016 前 言本標準代替008食品中泛酸的測定。本標準與008相比,主要變化如下:標準名稱修改為“食品安全國家標準 食品中泛酸的測定”;增加了高效液相色譜方法;修改了食品的前處理方法;增加了檢出限和定量限。0161 食品安全國家標準食品中泛酸的測定1 范圍本標準規定了食品中泛酸和泛酸鈣的測定方法。本標準第一法適用于食品中泛酸的測定,第二法適用于營養素補充劑類保健食品和配方食品中泛酸(鈣)的測定。第一法 微生物法2 原理泛酸是植物乳桿菌長所必需的營養素,在一定控制條件下,將植物乳桿菌液接種至含有試樣液的培養液中,培養一定時間后測定透光率(或吸光度值),根據泛酸含量與透光率(或吸光度值)的標準曲線計算出試樣中泛酸的含量。3 試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為6682規定的二級水。酸(乙酸(氧化鈉(化鈉(酸鈉(酸氫鉀(酸氫二鉀(水合乙酸鈉(水合磷酸二氫鉀(水合硫酸鎂(水合硫酸亞鐵(水合硫酸錳(2O)。羥甲基氨基甲烷(萄糖(苯(水乙醇(離子交換樹脂:粒度38m75m。0162 性磷酸酶:酶活力23U/g。子肝臟丙酮提取物干粉(酶活力g。白胨:含氮量10%。母提取物:含氮量10%。脂。酸溶液():水稀釋至1000勻。酸鈉溶液():水溶解并稀釋至1000勻。酸溶液(1):吸取83水稀釋至1000勻。酸浸泡液:吸取100 氫氧化鈉溶液(1):稱取40水溶解并稀釋至1000勻。氧化鈉溶液():稱取4水溶解并稀釋至1000勻。水至1000勻。貯存于24冰箱中,可保存2周。理鹽水:稱取9水溶解并稀釋至1000勻。臨用前預先滅菌,于121高壓滅菌10 乙醇溶液(20%):量取2000 碳酸鈉溶液():水溶解并稀釋至1000勻。酸氫鉀溶液():稱取2水溶解并稀釋至1000勻。性磷酸酶溶液:稱取2水溶解并稀釋至100用現配,24冰箱預冷?；?稱取100于錐形瓶中,加入1于振蕩器上充分振搖10鋪有濾紙的布氏漏斗過濾。轉回錐形瓶,再加入1濾。加入1濾,重復用水洗滌10次。逐滴加入4冰箱保存,2天內用完。子肝臟提取液:配制此試劑前一天將所用容器放入24冰箱中冷藏過夜。稱取30入研缽中,冰浴條件下分兩次加入300入具塞離心管中,蓋好塞后充分振搖,凍10上清液轉至500150,放入冰浴中混勻5混合液倒入離心管中,3000r/上清液移入另一50020冷凍10加150,放入冰浴中混勻5混合液倒入離心管中,3000r/上清液分裝于具塞試管中(每管大約3凍保存。用前于24冰箱內化凍并保存至用時。鹽溶液:分別稱取25水溶解并稀釋至500勻。加入14冰箱可保存1年。鹽溶液:分別稱取10水溶解并稀釋至5005滴鹽酸,24冰箱可保存1年。脂培養基:按表1稱取或吸取各試劑,加水至100合,沸水浴加熱至瓊脂完全溶化。趁熱用1鹽酸溶液和/或1快分裝,根據試管內徑粗細加入3面高度不得低于2上棉塞,121高壓滅菌150163 置,待冷卻后于冰箱內保存,備用。表1 酸測定用培養液:可按附錄可直接由試劑公司購買效力相當的泛酸測定用培養基,用前按說明書配制。準品18純度99%。酸標準儲備溶液(水溶解并轉移至10001000水定容至刻度。儲存于棕色瓶中,加入3滴5滴甲苯,于24冰箱中可保存2年。酸標準中間液(入1000水定容至刻度。加入3滴5滴甲苯于24冰箱中可保存1年。酸標準工作溶液(20ng/水定容至刻度,混勻。臨用前現配。4 平:溫培養箱:371。力蒸汽消毒器:121。渦振蕩器。心機:轉速3000r/種針和接種環。4.7 度外凈工作臺。聲振蕩器。0164 5 種植物乳桿菌備菌種的制備將菌種植物乳桿菌接至瓊脂培養基中,在371恒溫箱中培養20h24h,連續傳種2次3次。取出后放入24冰箱作為儲備菌株保存。每月至少傳代一次,不宜超過25代。試驗前將儲備菌株接種至瓊脂培養基中,371恒溫培養箱中培養20h24于接種液的制備。注:保存數周以上的儲備菌株,不能立即用作接種液制備,試驗前宜連續傳種2代3代以保證細菌活力。種液的制備試驗前一天,取2裝于2支5好棉塞,于121高壓滅菌15卻后用接種環將活化的菌株轉種至2支種子培養液中,于371恒溫培養箱中培養20h24h。取出后3000r/上清液,無菌操作下用已預先滅菌的生理鹽水淋洗2次,3000r/上清液。再加入3蕩混勻,制成接種液,立即使用。6 分析步驟注:樣制備谷薯類、豆類、乳粉等試樣需粉碎、研磨、過篩(肉、蛋、堅果等用勻質器制成食糜;果蔬、半固體食品等試樣需勻漿混勻;液體試樣用前振搖混合。4冰箱可保存1周。接提取法形態為顆粒、粉末、片劑、液體的營養素補充劑或強化劑、預混料,添加了泛酸鈣的配方食品或保健食品可采用直接提取法。準確稱取適量試樣(m),g;液態試樣5g10g,入100入80塞,超聲振搖提取4水定容至1001)。解法一般谷薯類、肉蛋乳類、果蔬菌藻類、豆及堅果類等食品試樣宜采用酶解提取法。解:準確稱取適量試樣(m,般谷薯類、肉類、蛋類、豆類及其制品稱取1g5g;新鮮果蔬、乳及其制品稱取5g10g。轉入至100100蕩混勻。于121高壓條件下水解15卻至室溫,0165 至100水定容至刻度(過濾。解:準確吸取適量試樣濾液(2)至25水至105冰浴條件下,心混勻試管,避免混合物黏附于試管壁,加1滴甲苯,371溫箱中溫育過夜(8加水至203),過濾。調節取適量的試樣酶解液(4)于25水至205)。另取一試管加入5法加入碳酸氫鈉溶液、堿性磷酸酶溶液、鴿子肝臟提取液酶液及溫育過夜,:以谷物、乳粉等為基質的配方食品如需計量基質本底泛酸含量,可采用酶解法提取。釋根據試樣中泛酸含量用水對試樣提取液進行適當稀釋(F),使稀釋后試樣提取液中泛酸濃度約為20ng/定系列管制備所用試管使用前洗刷干凈,用水煮沸30干后放入鹽酸浸泡液中浸泡2h,經170烘3 試樣和酶空白系列管取4支試管,x),勻。 當于標準系列管中泛酸含量為000000000000勻。為保證標準曲線的線性關系,應制備2套3套標準系列管,繪制標準曲線時,以每個標準點的均值計算。菌將所有測定管塞好棉塞,于121高壓滅菌15種和培養待測定系列管冷卻至室溫后,在無菌操作條件下向每支測定管滴加接種液50L。塞好棉塞,置于371恒溫培養箱中培養16h20h,直至達到最大混濁度,即再培養2吸光度值)無明顯變化。另準備一支標準0管(含0接種作為0對照管。定將培養好的標準系列管、試樣和酶空白系列管用漩渦混勻器混勻。用厚度為1550未接種的0對照管調節透光率為100%(或吸光度值為0),依次測定標準系列管、試樣和酶空白系列管的透光率(或吸光度值)。如果0對照管有明顯的細菌增長,或者與0對照管相比,標準0管透光率在90%以下(或標準系列管透光率最大變化量40%(0166 化量說明可能有雜菌或不明來源的泛酸混入,需重做試驗。注:泛酸測定適宜的光譜范圍54060準曲線:以標準系列管泛酸含量為橫坐標,每個標準點透光率(或吸光度值)均值為縱坐標,繪制標準曲線。樣結果計算:從標準曲線查得試樣和酶空白系列管中泛酸的相應含量(x),如果每個試樣的4支試樣系列管中有3支以上泛酸含量在100按照式(1)計算每毫升試樣稀釋液中泛酸濃度(),各管之間相對偏差小于15%,則可繼續按式(2)或式(3)式(5)進行結果計算,否則需重新取樣測定。試樣稀釋液中泛酸濃度按式(1)計算:=(1)式中: 試樣稀釋液中泛酸濃度,單位為納克每毫升(ng/x從標準曲線上查得測定系列管中泛酸含量,單位為納克(制備試樣系列管時吸取的試樣稀釋液體積,單位為毫升(采用直接提取法的試樣中泛酸含量按式(2)計算:X=m100106(2)式中:X 試樣中泛酸含量,固態試樣單位為毫克每百克(00g),液態試樣為毫克每百毫升(00試樣稀釋液泛酸濃度平均值,單位為納克每毫升(ng/試樣提取液的定容體積,單位為毫升(F試樣提取液稀釋倍數;m試樣質量,單位為克(g);100106換算系數。采用酶解法的試樣中泛酸含量按式(3)式(5)計算:025(3)3(4)X=(2100106(5)式中:酶空白液中泛酸含量,單位為納克(0酶空白液中泛酸濃度平均值,單位為納克每毫升(ng/25酶空白液總體積,單位為毫升(試樣酶解液中泛酸含量,單位為納克(試樣稀釋液泛酸濃度平均值,單位為納克每毫升(ng/試樣調位為毫升(試樣酶解液的定容體積,單位為毫升(0167 F試樣提取液稀釋倍數;試樣調位為毫升(X 試樣中泛酸含量,固態試樣單位為毫克每百克(00g),液態試樣為毫克每百毫升(00試樣水解液的定容體積,單位為毫升(m試樣質量,單位為克(g);試樣酶解時吸取的水解液體積,單位為毫升(100106換算系數。結果如以泛酸鈣計量,算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示,結果保留三位有效數字。7 精密度一般食品在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%;營養素補充劑和強化食品在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的5%。8 其他一般食品稱樣量為500g,00g。營養強化劑類保健食品和配方食品稱樣量為200g,00g。第二法 高效液相色譜法9 原理利用泛酸易溶于水,在弱酸性至中性條件下(定的理化性質,試樣用熱水在超聲波振蕩下提取,經紫外檢測器檢測200據色譜峰的保留時間及紫外光譜圖定性,外標法定量,計算試樣中泛酸含量。10 試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為6682規定的一級水。酸(酸(酸二氫鉀(色譜純。水合硫酸鋅(腈(色譜純。粉酶:酶活力0168 酸():水稀釋定容至刻度,混勻。酸鋅溶液():水溶解并定容至100酸二氫鉀溶液():500水定容至1000酸標準溶液注:18純度99%。酸標準儲備溶液(水溶解并轉入1000容至刻度,混勻(4冰箱中可保存5d)。酸標準中間溶液(水定容至刻度。臨用前配制。酸標準工作溶液:水定容至刻度,用前配制。11 平:箱培養箱:555。聲波振蕩器。11.4 度效液相色譜儀:帶紫外檢測器或二極管陣列檢測器。12 樣制備固態試樣粉碎并混合均勻;碳酸飲料需超聲波去除二氧化碳,其他液態試樣搖勻。養素補充劑類保健食品準確稱取或量取適量試樣(m),g,液態試樣10g20g,置于50入約3050溫水超聲提取20水定容至刻度(V)。轉入離心管3000r/0液待上機測定。方食品準確稱取適量試樣(m),般固態試樣約5g,液態試樣約20g。置于100入4050溫水至30果試樣中含有淀粉,搖混勻,蓋上瓶塞,在555水浴條件下,振搖酶解12040果試樣不含淀粉,直接超聲提取20出試樣液,冷卻至室溫,硫酸鋅溶液,充分混合。轉入50水定容至刻度并充分混勻后,轉入離心管3000r/0169 50液待上機測定。釋必要時,試樣測定液用水進行適當的稀釋(F),使試樣測定液中泛酸濃度在1g/2g/譜柱:徑5m,250具有同等性能的色譜柱。溫:28外檢測器:檢測波長:210動相:磷酸二氫鉀溶液+乙腈=95+5。速:樣量:10準曲線測定按照已經確立的色譜條件,將泛酸標準工作液依次進行色譜分析(標準色譜圖見附錄B),記錄標準出峰時間、色譜峰高(或峰面積)。以標準工作液濃度為橫坐標,峰高(或峰面積)為縱坐標,繪制標準曲線。樣溶液的測定取試樣測定液按照色譜條件進行色譜分析,根據試樣峰高(或峰面積)從標準曲線中查得相應的泛酸濃度()。13 分析結果的表述試樣中泛酸的含量按式(6)計算:X=V001000(6)式中:X 試樣中泛酸含量,固態試樣單位為毫克每百克(00g),液態試樣為毫克每百毫升(00從標準曲線上查得試樣測定液中泛酸的濃度,單位為微克每毫升(g/V試樣測定液總體積,單位為毫升(F試樣測定液稀釋倍數;m試樣質量,單位為克(g);1001000換算系數。結果如以泛酸鈣計量,算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示,結果保留三位有效數字。01610 14 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的5%。15 其他當稱樣量為500g,00g。01611 附 錄 酸(氧化鈉(性炭: 甲苯(酸腺嘌呤(2酸鳥嘌呤( 尿嘧啶(611黃素(酸硫胺素(物素(酸(液:。氨基苯甲酸(克酸(酸吡哆醇(水乙醇(醇溶液(1+3)。山梨酯溫水葡萄糖(水合乙酸鈉(維生素酪蛋白(氧化鈉溶液(10):稱取40100 氫氧化鈉溶液(1):稱取4100 鹽酸溶液(3):吸取250水稀釋至1000勻。酸溶液(1): 酪蛋白液:稱取50200),于121高壓水解6h。將水解物轉移至蒸發皿內,在沸水浴上蒸發至膏狀。加200此反復3次,以除去鹽酸。用1020搖約20濾。重復活性炭處理2次4次,直至濾液呈淡黃色或無色。濾液加水稀釋至1000324冰箱中可保存1年。注:每次蒸發時不可蒸干或焦糊,以避免所含營養素破壞。可直接由試劑公司購買效力相當的酸水解無維生素酪蛋白。01612 嘌呤別稱取硫酸腺嘌呤、75熱使其完全溶解后冷卻。若有沉淀產生,再加鹽酸數滴,加熱,如此反復直至冷卻后無沉淀產生為止。用水稀釋至1003滴5滴甲苯,貯存于棕色試劑瓶中,置24冰箱中可保存1年。氨酸別稱取4熱至7080,逐滴加入3鹽酸溶液,不斷攪拌,直至完全溶解為止