1、第一章 基因工程的分子生物學基礎,授 課 人：余春梅 授課學院: 南通大學生命科學學院,基因工程的概念,細胞外用各種方法產生的核酸分子插入載體分子中，形成遺傳物質的新組合，最終整合摻入到本來不含這些核酸分子的宿主生物中，并進行復制繁衍。 遺傳工程、基因操作、重組DNA技術等,基因工程誕生的理論基礎,-證明了DNA是遺傳物質 -雙螺旋模型 - 遺傳密碼子的破譯 1）不同的基因具有相同的物質基礎 2）基因是可切割的 3）基因是可以轉移的 4）多肽與基因之間存在對應關系 5）遺傳密碼是通用的 6）基因可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代。,基因工程的技術基礎,工具酶：DNA連接酶 內切酶 反轉錄酶 P

2、CR技術 載體技術 基因轉移技術,第三節 基因工程中采用的主要酶類,一、序列特異的DNA限制性內切核酸酶,（一）限制性內切酶的發現 宿主細胞的限制和修飾作用,1 、宿主細胞的限制和修飾作用： 兩種不同來源的入-噬菌體K； C，能高頻感染各自大腸桿菌宿主細胞（ K株，C 株 ）。 當它們分別與其它宿主菌交叉混合培養時，感染下降數千倍。一但K 噬菌體在C株成功，由C株繁殖出K后代，能感染C株, 不能感染原來K株.,(二 )限制和修飾作用的分子機制,1大腸桿菌宿主細胞 K株，C株 ，有各自的限制和修飾系統。 1）它們均有三個連續的基因位點控制，hsdR; hsdM; hsdS. 2）hsdR編碼限制

3、性核酸內切酶-識別DNA分子特定位點，將雙鏈DNA切斷。 3）hsdM編碼產物是DNA甲基化酶-催化DNA分子特定位點的堿基甲基化反應。 4） hsdS表達產物的功能是-協助限制性核酸內切酶和甲基化酶，識別特殊的作用位點。,(二)、限制和修飾作用的分子機制,2. 入噬菌體長期生長在大腸桿菌宿主細胞 K株，C株 中， 1）宿主細胞甲基化酶，將染色體DNA和噬菌體DNA特異性保護. 2）封閉自身所產生的核酸內切酶的識別位點（修飾） 3當外來DNA入侵時，遭到宿主限制性內切酶的特異降解（限制） 4. 由于降解不完全，外來少數DNA分子在宿主細胞中繁殖過程中被宿主細胞的甲基化酶修飾，雖然是外來卻不被降

4、解。,5但喪失在原宿主細胞中的存活能力，因為接受了新宿主菌甲基化修飾的同時喪失了原宿主菌修飾的標記(一但K噬菌體在C株成功，由C株繁殖出K 后代，能感染C株, 不能感染原來 K株) 6細菌利用限制和修飾系統來區分自身DNA與外來DNA。 B株不能產生限制性內切酶，其它來源入-噬菌體可以感染B株，在B株繁殖，入-噬菌體則在 K株和 C株 受到嚴格的限制作用,(二) 限制和修飾作用的分子機制,(三) 限制性內切酶的分類,（四）限制性內切酶切割特點,1、識別位點 一般為4-8個bp的回文序列 大多數酶作用于底物DNA雙鏈，位點在識別序列中或靠近識別序列 少數酶能作用于回文序列相應DNA單鏈序列,限制

5、性內切酶切割特異位點的機理,（四）限制性內切酶切割特點,平末端： 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心，形成的DNA片段具有平末端。 黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結構，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環化起來。 5突出的黏性末端 3 突出的黏性末端,平末端的DNA片段不易重新環化,已知有兩種不同的限制酶都可產生粘性末端：,5-P 端突出：,3-OH 端突出：,同尾酶,一組來源不同識別序列各異的，但能夠切割形成相同粘性末端的核酸內切限制酶。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-

6、5,同裂酶（isoschizomers）,有一些來源不同的限制性內切酶能識別并切割相同的核苷酸靶序列，這類酶稱為同裂酶。,限制酶識別與切割的靶點序列及其隨后的連接同DNA的來源無關，即不帶有種的特異性，對各種DNA普遍適用 。 根據這一特性，才能將不同來源的DNA片段重組成新的重組體分子或是新的基因。,從生物秀網站下載,二、連接酶,（一）DNA連接酶的作用模式,1、連接酶：能夠催化兩條雙鏈DNA鏈之間形成5，3磷酸二酯鍵的酶,5末端形成DNA腺苷酸復合物,（二） DNA連接酶的兩種類型,類型 I：E. coli DNA 連接酶（只連接粘末端） 利用NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）作為能量供體，主

7、要來源于原核生物 類型 II：T4 DNA連接酶（粘末端和平末端） 利用ATP作為能量供體，主要來源于真核生物，T4噬菌體也屬于此類 在基因工程的實驗中主要用T4 DNA連接酶,（三） 條件,（1）連接所需的條件 一條DNA鏈的3末端具有一個游離的羥基（-OH），而在另一條DNA鏈的5末端具有一個磷酸基團（-P）； （2）需要有一種能源分子存在以提供羥基與磷酸基團之間形成磷酸二酯鍵時所需的能量。 大腸桿菌及其它細菌中：NAD+（氧化氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸） 動物細胞及噬菌體中： ATP,OH3,5P,（四）注意,被連接的兩條DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分，DNA連接酶并不能連接兩條

8、單DNA分子或環化的單鏈DNA分子。 DNA連接酶只能連接并封閉雙螺旋DNA分子所出現的切口（Nick），即封閉雙鏈DNA上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現的斷裂,GGTAC-OH P-C C-P HO-CATGG,5 3,3 5,GG-OH P-CC CCATGG,5 3,3 5,GGTACC CCATGG,5 3,3 5,三、激酶及堿性磷酸酯酶,堿性磷酸酯酶：除去DNA 5磷酸的酶 激酶：在DNA或RNA的5羥基(OH)端進行磷酸化的酶（作用結果是添加磷酸，可用于核酸的末端標記）,四、DNA聚合酶和RNA聚合酶,DNA聚合酶（來自大腸桿菌） 功能：53 的聚合酶活性。53外切核酸

9、酶活性， 3 5外切核酸酶 利用：53 的聚合酶活性以及53外切核酸酶活性，切口平移,Taq DNA聚合酶（來自耐熱細菌） 具有53 的聚合酶活性和3 5外切核酸酶，高度保真，產生平末端，不能進行TA克隆 測序酶：具有53 的聚合酶活性，但不具備3 5外切核酸酶的T7DNA聚合酶。 反轉錄酶：以RNA為模板合成DNA 的聚合酶,第四節 研究DNA和RNA的方法,一、核酸的分離純化 通過各種方法將生物材料破碎，釋放DNA（RNA）至溶液中，去除雜質（如用苯酚萃取蛋白質），再用乙醇沉淀核酸，通過離心，分離純化核酸，最后用低濃度鹽溶液溶解核酸。,1、細菌培養物的生長和收集 確定成分的培養基(defi

10、ned medium)，M9 不確定成分的培養基(undefined medium)， 如LB 蛋白胨：提供氨基酸和小的肽段 酵母提取物：提供氮源，糖類以及其它有機與無機營養,實例1：細菌DNA的提取,2、細胞提取物的制備 細菌細胞的屏障:細胞膜和細胞壁 物理方法與化學方法 化學方法: 溶菌酶(消化細胞壁多聚物) EDTA(螯合鈣離子, 抑制DNA酶的活性) SDS:去污劑,協助細胞壁的裂解,實例1：細菌DNA的提取,3 從細胞提取物中純化DNA 降解雜質,留下DNA(苯酚與氯仿的混合物,RNA酶) 離子交換層析,分離DNA(帶正電荷的離子交換劑) 4 DNA取樣的濃縮 乙醇沉淀(破壞了DNA

11、分子間的氫鍵) 5 DNA濃度的測量 A260/A280=1.8,實例1：細菌DNA的提取,植物葉片用液氮碾磨成細末后轉移到1.5ml離心管 加650l 在65度預熱的CTBA提取液 水浴鍋中65溫浴40分鐘后取出，靜置冷卻 加入650l苯酚：氯仿（1：1）混合液，上下顛倒混勻，靜置5分鐘 12000rpm 離心10 分鐘,實例2：植物DNA的提取,取上清液，加入2l（10mg/ml）Rnase,37 度水浴30分鐘 再抽提一次 取上清液，加入2倍體積的冷乙醇或等體積的異丙醇 輕輕搖動，待發現有白色絮狀沉淀，用牙簽挑出或6000rpm離心5分鐘 70%的乙醇洗后，涼干。,實例2：植物DNA的提

12、取,實例3 質粒DNA的制備,1 基于分子大小的分離 2 基于構象的分離 質粒有三種構型 cccDNA(共價閉環DNA)：DNA的兩條鏈都是完整的。 ocDNA(開環DNA)：只有一條鏈是完整的。 線性DNA：DNA的兩條鏈均被打開。多種細菌中存在線性的質粒DNA。但末端或是通過重復序列形成發卡結構或通過共價結合蛋白進行保護，避免核酸酶的降解。,堿變性 用CsCl-EB等密度離心,Ethidium bromide (EB),包含質粒的細胞,用溶菌酶弱化細胞壁，用NaOH和SDS溶液裂解,變性的染色體 DNA,用acidic sodium acetate 中和,染色體DNA復性 形成不溶的網狀物

13、 高濃度的acidic sodium acetate使 protein-SDS 復合物和高分子量的RNA 沉淀,ccc DNA不發生變性，以天然狀態溶解在溶液中,通過離心去除沉淀,通過乙醇或異丙醇濃縮沉淀，或用凝膠過濾方法純化質粒DNA。,二、凝膠電泳,根據DNA或RNA 分子的大小，形狀和拓撲結構，將DNA和RNA進行分離的技術。 DNA和RNA在膠上的遷移性 DNA或RNA分子帶有負電荷，在膠支持物上向正電極運動 線性DNA分子根據大小進行分離，小分子比大分子要泳動快，所以能將DNA分子進行分離 環狀DNA分子的移動受拓撲結構的影響。相同分子量的情況下，超螺旋線性缺刻或松散,二、凝膠電泳,

14、瓊脂糖凝膠 是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agaropectin）組成。 瓊脂糖凝膠電泳常用于分離、鑒定核酸，如DNA鑒定 凝膠孔徑的大小 隨著濃度的增加而變小，有效分離DNA大小范圍為0.210Kb,DNA相對分子質量標準物,水平型平板電泳槽,二、凝膠電泳,聚丙烯胺凝膠 （acrylamide，簡稱Acr）和交聯劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑作用下合成的。 凝膠孔徑的大小決定于兩者的總濃度以及比值 分辨率比較高，能區分12bp 差別的DNA/RNA分子，但只能分離幾百bp的DNA/RNA分子,

15、三、 DNA測序,鏈終止法測序 化學降解法測序（自習） 自動化測序 非常規DNA測序（焦磷酸測序，芯片測序等）,1、鏈終止法測序技術路線與要求,制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火 加入DNA多聚酶 4種脫氧核苷酸 分別加入少量4種雙脫氧核苷酸 將4種反應產物分別在4條泳道電泳 根據4個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列,A 克隆于質粒中DNA用堿或熱變性 B M13克隆單鏈DNA C 噬粒克隆DNA D PCR產生單鏈DNA,A 高酶活性 B 無53外切酶活性 C 無35外切酶活性,ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP 的3碳原子連接的是氫原子,不是羥基,三、DNA測序,2、

16、自動測序 基本原理 與鏈終止法測序原理相同,只是用不同的熒光色彩標記ddNTP,如ddATP標記紅色熒光,ddCTP標記藍色熒光, ddGTP標記黃色熒光, ddTTP標記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個泳道同時判讀4種堿基.,制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火 加入DNA多聚酶（4種脫氧核苷酸） 分別加入少量4種熒光標記的雙脫氧核苷酸 將產物在一個泳道上電泳，根據不同片段的熒光信號判讀序列,模板制備,PCR 反應（測序反應）,電泳,核酸序列閱讀,2、自動測序,2、自動測序,第五節 膜印跡和核酸雜交,Southern 印跡,第五節 膜印跡和核酸雜交 So

17、uthern 印跡,大致過程如下： (1) 提取組織中的DNA，并用內切酶消化，進行瓊脂糖凝膠電泳。 (2) 將DNA片段轉移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。 (3) 預雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。 (4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結合的探針。 (5) 通過顯影檢查目的DNA所在的位置，以及信號的強度。,放射自顯影核酸雜交過程 (photo film),Professor Sir Ed Southern, Whitley Professor of Biochemistry at the University of Oxford,.,School of l

18、ife sciences Nantong University,“Real” Southern blot (DNA-DNA blot),STAINED by Et Br,VIZUALIZED by P32,Southern 印跡的應用,限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism, RFLP） RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點堿基發生突變，或酶切位點之間發生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態性）。用于構建遺傳圖譜，分子診斷等 確定基因組中基因的拷貝數,Northern印跡的應用,Northern印跡（P17頁） 檢測基因的表達,Western 印跡,這種技術是把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支持體，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應。 應用：蛋白表達量的檢測，組織特異性蛋白定位的檢測等,一抗,二抗,抗原,第六節 鑒定特定基因轉錄物的轉錄起點,對于轉錄的起始點、終止點和基因是否具有內含子等的研究 11.1.1電子顯微鏡分析核酸分子,