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文檔簡介
獸醫(yī)微生物實臉
實驗一坡璃器皿的準(zhǔn)備及常用儀器的使用
[目的]
系統(tǒng)掌握坡璃器皿的準(zhǔn)備方法及常用儀器的使用。
一、坡璃器皿的無害處理:
1、新購置的坡璃器皿因含有游離堿,一般在2%的鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時后再用
清水洗凈,也可在洗衣粉水中煮30-60min,取出用清水洗凈。
2、常用玻璃器皿洗滌時可用鬃刷蘸取洗衣粉刷洗,然后用自來水沖洗干凈。
3、帶油污坡璃器皿先將倒空的玻璃器皿用10%的氫氧化鈉浸泡半小時或放在5%
的蘇打液內(nèi)煮兩次,去掉油污,再用洗衣粉和熱水刷洗。
4、帶菌玻璃器皿經(jīng)121T高壓蒸汽滅菌20min后,趁熱倒去內(nèi)容物,再用洗衣粉
水刷洗干凈,以水在內(nèi)壁均勻分布成一薄層而不出現(xiàn)水珠為油垢除盡的標(biāo)準(zhǔn)。
經(jīng)以上處理的玻璃器皿,可滿足一般實驗用。少數(shù)實驗對玻璃器皿清潔度要求較高,除用上述
方法夕卜,還應(yīng)先用2%的HQ溶液浸泡數(shù)lOmin,再用自來水沖洗,蒸饋水淋洗2?3次。有
的尚需超純水淋洗然后烘干備用。
二、玻璃器皿的包扎:吸管、平皿、瓶口等的包扎
三、玻璃器皿的滅菌:分為兩種,高壓蒸汽滅菌法和干熱滅菌法。
高壓蒸汽滅菌法是濕熱滅菌中應(yīng)用最為廣泛的一種方法。其原理是依據(jù)在一個密閉的高壓蒸汽
滅菌器中,水的沸點隨水蒸汽壓的?加而上升,加壓是為了提高水蒸汽的溫度。把待滅菌物品放
在滅菌器內(nèi),當(dāng)滅菌器內(nèi)壓力為O.IMPa時,溫度可達(dá)到,一般維持20minf即可殺死
一切微生物的營養(yǎng)體及其泡子。一般的培養(yǎng)基、玻璃器皿、金屬用具、實驗服、傳
染性標(biāo)本等均可用這種方法有效滅菌。滅菌的溫度及時間視滅菌物品中的微生物種類及數(shù)量而
定。
干熱滅菌法也叫熱空氣滅菌法。實驗室通常使用恒溫控制的電熱鼓風(fēng)干燥箱作為干熱滅菌
器。此法常用于空的坡璃器皿、金屬器具和其他耐高溫的物品(如陶裔培養(yǎng)皿蓋、石蠟油、
碳酸鈣)的滅菌。其優(yōu)點是滅菌器皿保持干燥。但帶有膠皮、塑料的物品、液體及固體培養(yǎng)基
不能用此法。干熱滅菌一般以能否殺死細(xì)菌的芽抱作為徹底滅菌的標(biāo)準(zhǔn),160-170(,
2-3h方可殺死細(xì)菌的芽抱。
[實期才料]
吸管若干、平皿5付、鹽水瓶1介、中試管、小試管、脫脂棉、紗布等
[實驗內(nèi)容]
一、各種坡璃器皿的包扎
二、棉塞的制作視管口大小取脫脂棉若干,順纖維方向?qū)盈B,用力卷緊后用紗布包
扎,以套入視管口1/2為宜。
三、各種常用儀器的使用方法及注意事項
I高壓蒸汽滅菌器
操作方法:
加水:打開滅菌鍋蓋,加水適量(手提式高壓鍋加水到與支架圈平行處)
翻:將帶滅菌物品放于滅菌桶內(nèi),物品冒做注意彼此間留有一定空隙,使蒸汽在容器內(nèi)能夠流
通達(dá)到每個物品的部位,以免形成蒸汽死角。物品不要緊靠桶壁,防止冷凝水進(jìn)入滅菌物品。
密封:將蓋上的軟管插入滅菌桶的槽內(nèi),使罐內(nèi)冷空氣自下而上^出,加蓋,上下雌口對齊,
采用對角方式均勻旋轉(zhuǎn)擰緊螺栓,使滅菌鍋密閉。
加熱:打開排氣口(放氣閥),排氣5-10min后(或噴出氣體不形成水霧),此時蒸汽已
將鍋內(nèi)的冷空用逅,關(guān)閉放氣閥。溫蒸汽壓力熠高而上升。待壓力逐漸上升至所需溫度時,
期啜褫,縮$所需壓力和降,麗始時,到達(dá)規(guī)定時向,關(guān)閉熱源,停止1HB,壓力隨之逐
漸降低。
降壓、取料:待壓力自然降至"0"后,打開放氣閥,松動螺栓,開蓋。立即取出滅菌物品,
以免油鍋蓋和器壁上的水滴弄濕包裝紙或被滅菌物品,增加染均的概率。斜面培養(yǎng)基官鍋
內(nèi)取出后要趁熱擺放,滅菌后的空培養(yǎng)皿、試管等要烘干或晾干。
清理:滅菌完畢后,除去鍋內(nèi)剩余水,保持鍋內(nèi)干燥。若連續(xù)使用則需每次補(bǔ)足水分。注
意事項:
高壓蒸汽滅菌的技術(shù)關(guān)鍵是在壓力上升之前先排除鍋內(nèi)的冷空氣。若鍋內(nèi)仍有滯留的;轉(zhuǎn)
氣,壓力表雖達(dá)到指定壓力但鍋內(nèi)溫度卻達(dá)不到相應(yīng)的溫度,滅菌效果不好。
滅菌時人不能離用R!場,要嚴(yán)格控制熱源維持滅菌時的壓力。壓力過高不僅培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分被
破壞,而且高壓鍋超過耐壓范圍易發(fā)生爆炸造成傷人事故《滅菌完畢后要自然冷卻,切忌用涼水
澆滅端辣降溫壓力降至"0"位前不能開蓋,以免培養(yǎng)基沸騰噴出或沾濕棉塞。2、干熱滅
菌器(電熱鼓風(fēng)干燥箱、干烤箱)
操作方法:
裝料:滅菌前先將玻璃器皿、金屬用具用包扎紙(不用油紙)包好,培養(yǎng)皿也可裝入金屬盒
內(nèi),然后均勻放入干榔§內(nèi)。物品不雌放過擠,不能緊靠箱壁,使空氣流通,溫度均勻。升溫:
接通電源,打開開關(guān),雌闿詢的調(diào)氣閥,打開通氣孔,H滁箱內(nèi)叫氣和水汽,升溫,待箱內(nèi)
溫度達(dá)到8(TC時,關(guān)閉通氣孔,打開鼓風(fēng)機(jī),使箱內(nèi)溫度均勻。
維持恒溫:繼續(xù)加熱,待溫度達(dá)到。(:時,保溫維持
160J702ho
降溫:滅菌完畢,切斷電源,當(dāng)箱內(nèi)溫度冷卻至60℃時方可開箱取出物品。
注意事項:滅菌過程中溫度不能上升或下降過急。溫度達(dá)到6(rc以上時,不能隨意打開干燥
箱門。
3、冰箱常用于菌種保藏。有?4。《?20。&-70(。
4、離心機(jī)
實驗二顯微鏡油鏡的使用及細(xì)菌基本形態(tài)觀察
[目的]
1.了解光學(xué)顯微鏡的簡單構(gòu)造原理、使用方法和保護(hù)要點。熟練掌握油鏡
的使用方法。
2.認(rèn)識細(xì)菌的基本形態(tài)和構(gòu)造。通過細(xì)菌標(biāo)本片觀察,進(jìn)一步熟悉使用光學(xué)顯微鏡。
[原理]
1.微生物個體微小。肉眼難以看見,必須借助顯微鏡才能觀察到其個體形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。因此,
顯微鏡是微生物學(xué)研究必不可少的工具,正是顯微鏡的發(fā)明使人類揭開了微生物世界的奧秘。
耐科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步及微生物研究的需要,顯微鏡從使用可見光源的普通光學(xué)顯微鏡發(fā)展到使用
紫外線光源的熒光顯微鏡,進(jìn)一步發(fā)展到用電子流代替照明光源的電子顯微鏡,使放大率和分辨
率大大提高,為微生物學(xué)的發(fā)展提供了保障。此外,根據(jù)不同的用途還有暗視野、相差顯微鏡等。
普通光學(xué)顯微鏡由棚鰥統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)兩部分組成怖!系統(tǒng)包括有:鏡座、載物臺、鏡臂、鏡筒、
物朦骸器、調(diào)節(jié)器;光學(xué)部分包括有目漲物麻聚光器、反光鏡。有些較好的顯微鏡自身帶有
照明裝置。在檢查細(xì)菌標(biāo)本,多用油鏡進(jìn)行。油鏡是一種放大倍數(shù)較高(95~100倍)的物鏡,
一般都刻有放大倍數(shù)(如95X、100X等)和特別的標(biāo)記,以便于認(rèn)識。國產(chǎn)鏡多用油字表示,
國外產(chǎn)品則常用“Oil"(OilImmersion)或
“HI"(HomogeneousImmersion)作記號。;隔上也常漆有黑環(huán)或紅環(huán),而且鏡的鏡身
較高倍鏡和低鏡為長,鏡片最小,這也是識別的另一個標(biāo)益
2.油鏡的原理:油鏡頭的晶片細(xì)小,進(jìn)入鏡中的光量亦較少,其視野較高倍鏡暗。當(dāng)油鏡
頭與覦片之間為空氣所隔時,因為空氣的折光指數(shù)與坡璃不同,故有TP分光線被折射而不
能進(jìn)入鏡頭之內(nèi),幽雌?更暗;熱t(yī)與弱5片之間M上與蝌蜥瓶能相近的油^,如柏木
;靖,貝斶不會因折射而損失太大,可使視野充分牌月,能滑
用方法:進(jìn)行5由鏡檢查時,應(yīng)㈱好光線,但不可直對陽光,采取晶繇度附磁光器,開大痢,
喻就輜。然割林■功啪(物詡,,酶楸綺領(lǐng)IE中。輟懶
na=i幾乎耳物耐般度(畫礴瞰的鼬目鐲甥膜|機(jī)同時圜辮敏詡
螺旋,提iftM護(hù)噤fflffl城齷H悔匍,茹卿朦瞰懶5,薜勵微雕,MS嫡
清晰為止另一種是固定鏡筒調(diào)節(jié)載物臺的顯微鏡,調(diào)焦時,鏡片先與油鏡頭接觸,再慢慢轉(zhuǎn)動
粗螺旋,將臺往下調(diào),能酶看到物像時,再轉(zhuǎn)動細(xì)螺旋,直至物像清晰為止,隨即迸行
檢查觀察。油鏡用過后,應(yīng)立即用擦,日微頭擦拭干凈,如油漬已干,則須用擦制曜少許二
甲苯溶解并拭去油漬,然后再用干擦鏡紙拭凈鏡頭。
4.細(xì)菌是單細(xì)胞生物,盡管個體微小,但有其完整的形態(tài)特征和結(jié)構(gòu)。細(xì)菌的基本形態(tài)可分
為球狀、桿狀和螺旋狀三種。除細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)等基本結(jié)構(gòu)外,尚有鞭毛、菌
毛、芽抱、英膜、質(zhì)粒等附屬結(jié)構(gòu)。
[實驗材料]
1.標(biāo)本:
大腸桿菌、葡萄球菌、枯草桿菌、炭疽桿菌(培養(yǎng)物片及組織片)、變形桿菌、魏氏梭菌、
巴氏桿菌、醵母菌的染色標(biāo)本。
2.儀器及其他物品
普通光學(xué)顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙等
[實驗內(nèi)容]
1.用低、高倍鏡觀察酵母菌
(1).將低倍物鏡(10x)轉(zhuǎn)到工作位置。上升聚光器,將光圈打開,轉(zhuǎn)動反光鏡采集光源,
使視野明亮。
(2).將標(biāo)本片放于載物臺上并上升載物臺到最高。
(3).轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)螺旋,當(dāng)目鏡中看到模糊物像時再轉(zhuǎn)動細(xì)螺旋直至物像清晰為止。觀察醵母
菌的形態(tài)特點。
(4).高倍鏡觀察:用手按住物鏡轉(zhuǎn)換器慢慢旋轉(zhuǎn)將物鏡轉(zhuǎn)換成高倍鏡(40x),轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)將
物像調(diào)至清晰,進(jìn)行觀察。
2.用油鏡觀察細(xì)菌標(biāo)本片
(1).用10x鏡對光,使視野明亮
(2).在標(biāo)本片觀察部位滴加少量香柏油后放于載物臺上,轉(zhuǎn)換物鏡為油鏡。緩慢上升載
物臺使油鏡浸入香柏油中,并從側(cè)面觀察,使鏡頭上升至睨晡接近玻片又不與玻片相撞的合適
位置,避免壓碎鏡頭晶片。
(3).緩慢下降載物臺,同時從目鏡中觀察,直至出現(xiàn)模糊的物像時再用細(xì)螺旋調(diào)至物像
清晰為止。觀察細(xì)菌基本形態(tài)及特殊構(gòu)造。
3.顯微鏡用后的處理
(1).處理玻片加2-3滴二甲苯于標(biāo)本片上,使香柏油溶解,再用擦鏡紙擦凈保存供以
后使用。
(2).清潔顯微鏡先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油,再用蘸有二甲苯的擦鏡紙擦掉殘留的
香柏油,最后用干凈的擦鏡紙抹去殘留的二甲苯;清潔目讖和其他物鏡,可直接用干凈的擦
鏡紙擦凈;用柔軟的綢布擦凈機(jī)械部分的塵土。最后將物鏡轉(zhuǎn)成"八”字式,下降載物臺,
聚光器降至最低位置,反光鏡鏡面轉(zhuǎn)成垂直狀。
實驗三細(xì)菌涂片的制備及革蘭氏染色
[目的]
L掌握細(xì)菌涂片的制備方法及革蘭氏染色。
2.學(xué)習(xí)無菌操作,樹立無菌觀念。
[原理]
細(xì)小,月,期1,,色(由于毛
細(xì)管、滲透、吸附和吸收等物理作用以及離子交換、酸堿親和等化學(xué)作用,染樣能使細(xì)菌著色,
并且因細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分不同而有不同的染色反應(yīng))后,使其與背景形成明顯的色差,
從而郵清楚曲畸IJ細(xì)菌的基本形態(tài)K結(jié)構(gòu)。根據(jù)不同趣色反應(yīng),可作為慨!I細(xì)菌的一種依
據(jù)。微生牧染f4是一種帶新的有機(jī)化合物,其分子上具有發(fā)色基助包L給化合物以
特有的顏色,但不能與細(xì)菌結(jié)合;后者使化合物具成鹽的性質(zhì),能ffl菌怖合。分為嘲斗、酸
輛中除科三類。根蒯菌個體形初期不同要求,可修色分為三種方法即簡單染色
鑒SU染色和祿踩包
革蘭氏染色:1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram創(chuàng)立。此法可將所有細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性
菌(G+)和革蘭氏陽性菌(G.)兩大類。是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法,有著重要的理
論和實踐意義。其染色過程是先用草酸錢結(jié)晶紫進(jìn)行初染,再加媒染劑-革蘭氏碘液,以增加
染料和細(xì)胞的親和力,使結(jié)晶紫和碘在細(xì)胞膜上形成相對分子量較大的復(fù)合物,然后用脫色劑?
乙醇B兌色,最后用沙黃液復(fù)染。凡細(xì)菌不被脫色而保留初染劑的顏色(紫色)者即為G+菌反之,
脫色后染上發(fā)染劑顏色(紅色)者即為G.苗.其原理是利用細(xì)菌的細(xì)胞壁組的£分和結(jié)構(gòu)的不同,通遍咆加以鑒別。
革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁肽聚糖層厚,交聯(lián)而成的
肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)致密,且類脂質(zhì)含量少,經(jīng)乙醇處理發(fā)生1腓作用后反而使其孔徑縮小,通透
性降低,結(jié)晶紫-碘形成的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色,結(jié)果細(xì)胞呈現(xiàn)紫色。而革蘭氏陰性
菌的的肽聚糖層靖,網(wǎng)向交聯(lián)少,而且類脂質(zhì)含量較高,經(jīng)乙醇處理后,細(xì)胞壁孔徑變大,
通透性增加,結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物被溶出細(xì)胞壁,結(jié)果細(xì)菌被脫色,再經(jīng)沙黃復(fù)染后呈現(xiàn)紅色。
[實驗材料]
(1)菌種:大腸桿菌、葡萄球菌的斜面培養(yǎng)物和肉湯培養(yǎng)物各一管。
(2)材料:載玻片、接種棒、酒精燈、打火機(jī)、吸水紙(濾紙本八無菌水、染色缸、香柏
油、二甲苯等。
(3)染色液:草酸按結(jié)晶紫染液、革蘭氏碘液、95%乙醇、沙黃染色液。
(4)儀器:顯微鏡
[實瞼內(nèi)容】
1.細(xì)菌涂片的制備
(1)坡片準(zhǔn)備載玻片應(yīng)清晰透明,潔凈而無油潰,滴上水后,能均勻展開,附著性好。如
有殘余油漬,可按下列方法處理:滴95%酒精2~3滴,用潔凈紗布揩擦,然后在酒精燈
外焰上輕輕拖過幾次。也可提前將玻片浸泡在95%的乙醇中預(yù)先脫脂備用。
(2)涂片針對所用材料不同,涂片方法也有差異。
a.液體材料(如液體培養(yǎng)物、血液、滲出液、乳汁等)可直接用滅菌接種環(huán)取一環(huán)材料,于坡片
的中央均勻地涂布成適當(dāng)大小的薄層。
b.非液體材料(如菌落、膿,糞便等)則應(yīng)先用滅菌接種環(huán)取少量生理鹽水或蒸饋水,置于坡片
中央,然后再用滅菌接種壞取少量材料,在液滴中混合,均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。
C.組織臟器材料可先用銀子夾持中部,然后以滅菌或潔凈翦刀取一小塊,夾出后將其新鮮切面
在坡片上壓印(觸片)或涂抹成一薄層。
如有多個樣品同時需要制成抹片,只要染色方法相同,可在同一張玻片上有秩序地同府,做多
點涂抹,或先在玻片上劃分成若干小方格,每方格涂抹一種樣品并做好記錄。
(3)干燥上述涂片應(yīng)讓其室溫自然干燥。
(4)固定有兩類固定方法。
火焰固定(物理固定):將干燥好的抹片,使涂抹面向上,以其背面在酒精燈外烙上如鐘擺
樣來回拖過數(shù)次,略作加熱(但不能太熱,以不燙手為度)進(jìn)行固定。
化學(xué)固定:血液、組織臟器等抹片要作姬姆薩((Giemsa)染色,不用火焰固定,而用甲醇固
定,可將已干燥的抹片浸入甲醇中2~3min,取出晾干;或者在抹片上滴加數(shù)滴甲醇使其作
用2~3min,自然揮發(fā)干燥,抹片如做瑞氏(wrights)染色,則不必先做特別固定,染料中
含有甲醇,可以達(dá)到固定的目的。
抹片固定的目的有如下幾點:
(1)除去抹片的水分,涂抹材料能很好地貼附在坡片上,以免水洗時易被沖掉。
(2)使抹片易于著色或更好地著色,因為變性的蛋白質(zhì)比變性的蛋白質(zhì)著色力更強(qiáng)。
(3)可殺死抹片中的微生物。
必須注意,南片固定過程中,實際上并不能保證殺死全§削菌,也不能完全避免蹂色水洗時
不將部分抹片沖脫。因此,在制備烈性病原菌,特別是帶芽抱的病原菌的抹片時,應(yīng)嚴(yán)格慎重
處理染色用過的殘液和抹片本身,以免引起病原的黝S。
2.革蘭氏染色
(1)初染:將玻片置于染色架上,加草酸鍍結(jié)晶紫溶液(量以覆蓋滿涂抹面為宜),染
l-2min,倒去染液水洗,
⑵媒染:加革蘭氏碘液,染l-2min,水洗。
(3)脫色:加95%乙醇,將玻片輕搖幾下即傾去乙醇,如此重復(fù)幾次,直至乙醇液不呈現(xiàn)紫色
時停止,約20-60秒,立即水洗。
(4)復(fù)染:滴加沙黃染液,染l-2min,水洗。
3.鏡檢
將染色好的坡片夾入濾紙本中,吸去水分。滴加香柏油后油鏡觀察。4.
實驗完畢后處理
(1)清潔顯微鏡
(2)坡片處理高壓滅菌后用洗衣粉水煮沸、清洗、晾干備用。
實晚四培養(yǎng)基的制備
[目的]
1.掌握一般培養(yǎng)基制備的原則和要求。
2.熟悉一般培養(yǎng)基制備的過程。
3.掌握培養(yǎng)基酸堿度的測定。
[原理]
培養(yǎng)基是用人工方法將多種物質(zhì)按照各類微生物生長的需要而合成的一種混合營養(yǎng)基質(zhì),一股
'?111.----踴類及代般輜片樣性,故用開蹄性物的種類也很多。
它們的配方及配制方法雖各耨異,但培養(yǎng)基的配制步驟卻大致相同。即先按a昉稱取藥品,用
少量水先溶解各成分,待完全溶解后補(bǔ)足水至所需量,調(diào)整pH,然后將培養(yǎng)基分裝于合適的容
器中,經(jīng)滅菌后使用或備用。同時應(yīng)做無菌檢查。
制作培養(yǎng)基的要求:
(1)培養(yǎng)基必須含有細(xì)菌生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。
(2)培養(yǎng)基的材料和盛培養(yǎng)基的容器應(yīng)沒有抑制細(xì)菌生長的物質(zhì)。
(3)培養(yǎng)基的酸堿度應(yīng)符合細(xì)菌生長的要求。多數(shù)細(xì)菌生長適宜pH范圍是弱堿性(pH7.2~
7.6)。
(4)所制培養(yǎng)基應(yīng)均質(zhì)透明,以便觀察細(xì)菌的生長性狀和其他代謝活動所產(chǎn)生的變化。
(5)必須徹底滅菌,不得含有任何活細(xì)菌。
[實瞼材料]
1.器皿:量筒(100mL)、燒杯QOOOmL和100mL各一介)、漏斗、三角燒瓶(100mL)、
試管、坡棒、刻度吸管(1mL和10mL各一個)、pH試紙、紗布、脫脂棉、天平、電爐、
試管塞、包裝紙、扎繩、洗耳球等。
2.試劑:牛肉青、蛋白陳、氯化鈉、磷酸氫二鉀、瓊脂條或粉、0.1mol/L和lmol/L的氫
氧化鈉、0.1mol/L和lmol/L的鹽酸溶液、蒸饋水、無菌的脫纖綿羊或家兔鮮血。
[實驗內(nèi)容]
每組需制備普通肉湯培養(yǎng)基(牛肉音蛋白陳培養(yǎng)基)200mL。其中50mL用于制作普通營
養(yǎng)肉湯;50mL用于制備普通斜面;剩余部分用于制作普通瓊脂平板。
1.普通肉湯培養(yǎng)基的制作
牛肉盲0.5%蛋白陳1%氯化鈉0.5%磷酸氫二鉀0.1%蒸播水
按以上劑量稱取各種試劑(先稱取鹽類再稱蛋白陳及牛肉膏),置于燒杯內(nèi)加熱溶解備用。
2.pH的矯正
(1)試紙法因初配好的牛肉音蛋白陳培養(yǎng)液是偏酸性的,故要用NaOH調(diào)整。為避免
過堿,應(yīng)緩慢加入NaOH,邊加邊攪拌,并不時地用pH試紙測試,直至達(dá)到所需pH。也
可取培養(yǎng)基5mL于干凈試管中,逐滴加入NaOH調(diào)pH至7.4~7.6,并記錄NaOH的用
量,再換算出培養(yǎng)基總體積中須加入NaOH的數(shù)量,即可調(diào)至所需的pH范圍。
(2)標(biāo)準(zhǔn)比色法
待已配好的培養(yǎng)基冷至5(rc左右時,調(diào)該溶液的pH至7.4~7.6。校正pH的方法為:①
取兩支與標(biāo)準(zhǔn)比色管(pH7.4-pH7.8)相同的空比色管,加入欲測的肉湯培養(yǎng)基5ml,其
中一管內(nèi)加0.02%酚紅指示劑0.25ml(滴定管),搖勻。②按圖2所示排列,舉起比色
架,若
滴定管色調(diào)較淡
或為黃色,即表示
培養(yǎng)基偏雌,需
滴加0.1mol/L
NaOH矯正;若
偏堿性,應(yīng)滴加0.1mol/LHCI矯正;使之與標(biāo)準(zhǔn)比色管色澤相同為止。維帶懿
肉湯均呈酸性。記下用去的NaOH(或HCI)溶液量,由此計算出矯正全量培養(yǎng)基時所需
lmol/LNaOH(或HQ)溶液量。
圖2pH比色架
計算公式:所需0.1mol/L氫氧化鈉量二(培養(yǎng)基量x校正時用去0.1mol/LNaOHg)/5xl0
3.營養(yǎng)肉湯的制備:
量取已矯正pH的肉湯培養(yǎng)基50mL于鹽水瓶中,塞上棉塞,用包裝紙扎好經(jīng)12FC滅菌
15min后過濾分裝中試管,每管約5mL,滅菌備用。
4.普通斜面的制備
量取已矯正pH的肉湯培養(yǎng)基50mL于燒杯中,稱取1克瓊脂粉加入,加熱煮沸,待瓊脂
完全融化后,分裝試管(動作要快,防止瓊脂凝固),每管約4~5mL(約3指高),試管分裝
完畢塞好棉塞,121c滅菌15-20min后,趁熱將試管口一端擱在玻棒上,使之有一定坡
度,凝固后即成普通瓊脂斜面。
5.普通瓊脂平板的制備
量取剩余的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,按L5?2%加入瓊脂粉,121C滅菌15?20min。將瓊脂瓶緊
握手中覺得燙手,但仍能握持時,即為傾倒平皿的合適溫度(50~60℃)。每只滅菌培養(yǎng)皿
倒入10~15mL(以鋪滿皿底為宜),蓋上皿蓋,凝固后即成普通瓊脂平板。翻轉(zhuǎn)放入冰
箱備用。
6.鮮血瓊脂培養(yǎng)基制備
有些細(xì)菌對營養(yǎng)要求較高,需在培養(yǎng)基中加入營養(yǎng)因子如血液、血清等。
將已融化的滅菌普通瓊脂培養(yǎng)基冷至50C左右,無菌操作加入無菌的脫纖綿羊或家兔鮮血5%
(即每100mL普通瓊脂加入鮮血5~6mL)混合后,分裝滅菌試管立即擺成斜面或傾注于滅
菌平皿(如果瓊脂溫度過高,鮮血加入后則成紫褐色,溫度過低,則鮮血加入瓊脂易凝不易混
合。注意,混合時切勿產(chǎn)生氣泡)。待凝固后,置37C培養(yǎng)24h,無菌檢驗合格方可應(yīng)用。
半成品培養(yǎng)基包見成的商品出售。只要按瓶簽上的說明及所需量和要求直接溶解、分裝、滅菌
制成平斗面即可。半成品培養(yǎng)基,瞰培^基所含成分的特性不同,有的可高壓滅菌,有的則
不宜高壓滅菌,如SS瓊脂、沙門氏菌、志賀菌硼培^基不可高壓滅菌或過久加熱,麥康凱瓊
脂、三糖鐵瓊脂均可進(jìn)行高壓滅菌。
實驗五自然界中微生物的分布
[目的]
1.了解周圍環(huán)境中微生物的存在和分布狀況。
2.了解無菌操作在微生物實驗中的重要性。
[原理]
在我們的周圍環(huán)境中存在著大量微生物,其種類繁多、形態(tài)多樣、數(shù)量龐大。它們不但
廣泛分布于室內(nèi)外償二水和±填中,還分布。在新境中的所有物品上,±?是微生物棲
居的“大本營”,它含有的微生物種類和數(shù)量最多;有些微生物附著于塵埃上漂浮于大氣中,
此外,人和動物體的口腔、呼吸道和消化道及動、植物體表面都存在著各種微生物??梢哉f,微
生物是無孔不入、無處不在的。由于微生物個體微小、結(jié)構(gòu)簡單和肉眼難以觀察,如果將這些微
生物通過某種方;懶幅0合適它們生長的營養(yǎng)基質(zhì)上,在適宜溫度下培養(yǎng)后可形成肉眼可見確
嘲體,此即為菌落。通過平板培養(yǎng)的方法可不境中微生物的數(shù)量。不同種的
小、形態(tài)各異的菌落,其可作為細(xì)菌種屬鑒定的礴。
[實瞼材料]
1.樣品土壤,自來水,污水,實驗室或其他地方室內(nèi)空氣,物體或桌面表面,人皮膚
表面等。
2.培養(yǎng)基無菌普通瓊脂平板、無菌普通營養(yǎng)瓊脂瓶。
3.儀器和其他物品培養(yǎng)箱、酒精燈、試管架、水浴鍋、無菌生理鹽水(10mL、9mL、
5mL),無菌吸管(1mL),無菌空平皿等。
[實瞼內(nèi)容]
1.標(biāo)記用記號筆在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記樣品名稱、組別、日期等內(nèi)容或?qū)懺跇?biāo)簽紙上,貼
于皿底一側(cè),避免影響結(jié)果觀察。
2.空氣中微生物的檢測
選擇適當(dāng)位置,打開無菌平板的皿蓋,使培養(yǎng)基暴露于空氣中一段時間,即讓空氣中
含微生物的塵?;蝾w粒以沉降法自然接種到培養(yǎng)基表面。一般為lOmin、30min.60min,
時間到后蓋上皿蓋,37℃24h培養(yǎng)。可選擇同一地點不同時間或不同地點同一時間的不同
方式。
3.皮膚表面的細(xì)菌檢測
取無菌平板一塊,一分為二。一側(cè)用手指直接在培養(yǎng)基表面涂抹,洗手后再在另一側(cè)
涂抹,蓋好皿蓋。37℃24h倒置培養(yǎng)。
4.桌面的細(xì)菌檢測
取無菌平板一塊,一分為二。一側(cè)用無菌棉簽在5mL鹽水管中浸濕后直接在培養(yǎng)基
表面涂抹,再用此棉簽涂抹桌面后在另一側(cè)涂抹,蓋好皿蓋。37℃24h倒置培養(yǎng)。
5.土壤中微生物的檢測
取約1克土(離地表10cm處)于10mL無菌生理鹽水中,混勻。靜置lOmin后,
做10倍遞增稀釋。選擇三個稀釋度,稀釋的同時各吸取1mL菌懸液于無菌空平皿中,傾
注,凝固后37℃24h倒置培養(yǎng)。
6.水中微生物的檢測
分別無菌吸取ImL自來水和污水于無菌的空平皿中,傾注,37℃24h倒置培養(yǎng)。
實驗六細(xì)菌的分離培養(yǎng)與移植
[目的]
掌握細(xì)菌分離培養(yǎng)及移植的基本要領(lǐng)和方法。
[原理]
在細(xì)菌學(xué)診斷中,分離培養(yǎng)是不可缺少的一環(huán)。分離培養(yǎng)的目的主要是在含多種細(xì)菌的病料或培
養(yǎng)物中挑選出某種細(xì)菌。在分離培養(yǎng)時應(yīng)注意:選擇適合于所分離細(xì)菌生長的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、
氣體條件等。同時應(yīng)嚴(yán)格按無菌操作程序進(jìn)行實驗,并做好標(biāo)記。
[實瞼材料]
菌種:大腸桿菌斜面、大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合培養(yǎng)肉湯等。
器械:剪刀、記號筆(以上小組共用)。
培養(yǎng)基:普通肉湯和普通瓊脂斜面、普通瓊8旨平板、酒精燈、接種環(huán)(以上每人一套)。
[實覽內(nèi)容]
1.細(xì)菌的分離
(1).平板劃線接種法通過在平板上劃線,將混雜的細(xì)菌在瓊脂平板表面充分的分散開,使
單個細(xì)菌能固定在一點上生長繁殖,形成單個菌落,以達(dá)到分離純種的目的。若需從平板上獲
取純種,則}}瞰一個單個菌落作純培養(yǎng)。可用做分離純種細(xì)菌。
操作方法(三區(qū)劃線法):
a、右手拿接種環(huán),燒灼冷卻后,勾取菌種。
民左手抓握瓊脂平板(讓皿蓋留于桌上),在酒精燈火焰左前上方,使平板面向火焰,以
免空中雜菌落入,右手將已沾菌的接種環(huán)在瓊脂表面密集而不重疊的來回劃線,面積約占整個
平板的1/5-1/6,此為第一區(qū)。劃線時接種環(huán)與瓊脂呈30?40度角輕輕接觸,利用腕力滑
動,切忌劃破瓊脂。
G接種環(huán)上多余的細(xì)菌可燒灼(每劃完一個區(qū)域是否需要燒灼滅菌視標(biāo)本中含菌量多少而
定),待冷后,在劃線末端重復(fù)2-3根線后,再劃下一區(qū)域(約占1/4面積),此為第二區(qū)。
&第二區(qū)劃完后可不燒灼接種環(huán),用同樣方法劃第三區(qū),劃滿整個平皿。
e,劃線完畢,將平板扣入皿蓋并作好標(biāo)記,置37。(:溫箱孵育18?24小時觀察瓊脂表面菌落
分布情況,注意是否分離出單個菌落,并記錄菌落特征(如大小、吸透明度、色素等)。
平板分區(qū)劃線法培養(yǎng)后菌落分布情況
平板劃線培養(yǎng)的方法甚多,可按各人的習(xí)慣選擇應(yīng)用,其目的都是達(dá)到使被檢材料適當(dāng)神釋,
以求獲得獨立單在的菌落,防止發(fā)育成菌苔,以致不易鑒SOM菌落性狀。劃線培養(yǎng)時須注意以下
幾點:
a.整個操作過程中應(yīng)嚴(yán)格無菌操作.
b.劃線前先將接種環(huán)稍稍彎曲,這樣易和平皿內(nèi)瓊脂面平行,不致劃破培養(yǎng)基。c.
劃線中不宜過多地重復(fù)舊線,以免形成菌苔。
d.接種完畢后在皿底作好菌名、日期和接種者等標(biāo)記平皿倒扣,置37c培養(yǎng)。
(2).稀釋分離法也稱幅呈平板分離法有傾注培養(yǎng)法和涂布培養(yǎng)法兩種。
(3).利用化學(xué)藥品的分離法
a.抑菌作用:有些藥品對某些細(xì)菌有極強(qiáng)的抑制作用,而對另一些細(xì)菌則無效,故可利用此種
特性來進(jìn)行98菌的分離,例如通常在培養(yǎng)基中加入結(jié)晶紫或青霉素抑制革蘭氏陽性菌的生長,以
分離革蘭氏陰性菌。
b.殺菌作用:將病料如結(jié)核病病料加入15%硫酸溶液中處理,其他雜菌皆被殺死,結(jié)核菌因
具有抗酸活性而存活.
c.鑒SU作用:根據(jù)細(xì)菌對翱糖具有分解能力,通過培養(yǎng)基中指示劑的變化來鑒BU野I細(xì)菌。例如
SS瓊脂培養(yǎng)基可以用做鑒別大腸桿菌與沙門氏桿菌。
(4).實驗動物分離法
當(dāng)分離某種病原菌時,可將被檢材料注射于敏感性高的實動物體內(nèi),如將結(jié)核菌材料注射于豚
鼠體內(nèi),雜菌不發(fā)育,而豚患慢強(qiáng)廢病而死。實驗動物死后,取心血或臟器用以分離細(xì)
菌。有時甚至可得到純培養(yǎng)。
2.細(xì)菌的培養(yǎng)
(1).需氧性細(xì)菌的培養(yǎng)根據(jù)細(xì)菌的生長特性給于合適的生長環(huán)境大多數(shù)嗜體溫菌及病
原菌均能在37℃18-24h生長良好.
(2).厭氧性細(xì)菌的培養(yǎng)
厭氧菌需有較低的氧化一還原勢能才能生長(例如破傷風(fēng)梭狀芽抱桿菌需氧化一還原電勢降低
至0.1IV時才開始生長),在有氧的環(huán)境下,培養(yǎng)基的氧化一還原電勢較高,不適于厭氧菌
的生長.為使培養(yǎng)基降低電勢,降低ig養(yǎng)環(huán)境的氧壓是十^必要的.現(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法甚多,主
要有生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)3種方法,可根據(jù)各實驗室的具體情況而選用。a.生物學(xué)
方法
培養(yǎng)基中含有植物組織(如馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等)或動物組織(新鮮無菌的小片組織或加熱
殺菌的肌肉、心、畸),由于組織的呼吸作用或組織中的可氧化物質(zhì)氧化而懶氧氣(如肌肉或腦
組織中不飽和脂肪酸的氧化能消耗氧氣,碎肉培養(yǎng)基的應(yīng)用,就是根據(jù)這個原理),組織中所含
的還原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化一還原電勢下降。
另外,將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在一個平皿內(nèi),利用需氧菌的生長將氧i肖耗后,使厭氧菌能生
長。其方法是將培養(yǎng)皿的一半接種吸收氧氣能力強(qiáng)的需氧菌(如枯草桿菌),另一僻種厭氧菌,
接種后將平皿倒扣在一塊玻璃板上,并用石蠟密封,置37c恒溫箱中培養(yǎng)2~3d后,即可
觀察到需氧菌和厭氧菌均先后生長。
b.化學(xué)方法利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì),將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收,或用還原氧化
型物質(zhì),降低氧化一還原電勢。
李伏夫(B.MJIbbob)法此法系用連二亞硫酸納(Sod~Lkrnhydrosulphite)和碳酸鈉以吸
收空氣中的氧氣,其反應(yīng)式如下:
Na2S2O4+Na2C03+02-->Na2SO4+Na2SO3+C02
取T蓋郵,罐)旌TW層棉花,將接種好的平皿重疊正放于罐內(nèi)(如系液體培養(yǎng)基,則
直立于罐內(nèi)),最上端保留可容納1~2個平皿的空間(視玻罐的體積而定),按玻罐的體積每1
000cm3空間用連二亞硫酸鈉及碳酸鈉各30g,在紙上混勻后,盛于上面的空平皿中,加水少
許佛昆合物潮濕,但和阻濕,以免罐內(nèi)水分i修。若用無款娓,則可將平皿重疊正放在電底
容器上,以5罩于皿上,罐口周圍用膠泥或水域嫻.
c.物理學(xué)方法
利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法,以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣,使其形成厭氧狀
態(tài),有利于厭氧菌的生長發(fā)育。
厭氧罐法常用的厭氧罐有Brewer-氏罐、Broen氏罐和McIntosh-Fildes二氏罐。將接種
好的厭氧菌培養(yǎng)皿依次放于厭氧罐中,先抽去部分空氣,代以氫氣至大氣壓。通電,使罐中殘存
的氧與氫經(jīng)的或杷的催化而化合成水,使罐內(nèi)氧氣全部消失。將整個厭氧罐放入孵育箱培養(yǎng)。
本法適用大量的厭氧菌培養(yǎng)。
3.細(xì)菌的移植
將劃線分離培養(yǎng)37?C24h的平板從溫箱取出,到瞰單個菌落,經(jīng)染色鏡檢,證明不含雜菌,
此時用接種環(huán)}}瞰單個菌落,移植于瓊脂斜面tg養(yǎng),得到的培養(yǎng)物,即為純培養(yǎng)物,再作其他各
項試驗檢查和致病性試驗等。具體操作方法如下:
Q)兩試管斜面移植時,左手斜持菌種管和被接種瓊脂斜面管,使管口互相并齊,管底部放
由物副食指之間,松動兩管棉塞,以骸幗容易拔出。右手持窗僻,在火焰上滅菌后,用右
手旨和無名指并齊同時拔出兩管棉塞,將管口迸行火焰滅菌,使其靠近火焰。將接種
環(huán)伸入菌種管內(nèi),先在無菌生長的瓊脂±接觸使之冷卻,再另瞰少濟(jì)細(xì)菌后拉出接種環(huán)立即伸入
另一管斜面培養(yǎng)基上,勿碰及斜面和管壁,直達(dá)斜面底部。從斜面底g際始劃曲線,向上至斜面
頂端為止,管口通過火焰滅菌,將棉塞塞好。蹄院畢,接種環(huán)通過火焰滅菌后放下接種器
最后在斜面管壁上注明菌名、日期和接種者,置37P溫箱中培養(yǎng)。
(2).從平板培養(yǎng)基上選取可疑菌落移植到瓊脂斜面上作純培養(yǎng)時,則用右手執(zhí)接種棒,將接
種環(huán)火焰滅菌,左手打開平皿蓋,到瞰可疑菌落,左手蓋上平皿蓋后立即取斜面管,按上述方
磷亍蝴、腐。
(3).從斜面接種到液體培養(yǎng)基將已取有菌種的接種環(huán)伸入到液體培養(yǎng)基中,并使環(huán)在液
體與管壁接觸的部位輕輕摩露使菌體分散于液體中。接種后塞上棉塞將液體培養(yǎng)基輕輕晃
動,使菌體均勻分布于液體中,以利生長。
(4).從液體接種到液體培養(yǎng)基需用無菌移液器、移液管或吸管等。本實驗室常用吸管。
取無菌吸管,除去上部包裝紙,在上端管口加橡皮頭,拔出管口棉塞,在火焰旁伸入菌種管
內(nèi),吸取菌液,轉(zhuǎn)接到待接種的液體培養(yǎng)基內(nèi)。燒灼管口,塞好棉塞,進(jìn)行培養(yǎng)。
(5).液體接斜面方法同(1)
(6).半固體移植用穿剌法接種方法基本上與純培養(yǎng)接種相同,不同的是用接種針挑取菌落,
垂直剌人培養(yǎng)基內(nèi)。要從培養(yǎng)基表面的中部一直刺入管底,然后按原方向退出即可。
實驗七環(huán)境因素對微生物生長的影響
[目的]
了解環(huán)境因素對微生物生長
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