基因工程和基因組學

第一節基因工程(GeneticEngineering)

基因工程概述

限制性內切核酸酶

載體

基因的分離與鑒定

基因工程的應用

基因工程概述★遺傳工程廣義狹義：細胞工程、染色體工程、細胞器工程等基因工程★1、概念：

是指將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿遺傳并表達出新的性狀。

基因工程概述也稱為DNA重組技術(DNARecombination)、或分子克隆(Molecularcloning)★2、誕生：

1971年，美國Smith,H.O.

等分離出一種限制性酶，可酶切病毒的DNA分子；

1972年：Ｂerg,P.

等實現不同酶切DNA片段的體外連接；

1973年：Cohen,s.等將體外重組的DNA

轉入大腸桿菌細胞并得以表達。

基因工程概述★３、基本過程：

基因工程概述⑴從供體細胞中分離出目的基因；(簡稱“切”)⑵用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片斷接到載體上，形成DNA重組分子(“接”)；⑶借助細胞轉化手段將DNA重組分子導入受體細胞(“轉”)；★３、基本過程：

基因工程概述⑷培養轉化細胞，以擴增DNA重組分子，使其整合到受體細胞的基因組中（“增”）；⑸鑒定轉化細胞，獲得外源基因高效表達的細胞（“檢”）；由此可見，基因工程的操作過程可簡化為：“切、接、轉、增、檢”目的基因與載體連接(DNA分子重組)DNA分子重組目的基因導入受體二限制性內切核酸酶

★限制性內切核酸酶或限制性酶：

(restrictionenzymes)

在細菌中此酶的功能是降解外來DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。該類能識別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，并將雙鏈DNA分子切斷。二限制性內切核酸酶

★限制性酶據其作用特點，可分為兩類。

⑴第Ⅰ類限制性酶：每隔一段DNA序列隨機切割雙鏈

DNA分子，沒有序列特異性。

⑵第Ⅱ類限制性酶：能識別一段特異的DNA序列，準確地酶切雙鏈DNA的特異序列。其識別的序列是對稱的，即在一條鏈中從5’到3’方向的序列，與其互補鏈從5’到3’方向的序列完全相同。這種序列稱為回紋對稱序列(palindrome)。三載體

一個DNA片段只有與適合的載體(vector)DNA連接構成重組DNA后，在載體DNA的運載下，才可以高效率地進入宿主細胞(hostcell)，并在其中復制、擴增、克隆出多個拷貝。可作為DNA載體的有質粒、噬菌體、病毒、細菌或酵母菌人工染色體（BAC、YAC）等。三載體

★作為載體DNA分子，需具備四個條件：⑴具復制原點(ori)，

能攜帶的外源DNA片段獨立地自我復制；⑵具有多克隆位點，即具有多種限制性酶的切點，用于克隆外源DNA片段；⑶至少具有一個選擇標記基因；⑷易從宿主細胞中回收。

1.細菌質粒◆質粒是細菌細胞內獨立于細菌染色體而自然存在的、能自我復制、易分離和導入的環狀雙鏈DNA分子。☆這些質粒的適應范圍廣，拷貝數多。進入宿主細胞復制后，每個細胞的質粒拷貝數可高達1000個。2.λ噬菌體

3.柯斯質粒

4.穿梭載體

5.細菌人工染色體

6.酵母人工染色體7.Ti質粒及其衍生載體

四基因的分離與鑒定(一)從基因庫中分離基因(二)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增基因(三)人工合成基因

五基因工程的應用

(一)基因工程工業(二)植物基因工程(三)轉基因動物(四)遺傳疾病診斷(一)基因工程藥物◆胰島素的人工生產(二)植物基因工程根癌農桿菌介導的植物轉化◆植物基因轉化：是指將外源基因轉移到植物細胞內、并整合到植物基因組中穩定遺傳和表達的過程。◆根癌農桿菌介導的植物轉化2.基因槍轉化技術◆通過高壓氣體等動力，高速發射包裹有重組DNA的金屬顆粒，將目的基因直接導入受體細胞，并整合到染色體上的方法。◆此法已廣泛用于轉化水稻、小麥、玉米、大豆等主要作物。(三)轉基因動物

與轉基因植物相比，轉基因動物的發展要慢些。

◆例如，利用轉基因羊大量表達人類的抗胰蛋白酶。◆將人的抗胰蛋白酶α-1基因克隆在羊奶產生相關基因啟動子的下游，這種啟動子僅在乳腺細胞中表達，使羊奶中含有大量有功能的人類抗胰蛋白酶；◆可利用家禽作為生物反應器，生產人類大量需要的重要蛋白質。大象的生長基因轉到豬身上(四)遺傳疾病診斷(五)基因治療◆利用基因工程技術，將特異基因導入并整合到具有遺傳缺陷的患者的基因組中，以治療遺傳疾病的方法，通常叫做基因治療(genetherapy)。◆目前最常用的方法是利用病毒DNA作載體，構建重組DNA分子，用病毒包裝物包裝后形成的重組去毒病毒感染患者的細胞，將正常基因整合到染色體上。

第二節基因組學

◆基因組學(genomics)：是遺傳學研究進入分子水平后發展起來的一個分支，主要研究生物體全基因組(genome)的分子特征。◆特點：是以基因組為研究單位，而不是以單個基因，◆目標：是認識基因組的結構、功能及進化，弄清基因組包含的全部遺傳信息及相互關系，為最終充分合理利用各種有效資源，預防和治療人類遺傳疾病提供科學依據。㈠構建基因組的遺傳圖譜

(geneticmap)；㈡構建基因組的物理圖譜

(physicalmap)；㈢測定基因組DNA的全部序列；㈣構建基因組的轉錄本圖譜；㈤分析基因組的功能。

基因組學的重要組成部分是基因組計劃(genomeproject)，大體上可分為：◆人類基因組計劃(humangenomeproject，HGP)：◆水稻基因組計劃(ricegenomeproject，RGP)◆模式生物基因組計劃：如酵母、線蟲、果蠅、小鼠、家豬、擬南芥一基因組圖譜的構建鳥槍射擊法(shotgun)基因組序列測定㈠遺傳圖譜的構建㈡物理圖譜的構建一基因組圖譜的構建

(一)遺傳圖譜的構建

圖譜標記圖譜構建中需要可以鑒別的標記(marker)，在構建遺傳圖譜中，可用基因和DNA作為標記。(1)基因標記

(2)DNA標記(二)物理圖譜的構建擬南芥人類部分染色體物理圖譜E.coli

物理圖譜二基因組圖譜的應用

◆基因定位◆基因組比較分析

◆標記輔助選擇(marker-assistedselection，MAS)◆

基因的克隆與分離三后基因組學

◆后基因組學(post-genomics)：是在完成基因組圖譜構建以及全部序列測定的基礎上，進一步研究全基因組的基因功能、基因之間的相互關系和調控機制為主要內容的學科。◆后基因組學主要利用DNA微列陣技術、蛋白質組學、

酵母菌雙雜交系統以及生物信息學等技術相結合，對已知的基因組序列進行研究。

(1)DNA微列陣(DNAmicroarrays)

是利用DNA芯片技術，同時進行大量分子雜交，以分析比較不同組織或器官的基因表達水平，篩選突變基因，從核酸水平分析基因表達模式。這是后基因組學研究中的重要方法之一。三后基因組學

基因芯片發展歷史Southern&NorthernBlotDotBlotMacroarrayMicroarray(2)蛋白質組學蛋白質組學(proteomics)是從蛋白質水平來研究基因組的基因表達，分析基因組的蛋白質類型、數量、空間結構變異以及相互作用的機制。在蛋白質分析中，目前主要利用奧佛諾(O￠Farrel，1975)發明的據蛋白質的等電點和分子量分析蛋白質的雙向電泳技術，來分析蛋白質組(proteomes)，四生物信息學

生物信息學(bioinformatics)是：

利用計算機貯存原始資料，分析生物信息，將DNA芯片以及蛋白質雙向電泳結果轉變成為可讀的遺傳學信息的學科。是將現代生物技術與計算機科學結合，收集、加工和處理生物資料。PubMedEntrezBLASTOMIMBooksTaxBrowserStructure

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