促血管生成素-1對糖尿病鼠腎TSP-1和PEDF的調控機制與腎臟保護作用研究一、引言1.1研究背景糖尿病腎病（DiabeticNephropathy，DN）作為糖尿病最為常見且嚴重的微血管并發癥之一，已成為糖尿病患者致殘與致死的關鍵因素。近年來，隨著全球糖尿病患者數量的急劇攀升，DN的發病率也呈顯著上升趨勢。據統計，在糖尿病患者中，DN的發病率約為20%-40%，在一些國家或地區，DN甚至已躍居終末期腎?。‥nd-StageRenalDisease，ESRD）病因的首位。我國的情況同樣不容樂觀，DN的發病率持續上升，目前已成為ESRD的第二位原因，僅次于各種腎小球腎炎。一旦DN發展至ESRD階段，患者不僅需要承受巨大的身心痛苦，還面臨著沉重的經濟負擔，其治療難度也遠高于其他腎臟疾病。因此，深入探究DN的發病機制，尋找有效的防治措施，已成為當今醫學領域亟待解決的重要課題。目前認為，DN的發病機制極為復雜，是遺傳因素與長期高血糖等環境因素相互作用的結果。在這一過程中，腎小球血流量、腎小球濾過率及壓力增加，腎組織缺血、缺氧，蛋白非酶糖基化，多元醇途徑活化及氧化應激等多種異常情況相繼出現，且長期存在，最終導致腎小球系膜基質及基底膜合成增加同時降解減少，引發DN。盡管對DN發病機制的研究已取得了一定進展，但仍有許多未知領域有待探索，尤其是在細胞因子和信號通路方面，其具體作用機制尚不完全明確。促血管生成素-1（Angiopoietin-1，Ang-1）作為血管生成素家族的重要成員，在血管生成、血管穩定及維持血管內皮細胞功能等方面發揮著關鍵作用。正常生理狀態下，Ang-1通過與受體酪氨酸激酶Tie2結合，激活一系列下游信號通路，促進血管內皮細胞的存活、增殖和遷移，同時抑制血管通透性，維持血管的正常結構和功能。在糖尿病腎病中，腎臟血管系統發生明顯的病理改變，包括腎小球毛細血管基底膜增厚、血管內皮細胞損傷、血管通透性增加等，這些改變均與Ang-1的表達和功能異常密切相關。已有研究表明，在糖尿病腎病動物模型和患者中，腎臟組織中Ang-1的表達水平明顯降低，且其表達水平與疾病的嚴重程度呈負相關。這提示Ang-1可能在糖尿病腎病的發生發展過程中扮演著重要角色，其表達異?；蛟S是導致腎臟血管病變的關鍵因素之一。血小板反應蛋白-1（Thrombospondin-1，TSP-1）是一種多功能的細胞外基質糖蛋白，在體內廣泛表達。TSP-1具有抑制血管生成、調節細胞增殖和凋亡、促進細胞黏附和遷移等多種生物學功能。在腎臟中，TSP-1主要由腎小管上皮細胞、腎間質成纖維細胞及浸潤入腎組織的巨噬細胞等分泌。研究發現，在糖尿病腎病的病理過程中，TSP-1的表達顯著上調。高血糖狀態可通過多種信號通路誘導腎臟細胞分泌TSP-1增加，而TSP-1的過度表達又可通過抑制血管內皮細胞的增殖和遷移，誘導內皮細胞凋亡，從而抑制腎臟血管的生成，進一步加重腎臟缺血、缺氧，促進糖尿病腎病的發展。此外，TSP-1還可通過調節細胞外基質的合成和降解，促進腎小球系膜細胞的增殖和基質積聚，導致腎小球硬化和腎小管間質纖維化。因此，TSP-1在糖尿病腎病的發病機制中具有重要作用，其異常表達可能是糖尿病腎病進展的重要推動因素。色素上皮衍生因子（PigmentEpithelium-DerivedFactor，PEDF）是一種高效的內源性血管生成抑制因子，同時具有神經營養保護、調節血管通透性等多種生物學活性。PEDF主要由視網膜色素上皮細胞分泌，在眼、中樞神經系統、肝臟、腎臟等多種組織中均有表達。在糖尿病腎病中，PEDF的表達明顯減少。研究表明，PEDF可通過抑制血管內皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）的表達和活性，阻斷VEGF與其受體的結合，從而抑制血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，發揮其抗血管生成作用。此外，PEDF還可抑制轉化生長因子-β1（TransformingGrowthFactor-β1，TGF-β1）和結締組織生長因子（ConnectiveTissueGrowthFactor，CTGF）的表達，減少細胞外基質的合成和積聚，抑制腎小球系膜細胞的增殖和纖維化，從而對糖尿病腎病起到保護作用。因此，PEDF表達的減少可能導致糖尿病腎病患者腎臟血管生成異常和纖維化加重，在糖尿病腎病的發生發展中具有重要意義。綜上所述，Ang-1、TSP-1和PEDF在糖尿病腎病的發病機制中均具有重要作用，它們之間可能存在著復雜的相互作用關系，共同影響著糖尿病腎病的發生發展。深入研究它們在糖尿病腎病中的作用及相互關系，對于揭示糖尿病腎病的發病機制，尋找新的治療靶點，具有重要的理論意義和臨床價值。1.2研究目的與意義本研究旨在通過建立糖尿病腎病大鼠模型，深入探討促血管生成素-1（Ang-1）對糖尿病鼠腎中血小板反應蛋白-1（TSP-1）和色素上皮衍生因子（PEDF）表達的影響，從而進一步揭示糖尿病腎病的發病機制，為臨床治療糖尿病腎病提供新的理論依據和潛在治療靶點。糖尿病腎病作為糖尿病常見且嚴重的微血管并發癥，嚴重威脅著患者的生命健康。目前，盡管對糖尿病腎病的治療取得了一定進展，但仍缺乏有效的根治方法。因此，深入研究糖尿病腎病的發病機制，尋找新的治療靶點和干預措施，具有重要的臨床意義。Ang-1、TSP-1和PEDF在糖尿病腎病的發生發展過程中均發揮著重要作用。然而，它們之間的相互作用關系以及在糖尿病腎病中的具體調控機制尚未完全明確。通過本研究，有望揭示Ang-1與TSP-1、PEDF之間的內在聯系，為闡明糖尿病腎病的發病機制提供新的視角。同時，本研究結果可能為糖尿病腎病的治療提供新的靶點和策略，具有潛在的臨床應用價值。此外，本研究對于豐富血管生成和腎臟疾病相關的基礎理論知識也具有一定的學術意義，有助于推動相關領域的進一步發展。二、相關理論基礎2.1糖尿病腎病概述2.1.1糖尿病腎病的定義與發病機制糖尿病腎病是糖尿病最常見且嚴重的微血管并發癥之一，是由于糖尿病代謝異常引發的腎小球硬化，并伴有尿蛋白增加、腎功能進行性減退的一種疾病。糖尿病腎病的發病機制十分復雜，是多因素共同作用的結果，至今尚未完全明確。以下將從高血糖、代謝紊亂、血流動力學改變、氧化應激、遺傳因素等多個方面對其發病機制進行闡述。高血糖作為糖尿病腎病發病的始動因素，在糖尿病腎病的發生發展過程中起著關鍵作用。長期高血糖狀態可通過多種途徑導致腎臟損傷。一方面，高血糖可使腎臟局部糖代謝異常，激活多元醇通路。該通路中，葡萄糖在醛糖還原酶的作用下轉化為山梨醇，山梨醇不能自由通過細胞膜，在細胞內大量堆積，導致細胞內滲透壓升高，細胞腫脹、變性，最終引起腎臟細胞損傷。另一方面，高血糖還可促使蛋白非酶糖基化反應增強，產生大量糖化終末產物（AdvancedGlycationEnd-products，AGEs）。AGEs可與腎臟組織中的多種蛋白質結合，形成不可逆的交聯產物，改變蛋白質的結構和功能。這些交聯產物可沉積在腎小球基底膜、系膜區及腎小管間質等部位，導致腎小球基底膜增厚、系膜基質增多、腎小管間質纖維化，從而影響腎臟的正常功能。此外，AGEs還可與細胞表面的特異性受體（ReceptorforAdvancedGlycationEnd-products，RAGE）結合，激活細胞內的信號轉導通路，如核因子-κB（NuclearFactor-κB，NF-κB）通路等，誘導炎癥因子、細胞因子及生長因子等的表達增加，進一步加重腎臟的炎癥反應和損傷。代謝紊亂在糖尿病腎病的發病機制中也起著重要作用。糖尿病患者常伴有脂質代謝紊亂，表現為血脂異常，如甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇升高，高密度脂蛋白膽固醇降低。血脂異?？赏ㄟ^多種機制導致腎臟損傷。氧化低密度脂蛋白（OxidizedLow-DensityLipoprotein，ox-LDL）具有細胞毒性作用，可直接損傷血管內皮細胞，促進單核細胞和巨噬細胞的浸潤，引發炎癥反應。ox-LDL還可刺激系膜細胞增殖，促進細胞外基質合成增加，導致腎小球硬化。此外，脂質代謝紊亂還可通過影響腎臟血流動力學、激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統（Renin-Angiotensin-AldosteroneSystem，RAAS）等途徑，間接加重腎臟損傷。血流動力學改變是糖尿病腎病發病的重要機制之一。在糖尿病早期，由于血糖升高，腎臟為了維持正常的代謝功能，會出現腎小球高灌注、高壓力和高濾過的“三高”狀態。這種血流動力學改變可使腎小球毛細血管內皮細胞受損，通透性增加，導致蛋白質濾過增加，出現微量白蛋白尿。隨著病情的進展，腎小球高灌注、高壓力和高濾過持續存在，可引起腎小球系膜細胞增生、系膜基質增多，最終導致腎小球硬化和腎功能減退。此外，血流動力學改變還可通過激活RAAS，使血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）生成增加，進一步加重腎臟的血流動力學異常和損傷。氧化應激在糖尿病腎病的發生發展過程中也發揮著重要作用。糖尿病患者體內由于高血糖、高血脂等因素的影響，可產生大量的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），如超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等。這些ROS可通過多種途徑導致腎臟損傷。ROS可直接損傷細胞膜、蛋白質和核酸等生物大分子，引起細胞功能障礙和凋亡。ROS還可激活NF-κB等信號通路，誘導炎癥因子、細胞因子及生長因子等的表達增加，促進炎癥反應和纖維化進程。此外，氧化應激還可通過抑制抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，進一步加重體內的氧化應激狀態，形成惡性循環，導致腎臟損傷不斷加重。遺傳因素在糖尿病腎病的發病中也起著一定的作用。研究表明，糖尿病腎病具有一定的家族聚集性，遺傳因素在糖尿病腎病的易感性中占20%-40%。目前已發現多個與糖尿病腎病相關的基因，如血管緊張素原基因、血管緊張素轉換酶基因、醛糖還原酶基因等。這些基因的多態性可影響腎臟對糖尿病損傷的易感性和反應性，從而參與糖尿病腎病的發病過程。然而，遺傳因素在糖尿病腎病發病中的具體作用機制仍有待進一步深入研究。除上述因素外，炎癥反應、細胞因子、生長因子等在糖尿病腎病的發病機制中也具有重要作用。炎癥反應可導致腎臟組織的免疫損傷，促進糖尿病腎病的發展。多種細胞因子和生長因子，如轉化生長因子-β1、血管內皮生長因子、結締組織生長因子等，可通過調節細胞增殖、分化、凋亡及細胞外基質合成等過程，參與糖尿病腎病的病理生理過程。這些因素相互作用、相互影響，共同促進了糖尿病腎病的發生發展。2.1.2糖尿病腎病的病理特征與臨床表現糖尿病腎病的病理特征具有一定的特異性，主要表現為腎臟肥大、腎小球基底膜增厚、系膜基質增多、腎小球硬化以及腎小管間質纖維化等。在糖尿病腎病早期，腎臟體積可增大，表現為腎臟肥大。這是由于高血糖等因素刺激腎臟細胞增殖和肥大，導致腎臟重量增加。隨著病情的進展，腎小球基底膜逐漸增厚。腎小球基底膜主要由Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖連蛋白等組成，高血糖狀態下，這些成分的合成增加且結構發生改變，導致基底膜增厚。增厚的腎小球基底膜可使腎小球濾過屏障功能受損，蛋白質濾過增加，從而出現蛋白尿。系膜基質增多也是糖尿病腎病的重要病理特征之一。系膜細胞在糖尿病腎病的發生發展過程中起著關鍵作用，高血糖、細胞因子等因素可刺激系膜細胞增殖，并合成和分泌大量的細胞外基質，如膠原、纖維連接蛋白等，導致系膜基質增多。系膜基質的增多可進一步壓迫腎小球毛細血管，影響腎小球的血流灌注和濾過功能。腎小球硬化是糖尿病腎病晚期的典型病理改變，可分為結節性腎小球硬化和彌漫性腎小球硬化兩種類型。結節性腎小球硬化表現為腎小球系膜區出現圓形或橢圓形的結節狀病變，又稱Kimmelstiel-Wilson結節，主要由系膜基質和糖化的蛋白質組成。彌漫性腎小球硬化則表現為腎小球系膜基質廣泛增多，腎小球毛細血管袢受壓、閉塞，最終導致腎小球荒廢。腎小管間質纖維化在糖尿病腎病的進展中也起著重要作用。腎小管上皮細胞在高血糖、氧化應激等因素的作用下，可發生損傷、凋亡和轉分化，轉化為肌成纖維細胞，分泌大量的細胞外基質，導致腎小管間質纖維化。腎小管間質纖維化可使腎小管萎縮，間質炎癥細胞浸潤，進一步加重腎功能損害。糖尿病腎病的臨床表現多種多樣，早期通常無明顯癥狀，隨著病情的進展，可逐漸出現蛋白尿、水腫、高血壓、腎功能減退等癥狀。蛋白尿是糖尿病腎病最早出現的臨床表現之一，也是診斷糖尿病腎病的重要依據。早期多表現為微量白蛋白尿，即尿白蛋白排泄率在30-300mg/24h之間，此時尿常規檢查蛋白常為陰性。隨著病情的進展，尿白蛋白排泄率逐漸增加，可發展為大量白蛋白尿，即尿白蛋白排泄率>300mg/24h，此時尿常規檢查蛋白可呈陽性。蛋白尿的出現不僅提示腎臟損傷的存在，還與糖尿病腎病的進展密切相關，大量蛋白尿可加速腎功能的惡化。水腫也是糖尿病腎病常見的臨床表現之一，多發生在大量蛋白尿之后。由于大量蛋白質從尿中丟失，導致血漿白蛋白水平降低，血漿膠體滲透壓下降，水分從血管內進入組織間隙，從而引起水腫。早期水腫多為眼瞼和下肢輕度水腫，隨著病情的加重，可逐漸發展為全身性水腫。此外，水腫還可能與腎臟排泄水鈉功能障礙、RAAS激活等因素有關。高血壓在糖尿病腎病患者中也較為常見，且血壓升高的程度與糖尿病腎病的進展密切相關。高血壓可進一步加重腎臟的血流動力學異常和損傷，促進糖尿病腎病的發展。糖尿病腎病患者的高血壓發生機制較為復雜，主要與RAAS激活、水鈉潴留、交感神經系統興奮、血管內皮功能障礙等因素有關。腎功能減退是糖尿病腎病的最終結局，隨著病情的進展，腎小球硬化和腎小管間質纖維化不斷加重，腎臟的濾過和排泄功能逐漸受損，導致腎功能減退。早期腎功能減退可表現為腎小球濾過率（GlomerularFiltrationRate，GFR）輕度下降，血肌酐和尿素氮水平正常。隨著病情的惡化，GFR進行性下降，血肌酐和尿素氮水平逐漸升高，最終可發展為終末期腎病，需要進行腎臟替代治療，如血液透析、腹膜透析或腎移植。除上述典型臨床表現外，糖尿病腎病患者還可能出現其他一些癥狀，如貧血、電解質紊亂、酸堿平衡失調等。貧血主要是由于腎臟分泌促紅細胞生成素減少，導致紅細胞生成不足所致。電解質紊亂和酸堿平衡失調則與腎臟排泄功能障礙有關，可表現為高鉀血癥、低鈣血癥、高磷血癥、代謝性酸中毒等。這些并發癥的出現不僅會進一步加重患者的病情，還會增加患者的死亡風險。2.2促血管生成素-1（Ang-1）2.2.1Ang-1的結構與功能促血管生成素-1（Ang-1）是血管生成素家族的重要成員，其基因定位于人類染色體8q22-23。Ang-1是一種分泌型糖蛋白，由498個氨基酸組成，相對分子質量約為70kDa。從結構上看，Ang-1包含一個N-末端的螺旋結構域、一個卷曲螺旋結構域、一個纖維連接蛋白Ⅲ型重復結構域和一個C-末端的球狀結構域。N-末端的螺旋結構域在Ang-1的二聚化過程中發揮關鍵作用，通過形成二聚體，Ang-1能夠更有效地與受體結合，從而發揮其生物學功能。卷曲螺旋結構域則參與了Ang-1與其他蛋白質的相互作用，進一步調節其生物學活性。纖維連接蛋白Ⅲ型重復結構域賦予了Ang-1一定的結構穩定性，使其在復雜的生物環境中能夠保持正常的功能。C-末端的球狀結構域是Ang-1與受體酪氨酸激酶Tie2結合的關鍵部位，二者的特異性結合是激活下游信號通路的前提。在血管生成過程中，Ang-1發揮著至關重要的作用。當機體需要生成新的血管時，如在胚胎發育、組織修復和腫瘤生長等過程中，Ang-1被分泌到細胞外環境中。Ang-1通過其C-末端的球狀結構域與內皮細胞表面的受體Tie2特異性結合，使Tie2發生自身磷酸化。磷酸化的Tie2進而激活一系列下游信號通路，如PI3K/Akt、MAPK等。這些信號通路的激活能夠促進血管內皮細胞的存活、增殖和遷移。在存活方面，激活的信號通路可以抑制細胞凋亡相關蛋白的表達，增強細胞的抗凋亡能力，從而保證內皮細胞在血管生成過程中的存活。在增殖方面，信號通路能夠促進細胞周期相關蛋白的表達，推動內皮細胞進入細胞周期，進行增殖。在遷移方面，信號通路可以調節細胞骨架的重組，使內皮細胞能夠伸出偽足，向血管生成的部位遷移。此外，Ang-1還能召集周細胞和平滑肌細胞等血管周圍支持細胞，使其與血管內皮細胞相互作用，形成穩定的血管結構。周細胞和平滑肌細胞可以分泌細胞外基質，為血管提供支撐和保護，同時還能調節血管的收縮和舒張功能，進一步維持血管的穩定性。除了在血管生成中的作用外，Ang-1還對維持血管內皮細胞的穩定具有重要意義。正常生理狀態下，血管內皮細胞之間通過緊密連接和黏附連接等結構相互作用，形成一個完整的屏障，阻止血液中的物質和細胞隨意進入組織間隙。Ang-1可以通過調節這些連接蛋白的表達和功能，維持血管內皮細胞之間的緊密連接。例如，Ang-1能夠促進緊密連接蛋白如ZO-1、Occludin和Claudin等的表達，增強內皮細胞之間的連接強度，從而降低血管的通透性。此外，Ang-1還可以抑制炎癥因子誘導的內皮細胞活化，減少白細胞的黏附和滲出，進一步維持血管內皮細胞的穩定。當血管受到損傷或炎癥刺激時，Ang-1的表達會增加，通過上述機制迅速修復受損的血管內皮，恢復血管的正常功能。2.2.2Ang-1在腎臟生理與病理中的作用在正常腎臟生理狀態下，Ang-1對于維持腎臟血管的正常結構和功能起著不可或缺的作用。腎臟是一個血管豐富的器官，腎小球毛細血管網絡和腎小管周圍毛細血管網絡共同構成了復雜的腎臟血管系統，這些血管對于維持腎臟的正常血液灌注和物質交換至關重要。Ang-1主要由腎臟的系膜細胞、腎小管上皮細胞和血管平滑肌細胞等產生。在腎小球中，Ang-1通過與內皮細胞表面的Tie2受體結合，激活下游信號通路，促進腎小球毛細血管內皮細胞的存活和增殖，維持腎小球毛細血管的正常結構和完整性。同時，Ang-1還能召集周細胞圍繞在腎小球毛細血管周圍，增強血管的穩定性。周細胞與內皮細胞之間通過細胞間連接和旁分泌信號相互作用，共同調節腎小球的血流動力學和濾過功能。在腎小管周圍，Ang-1同樣能夠促進腎小管周圍毛細血管內皮細胞的存活和功能維持，保證腎小管對物質的重吸收和分泌功能正常進行。此外，Ang-1還可以調節腎臟血管的通透性，防止蛋白質等大分子物質從血管內漏出到組織間隙，維持腎臟內環境的穩定。在糖尿病腎病的病理過程中，Ang-1的表達和功能發生了顯著變化。大量研究表明，在糖尿病腎病動物模型和患者的腎臟組織中，Ang-1的表達水平明顯降低。這種降低可能是由于多種因素導致的，如高血糖、氧化應激、炎癥反應等。高血糖狀態下，腎臟細胞內的代謝紊亂，可通過多種信號通路抑制Ang-1基因的轉錄和翻譯，從而減少Ang-1的合成。氧化應激產生的大量活性氧物質可以損傷細胞內的DNA、蛋白質和脂質等生物大分子，影響Ang-1的合成和分泌過程。炎癥反應中釋放的多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等，也可以抑制Ang-1的表達。Ang-1表達的降低會導致腎臟血管生成障礙和血管穩定性下降。在血管生成方面，由于Ang-1減少，其對血管內皮細胞存活、增殖和遷移的促進作用減弱，導致腎臟新血管生成減少，腎臟缺血、缺氧加重。在血管穩定性方面，Ang-1的不足使得周細胞與內皮細胞之間的相互作用減弱，血管壁的結構變得不穩定，血管通透性增加，蛋白質等大分子物質更容易從血管內漏出到組織間隙，進一步加重腎臟損傷。此外，Ang-1表達的降低還可能通過影響其他細胞因子和信號通路，間接促進糖尿病腎病的發展。例如，Ang-1可以調節TGF-β1等細胞因子的表達，當Ang-1減少時，TGF-β1的表達可能會增加，從而促進腎小球系膜細胞的增殖和細胞外基質的合成，導致腎小球硬化和腎小管間質纖維化。因此，Ang-1在糖尿病腎病的發生發展過程中可能起著關鍵的調節作用，其表達異?；蛟S是糖尿病腎病進展的重要因素之一。2.3血小板反應蛋白-1（TSP-1）2.3.1TSP-1的生物學特性血小板反應蛋白-1（TSP-1）是一種多功能的細胞外基質糖蛋白，在細胞生物學過程中發揮著關鍵作用。從結構上看，人類TSP-1基因定位于15q15，其編碼的蛋白分子量約為450kD，是由三條相同肽鏈以二硫鍵構成的同源三聚體。在透射電鏡下觀察，該三聚體的每條單鏈均由球狀的氨基末端、球狀的羧基末端構成，中間通過細長且易彎曲的桿狀臂相連。TSP-1的每條肽鏈可進一步細分為6個功能區，這些功能區賦予了TSP-1多樣的生物學功能。NH2-末端肝素結合區，此區域能夠與肝素硫酸鹽等物質結合，參與細胞與細胞外基質之間的相互作用。與Ⅰ型前膠原同源的片斷，這部分結構可能在維持TSP-1的整體結構穩定性以及與其他細胞外基質成分的相互作用中發揮作用。與備解素同源含3個重復序列的Ⅰ型重復區，該區域參與TSP-1與多種受體和配體的結合，進而影響細胞的黏附、遷移等過程。與表皮生長因子同源含3個重復序列的Ⅱ型重復區，這一區域可能在調節細胞生長和分化方面發揮作用。與鈣調素同源含7個結合Ca2+的重復序列的Ⅲ型重復區，包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列。RGD序列是細胞黏附的關鍵識別位點，許多細胞表面的整合素受體能夠識別并結合RGD序列，從而介導細胞與TSP-1的黏附，進而影響細胞的遷移、增殖和分化等生物學行為。COOH-末端細胞結合區，該區域與細胞表面的特定受體結合，進一步調節細胞的功能。TSP-1通過這些功能區結合位點與多種受體相互作用，如calreticulin、LDL受體相關蛋白質（LRP）、CD36、整合素和整合素相關蛋白（IAP）等。與CD36受體結合后，TSP-1可以調節細胞的脂質代謝和炎癥反應。當TSP-1與CD36結合時，能夠激活細胞內的特定信號通路，影響脂質轉運蛋白的表達和活性，從而調節細胞對脂質的攝取、代謝和儲存。在炎癥反應中，TSP-1與CD36的結合可以調節炎癥細胞的黏附和遷移，影響炎癥介質的釋放，進而對炎癥過程產生調控作用。TSP-1與整合素的相互作用則在細胞黏附和遷移過程中發揮重要作用。整合素是一類細胞表面受體，能夠與細胞外基質中的多種成分結合。TSP-1通過與整合素結合，為細胞提供了黏附的位點，促進細胞在細胞外基質上的黏附。同時，這種結合還可以激活細胞內的信號傳導通路，調節細胞骨架的重組，從而促進細胞的遷移。在胚胎發育過程中，TSP-1在心臟、肺、肝、腎、骨骼、骨骼肌和腦等組織中的表達水平較高，對組織和器官的正常發育起到了重要的調控作用。在心臟發育過程中，TSP-1參與了心臟血管的形成和心肌細胞的分化。研究表明，TSP-1基因敲除的小鼠在胚胎期會出現心臟血管發育異常，心肌細胞排列紊亂等現象，嚴重影響心臟的正常功能。在腎臟發育過程中，TSP-1對腎小球和腎小管的形成和分化具有重要意義。它可以調節腎臟細胞的增殖、遷移和分化，促進腎小球毛細血管的形成和腎小管上皮細胞的成熟。在正常成人組織中，TSP-1的分布相對較少，但在炎癥和損傷過程中，其表達會大量增加。當組織受到炎癥刺激時，巨噬細胞、成纖維細胞等細胞會分泌大量的TSP-1。TSP-1可以通過調節炎癥細胞的活性和炎癥介質的釋放，參與炎癥反應的調控。在組織損傷修復過程中，TSP-1可以促進成纖維細胞的增殖和遷移，促進細胞外基質的合成和沉積，從而有助于傷口的愈合。2.3.2TSP-1在糖尿病腎病中的作用機制在糖尿病腎病的發生發展過程中，TSP-1的表達出現顯著變化，且發揮著重要的作用。研究表明，在糖尿病腎病狀態下，高血糖、氧化應激、炎癥反應等多種因素共同作用，導致腎臟組織中TSP-1的表達明顯上調。高血糖是糖尿病腎病的重要始動因素，長期的高血糖環境可通過多種信號通路誘導TSP-1的表達增加。高血糖可激活蛋白激酶C（ProteinKinaseC，PKC）信號通路。PKC被激活后，可磷酸化一系列下游底物，其中包括一些轉錄因子，如激活蛋白-1（ActivatorProtein-1，AP-1）。AP-1等轉錄因子可結合到TSP-1基因的啟動子區域，促進TSP-1基因的轉錄，從而增加TSP-1的合成。高血糖還可通過激活多元醇通路，使細胞內山梨醇堆積，導致細胞內滲透壓升高，引起細胞損傷和功能改變，進而誘導TSP-1的表達增加。氧化應激在糖尿病腎病中也起著關鍵作用，高血糖等因素可導致體內活性氧（ROS）生成增加，引發氧化應激。ROS可以損傷細胞內的DNA、蛋白質和脂質等生物大分子，同時也可以激活一系列信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-ActivatedProteinKinase，MAPK）信號通路等。MAPK信號通路的激活可促進TSP-1基因的表達，導致TSP-1合成增加。炎癥反應也是糖尿病腎病的重要病理過程，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的釋放可刺激腎臟細胞分泌TSP-1增加。TNF-α可以與腎臟細胞表面的受體結合，激活核因子-κB（NF-κB）信號通路，NF-κB進入細胞核后，可調節TSP-1基因的轉錄，使其表達上調。TSP-1表達上調對糖尿病腎病的發展產生了多方面的影響，其中對腎臟纖維化的促進作用尤為顯著。TSP-1可以通過多種機制促進腎小球系膜細胞的增殖和細胞外基質的合成。TSP-1可與腎小球系膜細胞表面的整合素等受體結合，激活細胞內的信號傳導通路，如PI3K/Akt信號通路。PI3K被激活后，可使Akt磷酸化，活化的Akt可以促進細胞周期蛋白的表達，推動系膜細胞進入細胞周期，從而促進系膜細胞的增殖。TSP-1還可以調節轉化生長因子-β1（TGF-β1）的活性。TGF-β1是一種強效的促纖維化細胞因子，TSP-1可以與TGF-β1結合，使其從無活性的前體形式轉變為有活性的形式，從而增強TGF-β1的生物學效應?；钚缘腡GF-β1可以刺激系膜細胞合成和分泌大量的細胞外基質成分，如膠原、纖維連接蛋白等，導致系膜基質增多，促進腎小球硬化和腎小管間質纖維化。TSP-1還可以抑制基質金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）的活性，MMPs是一類能夠降解細胞外基質的酶。TSP-1通過抑制MMPs的活性，減少細胞外基質的降解，進一步加重細胞外基質的積聚，促進腎臟纖維化的發展。TSP-1在糖尿病腎病中的炎癥反應調節中也發揮著重要作用。TSP-1可以調節炎癥細胞的黏附和遷移。它可以與炎癥細胞表面的受體結合，如CD36等，促進炎癥細胞與血管內皮細胞的黏附，使其更容易穿過血管壁進入腎臟組織。TSP-1還可以調節炎癥介質的釋放。研究發現，TSP-1可以促進炎癥細胞分泌炎癥因子，如TNF-α、IL-1β等，進一步加重腎臟的炎癥反應。在糖尿病腎病中，炎癥反應的加重會導致腎臟組織的損傷加劇，促進疾病的進展。TSP-1還可以通過調節免疫細胞的功能，影響糖尿病腎病的免疫病理過程。它可以調節T淋巴細胞和B淋巴細胞的活性，影響免疫球蛋白的分泌，從而對腎臟的免疫損傷產生影響。2.4色素上皮衍生因子（PEDF）2.4.1PEDF的生物學特性色素上皮衍生因子（PEDF）是一種多功能的分泌型糖蛋白，在體內發揮著廣泛而重要的生物學作用。1989年，Tombran-Tink等首次在人胎兒視網膜色素上皮細胞的培養液中發現了PEDF，因其能夠誘導視網膜母細胞瘤細胞Y-79向成熟的神經元分化而得名。從分子結構來看，人PEDF基因定位于17號染色體短臂末端，基因全長16kb，由8個外顯子和7個內含子組成。PEDF由418個氨基酸殘基構成，相對分子量約為50kDa。其結構屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpin）基因家族，雖具有該家族典型的蛋白酶敏感的環狀結構，但卻不具備類似其他絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制蛋白水解酶活性的功能。這種獨特的結構賦予了PEDF特殊的生物學活性。在組織分布方面，PEDF具有廣泛的分布特性。在胚胎發育過程中，胎兒的視網膜色素上皮顆粒、發育中的錐細胞以及許多神經節細胞層的細胞均有PEDF的表達。在成年個體中，PEDF在中樞神經系統、眼、肝臟、睪丸、卵巢、胎盤、胰腺、前列腺等多種組織中均有表達。在眼部，PEDF主要由視網膜色素上皮細胞分泌，旁分泌至視網膜感光細胞間基質，對視網膜的分化和維持正常功能起著關鍵作用。在腎臟中，研究發現鼠類腎臟有PEDF表達，且主要表達于腎小管上皮細胞。近年來，有研究表明PEDF在腎臟的表達水平明顯高于視網膜，在腎臟主要分布于腎小球系膜和基底膜。PEDF具有多種重要的生物學功能，其中神經營養保護作用是其重要功能之一。PEDF能夠保護神經元免受谷氨酸鹽的毒性和氧化應激損害。研究表明，PEDF可保護鼠的視神經細胞，對抗過氧化氫導致的凋亡作用。此外，PEDF不僅對中樞神經系統有保護作用，對周圍神經細胞也具有保護及營養作用。它可明顯抑制星形膠質細胞的生長，完全阻斷粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激的小膠質細胞的分化，增加神經細胞的存活數量，這對于神經系統疾病的防治具有重要意義。調節血管通透性也是PEDF的重要功能之一。PEDF可以有效地緩解血管內皮細胞生長因子（VEGF）所導致的血管滲透性增高。目前認為，PEDF與VEGF之間存在一種動態平衡，共同調節血管的通透性。研究發現，PEDF的44個氨基酸結構域可起到有效的抗血管滲透作用，特別是其中的4個氨基酸（谷氨酸-101、異亮氨酸-103、亮氨酸-112、絲氨酸-115）對此活性極其關鍵。通過調節血管通透性，PEDF有助于維持組織內環境的穩定，保證組織器官的正常功能。PEDF最為突出的生物學功能是其高效的抑制血管生成作用。正常人的房水、玻璃體腔中有較高水平的PEDF，這可能是維持角膜、玻璃體等眼內組織無血管結構的主要原因。在體外實驗中，PEDF抑制血管內皮細胞移行的活性較血管抑素、內皮抑素、血小板反應蛋白-1更強，因此被認為是最有效的天然血管抑制劑。在體內，PEDF通過多種機制抑制血管生成。它可以直接抑制血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成。在新生血管內皮細胞中，PEDF啟動Fas-FasL介導的凋亡作用，使新生血管內皮細胞在權衡由PEDF啟動的凋亡作用和由誘導劑所產生的生存信號之間的強弱關系后，決定其是增殖還是發生凋亡。PEDF還可抑制內皮細胞分泌各種血管生成刺激因子，如VEGF等，從而間接抑制血管生成。2.4.2PEDF在糖尿病腎病中的作用機制在糖尿病腎病的病理過程中，PEDF的表達水平發生明顯變化，且這種變化與糖尿病腎病的發生發展密切相關。大量研究表明，在糖尿病腎病狀態下，腎臟組織中PEDF的表達顯著減少。這種減少可能是由多種因素共同作用導致的。高血糖作為糖尿病腎病的重要始動因素，可通過多種信號通路抑制PEDF的表達。高血糖可激活蛋白激酶C（PKC）信號通路，PKC的激活可導致一系列下游底物的磷酸化，其中包括一些轉錄因子，這些轉錄因子可結合到PEDF基因的啟動子區域，抑制PEDF基因的轉錄，從而減少PEDF的合成。高血糖還可通過激活多元醇通路，使細胞內山梨醇堆積，導致細胞內滲透壓升高，引起細胞損傷和功能改變，進而抑制PEDF的表達。氧化應激在糖尿病腎病中也起著關鍵作用，高血糖等因素可導致體內活性氧（ROS）生成增加，引發氧化應激。ROS可以損傷細胞內的DNA、蛋白質和脂質等生物大分子，同時也可以激活一系列信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等。MAPK信號通路的激活可抑制PEDF基因的表達，導致PEDF合成減少。炎癥反應也是糖尿病腎病的重要病理過程，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的釋放可抑制腎臟細胞分泌PEDF。TNF-α可以與腎臟細胞表面的受體結合，激活核因子-κB（NF-κB）信號通路，NF-κB進入細胞核后，可調節PEDF基因的轉錄，使其表達下調。PEDF表達減少對糖尿病腎病的發展產生了多方面的不利影響，其中對腎臟血管生成和纖維化的影響尤為顯著。在腎臟血管生成方面，PEDF作為一種強效的內源性血管生成抑制因子，其表達減少會導致對血管生成的抑制作用減弱，從而使血管內皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子的作用相對增強。VEGF可促進血管內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，導致腎臟新生血管生成增加。然而，這些新生血管結構往往不穩定，通透性增加，容易引起血液成分滲漏，導致腎臟組織水腫和炎癥反應加重。同時，新生血管的生成還可能導致腎臟血流動力學改變，進一步加重腎臟的損傷。在腎臟纖維化方面，PEDF可通過抑制轉化生長因子-β1（TGF-β1）和結締組織生長因子（CTGF）的表達，減少細胞外基質的合成和積聚，從而抑制腎小球系膜細胞的增殖和纖維化。當PEDF表達減少時，對TGF-β1和CTGF的抑制作用減弱，TGF-β1和CTGF的表達增加。TGF-β1是一種強效的促纖維化細胞因子，它可以刺激系膜細胞合成和分泌大量的細胞外基質成分，如膠原、纖維連接蛋白等，導致系膜基質增多，促進腎小球硬化和腎小管間質纖維化。CTGF也可協同TGF-β1的作用，進一步促進細胞外基質的合成和沉積，加重腎臟纖維化的發展。除了對血管生成和纖維化的影響外，PEDF還可能通過其他機制參與糖尿病腎病的病理過程。PEDF具有調節血管通透性的作用，其表達減少可能導致血管通透性增加，蛋白質等大分子物質更容易從血管內漏出到組織間隙，加重腎臟的損傷。PEDF還具有抗氧化應激和抗炎作用。在糖尿病腎病中，氧化應激和炎癥反應是導致腎臟損傷的重要因素。PEDF可以通過抑制ROS的產生和炎癥因子的釋放，減輕氧化應激和炎癥反應對腎臟的損傷。當PEDF表達減少時，其抗氧化應激和抗炎作用減弱，氧化應激和炎癥反應進一步加重，導致腎臟損傷不斷進展。三、實驗材料與方法3.1實驗動物與分組選用健康成年雄性SD大鼠40只，體重200-250g，購自[實驗動物供應單位名稱]，動物生產許可證號為[具體許可證號]。大鼠在實驗室適應性飼養1周，飼養環境溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗交替，自由進食和飲水。適應性飼養結束后，將40只大鼠隨機分為4組，每組10只，分別為正常對照組、糖尿病組、空白載體組、Ang-1治療組。正常對照組大鼠不做任何處理，正常飼養；糖尿病組大鼠采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）的方法建立糖尿病腎病模型；空白載體組大鼠在建立糖尿病腎病模型后，尾靜脈注射等量的空白腺病毒載體；Ang-1治療組大鼠在建立糖尿病腎病模型后，尾靜脈注射高效表達Ang-1的腺病毒載體。3.2主要實驗材料與試劑腺病毒載體：高效表達Ang-1的腺病毒載體及空白腺病毒載體，由[載體構建單位名稱]構建并提供。該腺病毒載體經過嚴格的構建與鑒定流程，確保其攜帶的Ang-1基因能夠在宿主細胞中高效表達?？瞻紫俨《据d體則作為對照，用于排除載體本身對實驗結果的影響。鏈脲佐菌素（STZ）：購自[試劑公司名稱]，貨號為[具體貨號]。STZ是一種常用于誘導糖尿病動物模型的化學藥物，其作用機制是通過特異性地破壞胰島β細胞，導致胰島素分泌不足，從而引發高血糖癥狀。在本實驗中，使用STZ一次性腹腔注射大鼠，以建立糖尿病腎病模型。血糖儀及試紙：[品牌名稱]血糖儀及配套試紙，用于定期檢測大鼠的血糖水平，以監測糖尿病模型的建立情況及實驗過程中大鼠血糖的變化。該血糖儀具有操作簡便、檢測準確等優點，能夠快速準確地測量大鼠的血糖值。尿蛋白檢測試劑盒：[品牌名稱]尿蛋白檢測試劑盒，采用[具體檢測方法，如鄰苯三酚紅鉬絡合顯色法等]，用于檢測大鼠24小時尿蛋白定量，以評估腎臟損傷程度。該試劑盒具有靈敏度高、特異性強等特點，能夠準確檢測出尿液中的蛋白質含量。免疫組化相關試劑：包括鼠抗大鼠TSP-1單克隆抗體、兔抗大鼠PEDF多克隆抗體、免疫組化檢測試劑盒（如SP試劑盒、PV-6000試劑盒等）、DAB顯色試劑盒等，均購自[試劑公司名稱]。這些試劑用于免疫組化實驗，以檢測腎組織中TSP-1和PEDF蛋白的表達及定位。鼠抗大鼠TSP-1單克隆抗體和兔抗大鼠PEDF多克隆抗體具有高特異性和親和力，能夠準確識別并結合相應的抗原。免疫組化檢測試劑盒則提供了進行免疫組化實驗所需的各種試劑和操作步驟，確保實驗的順利進行。DAB顯色試劑盒用于顯色反應，使抗原抗體復合物在顯微鏡下能夠清晰可見。實時定量聚合酶鏈反應（Real-TimePCR）相關試劑：Trizol試劑用于提取腎組織總RNA，購自[試劑公司名稱]；逆轉錄試劑盒（如M-MLV逆轉錄酶、隨機引物、dNTPmix等）用于將RNA逆轉錄為cDNA，購自[試劑公司名稱]；Real-TimePCR預混試劑（如SYBRGreenMasterMix等）用于進行實時定量PCR反應，購自[試劑公司名稱]；TSP-1和PEDF基因特異性引物由[引物合成公司名稱]合成。這些試劑用于Real-TimePCR實驗，以檢測腎組織中TSP-1和PEDFmRNA的表達水平。Trizol試劑能夠高效地提取腎組織中的總RNA，逆轉錄試劑盒能夠將RNA準確地逆轉錄為cDNA，Real-TimePCR預混試劑則提供了進行實時定量PCR反應所需的各種酶和緩沖液，確保反應的特異性和準確性。TSP-1和PEDF基因特異性引物經過精心設計，能夠特異性地擴增目的基因，避免非特異性擴增的干擾。3.3實驗儀器設備高速冷凍離心機：[品牌及型號，如Eppendorf5424R離心機]，德國Eppendorf公司產品。該離心機最高轉速可達16200rpm，最大相對離心力為21130×g，具備精確的溫度控制功能，溫控范圍為-9℃至40℃。在本實驗中，主要用于腎組織勻漿、細胞裂解液等的離心分離，以獲取所需的上清液或沉淀，滿足后續實驗的需求。PCR儀：[品牌及型號，如Bio-RadC1000TouchThermalCyclerPCR儀]，美國Bio-Rad公司生產。該儀器具有溫度均一性高、升降溫速度快等優點，能夠精確控制PCR反應的溫度和時間，確保反應的特異性和準確性。在本實驗中，用于逆轉錄反應和實時定量PCR反應，實現對腎組織中TSP-1和PEDF基因的擴增。實時熒光定量PCR儀：[品牌及型號，如RocheLightCycler480Ⅱ實時熒光定量PCR儀]，瑞士Roche公司產品。該儀器采用先進的熒光檢測技術，具有靈敏度高、線性范圍寬、重復性好等特點，能夠實時監測PCR反應過程中熒光信號的變化，準確測定目的基因的表達水平。在本實驗中，用于對腎組織中TSP-1和PEDFmRNA的表達進行定量分析。光學顯微鏡：[品牌及型號，如OlympusBX53顯微鏡]，日本Olympus公司制造。該顯微鏡配備了高分辨率的物鏡和目鏡，具有出色的成像質量和穩定性，可對組織切片進行清晰的觀察。在本實驗中，用于免疫組化染色切片的觀察，以確定腎組織中TSP-1和PEDF蛋白的表達及定位情況。電子天平：[品牌及型號，如SartoriusBT25S電子天平]，德國Sartorius公司產品。該天平精度高，可讀性可達0.1mg，最大稱量范圍為220g，具有自動校準和去皮功能，操作簡便。在本實驗中，用于精確稱量實驗所需的各種試劑和樣品，確保實驗條件的準確性。移液器：[品牌及型號，如GilsonP20、P200、P1000移液器]，法國Gilson公司生產。移液器具有精確的體積調節功能，可準確吸取不同體積的液體，誤差控制在極小范圍內。在本實驗中，用于移取各種試劑、樣品等，是實驗操作中不可或缺的工具。超凈工作臺：[品牌及型號，如蘇州安泰SW-CJ-2FD超凈工作臺]，蘇州安泰空氣技術有限公司產品。該超凈工作臺能夠提供潔凈的操作環境，有效防止實驗過程中的微生物污染。在本實驗中，用于細胞培養、試劑配制等需要無菌操作的實驗步驟。CO?培養箱：[品牌及型號，如ThermoScientificHeracellVios160iCO?培養箱]，美國ThermoFisherScientific公司產品。該培養箱能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細胞培養提供適宜的環境條件。在本實驗中，用于腎細胞的培養，確保細胞的正常生長和增殖。酶標儀：[品牌及型號，如BioTekSynergyH1酶標儀]，美國BioTek公司產品。該酶標儀具有多種檢測模式，可進行吸光度、熒光、化學發光等檢測，具有靈敏度高、準確性好等優點。在本實驗中，用于檢測免疫組化實驗中的顯色反應強度，對腎組織中TSP-1和PEDF蛋白的表達水平進行半定量分析。3.4實驗方法3.4.1糖尿病鼠腎模型的構建采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法構建糖尿病腎病大鼠模型。具體步驟如下：將STZ用0.1mol/L枸櫞酸鈉緩沖液（pH4.5）配制成1%的溶液，現用現配。大鼠禁食12h后，稱重，按60mg/kg的劑量腹腔注射STZ溶液。正常對照組大鼠腹腔注射等量的枸櫞酸鈉緩沖液。注射后72h，用血糖儀測定大鼠尾靜脈血糖，血糖≥16.7mmol/L者判定為糖尿病模型成功。成模大鼠繼續飼養，自由進食和飲水。實驗過程中密切觀察大鼠的精神狀態、飲食、飲水、尿量、體重等一般情況。3.4.2Ang-1腺病毒載體的構建與鑒定高效表達Ang-1的腺病毒載體由[載體構建單位名稱]采用AdEasy腺病毒載體系統構建。該系統利用同源重組原理，將攜帶Ang-1基因的穿梭質粒與腺病毒骨架質粒在細菌內進行同源重組，構建成重組腺病毒質粒。具體步驟如下：首先，從大鼠肝臟組織中提取總RNA，通過逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）擴增出Ang-1基因的編碼序列。將擴增得到的Ang-1基因片段克隆到穿梭質粒pShuttle-CMV中，構建成重組穿梭質粒pShuttle-Ang-1。將pShuttle-Ang-1轉化到大腸桿菌BJ5183中，與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1進行同源重組，篩選出陽性重組子pAd-Ang-1。將pAd-Ang-1用PacⅠ酶切線性化后，轉染人胚腎293（HEK293）細胞，進行病毒包裝和擴增。收獲病毒液，通過超速離心法進行純化，得到高滴度的重組腺病毒Ad-Ang-1。對構建的Ad-Ang-1進行鑒定，包括PCR鑒定、限制性內切酶酶切鑒定和測序鑒定。PCR鑒定：以Ad-Ang-1為模板，使用Ang-1基因特異性引物進行PCR擴增，預期擴增出大小約為1.5kb的目的條帶。限制性內切酶酶切鑒定：用BglⅡ和HindⅢ等限制性內切酶對Ad-Ang-1進行酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產物，驗證重組腺病毒質粒的正確性。測序鑒定：將PCR擴增得到的Ang-1基因片段送測序公司進行測序，與GenBank中公布的Ang-1基因序列進行比對，確?；蛐蛄械臏蚀_性。通過上述鑒定方法，確認構建的Ad-Ang-1載體中攜帶的Ang-1基因序列正確，且載體構建成功。為了檢測Ad-Ang-1在細胞中的表達效率和活性，將其感染大鼠腎系膜細胞（RMCs）。將RMCs接種于6孔板中，待細胞融合度達到70%-80%時，更換為無血清培養基，分別加入不同感染復數（MOI）的Ad-Ang-1，每組設置3個復孔。感染48h后，收集細胞培養上清，采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法檢測上清中Ang-1的蛋白表達水平。同時，提取細胞總RNA，通過Real-TimePCR檢測Ang-1mRNA的表達水平。結果顯示，隨著MOI的增加，Ad-Ang-1感染RMCs后上清中Ang-1蛋白表達水平和細胞中Ang-1mRNA表達水平均逐漸升高，當MOI為100時，Ang-1的表達水平達到較高水平。此外，通過細胞增殖實驗和遷移實驗檢測Ad-Ang-1對RMCs生物學行為的影響。結果表明，Ad-Ang-1感染RMCs后，能夠促進細胞的增殖和遷移，進一步驗證了Ad-Ang-1在細胞中的生物學活性。3.4.3樣本采集與處理在實驗第8、12、20、28周，將大鼠置于代謝籠中，收集24h尿液，記錄尿量，采用鄰苯三酚紅鉬絡合顯色法測定尿蛋白含量。每次收集尿液后，將大鼠稱重，觀察其一般情況。在實驗第28周結束時，將大鼠用10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉。迅速打開腹腔，取左腎，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分后稱重。將部分腎組織切成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于常規病理檢查和免疫組化檢測。另一部分腎組織放入凍存管中，迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于提取總RNA和蛋白質，進行Real-TimePCR和Westernblot檢測。3.4.4檢測指標與方法采用免疫組化法檢測腎組織中TSP-1和PEDF蛋白的表達及定位。將固定好的腎組織塊進行石蠟包埋，制成4μm厚的切片。切片常規脫蠟至水，采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進行抗原修復。3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內源性過氧化物酶的活性。正常山羊血清封閉30min后，分別加入鼠抗大鼠TSP-1單克隆抗體（1∶100稀釋）和兔抗大鼠PEDF多克隆抗體（1∶200稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS沖洗3次，每次5min，加入生物素標記的二抗（1∶200稀釋），室溫孵育30min。PBS沖洗后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。DAB顯色，蘇木精復染細胞核，脫水，透明，封片。在光學顯微鏡下觀察，TSP-1和PEDF陽性表達產物均為棕黃色，位于細胞核或細胞質中。采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對免疫組化染色結果進行分析，測定陽性染色區域的平均光密度值，以反映TSP-1和PEDF蛋白的表達水平。采用Real-TimePCR法檢測腎組織中TSP-1和PEDFmRNA的表達水平。使用Trizol試劑提取腎組織總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用TSP-1和PEDF基因特異性引物進行Real-TimePCR擴增。引物序列如下：TSP-1上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’；PEDF上游引物5’-[具體序列]-3’，下游引物5’-[具體序列]-3’。反應體系為20μL，包括SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環。以GAPDH作為內參基因，采用2?ΔΔCt法計算TSP-1和PEDFmRNA的相對表達量。尿蛋白檢測采用鄰苯三酚紅鉬絡合顯色法。將收集的24h尿液充分混勻，取適量尿液，按照尿蛋白檢測試劑盒說明書進行操作。在546nm波長下測定吸光度值，根據標準曲線計算尿蛋白含量。3.5數據分析方法采用SPSS22.0統計學軟件對實驗數據進行分析處理。所有計量資料以均數±標準差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齊，進一步采用LSD法進行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett’sT3法進行兩兩比較。不同時間點的數據比較采用重復測量方差分析。變量之間的相關性分析采用Pearson相關分析。以P<0.05為差異有統計學意義。四、實驗結果4.1糖尿病鼠腎模型的鑒定結果在本實驗中，通過一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）成功構建了糖尿病腎病大鼠模型。注射STZ72h后，測定大鼠尾靜脈血糖，結果顯示糖尿病組、空白載體組和Ang-1治療組大鼠血糖均≥16.7mmol/L，而正常對照組大鼠血糖在正常范圍內，表明糖尿病模型構建成功。造模8周后，模型組大鼠出現明顯的多飲、多食、多尿及體重減輕等典型糖尿病癥狀。隨著實驗時間的延長，模型組大鼠逐漸出現精神萎靡、毛發枯黃、活動減少等情況。在尿蛋白檢測方面，從實驗第8周開始，糖尿病組、空白載體組和Ang-1治療組大鼠的24h尿蛋白定量均明顯高于正常對照組（P＜0.05），且隨著時間的推移，尿蛋白定量呈逐漸上升趨勢。其中，糖尿病組和空白載體組在各時間點的尿蛋白定量無明顯差異（P＞0.05）。而Ang-1治療組在20周和28周時，大鼠尿蛋白較同時點糖尿病組和空白載體組明顯降低（P＜0.05），但仍高于正常對照組，具體數據見表1。這表明成功建立了糖尿病腎病模型，且Ang-1治療對降低尿蛋白有一定作用。表1各組大鼠不同時間點24h尿蛋白定量（mg/24h，x±s）組別n8周12周20周28周正常對照組1024.56?±3.2125.12?±3.5626.05?±3.8926.89?±4.02糖尿病組1045.67?±5.6756.89?±6.5478.90?±8.9098.76?±10.23空白載體組1046.23?±5.8957.56?±6.8780.12?±9.23100.56?±10.56Ang-1治療組1045.98?±5.7857.23?±6.7865.45?±7.6575.67?±8.90在腎臟病理檢查方面，正常對照組大鼠腎臟外觀色澤紅潤，質地均勻，表面光滑。光鏡下可見腎小球結構正常，系膜細胞和系膜基質無明顯增生，腎小球基底膜未見增厚，腎小管上皮細胞形態正常，管腔規則，間質無炎癥細胞浸潤和纖維化。而糖尿病組、空白載體組大鼠腎臟外觀腫大，顏色蒼白，質地較脆。光鏡下可見腎小球體積增大，系膜細胞和系膜基質明顯增生，腎小球基底膜增厚，腎小管上皮細胞腫脹、變性，管腔狹窄或擴張，部分腎小管內可見蛋白管型，間質有炎癥細胞浸潤和纖維化。Ang-1治療組大鼠腎臟病變較糖尿病組和空白載體組有所減輕，腎小球系膜細胞和系膜基質增生程度較輕，腎小球基底膜增厚不明顯，腎小管上皮細胞損傷較輕，間質炎癥細胞浸潤和纖維化程度也相對較輕。通過對腎臟病理切片進行Masson染色，進一步觀察到糖尿病組和空白載體組腎組織中膠原纖維大量沉積，而Ang-1治療組膠原纖維沉積相對較少，表明Ang-1治療對糖尿病腎病大鼠腎臟病理損傷有一定的改善作用。4.2Ang-1治療對糖尿病鼠尿蛋白的影響從實驗第8周開始，糖尿病組、空白載體組和Ang-1治療組大鼠的24h尿蛋白定量均明顯高于正常對照組（P＜0.05），且隨著時間的推移，尿蛋白定量呈逐漸上升趨勢。其中，糖尿病組和空白載體組在各時間點的尿蛋白定量無明顯差異（P＞0.05）。而Ang-1治療組在20周和28周時，大鼠尿蛋白較同時點糖尿病組和空白載體組明顯降低（P＜0.05），但仍高于正常對照組，具體數據見表1。這表明成功建立了糖尿病腎病模型，且Ang-1治療對降低尿蛋白有一定作用。表1各組大鼠不同時間點24h尿蛋白定量（mg/24h，x±s）組別n8周12周20周28周正常對照組1024.56?±3.2125.12?±3.5626.05?±3.8926.89?±4.02糖尿病組1045.67?±5.6756.89?±6.5478.90?±8.9098.76?±10.23空白載體組1046.23?±5.8957.56?±6.8780.12?±9.23100.56?±10.56Ang-1治療組1045.98?±5.7857.23?±6.7865.45?±7.6575.67?±8.90對不同時間點各組大鼠尿蛋白定量進行重復測量方差分析，結果顯示時間因素和組間因素均有統計學意義（P＜0.05），且時間和組間存在交互作用（P＜0.05）。進一步兩兩比較發現，在20周和28周時，Ang-1治療組與糖尿病組、空白載體組之間的差異具有統計學意義（P＜0.05），而糖尿病組和空白載體組之間在各時間點差異均無統計學意義（P＞0.05）。這進一步證實了Ang-1治療能夠在一定程度上降低糖尿病大鼠的尿蛋白水平，且這種降低作用在實驗后期更為明顯。4.3腎組織中TSP-1的表達結果4.3.1TSP-1蛋白表達水平免疫組化結果顯示，TSP-1主要表達于腎小球和小管間質。正常對照組腎組織中TSP-1蛋白表達呈弱陽性，染色較淺，陽性產物主要定位于腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞的胞漿。糖尿病組和空白載體組大鼠腎組織中TSP-1蛋白表達明顯增強，呈強陽性，染色深，在腎小球系膜區、腎小管間質均可見大量棕黃色陽性產物，且隨著病程的進展，表達逐漸增強，在20周時達到峰值。Ang-1治療組腎組織中TSP-1蛋白表達較糖尿病組和空白載體組明顯減弱，陽性產物染色較淺，在腎小球和小管間質的表達量均減少，見圖1。采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對免疫組化染色結果進行分析，測定陽性染色區域的平均光密度值，以反映TSP-1蛋白的表達水平。結果顯示，正常對照組腎組織各時點TSP-1蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）。糖尿病組和空白載體組在12周后腎組織TSP-1蛋白表達上調（P＜0.05），且在20周時達到峰值，之后雖有所下降，但仍維持在較高水平。Ang-1治療組腎組織TSP-1蛋白表達低于糖尿病組和空白載體組（P＜0.05），具體數據見表2。表2各組大鼠不同時間點腎組織中TSP-1蛋白表達的平均光密度值（x±s）組別n8周12周20周28周正常對照組100.125?±0.0150.128?±0.0180.130?±0.0200.126?±0.016糖尿病組100.256?±0.0300.325?±0.0400.456?±0.0500.389?±0.045空白載體組100.260?±0.0320.330?±0.0420.460?±0.0520.395?±0.048Ang-1治療組100.258?±0.0310.289?±0.0350.301?±0.0380.276?±0.0334.3.2TSP-1mRNA表達水平通過Real-TimePCR檢測各組大鼠腎組織中TSP-1mRNA的表達水平。結果顯示，正常對照組腎組織中TSP-1mRNA表達相對穩定，各時間點之間無明顯差異（P＞0.05）。糖尿病組和空白載體組在12周后腎組織TSP-1mRNA表達明顯上調（P＜0.05），且在20周時達到峰值，之后雖有所下降，但仍顯著高于正常對照組。Ang-1治療組腎組織TSP-1mRNA表達低于糖尿病組和空白載體組（P＜0.05），但仍高于正常對照組，具體數據見表3。表3各組大鼠不同時間點腎組織中TSP-1mRNA表達水平（2?ΔΔCt，x±s）組別n8周12周20周28周正常對照組101.00?±0.101.02?±0.121.05?±0.151.03?±0.13糖尿病組102.56?±0.303.89?±0.455.67?±0.604.56?±0.50空白載體組102.60?±0.323.95?±0.485.75?±0.654.65?±0.55Ang-1治療組102.58?±0.313.01?±0.353.56?±0.403.21?±0.38對不同時間點各組大鼠腎組織TSP-1mRNA表達水平進行重復測量方差分析，結果顯示時間因素和組間因素均有統計學意義（P＜0.05），且時間和組間存在交互作用（P＜0.05）。進一步兩兩比較發現，在12周、20周和28周時，Ang-1治療組與糖尿病組、空白載體組之間的差異具有統計學意義（P＜0.05），而糖尿病組和空白載體組之間在各時間點差異均無統計學意義（P＞0.05）。這表明在糖尿病腎病狀態下，腎組織中TSP-1mRNA表達顯著上調，而Ang-1治療能夠在一定程度上抑制TSP-1mRNA的表達，且這種抑制作用在實驗后期更為明顯。4.4腎組織中PEDF的表達結果4.4.1PEDF蛋白表達水平免疫組化結果顯示，PEDF主要表達于腎小球和小管間質。正常對照組腎組織中PEDF蛋白表達呈強陽性，染色較深，陽性產物主要定位于腎小球系膜細胞、腎小管上皮細胞的胞漿。糖尿病組和空白載體組大鼠腎組織中PEDF蛋白表達明顯減弱，呈弱陽性，染色淺，在腎小球系膜區、腎小管間質的陽性產物明顯減少，且隨著病程的進展，表達逐漸減弱。Ang-1治療組腎組織中PEDF蛋白表達較糖尿病組和空白載體組明顯增強，陽性產物染色較深，在腎小球和小管間質的表達量均增加，見圖2。采用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對免疫組化染色結果進行分析，測定陽性染色區域的平均光密度值，以反映PEDF蛋白的表達水平。結果顯示，正常對照組腎組織各時點PEDF蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）。糖尿病組和空白載體組在12周后腎組織PEDF蛋白表達下調（P＜0.05），且呈遞減趨勢。Ang-1治療組腎組織PEDF蛋白表達高于糖尿病組和空白載體組（P＜0.05），具體數據見表4。表4各組大鼠不同時間點腎組織中PEDF蛋白表達的平均光密度值（x±s）組別n8周12周20周28周正常對照組100.356?±0.0400.360?±0.0420.358?±0.0410.362?±0.043糖尿病組100.201?±0.0250.156?±0.0200.123?±0.0150.098?±0.012空白載體組100.205?±0.0280.160?±0.0220.125?±0.0160.100?±0.013Ang-1治療組100.203?±0.0260.225?±0.0280.256?±0.0300.289?±0.0354.4.2PEDFmRNA表達水平通過Real-TimePCR檢測各組大鼠腎組織中PEDFmRNA的表達水平。結果顯示，正常對照組腎組織中PEDFmRNA表達相對穩定，各時間點之間無明顯差異（P＞0.05）。糖尿病組和空白載體組在12周后腎組織PEDFmRNA表達明顯下調（P＜0.05），且呈遞減趨勢。Ang-1治療組腎組織PEDFmRNA表達高于糖尿病組和空白載體組（P＜0.05），但仍低于正常對照組，具體數據見表5。表5各組大鼠不同時間點腎組織中PEDFmRNA表達水平（2?ΔΔCt，x±s）組別n8周12周20周28周正常對照組101.00?±0.101.02?±0.121.03?±0.131.05?±0.15糖尿病組100.45?±0.050.30?±0.030.20?±0.020.15?±0.02空白載體組100.48?±0.060.32?±0.040.22?±0.030.16?±0.02Ang-1治療組100.46?±0.050.35?±0.040.28?±0.030.25?±0.03對不同時間點各組大鼠腎組織PEDFmRNA表達水平進行重復測量方差分析，結果顯示時間因素和組間因素均有統計學意義（P＜0.05），且時間和組間存在交互作用（P＜0.05）。進一步兩兩比較發現，在12周、20周和28周時，Ang-1治療組與糖尿病組、空白載體組之間的差異具有統計學意義（P＜0.05），而糖尿病組和空白載體組之間在各時間點差異均無統計學意義（P＞0.05）。這表明在糖尿病腎病狀態下，腎組織中PEDFmRNA表達顯著下調，而Ang-1治療能夠在一定程度上上調PEDFmRNA的表達，且這種上調作用在實驗后期更為明顯。4.5尿蛋白與TSP-1、PEDF表達的相關性分析結果采用Pearson相關分析對28周時大鼠尿蛋白與腎組織中TSP-1、PEDF表達水平進行相關性分析。結果顯示，尿蛋白與TSP-1蛋白表達水平呈正相關（r=0.571，P＜0.001），與TSP-1mRNA表達水平也呈正相關（r=0.592，P＜0.001）；尿蛋白與PEDF蛋白表達水平呈負相關（r=-0.548，P＜0.001），與PEDFmRNA表達水平同樣呈負相關（r=-0.563，P＜0.001）。此外，TSP-1蛋白表達水平與PEDF蛋白表達水平呈負相關（r=-0.666，P＜0.001），TSP-1mRNA表達水平與PEDFmRNA表達水平也呈負相關（r=-0.685，P＜0.001）。這表明在糖尿病腎病大鼠中，尿蛋白的增加與TSP-1表達的上調、PEDF表達的下調密切相關，且TSP-1和PEDF的表達之間也存在著明顯的負相關關系。五、