1、專題一 微生物培養(yǎng)技術(shù),微生物,非細胞生物：病毒,原核生物：細菌、放線菌、支原體、 立克次氏體,真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）,菌落：,單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。,細菌的營養(yǎng)類型,根據(jù)細菌所利用的能源和碳源的不同，將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。 自養(yǎng)型: 異養(yǎng)型: 腐生菌 寄生菌,光合自養(yǎng)型:光合細菌 化能自養(yǎng)型:硝化細菌,一、微生物的分離和純培養(yǎng),（3項技術(shù)1個案例）,（一）培養(yǎng)基配制技術(shù),（二）無菌技術(shù),（三）接種技術(shù),案例：大腸桿菌的分離和純培養(yǎng),1、培養(yǎng)基定義：（課本第2頁）,2、營養(yǎng)構(gòu)

2、成：,環(huán)境條件：pH、氧氣、二氧化碳、滲透壓等,（一）培養(yǎng)基配制技術(shù),營養(yǎng)成分：水、無機鹽、碳源、氮源、生長因子,固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等 半固體培養(yǎng)基可觀察微生物的運動 液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。,（1）按物理狀態(tài)分：,固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。,3.培養(yǎng)基的分類,固體培養(yǎng)基,平板培養(yǎng)基（課本第2頁）,斜面培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基中需加入凝固劑，如瓊脂,半固體培養(yǎng)基,無運動 有運動,半固體培養(yǎng)基中也需要加入凝固劑瓊脂，但加入量少于固體培養(yǎng)基。,液體培養(yǎng)基,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,選擇培養(yǎng)基,（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基,加入青霉素的培養(yǎng)基:抑制細菌和放線菌

3、的生長， 分離酵母菌、霉菌等真菌。,不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌,定義（課本第7頁）,舉例：,加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌,鑒別培養(yǎng)基,根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物。,例如：在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來 鑒別大腸桿菌。 如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍 結(jié)合，使菌落呈藍紫色，并帶有金屬光澤。 (課本15頁),用化學成分已知的化學物質(zhì)配成的，因成分明確，常用于分類、鑒定等 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。,合成培養(yǎng)基:,天然培養(yǎng)基：,（3）按成分分：合成培養(yǎng)

4、基和天然培養(yǎng)基,用化學成分不明確的天然物質(zhì)配成的，如血清、組織提取液等,稱量：準確地稱取各種成分。牛肉膏比較黏稠， 可以用玻棒挑取，放在稱量紙上稱量。牛 肉膏和蛋白胨都容易吸潮，稱量時動作要 迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋。,4.培養(yǎng)基的配制步驟（第8頁）,（1）.計算:根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的 比例，計算配制100mL的培養(yǎng)基 時，各種成分的用量。 （參考課本83頁培養(yǎng)基配方）,（以牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基為例）,（2）.溶化： 加水加熱熔化牛肉膏 將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯加入少量的 水，加熱。當牛肉膏溶化并與稱量紙分 離后，用玻棒 取出稱量紙。 加入蛋白胨和氯化鈉，用玻棒攪拌，使其

5、溶解； 加入瓊脂； 用蒸餾水定容到100mL。 整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。,（3）.調(diào)節(jié)pH,（4）.分裝、包扎,（5）.滅菌,（6）倒平板,待培養(yǎng)基冷卻到50 左右時，在酒精燈附近倒平板。,倒平板,在火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞； 右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰； 左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培 養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋。 待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。,倒平板技術(shù),（二）無菌技術(shù),無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。,、消毒,（1）定義：使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體 表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生

6、物（不 包括芽孢和孢子）,A、煮沸消毒法:100煮沸5-6min B、巴氏消毒法：70-75 下煮30min 或 80 下煮15min C、化學藥劑消毒法:用酒精進行皮膚消毒; 氯氣消毒水源 D、射線消毒法,（2）消毒的方法：,（1）定義：使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的 微生物，包括芽孢和孢子 。,2、滅菌,（2）滅菌的方法：,A、灼燒滅菌,C、高壓蒸汽滅菌： 100kPa、121 下維持 15-30min.,B、干熱滅菌： 160-170 下加熱1-2h。,（三）接種技術(shù)（課本第2頁）,1.定義,2.平板培養(yǎng)基上接種方法,平板劃線法、稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法,平板劃線的操作方法

7、連續(xù)劃線法 交叉劃線法,稀釋涂布平板法,將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。,在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。,1、微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序,（1）器具的滅菌 （2）培養(yǎng)基的配制 （3）培養(yǎng)基的滅菌 （4）倒平板 （5）微生物接種 （6）恒溫箱中培養(yǎng) （7）菌種的保存,（四）案例：大腸桿菌的分離和純培養(yǎng),（1）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,2、大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)步驟,（2)配制培養(yǎng)基：計算稱量；熔化； 調(diào)PH；分裝； 滅菌； 倒平板 （3）接種：平板劃線法；稀釋涂布平板法

8、。 （4）培養(yǎng)： 倒置，37恒溫箱，12和24h。 （5）純化培養(yǎng)：倒置，37恒溫箱，24h。 （6）菌種保藏：臨時、長期保存法。,菌種的保存,1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4冰箱保存。 2、長期保存：甘油冷凍管藏法 -20 冷凍箱保存,二、培養(yǎng)基對微生物的選擇作用,（一）、基礎知識,1、纖維素與纖維素酶,【案例】分解纖維素的微生物的分離,纖維素是一種多糖 纖維素酶是一種復合酶,（二）、篩選,1、方法：,剛果紅染色法,原理：剛果紅（CR）可以與纖維素形成紅 色復合物，當纖維素被纖維素酶分 解后，紅色復合物無法形成，出現(xiàn) 以纖維素分解菌為中心的透明圈， 我們可以通過是否產(chǎn)生透

9、明圈來篩 選纖維素分解菌。,常用的剛果紅染色法有兩種,方法一：在長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋1mg/mL的CR 溶液，1015min后，倒去CR溶液，加入 1mol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液。,方法二：配制質(zhì)量濃度為10mg/mL的CR溶液，滅菌 后，按照每200mL培養(yǎng)基加入1mL的比例加入 CR溶液，混勻后倒平板。,一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應，另一種是在倒平板時就加入剛果紅,（1）土壤取樣 （2）選擇培養(yǎng)（可省略） （3）梯度稀釋 （4）涂布培養(yǎng) （5）挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 （6）微生物培養(yǎng)（純培養(yǎng)）,（三）、實驗流程,三、測定微生物的數(shù)量,（一）測定微

10、生物數(shù)量的方法,1.直接計數(shù)法,最常用：顯微鏡直接計數(shù)法 （方法、優(yōu)點、缺點、適用條件）,一、基礎知識,2、間接計數(shù)法：,最常用的是稀釋平板計數(shù)法,稀釋平板法,稀釋涂布平板法,稀釋混合平板法,（一）測定飲用水中大腸桿菌的數(shù)目,配制培養(yǎng)基 倒平板 接種（濾膜法） 培養(yǎng) 觀察記錄,二、實踐案例,1、土壤取樣,（二）土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù),2、配制培養(yǎng)基,尿素瓊脂培養(yǎng)基,牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基,3、樣品稀釋,細菌：一般選用104 、105 、106倍的稀釋液進行培養(yǎng),放線菌：一般選用103 、104 、105倍的稀釋液,真菌：一般選用102 、103 、104倍的稀釋液,4、取樣及平板接種（涂布平板或混合平板）,在以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑， 指示劑變紅，就可以準確的鑒定該種細菌能夠分解尿素。,5、培養(yǎng)與觀察：,細菌：30370C的溫度下培養(yǎng)12d； 放線菌：25280C的溫度下培養(yǎng)57d； 霉菌：25280C的溫度下培養(yǎng)34d。,當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在30300的平板進行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目。,每克樣品中的菌數(shù)(C/ V) M C:代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù) V:代表涂布平板時所用的稀