獸醫微生物實臉

實驗一坡璃器皿的準備及常用儀器的使用

［目的］

系統掌握坡璃器皿的準備方法及常用儀器的使用。

一、坡璃器皿的無害處理：

1、新購置的坡璃器皿因含有游離堿，一般在2%的鹽酸溶液中浸泡數小時后再用

清水洗凈,也可在洗衣粉水中煮30-60min,取出用清水洗凈。

2、常用玻璃器皿洗滌時可用鬃刷蘸取洗衣粉刷洗，然后用自來水沖洗干凈。

3、帶油污坡璃器皿先將倒空的玻璃器皿用10%的氫氧化鈉浸泡半小時或放在5%

的蘇打液內煮兩次，去掉油污，再用洗衣粉和熱水刷洗。

4、帶菌玻璃器皿經121T高壓蒸汽滅菌20min后，趁熱倒去內容物，再用洗衣粉

水刷洗干凈，以水在內壁均勻分布成一薄層而不出現水珠為油垢除盡的標準。

經以上處理的玻璃器皿，可滿足一般實驗用。少數實驗對玻璃器皿清潔度要求較高，除用上述

方法夕卜，還應先用2%的HQ溶液浸泡數lOmin,再用自來水沖洗,蒸饋水淋洗2?3次。有

的尚需超純水淋洗然后烘干備用。

二、玻璃器皿的包扎：吸管、平皿、瓶口等的包扎

三、玻璃器皿的滅菌：分為兩種，高壓蒸汽滅菌法和干熱滅菌法。

高壓蒸汽滅菌法是濕熱滅菌中應用最為廣泛的一種方法。其原理是依據在一個密閉的高壓蒸汽

滅菌器中，水的沸點隨水蒸汽壓的?加而上升，加壓是為了提高水蒸汽的溫度。把待滅菌物品放

在滅菌器內，當滅菌器內壓力為O.IMPa時，溫度可達到，一般維持20minf即可殺死

一切微生物的營養體及其泡子。一般的培養基、玻璃器皿、金屬用具、實驗服、傳

染性標本等均可用這種方法有效滅菌。滅菌的溫度及時間視滅菌物品中的微生物種類及數量而

定。

干熱滅菌法也叫熱空氣滅菌法。實驗室通常使用恒溫控制的電熱鼓風干燥箱作為干熱滅菌

器。此法常用于空的坡璃器皿、金屬器具和其他耐高溫的物品（如陶裔培養皿蓋、石蠟油、

碳酸鈣）的滅菌。其優點是滅菌器皿保持干燥。但帶有膠皮、塑料的物品、液體及固體培養基

不能用此法。干熱滅菌一般以能否殺死細菌的芽抱作為徹底滅菌的標準，160-170（,

2-3h方可殺死細菌的芽抱。

［實期才料］

吸管若干、平皿5付、鹽水瓶1介、中試管、小試管、脫脂棉、紗布等

［實驗內容］

一、各種坡璃器皿的包扎

二、棉塞的制作視管口大小取脫脂棉若干，順纖維方向層疊，用力卷緊后用紗布包

扎，以套入視管口1/2為宜。

三、各種常用儀器的使用方法及注意事項

I高壓蒸汽滅菌器

操作方法：

加水：打開滅菌鍋蓋，加水適量（手提式高壓鍋加水到與支架圈平行處）

翻：將帶滅菌物品放于滅菌桶內，物品冒做注意彼此間留有一定空隙，使蒸汽在容器內能夠流

通達到每個物品的部位，以免形成蒸汽死角。物品不要緊靠桶壁，防止冷凝水進入滅菌物品。

密封：將蓋上的軟管插入滅菌桶的槽內，使罐內冷空氣自下而上^出，加蓋，上下雌口對齊，

采用對角方式均勻旋轉擰緊螺栓，使滅菌鍋密閉。

加熱：打開排氣口（放氣閥），排氣5-10min后（或噴出氣體不形成水霧），此時蒸汽已

將鍋內的冷空用逅，關閉放氣閥。溫蒸汽壓力熠高而上升。待壓力逐漸上升至所需溫度時,

期啜褫，縮$所需壓力和降，麗始時，到達規定時向，關閉熱源，停止1HB,壓力隨之逐

漸降低。

降壓、取料：待壓力自然降至"0"后，打開放氣閥，松動螺栓，開蓋。立即取出滅菌物品,

以免油鍋蓋和器壁上的水滴弄濕包裝紙或被滅菌物品，增加染均的概率。斜面培養基官鍋

內取出后要趁熱擺放，滅菌后的空培養皿、試管等要烘干或晾干。

清理：滅菌完畢后，除去鍋內剩余水，保持鍋內干燥。若連續使用則需每次補足水分。注

意事項：

高壓蒸汽滅菌的技術關鍵是在壓力上升之前先排除鍋內的冷空氣。若鍋內仍有滯留的;轉

氣，壓力表雖達到指定壓力但鍋內溫度卻達不到相應的溫度，滅菌效果不好。

滅菌時人不能離用R!場,要嚴格控制熱源維持滅菌時的壓力。壓力過高不僅培養基的營養成分被

破壞，而且高壓鍋超過耐壓范圍易發生爆炸造成傷人事故《滅菌完畢后要自然冷卻，切忌用涼水

澆滅端辣降溫壓力降至"0"位前不能開蓋，以免培養基沸騰噴出或沾濕棉塞。2、干熱滅

菌器（電熱鼓風干燥箱、干烤箱）

操作方法：

裝料：滅菌前先將玻璃器皿、金屬用具用包扎紙（不用油紙）包好，培養皿也可裝入金屬盒

內，然后均勻放入干榔§內。物品不雌放過擠，不能緊靠箱壁，使空氣流通，溫度均勻。升溫：

接通電源，打開開關，雌闿詢的調氣閥，打開通氣孔，H滁箱內叫氣和水汽,升溫，待箱內

溫度達到8（TC時，關閉通氣孔，打開鼓風機，使箱內溫度均勻。

維持恒溫：繼續加熱，待溫度達到。（:時，保溫維持

160J702ho

降溫：滅菌完畢，切斷電源，當箱內溫度冷卻至60℃時方可開箱取出物品。

注意事項：滅菌過程中溫度不能上升或下降過急。溫度達到6(rc以上時，不能隨意打開干燥

箱門。

3、冰箱常用于菌種保藏。有?4。《?20。&-70(。

4、離心機

實驗二顯微鏡油鏡的使用及細菌基本形態觀察

［目的］

1.了解光學顯微鏡的簡單構造原理、使用方法和保護要點。熟練掌握油鏡

的使用方法。

2.認識細菌的基本形態和構造。通過細菌標本片觀察，進一步熟悉使用光學顯微鏡。

［原理］

1.微生物個體微小。肉眼難以看見，必須借助顯微鏡才能觀察到其個體形態及內部結構。因此,

顯微鏡是微生物學研究必不可少的工具，正是顯微鏡的發明使人類揭開了微生物世界的奧秘。

耐科學技術的進步及微生物研究的需要,顯微鏡從使用可見光源的普通光學顯微鏡發展到使用

紫外線光源的熒光顯微鏡，進一步發展到用電子流代替照明光源的電子顯微鏡，使放大率和分辨

率大大提高，為微生物學的發展提供了保障。此外，根據不同的用途還有暗視野、相差顯微鏡等。

普通光學顯微鏡由棚鰥統和光學系統兩部分組成怖!系統包括有：鏡座、載物臺、鏡臂、鏡筒、

物朦骸器、調節器；光學部分包括有目漲物麻聚光器、反光鏡。有些較好的顯微鏡自身帶有

照明裝置。在檢查細菌標本，多用油鏡進行。油鏡是一種放大倍數較高(95~100倍)的物鏡，

一般都刻有放大倍數(如95X、100X等)和特別的標記，以便于認識。國產鏡多用油字表示，

國外產品則常用“Oil"(OilImmersion)或

“HI"(HomogeneousImmersion)作記號。；隔上也常漆有黑環或紅環，而且鏡的鏡身

較高倍鏡和低鏡為長，鏡片最小，這也是識別的另一個標益

2.油鏡的原理：油鏡頭的晶片細小，進入鏡中的光量亦較少，其視野較高倍鏡暗。當油鏡

頭與覦片之間為空氣所隔時，因為空氣的折光指數與坡璃不同，故有TP分光線被折射而不

能進入鏡頭之內，幽雌？更暗;熱t與弱5片之間M上與蝌蜥瓶能相近的油^，如柏木

；靖，貝斶不會因折射而損失太大，可使視野充分牌月，能滑

用方法：進行5由鏡檢查時，應㈱好光線，但不可直對陽光,采取晶繇度附磁光器，開大痢,

喻就輜。然割林■功啪（物詡，，酶楸綺領IE中。輟懶

na=i幾乎耳物耐般度（畫礴瞰的鼬目鐲甥膜|機同時圜辮敏詡

螺旋，提iftM護噤fflffl城齷H悔匍，茹卿朦瞰懶5,薜勵微雕，MS嫡

清晰為止另一種是固定鏡筒調節載物臺的顯微鏡，調焦時，鏡片先與油鏡頭接觸，再慢慢轉動

粗螺旋，將臺往下調，能酶看到物像時，再轉動細螺旋，直至物像清晰為止，隨即迸行

檢查觀察。油鏡用過后，應立即用擦，日微頭擦拭干凈，如油漬已干，則須用擦制曜少許二

甲苯溶解并拭去油漬，然后再用干擦鏡紙拭凈鏡頭。

4.細菌是單細胞生物，盡管個體微小，但有其完整的形態特征和結構。細菌的基本形態可分

為球狀、桿狀和螺旋狀三種。除細胞壁、細胞膜、細胞質和核質等基本結構外，尚有鞭毛、菌

毛、芽抱、英膜、質粒等附屬結構。

［實驗材料］

1.標本：

大腸桿菌、葡萄球菌、枯草桿菌、炭疽桿菌（培養物片及組織片）、變形桿菌、魏氏梭菌、

巴氏桿菌、醵母菌的染色標本。

2.儀器及其他物品

普通光學顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙等

［實驗內容］

1.用低、高倍鏡觀察酵母菌

(1).將低倍物鏡(10x)轉到工作位置。上升聚光器，將光圈打開，轉動反光鏡采集光源，

使視野明亮。

(2).將標本片放于載物臺上并上升載物臺到最高。

(3).轉動粗調節螺旋，當目鏡中看到模糊物像時再轉動細螺旋直至物像清晰為止。觀察醵母

菌的形態特點。

(4).高倍鏡觀察：用手按住物鏡轉換器慢慢旋轉將物鏡轉換成高倍鏡(40x),轉動細調將

物像調至清晰，進行觀察。

2.用油鏡觀察細菌標本片

(1).用10x鏡對光，使視野明亮

(2).在標本片觀察部位滴加少量香柏油后放于載物臺上，轉換物鏡為油鏡。緩慢上升載

物臺使油鏡浸入香柏油中，并從側面觀察，使鏡頭上升至睨晡接近玻片又不與玻片相撞的合適

位置，避免壓碎鏡頭晶片。

(3).緩慢下降載物臺，同時從目鏡中觀察，直至出現模糊的物像時再用細螺旋調至物像

清晰為止。觀察細菌基本形態及特殊構造。

3.顯微鏡用后的處理

(1).處理玻片加2-3滴二甲苯于標本片上，使香柏油溶解，再用擦鏡紙擦凈保存供以

后使用。

(2).清潔顯微鏡先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用蘸有二甲苯的擦鏡紙擦掉殘留的

香柏油，最后用干凈的擦鏡紙抹去殘留的二甲苯；清潔目讖和其他物鏡，可直接用干凈的擦

鏡紙擦凈；用柔軟的綢布擦凈機械部分的塵土。最后將物鏡轉成"八”字式，下降載物臺，

聚光器降至最低位置，反光鏡鏡面轉成垂直狀。

實驗三細菌涂片的制備及革蘭氏染色

［目的］

L掌握細菌涂片的制備方法及革蘭氏染色。

2.學習無菌操作，樹立無菌觀念。

［原理］

細小，月，期1,，色（由于毛

細管、滲透、吸附和吸收等物理作用以及離子交換、酸堿親和等化學作用，染樣能使細菌著色，

并且因細菌細胞的結構和化學成分不同而有不同的染色反應）后，使其與背景形成明顯的色差,

從而郵清楚曲畸IJ細菌的基本形態K結構。根據不同趣色反應，可作為慨!I細菌的一種依

據。微生牧染f4是一種帶新的有機化合物，其分子上具有發色基助包L給化合物以

特有的顏色，但不能與細菌結合;后者使化合物具成鹽的性質，能ffl菌怖合。分為嘲斗、酸

輛中除科三類。根蒯菌個體形初期不同要求，可修色分為三種方法即簡單染色

鑒SU染色和祿踩包

革蘭氏染色：1884年由丹麥病理學家C.Gram創立。此法可將所有細菌區分為革蘭氏陽性

菌（G+）和革蘭氏陽性菌（G.）兩大類。是細菌學上最常用的鑒別染色法，有著重要的理

論和實踐意義。其染色過程是先用草酸錢結晶紫進行初染，再加媒染劑-革蘭氏碘液，以增加

染料和細胞的親和力，使結晶紫和碘在細胞膜上形成相對分子量較大的復合物，然后用脫色劑?

乙醇B兌色，最后用沙黃液復染。凡細菌不被脫色而保留初染劑的顏色（紫色）者即為G+菌反之，

脫色后染上發染劑顏色（紅色）者即為G.苗.其原理是利用細菌的細胞壁組的￡分和結構的不同，通遍咆加以鑒別。

革蘭氏陽性菌的細胞壁肽聚糖層厚，交聯而成的

肽聚糖網狀結構致密，且類脂質含量少，經乙醇處理發生1腓作用后反而使其孔徑縮小，通透

性降低，結晶紫-碘形成的復合物保留在細胞內而不被脫色，結果細胞呈現紫色。而革蘭氏陰性

菌的的肽聚糖層靖，網向交聯少，而且類脂質含量較高，經乙醇處理后，細胞壁孔徑變大，

通透性增加，結晶紫與碘的復合物被溶出細胞壁，結果細菌被脫色，再經沙黃復染后呈現紅色。

［實驗材料］

(1)菌種：大腸桿菌、葡萄球菌的斜面培養物和肉湯培養物各一管。

(2)材料：載玻片、接種棒、酒精燈、打火機、吸水紙(濾紙本八無菌水、染色缸、香柏

油、二甲苯等。

(3)染色液：草酸按結晶紫染液、革蘭氏碘液、95%乙醇、沙黃染色液。

(4)儀器：顯微鏡

［實瞼內容】

1.細菌涂片的制備

(1)坡片準備載玻片應清晰透明，潔凈而無油潰，滴上水后，能均勻展開，附著性好。如

有殘余油漬，可按下列方法處理：滴95%酒精2~3滴，用潔凈紗布揩擦，然后在酒精燈

外焰上輕輕拖過幾次。也可提前將玻片浸泡在95%的乙醇中預先脫脂備用。

(2)涂片針對所用材料不同，涂片方法也有差異。

a.液體材料(如液體培養物、血液、滲出液、乳汁等)可直接用滅菌接種環取一環材料，于坡片

的中央均勻地涂布成適當大小的薄層。

b.非液體材料(如菌落、膿,糞便等)則應先用滅菌接種環取少量生理鹽水或蒸饋水，置于坡片

中央，然后再用滅菌接種壞取少量材料，在液滴中混合，均勻涂布成適當大小的薄層。

C.組織臟器材料可先用銀子夾持中部，然后以滅菌或潔凈翦刀取一小塊，夾出后將其新鮮切面

在坡片上壓印(觸片)或涂抹成一薄層。

如有多個樣品同時需要制成抹片,只要染色方法相同，可在同一張玻片上有秩序地同府，做多

點涂抹，或先在玻片上劃分成若干小方格，每方格涂抹一種樣品并做好記錄。

(3)干燥上述涂片應讓其室溫自然干燥。

(4)固定有兩類固定方法。

火焰固定(物理固定)：將干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精燈外烙上如鐘擺

樣來回拖過數次，略作加熱(但不能太熱，以不燙手為度)進行固定。

化學固定：血液、組織臟器等抹片要作姬姆薩((Giemsa)染色，不用火焰固定，而用甲醇固

定，可將已干燥的抹片浸入甲醇中2~3min,取出晾干；或者在抹片上滴加數滴甲醇使其作

用2~3min,自然揮發干燥，抹片如做瑞氏(wrights)染色，則不必先做特別固定，染料中

含有甲醇，可以達到固定的目的。

抹片固定的目的有如下幾點：

(1)除去抹片的水分，涂抹材料能很好地貼附在坡片上，以免水洗時易被沖掉。

(2)使抹片易于著色或更好地著色，因為變性的蛋白質比變性的蛋白質著色力更強。

(3)可殺死抹片中的微生物。

必須注意,南片固定過程中，實際上并不能保證殺死全§削菌,也不能完全避免蹂色水洗時

不將部分抹片沖脫。因此，在制備烈性病原菌，特別是帶芽抱的病原菌的抹片時，應嚴格慎重

處理染色用過的殘液和抹片本身，以免引起病原的黝S。

2.革蘭氏染色

(1)初染：將玻片置于染色架上，加草酸鍍結晶紫溶液(量以覆蓋滿涂抹面為宜)，染

l-2min,倒去染液水洗,

⑵媒染：加革蘭氏碘液，染l-2min,水洗。

(3)脫色：加95%乙醇，將玻片輕搖幾下即傾去乙醇，如此重復幾次，直至乙醇液不呈現紫色

時停止，約20-60秒，立即水洗。

(4)復染：滴加沙黃染液，染l-2min,水洗。

3.鏡檢

將染色好的坡片夾入濾紙本中，吸去水分。滴加香柏油后油鏡觀察。4.

實驗完畢后處理

(1)清潔顯微鏡

(2)坡片處理高壓滅菌后用洗衣粉水煮沸、清洗、晾干備用。

實晚四培養基的制備

［目的］

1.掌握一般培養基制備的原則和要求。

2.熟悉一般培養基制備的過程。

3.掌握培養基酸堿度的測定。

［原理］

培養基是用人工方法將多種物質按照各類微生物生長的需要而合成的一種混合營養基質，一股

'?111.----踴類及代般輜片樣性，故用開蹄性物的種類也很多。

它們的配方及配制方法雖各耨異，但培養基的配制步驟卻大致相同。即先按a昉稱取藥品，用

少量水先溶解各成分，待完全溶解后補足水至所需量，調整pH,然后將培養基分裝于合適的容

器中，經滅菌后使用或備用。同時應做無菌檢查。

制作培養基的要求：

(1)培養基必須含有細菌生長所需要的營養物質。

(2)培養基的材料和盛培養基的容器應沒有抑制細菌生長的物質。

(3)培養基的酸堿度應符合細菌生長的要求。多數細菌生長適宜pH范圍是弱堿性(pH7.2~

7.6)。

(4)所制培養基應均質透明，以便觀察細菌的生長性狀和其他代謝活動所產生的變化。

(5)必須徹底滅菌，不得含有任何活細菌。

［實瞼材料］

1.器皿：量筒(100mL)、燒杯QOOOmL和100mL各一介)、漏斗、三角燒瓶(100mL)、

試管、坡棒、刻度吸管(1mL和10mL各一個)、pH試紙、紗布、脫脂棉、天平、電爐、

試管塞、包裝紙、扎繩、洗耳球等。

2.試劑：牛肉青、蛋白陳、氯化鈉、磷酸氫二鉀、瓊脂條或粉、0.1mol/L和lmol/L的氫

氧化鈉、0.1mol/L和lmol/L的鹽酸溶液、蒸饋水、無菌的脫纖綿羊或家兔鮮血。

［實驗內容］

每組需制備普通肉湯培養基(牛肉音蛋白陳培養基)200mL。其中50mL用于制作普通營

養肉湯；50mL用于制備普通斜面；剩余部分用于制作普通瓊脂平板。

1.普通肉湯培養基的制作

牛肉盲0.5%蛋白陳1%氯化鈉0.5%磷酸氫二鉀0.1%蒸播水

按以上劑量稱取各種試劑(先稱取鹽類再稱蛋白陳及牛肉膏)，置于燒杯內加熱溶解備用。

2.pH的矯正

(1)試紙法因初配好的牛肉音蛋白陳培養液是偏酸性的，故要用NaOH調整。為避免

過堿，應緩慢加入NaOH,邊加邊攪拌，并不時地用pH試紙測試，直至達到所需pH。也

可取培養基5mL于干凈試管中，逐滴加入NaOH調pH至7.4~7.6,并記錄NaOH的用

量，再換算出培養基總體積中須加入NaOH的數量，即可調至所需的pH范圍。

（2）標準比色法

待已配好的培養基冷至5（rc左右時，調該溶液的pH至7.4~7.6。校正pH的方法為：①

取兩支與標準比色管（pH7.4-pH7.8）相同的空比色管，加入欲測的肉湯培養基5ml,其

中一管內加0.02%酚紅指示劑0.25ml（滴定管），搖勻。②按圖2所示排列，舉起比色

架，若

滴定管色調較淡

或為黃色，即表示

培養基偏雌，需

滴加0.1mol/L

NaOH矯正；若

偏堿性，應滴加0.1mol/LHCI矯正；使之與標準比色管色澤相同為止。維帶懿

肉湯均呈酸性。記下用去的NaOH（或HCI）溶液量，由此計算出矯正全量培養基時所需

lmol/LNaOH（或HQ）溶液量。

圖2pH比色架

計算公式：所需0.1mol/L氫氧化鈉量二（培養基量x校正時用去0.1mol/LNaOHg）/5xl0

3.營養肉湯的制備：

量取已矯正pH的肉湯培養基50mL于鹽水瓶中，塞上棉塞，用包裝紙扎好經12FC滅菌

15min后過濾分裝中試管，每管約5mL,滅菌備用。

4.普通斜面的制備

量取已矯正pH的肉湯培養基50mL于燒杯中，稱取1克瓊脂粉加入，加熱煮沸,待瓊脂

完全融化后，分裝試管（動作要快，防止瓊脂凝固），每管約4~5mL（約3指高），試管分裝

完畢塞好棉塞，121c滅菌15-20min后，趁熱將試管口一端擱在玻棒上，使之有一定坡

度，凝固后即成普通瓊脂斜面。

5.普通瓊脂平板的制備

量取剩余的營養肉湯培養基，按L5?2%加入瓊脂粉，121C滅菌15?20min。將瓊脂瓶緊

握手中覺得燙手，但仍能握持時，即為傾倒平皿的合適溫度（50~60℃）。每只滅菌培養皿

倒入10~15mL（以鋪滿皿底為宜），蓋上皿蓋，凝固后即成普通瓊脂平板。翻轉放入冰

箱備用。

6.鮮血瓊脂培養基制備

有些細菌對營養要求較高，需在培養基中加入營養因子如血液、血清等。

將已融化的滅菌普通瓊脂培養基冷至50C左右，無菌操作加入無菌的脫纖綿羊或家兔鮮血5%

（即每100mL普通瓊脂加入鮮血5~6mL）混合后，分裝滅菌試管立即擺成斜面或傾注于滅

菌平皿（如果瓊脂溫度過高，鮮血加入后則成紫褐色，溫度過低，則鮮血加入瓊脂易凝不易混

合。注意，混合時切勿產生氣泡）。待凝固后，置37C培養24h,無菌檢驗合格方可應用。

半成品培養基包見成的商品出售。只要按瓶簽上的說明及所需量和要求直接溶解、分裝、滅菌

制成平斗面即可。半成品培養基，瞰培^基所含成分的特性不同，有的可高壓滅菌，有的則

不宜高壓滅菌，如SS瓊脂、沙門氏菌、志賀菌硼培^基不可高壓滅菌或過久加熱，麥康凱瓊

脂、三糖鐵瓊脂均可進行高壓滅菌。

實驗五自然界中微生物的分布

［目的］

1.了解周圍環境中微生物的存在和分布狀況。

2.了解無菌操作在微生物實驗中的重要性。

［原理］

在我們的周圍環境中存在著大量微生物，其種類繁多、形態多樣、數量龐大。它們不但

廣泛分布于室內外償二水和±填中，還分布。在新境中的所有物品上，±?是微生物棲

居的“大本營”，它含有的微生物種類和數量最多；有些微生物附著于塵埃上漂浮于大氣中，

此外，人和動物體的口腔、呼吸道和消化道及動、植物體表面都存在著各種微生物。可以說，微

生物是無孔不入、無處不在的。由于微生物個體微小、結構簡單和肉眼難以觀察，如果將這些微

生物通過某種方;懶幅0合適它們生長的營養基質上，在適宜溫度下培養后可形成肉眼可見確

嘲體，此即為菌落。通過平板培養的方法可不境中微生物的數量。不同種的

小、形態各異的菌落，其可作為細菌種屬鑒定的礴。

［實瞼材料］

1.樣品土壤，自來水，污水，實驗室或其他地方室內空氣，物體或桌面表面，人皮膚

表面等。

2.培養基無菌普通瓊脂平板、無菌普通營養瓊脂瓶。

3.儀器和其他物品培養箱、酒精燈、試管架、水浴鍋、無菌生理鹽水（10mL、9mL、

5mL）,無菌吸管（1mL），無菌空平皿等。

［實瞼內容］

1.標記用記號筆在培養皿底部標記樣品名稱、組別、日期等內容或寫在標簽紙上，貼

于皿底一側，避免影響結果觀察。

2.空氣中微生物的檢測

選擇適當位置，打開無菌平板的皿蓋，使培養基暴露于空氣中一段時間，即讓空氣中

含微生物的塵埃或顆粒以沉降法自然接種到培養基表面。一般為lOmin、30min.60min,

時間到后蓋上皿蓋，37℃24h培養。可選擇同一地點不同時間或不同地點同一時間的不同

方式。

3.皮膚表面的細菌檢測

取無菌平板一塊，一分為二。一側用手指直接在培養基表面涂抹，洗手后再在另一側

涂抹，蓋好皿蓋。37℃24h倒置培養。

4.桌面的細菌檢測

取無菌平板一塊，一分為二。一側用無菌棉簽在5mL鹽水管中浸濕后直接在培養基

表面涂抹，再用此棉簽涂抹桌面后在另一側涂抹，蓋好皿蓋。37℃24h倒置培養。

5.土壤中微生物的檢測

取約1克土（離地表10cm處）于10mL無菌生理鹽水中，混勻。靜置lOmin后，

做10倍遞增稀釋。選擇三個稀釋度，稀釋的同時各吸取1mL菌懸液于無菌空平皿中，傾

注，凝固后37℃24h倒置培養。

6.水中微生物的檢測

分別無菌吸取ImL自來水和污水于無菌的空平皿中，傾注，37℃24h倒置培養。

實驗六細菌的分離培養與移植

［目的］

掌握細菌分離培養及移植的基本要領和方法。

［原理］

在細菌學診斷中，分離培養是不可缺少的一環。分離培養的目的主要是在含多種細菌的病料或培

養物中挑選出某種細菌。在分離培養時應注意：選擇適合于所分離細菌生長的培養基、培養溫度、

氣體條件等。同時應嚴格按無菌操作程序進行實驗，并做好標記。

［實瞼材料］

菌種：大腸桿菌斜面、大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合培養肉湯等。

器械：剪刀、記號筆（以上小組共用）。

培養基：普通肉湯和普通瓊脂斜面、普通瓊8旨平板、酒精燈、接種環（以上每人一套）。

［實覽內容］

1.細菌的分離

（1）.平板劃線接種法通過在平板上劃線，將混雜的細菌在瓊脂平板表面充分的分散開，使

單個細菌能固定在一點上生長繁殖，形成單個菌落，以達到分離純種的目的。若需從平板上獲

取純種,則｝｝瞰一個單個菌落作純培養。可用做分離純種細菌。

操作方法（三區劃線法）：

a、右手拿接種環，燒灼冷卻后，勾取菌種。

民左手抓握瓊脂平板（讓皿蓋留于桌上），在酒精燈火焰左前上方，使平板面向火焰，以

免空中雜菌落入，右手將已沾菌的接種環在瓊脂表面密集而不重疊的來回劃線，面積約占整個

平板的1/5-1/6,此為第一區。劃線時接種環與瓊脂呈30?40度角輕輕接觸，利用腕力滑

動，切忌劃破瓊脂。

G接種環上多余的細菌可燒灼（每劃完一個區域是否需要燒灼滅菌視標本中含菌量多少而

定），待冷后，在劃線末端重復2-3根線后，再劃下一區域（約占1/4面積），此為第二區。

&第二區劃完后可不燒灼接種環，用同樣方法劃第三區，劃滿整個平皿。

e,劃線完畢，將平板扣入皿蓋并作好標記，置37。（:溫箱孵育18?24小時觀察瓊脂表面菌落

分布情況，注意是否分離出單個菌落，并記錄菌落特征（如大小、吸透明度、色素等）。

平板分區劃線法培養后菌落分布情況

平板劃線培養的方法甚多，可按各人的習慣選擇應用，其目的都是達到使被檢材料適當神釋,

以求獲得獨立單在的菌落，防止發育成菌苔，以致不易鑒SOM菌落性狀。劃線培養時須注意以下

幾點：

a.整個操作過程中應嚴格無菌操作.

b.劃線前先將接種環稍稍彎曲，這樣易和平皿內瓊脂面平行，不致劃破培養基。c.

劃線中不宜過多地重復舊線，以免形成菌苔。

d.接種完畢后在皿底作好菌名、日期和接種者等標記平皿倒扣，置37c培養。

(2).稀釋分離法也稱幅呈平板分離法有傾注培養法和涂布培養法兩種。

(3).利用化學藥品的分離法

a.抑菌作用：有些藥品對某些細菌有極強的抑制作用，而對另一些細菌則無效，故可利用此種

特性來進行98菌的分離，例如通常在培養基中加入結晶紫或青霉素抑制革蘭氏陽性菌的生長，以

分離革蘭氏陰性菌。

b.殺菌作用：將病料如結核病病料加入15%硫酸溶液中處理，其他雜菌皆被殺死，結核菌因

具有抗酸活性而存活.

c.鑒SU作用：根據細菌對翱糖具有分解能力，通過培養基中指示劑的變化來鑒BU野I細菌。例如

SS瓊脂培養基可以用做鑒別大腸桿菌與沙門氏桿菌。

(4).實驗動物分離法

當分離某種病原菌時，可將被檢材料注射于敏感性高的實動物體內，如將結核菌材料注射于豚

鼠體內，雜菌不發育，而豚患慢強廢病而死。實驗動物死后，取心血或臟器用以分離細

菌。有時甚至可得到純培養。

2.細菌的培養

（1）.需氧性細菌的培養根據細菌的生長特性給于合適的生長環境大多數嗜體溫菌及病

原菌均能在37℃18-24h生長良好.

（2）.厭氧性細菌的培養

厭氧菌需有較低的氧化一還原勢能才能生長（例如破傷風梭狀芽抱桿菌需氧化一還原電勢降低

至0.1IV時才開始生長），在有氧的環境下，培養基的氧化一還原電勢較高，不適于厭氧菌

的生長.為使培養基降低電勢，降低ig養環境的氧壓是十^必要的.現有的厭氧培養法甚多，主

要有生物學、化學和物理學3種方法，可根據各實驗室的具體情況而選用。a.生物學

方法

培養基中含有植物組織（如馬鈴薯、燕麥、發芽谷物等）或動物組織（新鮮無菌的小片組織或加熱

殺菌的肌肉、心、畸），由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質氧化而懶氧氣（如肌肉或腦

組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣，碎肉培養基的應用，就是根據這個原理），組織中所含

的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化一還原電勢下降。

另外，將厭氧菌與需氧菌共同培養在一個平皿內，利用需氧菌的生長將氧i肖耗后，使厭氧菌能生

長。其方法是將培養皿的一半接種吸收氧氣能力強的需氧菌（如枯草桿菌），另一僻種厭氧菌，

接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上，并用石蠟密封，置37c恒溫箱中培養2~3d后，即可

觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長。

b.化學方法利用還原作用強的化學物質，將環境或培養基內的氧氣吸收，或用還原氧化

型物質，降低氧化一還原電勢。

李伏夫（B.MJIbbob）法此法系用連二亞硫酸納（Sod~Lkrnhydrosulphite）和碳酸鈉以吸

收空氣中的氧氣，其反應式如下：

Na2S2O4+Na2C03+02-->Na2SO4+Na2SO3+C02

取T蓋郵,罐）旌TW層棉花，將接種好的平皿重疊正放于罐內（如系液體培養基，則

直立于罐內），最上端保留可容納1~2個平皿的空間（視玻罐的體積而定），按玻罐的體積每1

000cm3空間用連二亞硫酸鈉及碳酸鈉各30g,在紙上混勻后，盛于上面的空平皿中，加水少

許佛昆合物潮濕，但和阻濕，以免罐內水分i修。若用無款娓，則可將平皿重疊正放在電底

容器上，以5罩于皿上，罐口周圍用膠泥或水域嫻.

c.物理學方法

利用加熱、密封、抽氣等物理學方法，以驅除或隔絕環境及培養基中的氧氣，使其形成厭氧狀

態，有利于厭氧菌的生長發育。

厭氧罐法常用的厭氧罐有Brewer-氏罐、Broen氏罐和McIntosh-Fildes二氏罐。將接種

好的厭氧菌培養皿依次放于厭氧罐中，先抽去部分空氣，代以氫氣至大氣壓。通電，使罐中殘存

的氧與氫經的或杷的催化而化合成水，使罐內氧氣全部消失。將整個厭氧罐放入孵育箱培養。

本法適用大量的厭氧菌培養。

3.細菌的移植

將劃線分離培養37?C24h的平板從溫箱取出，到瞰單個菌落，經染色鏡檢，證明不含雜菌，

此時用接種環｝｝瞰單個菌落,移植于瓊脂斜面tg養，得到的培養物，即為純培養物,再作其他各

項試驗檢查和致病性試驗等。具體操作方法如下：

Q）兩試管斜面移植時，左手斜持菌種管和被接種瓊脂斜面管，使管口互相并齊，管底部放

由物副食指之間，松動兩管棉塞，以骸幗容易拔出。右手持窗僻，在火焰上滅菌后，用右

手旨和無名指并齊同時拔出兩管棉塞，將管口迸行火焰滅菌，使其靠近火焰。將接種

環伸入菌種管內，先在無菌生長的瓊脂±接觸使之冷卻，再另瞰少濟細菌后拉出接種環立即伸入

另一管斜面培養基上，勿碰及斜面和管壁，直達斜面底部。從斜面底g際始劃曲線，向上至斜面

頂端為止，管口通過火焰滅菌，將棉塞塞好。蹄院畢，接種環通過火焰滅菌后放下接種器

最后在斜面管壁上注明菌名、日期和接種者，置37P溫箱中培養。

(2).從平板培養基上選取可疑菌落移植到瓊脂斜面上作純培養時，則用右手執接種棒，將接

種環火焰滅菌，左手打開平皿蓋,到瞰可疑菌落，左手蓋上平皿蓋后立即取斜面管，按上述方

磷亍蝴、腐。

(3).從斜面接種到液體培養基將已取有菌種的接種環伸入到液體培養基中，并使環在液

體與管壁接觸的部位輕輕摩露使菌體分散于液體中。接種后塞上棉塞將液體培養基輕輕晃

動，使菌體均勻分布于液體中，以利生長。

(4).從液體接種到液體培養基需用無菌移液器、移液管或吸管等。本實驗室常用吸管。

取無菌吸管，除去上部包裝紙，在上端管口加橡皮頭，拔出管口棉塞，在火焰旁伸入菌種管

內，吸取菌液，轉接到待接種的液體培養基內。燒灼管口，塞好棉塞，進行培養。

(5).液體接斜面方法同(1)

(6).半固體移植用穿剌法接種方法基本上與純培養接種相同，不同的是用接種針挑取菌落，

垂直剌人培養基內。要從培養基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。

實驗七環境因素對微生物生長的影響

［目的］

了解環境因素對微生物生長