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文檔簡(jiǎn)介
ICS03.080
CCSC00
江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)
DB32/T4644.4—2025
從業(yè)人員健康檢查第4部分:
傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂
弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法
Healthexaminationofemployees—
Part4:DetectionmethodsofSalmonellatyphimurium,Salmonella
paratyphi,Vibriocholerae,ShigellaandEntamoebahistolytica
2025?02?21發(fā)布2025?03?21實(shí)施
江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布
中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版
DB32/T4644.4—2025
目次
前言……………………………Ⅲ
引言……………………………Ⅳ
1范圍…………………………1
2規(guī)范性引用文件……………1
3術(shù)語(yǔ)和定義…………………1
4縮略語(yǔ)………………………1
5方法原理……………………2
6設(shè)備與材料…………………2
7培養(yǎng)基和試劑………………3
8檢驗(yàn)程序……………………4
9操作步驟……………………4
10生物安全……………………8
附錄A(資料性)培養(yǎng)基和試劑………………9
附錄B(規(guī)范性)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)反應(yīng)體系及注意事項(xiàng)………………19
Ⅰ
DB32/T4644.4—2025
前言
本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定
起草。
本文件是DB32/T4644《從業(yè)人員健康檢查》的第4部分。DB32/T4644已經(jīng)發(fā)布了以下部分:
——第1部分:檢查機(jī)構(gòu)管理規(guī)范;
——第2部分:健康檢查技術(shù)規(guī)范;
——第3部分:質(zhì)量控制規(guī)范;
——第4部分:傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法;
——第5部分:信息系統(tǒng)基本數(shù)據(jù)集。
請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。
本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出并組織實(shí)施。
本文件由江蘇省衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。
本文件起草單位:江蘇省疾病預(yù)防控制中心、南京市疾病預(yù)防控制中心、徐州市疾病預(yù)防控制中心、
深圳市職業(yè)病防治院、赤峰眾康生物科技有限公司。
本文件主要起草人:霍翔、喬昕、王燕梅、馬愷、朱寶立、王雨瀟、李曄、徐光、韓磊、李亞波、郭寶福、
苗升浩。
Ⅲ
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引言
從業(yè)人員健康檢查是根據(jù)《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》《中華人民共和國(guó)食品安全法》《中華人民
共和國(guó)藥品管理法》《公共場(chǎng)所衛(wèi)生管理?xiàng)l例》《生活飲用水衛(wèi)生監(jiān)督管理辦法》《化妝品衛(wèi)生管理?xiàng)l例》等
法律法規(guī)所進(jìn)行的從業(yè)前、從業(yè)期間的健康檢查。
DB32/T4644《從業(yè)人員健康檢查》分為以下5個(gè)部分:
——第1部分:檢查機(jī)構(gòu)管理規(guī)范;
——第2部分:健康檢查技術(shù)規(guī)范;
——第3部分:質(zhì)量控制規(guī)范;
——第4部分:傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法;
——第5部分:信息系統(tǒng)基本數(shù)據(jù)集。
DB32/T4644的制定是對(duì)從業(yè)人員健康檢查工作相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的有力補(bǔ)充,對(duì)貫徹落實(shí)
《“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要》、推進(jìn)健康中國(guó)建設(shè)、提高人民健康水平、保障公眾健康和公共衛(wèi)生安全具
有重要意義。
Ⅳ
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從業(yè)人員健康檢查第4部分:
傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂
弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法
1范圍
本文件描述了從業(yè)人員健康檢查糞便標(biāo)本(肛拭子)中傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志
賀氏菌和痢疾阿米巴的檢驗(yàn)方法。
本文件適用于公共場(chǎng)所從業(yè)人員、食品生產(chǎn)和加工人員、食品流通和餐飲服務(wù)人員、飲用水生產(chǎn)、經(jīng)
營(yíng)人員健康檢查項(xiàng)目中糞便標(biāo)本(肛拭子)的傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾
阿米巴的檢驗(yàn),醫(yī)療衛(wèi)生用品、化妝品等相關(guān)行業(yè)從業(yè)人員的健康檢查可參照?qǐng)?zhí)行。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文
件,僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本
文件。
GB4789.4食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)
GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求
WS280傷寒和副傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)
WS287細(xì)菌性和阿米巴性痢疾診斷標(biāo)準(zhǔn)
WS289霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)
3術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。
3.1
實(shí)時(shí)熒光PCRreal?timePCR
實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
3.2
Ct值cyclethreshold
每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
4縮略語(yǔ)
BS:亞硫酸鉍瓊脂(BismuthSulfiteAgar)
CY5:磺酸基?CY5羧酸(Cyanine5)
DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)
FAM:6?羧基熒光素(6?carboxyfluorescein)
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LDC:賴氨酸脫羧酶(LysineDecarboxylase)
MAC:麥康凱瓊脂(MacConkeyAgar)
NB:營(yíng)養(yǎng)肉湯(NutrientBroth)
NP?40:乙基苯基聚乙二醇(NonidetP?40)
Taq酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)
TCBS:硫代硫酸鹽?檸檬酸鹽?膽鹽?蔗糖瓊脂(TCBSAgar)
TSI:三糖鐵瓊脂(TripleSugarIronAgar)
UNG酶:尿嘧啶DNA糖基酶(UracilDNAglycosylase)
VIC:琥珀酰亞胺酯(FluoresceinAmidite)
XLD:木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(Xylose?LysineDesoxycholateAgar)
5方法原理
5.1篩查試驗(yàn)
5.1.1依據(jù)核酸體外擴(kuò)增基本原理,針對(duì)傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿
米巴特異靶基因序列設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記探針,在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)過(guò)程中,當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到并超過(guò)所
設(shè)定的閾值時(shí),利用熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量的正相關(guān)關(guān)系,即可對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果進(jìn)行分析和
判定。
5.1.2對(duì)標(biāo)本的模板
DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增,根據(jù)其Ct值及擴(kuò)增曲線進(jìn)行標(biāo)本結(jié)果報(bào)告,當(dāng)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果呈
陰性時(shí)直接報(bào)告陰性結(jié)果;當(dāng)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果呈陽(yáng)性時(shí),進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本做確證試驗(yàn)。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)
從業(yè)人員健康檢查糞便標(biāo)本(肛拭子)中的傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿
米巴的快速篩查。
5.2確證試驗(yàn)
通過(guò)增菌、分離、生化和血清學(xué)鑒定等方法,從實(shí)時(shí)熒光PCR陽(yáng)性標(biāo)本中分離得到目標(biāo)病原體。結(jié)
果為陽(yáng)性時(shí)報(bào)告陽(yáng)性(檢出),結(jié)果為陰性時(shí)報(bào)告陰性(未檢出)。
6設(shè)備與材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,包括但不限于以下設(shè)備和材料。
6.1Ⅱ級(jí)生物安全柜。
6.2冰箱:2℃~8℃和-20℃。
6.3恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃、37℃±1℃、42℃±1℃。
6.4電子天平:分度值為0.1g和0.01g。
6.5離心機(jī):離心力≥12000×g。
6.6pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。
6.7渦旋混勻器。
6.8恒溫金屬浴/水浴鍋:25℃~100℃。
6.9實(shí)時(shí)熒光PCR儀。
2
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6.10全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。
6.11微生物飛行質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)。
6.12無(wú)菌錐形瓶:容量500mL、250mL。
6.13無(wú)菌試管:10mm×75mm、15mm×150mm或其他合適規(guī)格。
6.14無(wú)菌小玻管:3mm×50mm。
6.15無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑90mm。
6.16無(wú)菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
6.17微量可調(diào)移液器和配套帶濾芯吸頭:2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL。
6.18采樣管:密閉式。
6.19采樣拭子:長(zhǎng)度≥10cm。
6.20PCR反應(yīng)管。
7培養(yǎng)基和試劑
7.1營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)增菌液:見(jiàn)A.1。
7.2四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液:見(jiàn)A.2。
7.3氯化鎂孔雀綠大豆胨(RVS)增菌液:見(jiàn)A.3。
7.4堿性蛋白胨水培養(yǎng)基:見(jiàn)A.4。
7.5亞硫酸鉍(BS)瓊脂:見(jiàn)A.5。
7.6HE瓊脂:見(jiàn)A.6。
7.7木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂:見(jiàn)A.7。
7.8麥康凱(MAC)瓊脂:見(jiàn)A.8。
7.9慶大霉素瓊脂:見(jiàn)A.9。
7.10硫代硫酸鹽?檸檬酸鹽?膽鹽?蔗糖(TCBS)瓊脂:見(jiàn)A.10。
7.11四號(hào)瓊脂:見(jiàn)A.11。
7.12堿性營(yíng)養(yǎng)瓊脂:見(jiàn)A.12。
7.13三糖鐵(TSI)瓊脂:見(jiàn)A.13。
7.14克氏雙糖鐵(KIA)瓊脂:見(jiàn)A.14。
7.15糖發(fā)酵培養(yǎng)基:見(jiàn)A.15。
7.16氧化酶試劑:見(jiàn)A.16。
7.17賴氨酸脫羧酶(LDC)試驗(yàn)培養(yǎng)基:見(jiàn)A.17。
7.18動(dòng)力?靛基質(zhì)?尿素半固體(MIU)瓊脂:見(jiàn)A.18。
7.19沙門氏菌顯色培養(yǎng)基。
7.20沙門氏菌診斷血清。
7.21志賀氏菌診斷血清。
7.22霍亂弧菌診斷血清。
7.23除特別說(shuō)明外,PCR所用化學(xué)試劑為分析純。所有試劑均用無(wú)DNA酶污染的容器分裝。
7.24DNA提取液:Tris?EDTA緩沖液(0.01mol/L,pH8.0)、0.01%NP40。
7.25實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑:傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴熒光
PCR檢測(cè)靶基因、反應(yīng)體系及注意事項(xiàng)應(yīng)符合附錄B。
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8檢驗(yàn)程序
傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。
FK
8
F
1$3K
81$3
1$3K
!K!8
!K
B!81$3K
+*K1
1$3K
!8L
81$3K
8
.
1J
*GN=BA=#
!K!8
!K!8
!K!8
+*
+
!K!8
B!
!K!8
B!K!8
B!8L
K1
*K1
8L
8!8L
8
8+*K1
圖1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)程序
9操作步驟
9.1標(biāo)本采集、保存及運(yùn)輸
9.1.1標(biāo)本采集
用滅菌的采樣拭子,由肛門插入直腸內(nèi)3cm~5cm處,旋轉(zhuǎn)360°采集,或用采樣拭子蘸取適量糞便,
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放入盛有1mL~3mL生理鹽水的采樣管內(nèi),旋緊管蓋,編號(hào)備用。
9.1.2標(biāo)本的保存和運(yùn)輸
采集的標(biāo)本盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè),如不能立即送檢,在2℃~8℃條件下保存不超過(guò)24h。
9.2標(biāo)本的前處理
9.2.1前增菌
將標(biāo)本充分混勻,吸取勻液1mL加入到4mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中,置于36℃±1℃增菌培養(yǎng)3h~6h。
9.2.2標(biāo)本混合
9.2.2.1根據(jù)樣本數(shù)量,取n個(gè)無(wú)菌的1.5mL離心管或合適容量篩選管作為混合管,分別編號(hào)。
9.2.2.2每份標(biāo)本取增菌液100μL,分別依次加入到混合管中。根據(jù)實(shí)際情況,將5~10份標(biāo)本混合成
1份混合標(biāo)本。
9.2.2.3標(biāo)本混合時(shí),應(yīng)防止操作人員和環(huán)境污染。混合完成后,使用渦旋振蕩器進(jìn)行混勻,再進(jìn)行實(shí)
時(shí)熒光PCR檢測(cè)。
9.2.2.4如混合標(biāo)本PCR檢測(cè)為陰性,判定混合標(biāo)本所代表的全部標(biāo)本為陰性。如混合標(biāo)本PCR檢測(cè)
為某種致病微生物陽(yáng)性,則再對(duì)混合標(biāo)本中的每一份標(biāo)本按9.4進(jìn)行確證試驗(yàn),以確定具體陽(yáng)性標(biāo)本。
9.3篩查試驗(yàn)
9.3.1DNA模板的制備
標(biāo)本12000×g離心5min,棄上清;加入50μL~100μLDNA取液,重懸沉淀并充分混合后100℃加
熱處理5min,12000×g離心2min,取5μL上清液,作為模板DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。若不能及
時(shí)檢測(cè),應(yīng)存放于-20℃以下保存,并盡快完成檢測(cè)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況,也可使用商品化試劑盒制
備DNA模板。
9.3.2PCR反應(yīng)體系
總反應(yīng)體系體積為25μL:PCR反應(yīng)液20μL(含有特異性引物、dNTP、探針及反應(yīng)所需各種離子
19.64μL,1U/μLUNG酶0.06μL,5U/μLTaq酶0.3μL),模板DNA5μL。反應(yīng)體系按照附錄B
執(zhí)行。
9.3.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)
9.3.3.1將9.3.2中瞬時(shí)離心后的PCR反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR儀內(nèi),記錄標(biāo)本擺放順序,進(jìn)行核酸
擴(kuò)增和檢測(cè)。
9.3.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件:50℃預(yù)熱2min;95℃預(yù)變性2min;95℃變性5s、60℃退火延伸30s
(同時(shí)采集FAM、VIC和CY5熒光信號(hào)),進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
9.3.4對(duì)照設(shè)置
檢測(cè)過(guò)程(包括DNA提取)中,每個(gè)反應(yīng)均應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。其中陽(yáng)性對(duì)照模
板為擴(kuò)增片段的陽(yáng)性克隆分子DNA或標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA,陰性對(duì)照模板為大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA,空
白對(duì)照為滅菌去離子水。
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9.3.5結(jié)果判讀
9.3.5.1對(duì)照的結(jié)果判讀
陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線,Ct值≤30;陰性對(duì)照無(wú)典型擴(kuò)增曲線或Ct值≥40;空白對(duì)照無(wú)典型擴(kuò)
增曲線或Ct值≥40。否則,此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果視為無(wú)效。
9.3.5.2樣品的結(jié)果判定和報(bào)告
9.3.5.2.1FAM通道Ct值>40或無(wú)Ct值,可判定標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為傷寒沙門氏菌(A管)和(或)痢疾阿
米巴(B管)陰性,可直接報(bào)告未檢出傷寒沙門氏菌和(或)痢疾阿米巴;VIC通道Ct值>40或無(wú)Ct值,可判
定標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為副傷寒沙門氏菌(A管)陰性,可直接報(bào)告未檢出副傷寒沙門氏菌;CY5通道Ct值>40
或無(wú)Ct值,可判定標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為霍亂弧菌(A管)和(或)志賀氏菌(B管)陰性,可直接報(bào)告未檢出霍亂
弧菌和(或)志賀氏菌。
9.3.5.2.2FAM通道Ct值<35,有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,可判定該標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為傷寒沙門氏菌(A管)和
(或)痢疾阿米巴(B管)陽(yáng)性;VIC通道Ct值<35,有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,可判定該標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為副傷寒沙
門氏菌(A管)陽(yáng)性;CY5通道Ct值<35,有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,可判定該標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為霍亂弧菌(A管)
和(或)志賀氏菌(B管)陽(yáng)性。見(jiàn)表1。
表1檢測(cè)結(jié)果判定表
FAMVICCY5
A管傷寒沙門氏菌副傷寒沙門氏菌霍亂弧菌
B管痢疾阿米巴—志賀氏菌
9.3.5.2.3FAM通道、VIC通道和(或)CY5通道35≤Ct值≤40,重新做實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。若重新檢
測(cè)結(jié)果的Ct值≥40,則判定為相應(yīng)病原體陰性,否則判定為陽(yáng)性。
9.3.5.2.4如用商品化實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒,應(yīng)按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判定。
9.3.5.3PCR陽(yáng)性混合標(biāo)本確認(rèn)
對(duì)PCR結(jié)果為陽(yáng)性的混合標(biāo)本,依據(jù)9.4確證試驗(yàn)做進(jìn)一步的確認(rèn)。
9.4確證試驗(yàn)
9.4.1增菌
9.4.1.1混合標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為傷寒沙門氏菌或副傷寒沙門氏菌陽(yáng)性時(shí),將混合前的所有
個(gè)標(biāo)本分別接種于RVS增菌液中42℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,同時(shí)接種TTB增菌液中42℃±1℃培養(yǎng)
18h~24h。
9.4.1.2混合標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為志賀氏菌陽(yáng)性時(shí),無(wú)須增菌,將混合前的所有單個(gè)標(biāo)本直
接分別分離培養(yǎng)。
9.4.1.3混合標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果為霍亂弧菌陽(yáng)性時(shí),將混合前的所有單個(gè)標(biāo)本分別接種于堿
性蛋白胨水培養(yǎng)基中36℃±1℃增菌培養(yǎng)6h~8h。
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9.4.2分離培養(yǎng)
9.4.2.1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌:按照GB4789.4進(jìn)行檢測(cè)。
9.4.2.2志賀氏菌:取前增菌液1環(huán),劃線接種于MAC或XLD瓊脂平板,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,
志賀氏菌呈現(xiàn)不發(fā)酵乳糖的菌落,見(jiàn)表2。
表2志賀菌屬在MAC和XLD瓊脂平板上的菌落特征
選擇性瓊脂平板志賀氏菌
形成圓形、隆起、無(wú)色、透明、直徑2mm~3mm、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的菌落。宋內(nèi)氏志賀菌菌
MAC瓊脂
落較大,不透明,培養(yǎng)時(shí)間稍長(zhǎng)易形成淡粉紅色、扁平的粗糙菌落
XLD瓊脂紅色透明狀、表面光滑、濕潤(rùn)、隆起、邊緣整齊的菌落
9.4.2.3霍亂弧菌:取增菌液1環(huán),劃線接種于強(qiáng)、弱選擇性培養(yǎng)基各一塊置37℃培養(yǎng)18h~24h。強(qiáng)選
擇性培養(yǎng)基包括慶大霉素瓊脂、TCBS瓊脂和四號(hào)瓊脂,弱選擇性培養(yǎng)基一般使用堿性營(yíng)養(yǎng)瓊脂。霍亂
弧菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征見(jiàn)表3。
表3霍亂弧菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征
選擇性瓊脂平板霍亂弧菌
無(wú)色、圓形、透明或半透明、表面光滑、潤(rùn)濕、扁平或稍凸起、邊緣整齊,菌落直徑一般約為
堿性營(yíng)養(yǎng)瓊脂
2mm
與堿性營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)的菌落相似,但透明性略差,多呈半透明狀,由于這類培養(yǎng)基均含
慶大霉素瓊脂和四號(hào)瓊脂
有亞碲酸鹽成分,菌落中央常呈灰色或灰黑色,并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而加深
TCBS瓊脂黃色發(fā)亮、表面光滑、潤(rùn)濕、稍凸起、邊緣整齊
9.4.3菌株鑒定
9.4.3.1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌
按照WS280進(jìn)行檢測(cè)。可選擇生化鑒定試劑盒、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)或微生物飛行質(zhì)譜鑒
定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
9.4.3.2志賀氏菌
按照WS287進(jìn)行檢測(cè)。可選擇生化鑒定試劑盒、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。
9.4.3.3霍亂弧菌
9.4.3.3.1菌株初篩
按照WS289進(jìn)行檢測(cè)。包括玻片凝集試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)。
9.4.3.3.2菌株復(fù)核
9.4.3.3.2.1經(jīng)初篩陽(yáng)性或可疑陽(yáng)性的菌株,應(yīng)該進(jìn)行復(fù)核鑒定。按照WS289進(jìn)行檢測(cè)。可選擇生化
鑒定試劑盒、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)或微生物飛行質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)。
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9.4.3.3.2.2復(fù)核結(jié)果符合O1群或O139群霍亂弧菌的菌株,按菌株管理的要求保存與上送;如復(fù)核結(jié)
果出現(xiàn)疑問(wèn),應(yīng)盡快將菌株上送參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)分析。
9.4.4血清學(xué)分型
9.4.4.1自凝性檢查
傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、志賀氏菌采用玻片凝集試驗(yàn)。一般采用瓊脂含量為1.2%~1.5%
的純培養(yǎng)物進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。首先用生理鹽水進(jìn)行自凝性檢測(cè)。若菌體在生理鹽水中凝集,即認(rèn)為有
自凝性,反之無(wú)自凝性。對(duì)無(wú)自凝的培養(yǎng)物參照下面方法進(jìn)行血清學(xué)鑒定。
9.4.4.2傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌血清分型
按照WS280進(jìn)行檢測(cè)。
9.4.4.3志賀氏菌血清分型
按照WS287—2008中A.1進(jìn)行檢測(cè)。
9.4.5痢疾阿米巴檢驗(yàn)
PCR檢測(cè)結(jié)果為痢疾阿米巴陽(yáng)性時(shí),需重新采集病人糞便,按照WS287—2008中A.2進(jìn)行檢測(cè)。
9.5結(jié)果報(bào)告
根據(jù)確證試驗(yàn)結(jié)果對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR陽(yáng)性標(biāo)本作出最終結(jié)果判定和菌型判定。
10生物安全
標(biāo)本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、保存和檢驗(yàn)等活動(dòng),按照GB19489相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
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附錄A
(資料性)
培養(yǎng)基和試劑
A.1營(yíng)養(yǎng)肉湯
A.1.1成分
蛋白胨10.0g
牛肉膏3.0g
氯化鈉5.0g
蒸餾水1000mL
A.1.2制法
將以上成分混合加熱溶解,冷卻至25℃左右校正pH至7.4±0.2,分裝適當(dāng)?shù)娜萜鳌?21℃滅菌
15min。
A.2四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液
A.2.1成分
A.2.1.1基礎(chǔ)液
A.2.1.1.1成分
蛋白胨9.0g
牛肉浸粉4.5g
氯化鈉2.7g
碳酸鈣40.5g
硫代硫酸鈉(含5個(gè)結(jié)晶水)50.0g
牛膽鹽5.0g
蒸餾水1000mL
A.2.1.1.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解。煮沸,無(wú)須高壓滅菌。煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為
7.6±0.2。
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A.2.1.2碘溶液
A.2.1.2.1成分
碘化鉀25.0g
碘20.0g
蒸餾水100mL
A.2.1.2.2制法
將碘化鉀溶解于少量的蒸餾水中,再加入碘,振搖至碘全部溶解。加蒸餾水至100mL,轉(zhuǎn)入棕色瓶
內(nèi),塞緊瓶塞冷藏貯存。
A.2.1.3煌綠溶液
A.2.1.3.1成分
煌綠0.5g
蒸餾水100mL
A.2.1.3.2制法
將煌綠在蒸餾水中溶解后,存放在冷暗處不少于1d。
A.2.2制法
使用的當(dāng)天,在冷卻后的1000mL基礎(chǔ)液中以無(wú)菌操作加入煌綠溶液2.0mL搖勻,加入碘溶液
20.0mL,再搖勻,分裝到無(wú)菌試管中。加入煌綠和碘液的培養(yǎng)基當(dāng)天使用,且不應(yīng)再次加熱。
A.3氯化鎂孔雀綠大豆胨(RVS)增菌液
A.3.1成分
大豆蛋白胨4.5g
氯化鈉7.2g
磷酸二氫鉀1.26g
磷酸氫二鉀0.18g
氯化鎂(含6個(gè)結(jié)晶水)28.6g
孔雀綠0.036g
蒸餾水1000mL
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A.3.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH,定量分裝于試管中,115℃高壓滅菌15min。
滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為5.2±0.2。
A.4堿性蛋白胨水培養(yǎng)基
A.4.1成分
蛋白胨20.0g
氯化鈉20.0g
蒸餾水1000mL
A.4.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。分裝,121℃高壓滅菌15min。滅菌后的
培養(yǎng)基在25℃的pH為8.6±0.2。
A.5亞硫酸鉍(BS)瓊脂
A.5.1成分
蛋白胨10.0g
牛肉浸粉5.0g
葡萄糖5.0g
硫酸亞鐵0.3g
磷酸氫二鈉4.0g
煌綠0.025g
檸檬酸鉍銨2.0g
亞硫酸鈉6.0g
瓊脂18.0g
蒸餾水1000mL
A.5.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸,勿過(guò)度加熱,勿高壓滅菌。冷卻至
48℃±2℃傾注平皿,煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.5±0.2。
注:本培養(yǎng)基于臨用前一天制備并傾注平皿,在室溫暗處保存,第二天使用。制備完成的培養(yǎng)基保存時(shí)間超過(guò)48h
會(huì)降低其選擇性。
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A.6HE瓊脂
A.6.1成分
蛋白胨12.0g
牛肉浸粉3.0g
乳糖12.0g
蔗糖12.0g
水楊苷2.0g
膽鹽20.0g
氯化鈉5.0g
硫代硫酸鈉6.8g
檸檬酸鐵銨0.8g
脫氧膽酸鈉2.0g
酸性品紅0.1g
溴麝香草酚藍(lán)0.064g
瓊脂18.0g
蒸餾水1000mL
A.6.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸,勿過(guò)度加熱,勿高壓滅菌。冷卻至
48℃±2℃傾注平皿,煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.5±0.2。
A.7木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂
A.7.1成分
酵母浸粉3.0g
L?賴氨酸5.0g
木糖3.75g
乳糖7.5g
蔗糖7.5g
脫氧膽酸鈉2.5g
檸檬酸鐵銨0.8g
硫代硫酸鈉6.8g
氯化鈉5.0g
酚紅0.08g
瓊脂15.0g
蒸餾水1000mL
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A.7.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸,勿過(guò)度加熱,勿高壓滅菌。冷卻至
48℃±2℃傾注平皿,煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.4±0.2。
A.8麥康凱(MAC)瓊脂
A.8.1成分
蛋白胨20.0g
乳糖10.0g
3號(hào)膽鹽1.5g
氯化鈉5.0g
中性紅0.03g
結(jié)晶紫0.001g
瓊脂15.0g
蒸餾水1000mL
A.8.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH,121℃高壓滅菌15min。冷卻至
48℃±2℃,傾注平板,滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.2±0.2。
A.9慶大霉素瓊脂
A.9.1成分
蛋白胨14.8g
牛肉粉3.0g
氯化鈉5.0g
蔗糖10.0g
枸櫞酸鈉10.0g
亞硫酸鈉3.0g
多黏菌素B6000IU
慶大霉素500IU
亞碲酸鉀0.01g
瓊脂12.0g
蒸餾水1000mL
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A.9.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸,勿過(guò)度加熱,勿高壓滅菌,冷卻至
55℃±2℃傾注平皿,煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為8.4±0.2。
A.10硫代硫酸鹽?檸檬酸鹽?膽鹽?蔗糖(TCBS)瓊脂
A.10.1成分
蛋白胨10.0g
酵母浸膏5.0g
CHONa2HO10.0g
檸檬酸鈉(6573·2)
NaSO5HO10.0g
硫代硫酸鈉(223·2)
氯化鈉10.0g
牛膽汁粉5.0g
檸檬酸鐵1.0g
膽酸鈉3.0g
蔗糖20.0g
溴麝香草酚藍(lán)0.04g
麝香草酚藍(lán)0.04g
瓊脂15.0g
蒸餾水1000mL
A.10.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸,勿過(guò)度加熱,勿高壓滅菌,冷卻至
48℃±2℃傾注平皿,煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為8.6±0.2。
A.11四號(hào)瓊脂
A.11.1成分
蛋白胨20.0g
牛肉膏粉5.0g
氯化鈉5.0g
無(wú)水亞硫酸鈉3.0g
十二烷基硫酸鈉0.5g
雷佛奴爾0.03g
豬膽汁粉5.0g
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慶大霉素500U
瓊脂15.0g
蒸餾水1000mL
A.11.2制法
將各成分溶于蒸餾水中,校正pH至8.5±0.2,加熱煮沸至完全溶解。冷至50℃左右,每100mL加
入0.1mL通過(guò)0.22μm孔徑濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液,搖勻,傾注平板。
A.12堿性營(yíng)養(yǎng)瓊脂
A.12.1成分
蛋白胨10.0g
牛肉粉3.0g
氯化鈉5.0g
瓊脂13.0g
蒸餾水1000mL
A.12.2制法
將各成分加入蒸餾水中,加熱煮沸至完全溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。分裝后121℃高壓滅菌15min。滅
菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為8.4±0.2。
A.13三糖鐵(TSI)瓊脂
A.13.1成分
蛋白胨20.0g
牛肉浸粉5.0g
乳糖10.0g
蔗糖10.0g
葡萄糖1.0g
酚紅0.025g
氯化鈉5.0g
硫酸亞鐵銨(含6個(gè)結(jié)晶水)0.2g
硫代硫酸鈉0.2g
瓊脂12.0g
蒸餾水1000mL
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A.13.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。定量分裝于試管中,115℃高壓滅菌
15min。滅菌后制成斜面,底層深度不小于2.5cm。滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.4±0.2。
A.14克氏雙糖鐵(KIA)瓊脂
A.14.1成分
蛋白胨20.0g
牛肉膏3.0g
酵母膏3.0g
山梨醇20.0g
葡萄糖1.0g
氯化鈉5.0g
檸檬酸鐵銨0.5g
硫代硫酸鈉0.5g
瓊脂12.0g
酚紅0.025g
蒸餾水1000mL
A.14.2制法
將酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,校正pH至7.4±0.2,加入0.2%的酚紅溶
液12.5mL,搖勻,分裝試管,裝量宜多些,以便得到比較高的底層,121℃高壓滅菌15min,放置高層斜面
備用。
A.15糖發(fā)酵培養(yǎng)基
A.15.1成分
蛋白胨10.0g
牛肉浸粉5.0g
氯化鈉3.0g
磷酸氫二鈉(含12個(gè)結(jié)晶水)2.0g
溴麝香草酚藍(lán)溶液0.025g
蒸餾水1000mL
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A.15.2制法
將各成分加入蒸餾水中,攪勻后加熱溶解,必要時(shí)調(diào)節(jié)pH,121℃高壓滅菌15min。冷卻后加入終濃
度為0.5%~1%的無(wú)水糖溶液,分裝。滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.4±0.2。
A.15.3試驗(yàn)方法
挑取少量培養(yǎng)物接種于糖發(fā)酵管36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者為陽(yáng)性。
對(duì)于培養(yǎng)48h后,懷疑為乳糖遲緩發(fā)酵者,可繼續(xù)培養(yǎng)至3d~5d再觀察結(jié)果。
A.16氧化酶試劑
A.16.1成分
N,N,N',N'?四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽1.0g
蒸餾水100.0mL
A.16.2制法
將N,N,N',N'?四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽溶于蒸餾水中,2℃~5℃冰箱內(nèi)避光保
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