流行毒株的情況遠比我們想象的復雜，我國南方和北方流行毒株不同，南方不同的地區流行毒株不同。 所有病毒對神經氨酸酶抑制劑藥物如達菲仍然是敏感的，只有2007年一株病毒M2基因分析是對金剛烷胺類藥物耐藥的，其它毒株還對該類藥物敏感。,對疾病預防控制的意義,對檢測工作的影響 在檢測過程中要充分考慮毒株差異對檢測結果的影響。 對疫苗的研制工作的影響 如何選擇合適的疫苗株？ 對臨床治療的影響 烷胺類藥物和神經氨酸酶抑制類藥物從目前的結果看來是有效的,建立檢測方法的質量控制體系,與中國藥品生物制品檢定所合作建立以下參考品 核酸檢測陽性參比品的建立 滴定好的病毒：103-10-5TCID50