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文檔簡介

實驗06植物組織中DNA的提取與測定(P226)一、實驗目的

1、提取DNA用于PCR等實驗

2、了解核酸提取的原理、各試劑的用途等二、原理——鹽溶法

1.鹽溶法:DNA溶于1mol/L的NaCl溶液,而RNA則不溶

2.

破碎細胞:機械處理:超聲波處理法、研磨法、勻漿法;化學處理:用SDS處理細胞。

3.

去除RNA:

DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液,RNA可溶;

DNA溶于1mol/L的NaCl溶液,而RNA則不溶;

RNA酶,酶解RNA

4.

去除蛋白質:加入SDS、高溫變性、有機溶劑(氯仿+異戊醇)變性、檸檬酸、高氯酸等。

用高氯酸除去磷蛋白、糖類、磷脂、核苷酸類輔酶和游離核苷酸、酸溶性小分子物質等雜質。

氯仿除脂類分子5.

DNA酶失活:

DNA酶需二價離子Mg2+、Ca2+的激活,使用EDTA、檸檬酸鹽螯合二價陽離子,基本可抑制DNA酶活性。

6.

DNA提取:不溶于一般有機溶劑,在乙醇中不溶形成沉淀。

7.

測定與含量計算:DNA在260nm處對紫外光吸收最大。對純DNA樣品來說,濃度為1

μg/ml時,DNA鈉鹽的OD260=0.02。即當A260=1時,dsDNA濃度約為50

μg/ml。三、材料、儀器、試劑

1.

材料:花棷菜、小麥芽等細胞分裂、DNA合成較旺盛的幼嫩組織器官。

2.

儀器:紫外分光光度計等。

3.

試劑:研磨緩沖液、10×SSC等、氯仿-異戊醇、高氯酸鈉、SDS等。四、實驗步驟1.

取花菜2-3g,剪碎置研缽中,加10ml預冷研磨緩沖液并加入0.1g左右的SDS,置冰浴上研磨成糊狀。2.

將勻漿無損轉入25ml刻度試管中,并將試管置65℃水浴中保溫15min,以滅活組織DNA酶,然后迅速冷卻到室溫。3.

向試管中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液,加上塞子,劇烈振蕩0.5min,轉入塑料離心管。靜置片刻以脫除組織蛋白質,配平,再以4000rpm離心5min。4.

離心后形成三層,小心地吸取上層清液(不用貪多)至刻度試管中,棄去中間層的細胞碎片、變性蛋白質及下層的氯仿。5.

加5mol/L高氯酸鈉溶液(提取液與高氯酸鈉溶液體積比為4:1),使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。6.

再次加入等體積氯仿-異戊醇混合液至大試管中,振蕩1min,靜置后在室溫下離心(4000rpm)

5min后,取上清液置小燒杯中。7.

用滴管吸95%的預冷乙醇,慢慢地加入燒杯中上清液的表面上,直至乙醇的體積為上清液的兩倍,用玻璃棒單方向輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上。8.

將核酸沉淀物在燒杯內壁上輕輕擠壓,以除去乙醇,先用5ml的0.1×SSC溶液溶解,然后加入0.5ml的10×SSC,使最終濃度為1×SSC,即得到DNA粗制品。重復7與8步驟,直至沒有絲狀DNA纏繞在玻棒上。9.

在波長260nm下測定DNA的吸收值A260。如濃度過高,需適當稀釋。(純DNA,A260/A280=1.8)五、原始數據與計算

W(樣品重量,g)=

A260

=N:稀釋倍數DNA含量

(μg/gFW)A260×50μg/ml×5.5ml×NWg=六、分析討論六分析討論

為什么在低溫下進行?研磨緩沖液中NaCl、檸檬酸鈉和EDTA的作用?加SDS的作用?加NaCl的作用,為什么要加到1mol/L?加入異戊醇有什么作用?補充:操作中一定要把溶液混勻,這樣離心后除雜效果才好!混勻過程要溫柔,以免DNA斷裂。某些時候還需要用到酚。酚、氯仿是變性蛋白質的(由于苯酚能溶進少量水中損失的DNA,因此與氯仿一起使用,可減少DNA損失)。材料里蛋白不太多不用苯酚,氯仿:異戊醇24:1就可以了。酚:加速細胞裂解,使蛋白質變性溶解,抑制DNase的降解作用

氯仿:變性沉淀蛋白質,加速有機相與水相分層,去除核酸溶液中殘余的酚。

異戊醇:降低表面張力,減少氣泡產生(氣泡會損失DNA),使離心后的水相、變性蛋白相及有機溶劑相維持穩定

乙醇沉淀:除鹽離子、糖、蛋白等雜質,保證PCR

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