肇慶大華農生物藥品有限公司,廣東省實驗動物監測所,廣東大華農動物保健品股份有限公司,2011年11月,禽流感動物模型、免疫機理及疫苗研制與推廣應用,立項背景,總體思路,主要技術內容,主要創新點,匯 報 提 綱,五,六,三,二,一,四,七,相關知識產權與獲獎勵情況,主要技術經濟指標與推廣效益,主要完成人對項目的貢獻,禽流感的危害,經濟損失巨大,危害人類健康,影響國家形象 和社會穩定,2005年11月8日，溫家寶在黑山防治高致病性禽流感醫療站看望醫療、防疫人員。,一 立項背景（1）,迄今為止，全世界已有超過 4億只家禽染病死亡或慘遭撲殺，造成的經濟損失高達200 億美元,我國2004年、05年、06年大規模爆發禽流感，養禽業損失150億美元以上,世界衛生組織（）發出警告，一場全球性的流感大流行將會導致200萬700萬人命喪黃泉,人們心理恐慌，不敢吃雞，家禽業受損，出口受阻，旅游業受挫，行業經濟全面受到沖擊，影響社會穩定,糧農組織的資料顯示，H5N1高致病性禽流感疫情于2003年爆發后，在全球己感染565人，導致331人死亡。,今年9月，聯合國糧食及農業組織(FAO)官員盧布羅夫日前發出警告，一種致命的“H5N1”高致病性禽流感變種病毒在越南出現。現有的所有疫苗對該病毒均無效果。,1、我國地域遼闊，候鳥的遷簁致使禽流感長期存在，加劇防疫的難度。 2、禽流感毒株變異快，對疫苗防控技術提出新的挑戰。 3、動物禽流感疫苗生產工藝落后，標準化水平低，亟待改進。 4、研究人禽流感疫苗和藥物缺乏哺乳動物模型，有待摸清和建立哺乳動物的免疫機理。,針對以上問題，進行了“禽流感動物模型、免疫機理及疫苗的研究”,肌肉變綠,一 立項背景（2）,禽流感防治存在的問題,二 總體思路,1、通過蛋白重組技術，建立禽流感疫苗產業化的基礎種毒和疫苗毒株，研制高致病性多變異型的高效疫苗，用于動物禽流感的防控。 2、利用造模毒株建立哺乳動物模型,為人禽流感疫苗和藥物研究提供技術支持。 3、研究新的生產工藝，制定新的標準，為禽流感疫苗產業化提供檢驗標準和制造標準。,三 主要技術內容,三 主要技術內容（1）,1、制備禽流感毒株,篩選造模毒株,確定鵝源禽流感H5N1病毒(A/Goose/Guangdong/NH/2003)是適宜的毒株，不必經哺乳動物細胞適應，利用雞胚內擴增病毒后即可感染哺乳類實驗動物，并在體內增殖，表現出與人禽流感相似的臨床病癥。,篩選疫苗毒株,最終選取H5N1（Re-1/4/5）、H9（SS）和(SS/94)作為制備疫苗毒株，這些毒株毒力弱、免疫原性好，能突破母源抗體干擾，生產種毒各項性能指標領先。,三 主要技術內容（2）,2、研究建立哺乳動物模型及模型指標,（1） 利用造模毒株建立了近交系BALB/c小鼠和封閉群ICR小鼠兩個小鼠模型。確定了近交系BALB/c小鼠和封閉群ICR小鼠的接種劑量100uL ，可使感染小鼠死亡率達到73%；通過不同接種途徑的研究，確定鼻腔接種后感染小鼠出現明顯的禽流感臨床疾病過程。,同時確定了小鼠模型的臨床癥狀、死亡率、病理變化、病毒復制、免疫反應等方面指標要符合人類感染禽流感疾病的基本特征,（2） 確定用“環甲膜穿刺術”經氣管接種為猴呼吸道接種方式，建立了恒河猴模型。該方法可以將接種物直接接種到肺內，操作技術簡單，定量準確，動物損傷較小，不需較高防護設備。,同時確定了恒河猴模型的臨床癥狀、體溫、呼吸頻率、感染器官、抗體水平、外周血白細胞的動態變化、外周血T 淋巴細胞及其亞群的動態變化、免疫因子、病理變化方面的指標，要與人禽流感疾病相似。,三 主要技術內容（3）,3、研究禽流感免疫機理,小鼠模型免疫機理,（1）主要表現T細胞免疫功能損傷，這種損傷與感染病程的發展和轉歸相一致，細胞免疫功能指標下降時期也是病情嚴重時期。到達恢復期各指標漸恢復正常。T細胞免疫功能低下是免疫病理改變之一。 （2）細胞因子表達失去平衡或過多的表達，都可能對宿主產生免疫病理損傷，推測這是H5N1禽流感引起哺乳動物嚴重疾病的另一重要致病機制。,恒河猴模型免疫機理,主要表現為外周血淋巴細胞數和一些T淋巴細胞亞群在第1天出現一過性下降，T 淋巴細胞亞群CD3T淋巴細胞、CD3CD4+T淋巴細胞和CD3CD8+T 淋巴細胞也在感染的第1 天出現一過性的下降，感染后第7天出現抗體，并逐漸升高，11天后達到最高，至90天仍維持較高水平。抗H5N1抗體能有效保護并減輕病毒對機體的再次攻擊，抑制病毒增殖，為人禽流感疾病的免疫接種或抗體治療提供了直接依據。,三 主要技術內容（4）,4、研制禽流感系列疫苗,建立生產種子庫,研究質量控制關鍵點,將基礎毒種經SPF雞胚復壯、增殖與傳代，建立種子批，經病毒含量、血凝特性、毒力、安全性、免疫原性、特異性、純粹檢驗等試驗檢驗均符合要求。同時，定期對不同代次的基礎種毒和生產用種毒對免疫原性相關基因HA和NA進行測序并分析其序列是否變異，以確保種毒不發生變異。,（1）確定多聯疫苗的質量控制關鍵點為“抗原濃縮”和“乳化”技術； （2）通過比較Millipore的橫向切流、中空纖維、連續離心等進行濃縮抗原的方法，最終確定了抗原濃縮（23倍）是免疫保護效果與單苗一致的關鍵工藝。 （3）研究不同乳化設備對乳化效果的影響，最終確定選擇了進口乳化設備是最佳乳化工藝的關鍵。按照該工藝生產的疫苗，乳化顆粒均勻，穩定性好，疫苗中抗原釋放速度合理。該種疫苗在2-8的保存期超過15個月，疫苗免疫雞后持續期超過5個月。,在實驗室研制、中試研制取得成功的基礎上，向農業部申報新獸藥證書和生產批準文號，本項目成功研制并獲得2個新獸藥證書和5個生產批文：H5+H9(N28+SS)、ND+IB+H9（La Sota+M41+SS/94)、H5N1（Re-1)、 H5N1（Re-5)、 H5N1（Re-5+ Re-4)、H9（SS),中試生產及臨床應用,申報新獸藥證書和生產批文,在實驗室試制取得成功的基礎上，在生產車間按照制定的制造及檢驗試行規程連續生產不少于3批，經檢驗合格后，申報獲得臨床批文，對不同品種普通雞免疫，免疫數量不少于20000只，通過觀察免疫后的臨床癥狀和檢測抗體水平，確定試制產品安全有效，同時最終確定免疫劑量、保存條件和保存期，建立質量標準。,4、研制禽流感系列疫苗,三 主要技術內容（6）,5、研究新工藝、新標準,（1）采用多級篩選、保證抗原質量： 胚蛋、孵化前期、后期、接種后和收獲前均對不合格的胚蛋進行挑除； （2）篩選優化疫苗配方，解決了免疫后出現疫苗殘留、腫塊、肌肉變綠等不良反應； （3）對疫苗乳化顆粒大小進行了監控，疫苗乳化顆粒大小為0.2-3微米；極大地延長了疫苗保存期（2年），遠高于國家標準（1年）。,提出了原材料的來源和質量要求,改進生產工藝,（1）經過研究最終確定采用SPF或非免胚蛋培養病毒，能極大地提高病毒滴度并降低了外源病毒的污染； （2）研究、篩選國內外油佐劑，最終確定采用進口佐劑，相對傳統生產工藝疫苗免疫后，HI抗體水平提高1-2滴度。,四 主要創新點,四 主要創新點（1）,1、在國內首次研究哺乳動物禽流感免疫機理，率先建立禽流感感染模型及模型指標。,項目查新結論,除本項目的相關研究人員發表的論文外，未見到國內和國外有與本委托項目“禽流感H5N1病毒初次和再次感染中免疫機理的實驗研究”中較早且系統測定禽流感H5Nl病毒的哺乳動物BABL/C小鼠模型的CD3+T、CD4+T、CD8+T細胞免疫和IL-2、IL-4、IL-10、 IL-18、TNF-與IFN-細胞因子變化的創新點相同的文獻報道，創新點相同的文獻、專利和成果報道。,四 主要創新點（2）,2、發現黃酮類化合物及單抗物質有效防治禽流感。,項目查新結論,除本項目的相關研究人員發表的論文外，未見到國內有與本委托項目中直接利用鵝源禽流感H5N1病毒感染哺乳動物、在未經預先適應的情況下通過鼻腔接種ICR小鼠和BALB/c小鼠或通過“環甲膜穿刺術”經氣管注射感染恒河猴的造模方法、小鼠模型及恒河猴模型、模型指標等創新點相同的文獻、專利和成果報道。,植物黃酮類化合物的用途,表沒食子兒茶素沒食子酸酯微囊顆粒及其制備工藝,四 主要創新點（3）,3、研制了防控禽流感的系列疫苗,禽流感（H5+H9）二價滅活疫苗（N28+SS株）,雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯活疫苗（La Sota株+M41株+SS/94株）,四 主要創新點（4）,4、研究新工藝，制定新標準，改善行業標準。,五 主要技術經濟指標與推廣效益（1）,主要技術指標,小鼠和恒河猴模型感染禽流感病毒后，其病理癥狀應符合人類感染禽流感疾病的基本特征，成功建立了禽流感的動物模型。 建立了抗原濃縮技術、填補了動物疫苗細菌內毒素檢測技術、突破了乳劑疫苗的顆粒度，解決了乳劑疫苗的不穩定性和分層，疫苗保護期延長至2年，完善了疫苗生產新標準。,附：疫苗質量新標準,主要經濟指標,2008-2010年項目經濟效益,（單位：萬元/萬美元）,五 主要技術經濟指標與推廣效益（2）,2003-2010年共銷售禽流感疫苗156.24億羽份，年均增長率34%；實現銷售收入11.44億元，年均增長28%。,五 主要技術經濟指標與推廣效益（3）,主要經濟指標,2003-2010年禽流感疫苗銷售量（億羽份）,2003-2010年禽流感疫苗銷售收入（萬元）,08-10年H5亞型禽流感疫苗推廣應用情況（萬羽份）,五 主要技術經濟指標與推廣效益（4）,越南注冊證,埃及注冊證,08-10年禽流感疫苗出口產品情況（萬羽份）,五 主要技術經濟指標與推廣效益（5）,禽流感疫苗是防控疫情的關鍵，為養禽業的生產安全保駕護航。控制疫情發生，降低動物對人感染的風險。 近3年銷售禽流感疫苗47.33億毫升，減少禽類捕殺損失1154億元，節省治療費用5億元 H5：69.95億羽份3斤/只5.5元/斤=1154.18億元 H9：24.7億羽份（0.3-0.07）元/只=5.68億元 保證養禽業健康發展，增加農民收入，推進“三農”工作實施。,社會效益,五 主要技術經濟指標與推廣效益（6）,六 相關知識產權與獲獎勵情況（1）,獲得發明專利2個：-植物黃酮類化合物的用途（授權號：ZL 200410074592.8）； -表沒食子兒茶素沒食子酸酯微囊顆粒及其制備工藝（授權號： ZL 200710165270.8） 獲得新藥證書2個：-禽流感(H5+H9)二價滅活疫苗 證號： （2006）新獸藥證字33號； -雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯滅活疫苗（La Sota株+M41株+SS/94株） 證書號： （2011）新獸藥證字15號 獲得生產批文5個：-禽流感滅活疫苗（H9亞型，SS株） 證號:獸藥生字（2011）190032080； -雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）三聯滅活疫苗（La Sota株+M41株+SS/94株） 證號:獸藥生字（2011）190032168 -重組禽流感病毒滅活疫苗（H5N1亞型，Re-1株) 證號:獸藥生字（2011）190022098 -重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗（H5N1，Re-5株+Re-4株） 證號:農醫藥便函200927號 -禽流感油乳劑滅活疫苗（H5亞型，N28株) 證號:獸藥生字（2006）190022077,共發表論文共計33篇，其中S