ICS03.080

CCSC00

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T4644.4—2025

從業(yè)人員健康檢查第4部分：

傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂

弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法

Healthexaminationofemployees—

Part4:DetectionmethodsofSalmonellatyphimurium，Salmonella

paratyphi，Vibriocholerae，ShigellaandEntamoebahistolytica

2025?02?21發(fā)布2025?03?21實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版

DB32/T4644.4—2025

目次

前言……………………………Ⅲ

引言……………………………Ⅳ

1范圍…………………………1

2規(guī)范性引用文件……………1

3術(shù)語(yǔ)和定義…………………1

4縮略語(yǔ)………………………1

5方法原理……………………2

6設(shè)備與材料…………………2

7培養(yǎng)基和試劑………………3

8檢驗(yàn)程序……………………4

9操作步驟……………………4

10生物安全……………………8

附錄A（資料性）培養(yǎng)基和試劑………………9

附錄B（規(guī)范性）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)體系及注意事項(xiàng)………………19

Ⅰ

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件是DB32/T4644《從業(yè)人員健康檢查》的第4部分。DB32/T4644已經(jīng)發(fā)布了以下部分：

——第1部分：檢查機(jī)構(gòu)管理規(guī)范；

——第2部分：健康檢查技術(shù)規(guī)范；

——第3部分：質(zhì)量控制規(guī)范；

——第4部分：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法；

——第5部分：信息系統(tǒng)基本數(shù)據(jù)集。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出并組織實(shí)施。

本文件由江蘇省衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、南京市疾病預(yù)防控制中心、徐州市疾病預(yù)防控制中心、

深圳市職業(yè)病防治院、赤峰眾康生物科技有限公司。

本文件主要起草人：霍翔、喬昕、王燕梅、馬愷、朱寶立、王雨瀟、李曄、徐光、韓磊、李亞波、郭寶福、

苗升浩。

Ⅲ

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引言

從業(yè)人員健康檢查是根據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》《中華人民共和國(guó)食品安全法》《中華人民

共和國(guó)藥品管理法》《公共場(chǎng)所衛(wèi)生管理?xiàng)l例》《生活飲用水衛(wèi)生監(jiān)督管理辦法》《化妝品衛(wèi)生管理?xiàng)l例》等

法律法規(guī)所進(jìn)行的從業(yè)前、從業(yè)期間的健康檢查。

DB32/T4644《從業(yè)人員健康檢查》分為以下5個(gè)部分：

——第1部分：檢查機(jī)構(gòu)管理規(guī)范；

——第2部分：健康檢查技術(shù)規(guī)范；

——第3部分：質(zhì)量控制規(guī)范；

——第4部分：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法；

——第5部分：信息系統(tǒng)基本數(shù)據(jù)集。

DB32/T4644的制定是對(duì)從業(yè)人員健康檢查工作相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的有力補(bǔ)充，對(duì)貫徹落實(shí)

《“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要》、推進(jìn)健康中國(guó)建設(shè)、提高人民健康水平、保障公眾健康和公共衛(wèi)生安全具

有重要意義。

Ⅳ

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從業(yè)人員健康檢查第4部分：

傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂

弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法

1范圍

本文件描述了從業(yè)人員健康檢查糞便標(biāo)本（肛拭子）中傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志

賀氏菌和痢疾阿米巴的檢驗(yàn)方法。

本文件適用于公共場(chǎng)所從業(yè)人員、食品生產(chǎn)和加工人員、食品流通和餐飲服務(wù)人員、飲用水生產(chǎn)、經(jīng)

營(yíng)人員健康檢查項(xiàng)目中糞便標(biāo)本（肛拭子）的傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾

阿米巴的檢驗(yàn)，醫(yī)療衛(wèi)生用品、化妝品等相關(guān)行業(yè)從業(yè)人員的健康檢查可參照?qǐng)?zhí)行。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB4789.4食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

WS280傷寒和副傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)

WS287細(xì)菌性和阿米巴性痢疾診斷標(biāo)準(zhǔn)

WS289霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

實(shí)時(shí)熒光PCRreal?timePCR

實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

3.2

Ct值cyclethreshold

每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4縮略語(yǔ)

BS：亞硫酸鉍瓊脂（BismuthSulfiteAgar）

CY5：磺酸基?CY5羧酸（Cyanine5）

DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

FAM：6?羧基熒光素（6?carboxyfluorescein）

1

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LDC：賴氨酸脫羧酶（LysineDecarboxylase）

MAC：麥康凱瓊脂（MacConkeyAgar）

NB：營(yíng)養(yǎng)肉湯（NutrientBroth）

NP?40：乙基苯基聚乙二醇（NonidetP?40）

Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

TCBS：硫代硫酸鹽?檸檬酸鹽?膽鹽?蔗糖瓊脂（TCBSAgar）

TSI：三糖鐵瓊脂（TripleSugarIronAgar）

UNG酶：尿嘧啶DNA糖基酶（UracilDNAglycosylase）

VIC：琥珀酰亞胺酯（FluoresceinAmidite）

XLD：木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（Xylose?LysineDesoxycholateAgar）

5方法原理

5.1篩查試驗(yàn)

5.1.1依據(jù)核酸體外擴(kuò)增基本原理，針對(duì)傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿

米巴特異靶基因序列設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記探針，在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到并超過(guò)所

設(shè)定的閾值時(shí)，利用熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量的正相關(guān)關(guān)系，即可對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果進(jìn)行分析和

判定。

5.1.2對(duì)標(biāo)本的模板

DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)其Ct值及擴(kuò)增曲線進(jìn)行標(biāo)本結(jié)果報(bào)告，當(dāng)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果呈

陰性時(shí)直接報(bào)告陰性結(jié)果；當(dāng)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果呈陽(yáng)性時(shí)，進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本做確證試驗(yàn)。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)

從業(yè)人員健康檢查糞便標(biāo)本（肛拭子）中的傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿

米巴的快速篩查。

5.2確證試驗(yàn)

通過(guò)增菌、分離、生化和血清學(xué)鑒定等方法，從實(shí)時(shí)熒光PCR陽(yáng)性標(biāo)本中分離得到目標(biāo)病原體。結(jié)

果為陽(yáng)性時(shí)報(bào)告陽(yáng)性（檢出），結(jié)果為陰性時(shí)報(bào)告陰性（未檢出）。

6設(shè)備與材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，包括但不限于以下設(shè)備和材料。

6.1Ⅱ級(jí)生物安全柜。

6.2冰箱：2℃~8℃和-20℃。

6.3恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃、37℃±1℃、42℃±1℃。

6.4電子天平：分度值為0.1g和0.01g。

6.5離心機(jī)：離心力≥12000×g。

6.6pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。

6.7渦旋混勻器。

6.8恒溫金屬浴/水浴鍋：25℃~100℃。

6.9實(shí)時(shí)熒光PCR儀。

2

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6.10全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。

6.11微生物飛行質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)。

6.12無(wú)菌錐形瓶：容量500mL、250mL。

6.13無(wú)菌試管：10mm×75mm、15mm×150mm或其他合適規(guī)格。

6.14無(wú)菌小玻管：3mm×50mm。

6.15無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。

6.16無(wú)菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。

6.17微量可調(diào)移液器和配套帶濾芯吸頭：2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。

6.18采樣管：密閉式。

6.19采樣拭子：長(zhǎng)度≥10cm。

6.20PCR反應(yīng)管。

7培養(yǎng)基和試劑

7.1營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）增菌液：見A.1。

7.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液：見A.2。

7.3氯化鎂孔雀綠大豆胨（RVS）增菌液：見A.3。

7.4堿性蛋白胨水培養(yǎng)基：見A.4。

7.5亞硫酸鉍（BS）瓊脂：見A.5。

7.6HE瓊脂：見A.6。

7.7木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂：見A.7。

7.8麥康凱（MAC）瓊脂：見A.8。

7.9慶大霉素瓊脂：見A.9。

7.10硫代硫酸鹽?檸檬酸鹽?膽鹽?蔗糖（TCBS）瓊脂：見A.10。

7.11四號(hào)瓊脂：見A.11。

7.12堿性營(yíng)養(yǎng)瓊脂：見A.12。

7.13三糖鐵（TSI）瓊脂：見A.13。

7.14克氏雙糖鐵（KIA）瓊脂：見A.14。

7.15糖發(fā)酵培養(yǎng)基：見A.15。

7.16氧化酶試劑：見A.16。

7.17賴氨酸脫羧酶（LDC）試驗(yàn)培養(yǎng)基：見A.17。

7.18動(dòng)力?靛基質(zhì)?尿素半固體（MIU）瓊脂：見A.18。

7.19沙門氏菌顯色培養(yǎng)基。

7.20沙門氏菌診斷血清。

7.21志賀氏菌診斷血清。

7.22霍亂弧菌診斷血清。

7.23除特別說(shuō)明外，PCR所用化學(xué)試劑為分析純。所有試劑均用無(wú)DNA酶污染的容器分裝。

7.24DNA提取液：Tris?EDTA緩沖液（0.01mol/L，pH8.0）、0.01%NP40。

7.25實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴熒光

PCR檢測(cè)靶基因、反應(yīng)體系及注意事項(xiàng)應(yīng)符合附錄B。

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8檢驗(yàn)程序

傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)程序見圖1。

FK

8

F

1$3K

81$3

1$3K

!K!8

!K

B!81$3
K

+*K1

1$3
K

!8L

81$3
K

8

.

1J

*GN=BA=#



!K!8



!K!8

!K!8





+*

+

!K!8

B!

!K!8

B!K!8

B!8L

K1

*K1

8L

8!8L

8

8+*K1

圖1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)程序

9操作步驟

9.1標(biāo)本采集、保存及運(yùn)輸

9.1.1標(biāo)本采集

用滅菌的采樣拭子，由肛門插入直腸內(nèi)3cm~5cm處，旋轉(zhuǎn)360°采集，或用采樣拭子蘸取適量糞便，

4

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放入盛有1mL~3mL生理鹽水的采樣管內(nèi)，旋緊管蓋，編號(hào)備用。

9.1.2標(biāo)本的保存和運(yùn)輸

采集的標(biāo)本盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，如不能立即送檢，在2℃~8℃條件下保存不超過(guò)24h。

9.2標(biāo)本的前處理

9.2.1前增菌

將標(biāo)本充分混勻，吸取勻液1mL加入到4mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置于36℃±1℃增菌培養(yǎng)3h~6h。

9.2.2標(biāo)本混合

9.2.2.1根據(jù)樣本數(shù)量，取n個(gè)無(wú)菌的1.5mL離心管或合適容量篩選管作為混合管，分別編號(hào)。

9.2.2.2每份標(biāo)本取增菌液100μL，分別依次加入到混合管中。根據(jù)實(shí)際情況，將5~10份標(biāo)本混合成

1份混合標(biāo)本。

9.2.2.3標(biāo)本混合時(shí)，應(yīng)防止操作人員和環(huán)境污染?；旌贤瓿珊?，使用渦旋振蕩器進(jìn)行混勻，再進(jìn)行實(shí)

時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

9.2.2.4如混合標(biāo)本PCR檢測(cè)為陰性，判定混合標(biāo)本所代表的全部標(biāo)本為陰性。如混合標(biāo)本PCR檢測(cè)

為某種致病微生物陽(yáng)性，則再對(duì)混合標(biāo)本中的每一份標(biāo)本按9.4進(jìn)行確證試驗(yàn)，以確定具體陽(yáng)性標(biāo)本。

9.3篩查試驗(yàn)

9.3.1DNA模板的制備

標(biāo)本12000×g離心5min，棄上清；加入50μL~100μLDNA取液，重懸沉淀并充分混合后100℃加

熱處理5min，12000×g離心2min，取5μL上清液，作為模板DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。若不能及

時(shí)檢測(cè)，應(yīng)存放于-20℃以下保存，并盡快完成檢測(cè)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，也可使用商品化試劑盒制

備DNA模板。

9.3.2PCR反應(yīng)體系

總反應(yīng)體系體積為25μL：PCR反應(yīng)液20μL（含有特異性引物、dNTP、探針及反應(yīng)所需各種離子

19.64μL，1U/μLUNG酶0.06μL，5U/μLTaq酶0.3μL），模板DNA5μL。反應(yīng)體系按照附錄B

執(zhí)行。

9.3.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

9.3.3.1將9.3.2中瞬時(shí)離心后的PCR反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR儀內(nèi)，記錄標(biāo)本擺放順序，進(jìn)行核酸

擴(kuò)增和檢測(cè)。

9.3.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件：50℃預(yù)熱2min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性5s、60℃退火延伸30s

（同時(shí)采集FAM、VIC和CY5熒光信號(hào)），進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

9.3.4對(duì)照設(shè)置

檢測(cè)過(guò)程（包括DNA提?。┲?，每個(gè)反應(yīng)均應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。其中陽(yáng)性對(duì)照模

板為擴(kuò)增片段的陽(yáng)性克隆分子DNA或標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，陰性對(duì)照模板為大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，空

白對(duì)照為滅菌去離子水。

5

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9.3.5結(jié)果判讀

9.3.5.1對(duì)照的結(jié)果判讀

陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，Ct值≤30；陰性對(duì)照無(wú)典型擴(kuò)增曲線或Ct值≥40；空白對(duì)照無(wú)典型擴(kuò)

增曲線或Ct值≥40。否則，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果視為無(wú)效。

9.3.5.2樣品的結(jié)果判定和報(bào)告

9.3.5.2.1FAM通道Ct值>40或無(wú)Ct值，可判定標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為傷寒沙門氏菌（A管）和（或）痢疾阿

米巴（B管）陰性，可直接報(bào)告未檢出傷寒沙門氏菌和（或）痢疾阿米巴；VIC通道Ct值>40或無(wú)Ct值，可判

定標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為副傷寒沙門氏菌（A管）陰性，可直接報(bào)告未檢出副傷寒沙門氏菌；CY5通道Ct值>40

或無(wú)Ct值，可判定標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為霍亂弧菌（A管）和（或）志賀氏菌（B管）陰性，可直接報(bào)告未檢出霍亂

弧菌和（或）志賀氏菌。

9.3.5.2.2FAM通道Ct值<35，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，可判定該標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為傷寒沙門氏菌（A管）和

（或）痢疾阿米巴（B管）陽(yáng)性；VIC通道Ct值<35，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，可判定該標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為副傷寒沙

門氏菌（A管）陽(yáng)性；CY5通道Ct值<35，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，可判定該標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為霍亂弧菌（A管）

和（或）志賀氏菌（B管）陽(yáng)性。見表1。

表1檢測(cè)結(jié)果判定表

FAMVICCY5

A管傷寒沙門氏菌副傷寒沙門氏菌霍亂弧菌

B管痢疾阿米巴—志賀氏菌

9.3.5.2.3FAM通道、VIC通道和（或）CY5通道35≤Ct值≤40，重新做實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。若重新檢

測(cè)結(jié)果的Ct值≥40，則判定為相應(yīng)病原體陰性，否則判定為陽(yáng)性。

9.3.5.2.4如用商品化實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，應(yīng)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定。

9.3.5.3PCR陽(yáng)性混合標(biāo)本確認(rèn)

對(duì)PCR結(jié)果為陽(yáng)性的混合標(biāo)本，依據(jù)9.4確證試驗(yàn)做進(jìn)一步的確認(rèn)。

9.4確證試驗(yàn)

9.4.1增菌

9.4.1.1混合標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為傷寒沙門氏菌或副傷寒沙門氏菌陽(yáng)性時(shí)，將混合前的所有

個(gè)標(biāo)本分別接種于RVS增菌液中42℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，同時(shí)接種TTB增菌液中42℃±1℃培養(yǎng)

18h~24h。

9.4.1.2混合標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為志賀氏菌陽(yáng)性時(shí)，無(wú)須增菌，將混合前的所有單個(gè)標(biāo)本直

接分別分離培養(yǎng)。

9.4.1.3混合標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為霍亂弧菌陽(yáng)性時(shí)，將混合前的所有單個(gè)標(biāo)本分別接種于堿

性蛋白胨水培養(yǎng)基中36℃±1℃增菌培養(yǎng)6h~8h。

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9.4.2分離培養(yǎng)

9.4.2.1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌：按照GB4789.4進(jìn)行檢測(cè)。

9.4.2.2志賀氏菌：取前增菌液1環(huán)，劃線接種于MAC或XLD瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，

志賀氏菌呈現(xiàn)不發(fā)酵乳糖的菌落，見表2。

表2志賀菌屬在MAC和XLD瓊脂平板上的菌落特征

選擇性瓊脂平板志賀氏菌

形成圓形、隆起、無(wú)色、透明、直徑2mm~3mm、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的菌落。宋內(nèi)氏志賀菌菌

MAC瓊脂

落較大，不透明，培養(yǎng)時(shí)間稍長(zhǎng)易形成淡粉紅色、扁平的粗糙菌落

XLD瓊脂紅色透明狀、表面光滑、濕潤(rùn)、隆起、邊緣整齊的菌落

9.4.2.3霍亂弧菌：取增菌液1環(huán)，劃線接種于強(qiáng)、弱選擇性培養(yǎng)基各一塊置37℃培養(yǎng)18h~24h。強(qiáng)選

擇性培養(yǎng)基包括慶大霉素瓊脂、TCBS瓊脂和四號(hào)瓊脂，弱選擇性培養(yǎng)基一般使用堿性營(yíng)養(yǎng)瓊脂。霍亂

弧菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征見表3。

表3霍亂弧菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征

選擇性瓊脂平板霍亂弧菌

無(wú)色、圓形、透明或半透明、表面光滑、潤(rùn)濕、扁平或稍凸起、邊緣整齊，菌落直徑一般約為

堿性營(yíng)養(yǎng)瓊脂

2mm

與堿性營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)的菌落相似，但透明性略差，多呈半透明狀，由于這類培養(yǎng)基均含

慶大霉素瓊脂和四號(hào)瓊脂

有亞碲酸鹽成分，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而加深

TCBS瓊脂黃色發(fā)亮、表面光滑、潤(rùn)濕、稍凸起、邊緣整齊

9.4.3菌株鑒定

9.4.3.1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌

按照WS280進(jìn)行檢測(cè)?？蛇x擇生化鑒定試劑盒、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)或微生物飛行質(zhì)譜鑒

定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

9.4.3.2志賀氏菌

按照WS287進(jìn)行檢測(cè)?？蛇x擇生化鑒定試劑盒、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

9.4.3.3霍亂弧菌

9.4.3.3.1菌株初篩

按照WS289進(jìn)行檢測(cè)。包括玻片凝集試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)。

9.4.3.3.2菌株復(fù)核

9.4.3.3.2.1經(jīng)初篩陽(yáng)性或可疑陽(yáng)性的菌株，應(yīng)該進(jìn)行復(fù)核鑒定。按照WS289進(jìn)行檢測(cè)?？蛇x擇生化

鑒定試劑盒、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)或微生物飛行質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)。

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9.4.3.3.2.2復(fù)核結(jié)果符合O1群或O139群霍亂弧菌的菌株，按菌株管理的要求保存與上送；如復(fù)核結(jié)

果出現(xiàn)疑問(wèn)，應(yīng)盡快將菌株上送參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)分析。

9.4.4血清學(xué)分型

9.4.4.1自凝性檢查

傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、志賀氏菌采用玻片凝集試驗(yàn)。一般采用瓊脂含量為1.2%~1.5%

的純培養(yǎng)物進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。首先用生理鹽水進(jìn)行自凝性檢測(cè)。若菌體在生理鹽水中凝集，即認(rèn)為有

自凝性，反之無(wú)自凝性。對(duì)無(wú)自凝的培養(yǎng)物參照下面方法進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

9.4.4.2傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌血清分型

按照WS280進(jìn)行檢測(cè)。

9.4.4.3志賀氏菌血清分型

按照WS287—2008中A.1進(jìn)行檢測(cè)。

9.4.5痢疾阿米巴檢驗(yàn)

PCR檢測(cè)結(jié)果為痢疾阿米巴陽(yáng)性時(shí)，需重新采集病人糞便，按照WS287—2008中A.2進(jìn)行檢測(cè)。

9.5結(jié)果報(bào)告

根據(jù)確證試驗(yàn)結(jié)果對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR陽(yáng)性標(biāo)本作出最終結(jié)果判定和菌型判定。

10生物安全

標(biāo)本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、保存和檢驗(yàn)等活動(dòng)，按照GB19489相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

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附錄A

（資料性）

培養(yǎng)基和試劑

A.1營(yíng)養(yǎng)肉湯

A.1.1成分

蛋白胨10.0g

牛肉膏3.0g

氯化鈉5.0g

蒸餾水1000mL

A.1.2制法

將以上成分混合加熱溶解，冷卻至25℃左右校正pH至7.4±0.2，分裝適當(dāng)?shù)娜萜鳌?21℃滅菌

15min。

A.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液

A.2.1成分

A.2.1.1基礎(chǔ)液

A.2.1.1.1成分

蛋白胨9.0g

牛肉浸粉4.5g

氯化鈉2.7g

碳酸鈣40.5g

硫代硫酸鈉（含5個(gè)結(jié)晶水）50.0g

牛膽鹽5.0g

蒸餾水1000mL

A.2.1.1.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解。煮沸，無(wú)須高壓滅菌。煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為

7.6±0.2。

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A.2.1.2碘溶液

A.2.1.2.1成分

碘化鉀25.0g

碘20.0g

蒸餾水100mL

A.2.1.2.2制法

將碘化鉀溶解于少量的蒸餾水中，再加入碘，振搖至碘全部溶解。加蒸餾水至100mL，轉(zhuǎn)入棕色瓶

內(nèi)，塞緊瓶塞冷藏貯存。

A.2.1.3煌綠溶液

A.2.1.3.1成分

煌綠0.5g

蒸餾水100mL

A.2.1.3.2制法

將煌綠在蒸餾水中溶解后，存放在冷暗處不少于1d。

A.2.2制法

使用的當(dāng)天，在冷卻后的1000mL基礎(chǔ)液中以無(wú)菌操作加入煌綠溶液2.0mL搖勻，加入碘溶液

20.0mL，再搖勻，分裝到無(wú)菌試管中。加入煌綠和碘液的培養(yǎng)基當(dāng)天使用，且不應(yīng)再次加熱。

A.3氯化鎂孔雀綠大豆胨（RVS）增菌液

A.3.1成分

大豆蛋白胨4.5g

氯化鈉7.2g

磷酸二氫鉀1.26g

磷酸氫二鉀0.18g

氯化鎂（含6個(gè)結(jié)晶水）28.6g

孔雀綠0.036g

蒸餾水1000mL

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A.3.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH，定量分裝于試管中，115℃高壓滅菌15min。

滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為5.2±0.2。

A.4堿性蛋白胨水培養(yǎng)基

A.4.1成分

蛋白胨20.0g

氯化鈉20.0g

蒸餾水1000mL

A.4.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。分裝，121℃高壓滅菌15min。滅菌后的

培養(yǎng)基在25℃的pH為8.6±0.2。

A.5亞硫酸鉍（BS）瓊脂

A.5.1成分

蛋白胨10.0g

牛肉浸粉5.0g

葡萄糖5.0g

硫酸亞鐵0.3g

磷酸氫二鈉4.0g

煌綠0.025g

檸檬酸鉍銨2.0g

亞硫酸鈉6.0g

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

A.5.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸，勿過(guò)度加熱，勿高壓滅菌。冷卻至

48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.5±0.2。

注：本培養(yǎng)基于臨用前一天制備并傾注平皿，在室溫暗處保存，第二天使用。制備完成的培養(yǎng)基保存時(shí)間超過(guò)48h

會(huì)降低其選擇性。

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A.6HE瓊脂

A.6.1成分

蛋白胨12.0g

牛肉浸粉3.0g

乳糖12.0g

蔗糖12.0g

水楊苷2.0g

膽鹽20.0g

氯化鈉5.0g

硫代硫酸鈉6.8g

檸檬酸鐵銨0.8g

脫氧膽酸鈉2.0g

酸性品紅0.1g

溴麝香草酚藍(lán)0.064g

瓊脂18.0g

蒸餾水1000mL

A.6.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸，勿過(guò)度加熱，勿高壓滅菌。冷卻至

48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.5±0.2。

A.7木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂

A.7.1成分

酵母浸粉3.0g

L?賴氨酸5.0g

木糖3.75g

乳糖7.5g

蔗糖7.5g

脫氧膽酸鈉2.5g

檸檬酸鐵銨0.8g

硫代硫酸鈉6.8g

氯化鈉5.0g

酚紅0.08g

瓊脂15.0g

蒸餾水1000mL

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A.7.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸，勿過(guò)度加熱，勿高壓滅菌。冷卻至

48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.4±0.2。

A.8麥康凱（MAC）瓊脂

A.8.1成分

蛋白胨20.0g

乳糖10.0g

3號(hào)膽鹽1.5g

氯化鈉5.0g

中性紅0.03g

結(jié)晶紫0.001g

瓊脂15.0g

蒸餾水1000mL

A.8.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH，121℃高壓滅菌15min。冷卻至

48℃±2℃，傾注平板，滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.2±0.2。

A.9慶大霉素瓊脂

A.9.1成分

蛋白胨14.8g

牛肉粉3.0g

氯化鈉5.0g

蔗糖10.0g

枸櫞酸鈉10.0g

亞硫酸鈉3.0g

多黏菌素B6000IU

慶大霉素500IU

亞碲酸鉀0.01g

瓊脂12.0g

蒸餾水1000mL

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A.9.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸，勿過(guò)度加熱，勿高壓滅菌，冷卻至

55℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為8.4±0.2。

A.10硫代硫酸鹽?檸檬酸鹽?膽鹽?蔗糖（TCBS）瓊脂

A.10.1成分

蛋白胨10.0g

酵母浸膏5.0g

CHONa2HO10.0g

檸檬酸鈉（6573·2）

NaSO5HO10.0g

硫代硫酸鈉（223·2）

氯化鈉10.0g

牛膽汁粉5.0g

檸檬酸鐵1.0g

膽酸鈉3.0g

蔗糖20.0g

溴麝香草酚藍(lán)0.04g

麝香草酚藍(lán)0.04g

瓊脂15.0g

蒸餾水1000mL

A.10.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸，勿過(guò)度加熱，勿高壓滅菌，冷卻至

48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為8.6±0.2。

A.11四號(hào)瓊脂

A.11.1成分

蛋白胨20.0g

牛肉膏粉5.0g

氯化鈉5.0g

無(wú)水亞硫酸鈉3.0g

十二烷基硫酸鈉0.5g

雷佛奴爾0.03g

豬膽汁粉5.0g

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慶大霉素500U

瓊脂15.0g

蒸餾水1000mL

A.11.2制法

將各成分溶于蒸餾水中，校正pH至8.5±0.2，加熱煮沸至完全溶解。冷至50℃左右，每100mL加

入0.1mL通過(guò)0.22μm孔徑濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液，搖勻，傾注平板。

A.12堿性營(yíng)養(yǎng)瓊脂

A.12.1成分

蛋白胨10.0g

牛肉粉3.0g

氯化鈉5.0g

瓊脂13.0g

蒸餾水1000mL

A.12.2制法

將各成分加入蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。分裝后121℃高壓滅菌15min。滅

菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為8.4±0.2。

A.13三糖鐵（TSI）瓊脂

A.13.1成分

蛋白胨20.0g

牛肉浸粉5.0g

乳糖10.0g

蔗糖10.0g

葡萄糖1.0g

酚紅0.025g

氯化鈉5.0g

硫酸亞鐵銨（含6個(gè)結(jié)晶水）0.2g

硫代硫酸鈉0.2g

瓊脂12.0g

蒸餾水1000mL

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A.13.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。定量分裝于試管中，115℃高壓滅菌

15min。滅菌后制成斜面，底層深度不小于2.5cm。滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.4±0.2。

A.14克氏雙糖鐵（KIA）瓊脂

A.14.1成分

蛋白胨20.0g

牛肉膏3.0g

酵母膏3.0g

山梨醇20.0g

葡萄糖1.0g

氯化鈉5.0g

檸檬酸鐵銨0.5g

硫代硫酸鈉0.5g

瓊脂12.0g

酚紅0.025g

蒸餾水1000mL

A.14.2制法

將酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，校正pH至7.4±0.2，加入0.2%的酚紅溶

液12.5mL，搖勻，分裝試管，裝量宜多些，以便得到比較高的底層，121℃高壓滅菌15min，放置高層斜面

備用。

A.15糖發(fā)酵培養(yǎng)基

A.15.1成分

蛋白胨10.0g

牛肉浸粉5.0g

氯化鈉3.0g

磷酸氫二鈉（含12個(gè)結(jié)晶水）2.0g

溴麝香草酚藍(lán)溶液0.025g

蒸餾水1000mL

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A.15.2制法

將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH，121℃高壓滅菌15min。冷卻后加入終濃

度為0.5%~1%的無(wú)水糖溶液，分裝。滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.4±0.2。

A.15.3試驗(yàn)方法

挑取少量培養(yǎng)物接種于糖發(fā)酵管36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者為陽(yáng)性。

對(duì)于培養(yǎng)48h后，懷疑為乳糖遲緩發(fā)酵者，可繼續(xù)培養(yǎng)至3d~5d再觀察結(jié)果。

A.16氧化酶試劑

A.16.1成分

N，N，N'，N'?四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽1.0g

蒸餾水100.0mL

A.16.2制法

將N，N，N'，N'?四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽溶于蒸餾水中，2℃~5℃冰箱內(nèi)避光保