第八章 高效液相色譜分析,第一節 特點與分類,一、特點： 高壓、高效、高速、高沸點、熱不穩定有機及生化試樣的高效分離分析方法。,第二節 高效液相色譜法的主要類型及基本原理,一、液-固吸附色譜（liquid-solid adsorption chromatography） 固 定 相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5 10m的硅膠吸附劑。 流 動 相：各種不同極性的一元或多元溶劑。 基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對分子質量中等的油溶性試樣，對具有 官能團的化合物和異構體有較高選擇性。 缺 點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾。,二、液-液分配色譜（liquid- liquid partition chromatography）,固定相與流動相均為液體（互不相溶）； 基本原理：組分在固定相和流動相上的分配； 流 動 相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極 性小于固定液的極性（正相 normal phase），反之，流 動相的極性大于固定液的極性（反相 reverse phase）。 正相與反相的出峰順序相反； 固 定 相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用； 化學鍵合固定相：（將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠 （擔體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。,三、離子交換色譜（ion-exchange chromatography）,固 定 相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂； 流 動 相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離 子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液； 基本原理：組分在固定相上發生的反復離子交換反應；組分與離子交換 劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關。 親和力大，保留時間長； 陽離子交換：RSO3H+M+=RSO3M+H+ 陰離子交換：RNR4OH+X-=RNR4X+OH- 應 用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。,四、離子色譜（ion chromatography）,離子色譜是在20世紀70年代中期發展起來的一中技術， 其與離子交換色譜的區別是其采用了特制的、具有極低交換 容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術和 電導檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。 有關內容將在第十章第六節中講授。,五、離子對色譜（ion pair chromatography）,原理：將一種（或多種）與溶質離子電荷相反的離子（對離子 或反離子）加到流動相中使其與溶質離子結合形成疏水 性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配； 陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十 六烷基三甲銨作為對離子； 陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子； 反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子 Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離 子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y+X - 后；在兩相間分配。,六、排阻色譜色譜 （size- exclusion chromatography）,固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)； 原 理：按分子大小分離。小分子可以擴散 到凝膠空隙，由其中通過，出峰 最慢；中等分子只能通過部分凝 膠空隙，中速通過；而大分子被 排斥在外，出峰最快；溶劑分子 小，故在最后出峰。 全部在死體積前出峰；可對相對分子質 量在100-105范圍內的化合物按質量分離。,七、親和色譜（Affinity chromatograph）,原理：利用生物大分子和固定 相表面存在的某種特異性親和 力，進行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種 具有一般反應性能的所謂間隔 臂(環氧、聯胺等)，再連接上配 基(酶、抗原等)，這種固載化的 配基將只能和具有親和力特性 吸附的生物大分子作用而被保 留。改變淋洗液后洗脫。,第三節 固定相與流動相,一、液相色譜固定相（stationary phases of LC）,1. 液-液分配及離子對分離固定相 （1）全多孔型擔體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用 100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多 見；現采用10m以下的小顆粒，化學鍵合制備柱填料；,（2）表面多孔型擔體 （薄殼型微珠擔體）3040m的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 2m的多孔硅膠。 表面積小，柱容量底；,（3）化學鍵合固定相,化學鍵合固定相: 目前應用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用最廣； c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN,化學鍵合固定相的特點,1）傳質快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質快； 2）壽命長，化學鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊； 3）耐水、耐光、耐有機溶劑，穩定； 4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性； 5）有利于梯度洗脫；,存在著雙重分離機制： (鍵合基團的覆蓋率決定分離機理) 高覆蓋率：分配為主； 低覆蓋率：吸附為主；,2、液-固吸附分離固定相,種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等； 結構類型：全多孔型和薄殼型； 粒度：510 m。,3.離子交換色譜分離固定相,結構類別： （1）薄殼型離子交換樹脂 薄殼玻璃珠為擔體，表面 涂約1%的離子交換樹脂； （2）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵 合型（鍵合離子交換基團） 樹脂類別： （1） 陽離子交換樹脂（強酸 性、弱酸性） （2） 陰離子交換樹脂（強堿 性、弱堿性）,4. 空間排阻分離固定相,（1）軟質凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網狀結構； 水為流動相。適用于常壓排阻分離。 （2）半硬質凝膠 苯乙烯-二乙烯基苯交聯共聚物，有機凝膠； 非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑 （3）硬質凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學穩定性、熱穩定性好、機械強度大，流動相性質影響小， 可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。,二、液相色譜的流動相（mobile phases of LC）,1.、流動相特性 （1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動 相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極 性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正 相柱。 （3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液 液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上 的出峰順序相反。,2.、流動相類別,按流動相組成分：單組分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙 腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調節流動 相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。,3、 流動相選擇,在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若 組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保 留時間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環己烷己烷煤油(最小),4.、選擇流動相時應注意的幾個問題,（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累 積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。 （2）避免流動相與固定相發生作用而使柱效下降或損壞柱 子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。 （3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產生沉淀并 在柱中沉積。 （4）流動相同時還應滿足檢測器的要求。當使用紫外檢測 器時，流動相不應有紫外吸收。,第四節 影響色譜峰擴展及色譜峰分離的因素,一、影響分離的因素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中, 液體的擴散系數僅為氣體的萬分之 一，則速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計， 即： H=A+Cu 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。,1）液體的黏度比氣體大一百倍， 密度為氣體的一千倍，故降低傳質 阻力是提高柱效主要途徑。 2）由速率方程，降低固定相粒度 可提高柱效。 3）液相色譜中，不可能通過增加 柱溫來改善傳質，恒溫。 4）改變淋洗液組成、極性是改善 分離的最直接的因素。,二、 流速,流速大于0.5 cm/s時,Hu曲線 是一段斜率不大的直線。降低流 速，柱效提高不是很大。但在實際 操作中，流量仍是一個調整分離度 和出峰時間的重要可選擇參數。,三、 固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。,第五節 高效液相色譜儀,高效液相色譜儀的結構示意見圖，一般可分為4個主要部分：高壓輸液系統，進樣系統，分離系統和檢測系統。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數據處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。,一、高壓輸液系統 由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。對于一個好的高壓輸液泵應符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩，可調范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。恒流泵特點是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無關；恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統阻力而變化，故保留時間的重視性差，它們各有優缺點。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機械泵，它又分機械注射泵和機械往復泵兩種，應用最多的是機械往復泵。,二、進樣系統,高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進樣系統、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進樣系統是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進樣技術要求較嚴。,三、 分離系統色譜柱,色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長530cm，內徑為45mm，凝膠色譜柱內徑312mm，制備往內徑較大，可達25mm 以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。 柱子裝填得好壞對柱效影響很大。對于細粒度的填料（20m）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內，經沖洗后，即可備用。,四、檢測系統,在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等。現將常用的檢測器介紹如下:,1、紫外檢測器 2、熒光檢測器 3、示差折光率檢測器 幾乎所有物質都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測器是一種通用型檢測器。靈敏度可達10-7gcm-3。主要缺點是對溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 4、電導檢測器 5、 附屬系統 它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動進樣、餾分收集以及數據處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置 .,第七節 高效液相色譜分離類型選擇,第八節 毛細管電泳簡介,在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質的不同，遷移速率不同，可實現分離。,1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質混合液分離出白蛋白和、球蛋白； 發現樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定； 第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學獎；,二、經典電泳分析,利用電泳現象對某些化學或生物物質進行分離分析的方法和技術叫電泳法或電泳技術。 按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳； 傳統電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發生了根本變革，迅速發展成為可與GC、