雜蛋白的去除主講教師杜會茹青霉素簡介任務(wù)2.1認識青霉素發(fā)酵液青霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

青霉素是含有青霉素母核的多種化合物的總稱，青霉素發(fā)酵液中至少含有5種以上的不同的青霉素：青霉素G、青霉素F、青霉素X、青霉素K及二氫青霉素F等。青霉素分子結(jié)構(gòu)球棍模型青霉素生產(chǎn)發(fā)酵工藝菌種

目前國內(nèi)青霉素生產(chǎn)菌按其在深層培養(yǎng)中菌絲的形態(tài)分為絲狀菌和球狀菌兩種，根據(jù)絲狀菌產(chǎn)生孢子的顏色又分為黃孢子絲狀菌和綠孢子絲狀菌，常用菌種為綠孢子絲狀菌，如產(chǎn)黃青霉素。培養(yǎng)基碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖等。氮源：玉米漿、花生餅粉、精制棉籽餅粉或麩皮粉等有機氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等無機氮源。前體：如苯乙酸或苯乙酰胺。無機鹽：包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等鹽類。抗生素制備的一般流程圖菌種孢子制備種子制備發(fā)酵發(fā)酵液預(yù)處理及種子加濾提取及精制成品檢驗成品包裝前體發(fā)酵階段提取階段發(fā)酵培養(yǎng)控制加糖控制。殘?zhí)墙抵?.6%，pH上升時加糖補氮及加前體。補氮：硫酸銨、氨、尿素，使發(fā)酵液氨氮量控制在0.01%~0.05%。前體：發(fā)酵液中殘存乙酰胺濃度為0.05%~0.08%。pH控制。6.6~6.4溫度。前期25℃

~26℃

，后期23℃

。溶解氧。不低于飽和溶解氧的30%。泡沫的控制。發(fā)酵液成分微生物發(fā)酵或動植物細胞培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液(或培養(yǎng)液)中除含有所需的生物活性物質(zhì)外，還存在大量的菌體、細胞、胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物及剩余的培養(yǎng)基成分等。任務(wù)2.2搜集預(yù)處理相關(guān)知識和資料

除蛋白質(zhì)的方法1凝聚和絮凝2固液分離3膜分離4為什么要進行預(yù)處理？發(fā)酵液中雜質(zhì)很多，對后續(xù)分離影響最大的是高價無機離子(Ca2+,Mg2+,Fe3+)和雜蛋白等。發(fā)酵液中細微顆粒包括懸浮物和膠體顆粒，沉降困難。預(yù)處理的條件發(fā)酵液預(yù)處理初步純化目的產(chǎn)物在胞外固液分離目的產(chǎn)物在胞內(nèi)細胞破碎預(yù)處理的目的⑴改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率。⑵盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中(多數(shù)是液相)。⑶去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。預(yù)處理方法的選擇藥物自身理化性質(zhì)藥物穩(wěn)定性藥物分子量藥物的活性預(yù)處理的方法沉淀凝聚和絮凝定義：利用沉淀劑使所需提取的生化物質(zhì)或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。發(fā)酵液沉淀主要去除的是雜蛋白。什么是沉淀？沉淀法的特點操作簡單、經(jīng)濟、濃縮倍數(shù)高，但針對復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強一、沉淀常用的幾種方法等電點法變性沉淀法鹽析有機溶劑沉淀法反應(yīng)沉淀法（去除蛋白質(zhì)和無機金屬離子）去除蛋白質(zhì)首先了解蛋白質(zhì)肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列（或殘基序列）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)依靠不同氨基酸之間的C=O和N-H基團間的氫鍵形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，主要為α螺旋和β折疊。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)通過多個二級結(jié)構(gòu)元素在三維空間的排列所形成的一個蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)由不同多肽鏈（亞基）間相互作用形成具有功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物分子。蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)在水中近似為球形“親水表面，疏水內(nèi)核”水中為膠體，穩(wěn)定有水化膜和雙電層懸浮物的存在狀態(tài)發(fā)酵液懸浮物在液體中以膠體形式存在。都帶有電荷，且電性相同，其組成的溶液是膠體溶液。導(dǎo)致膠體穩(wěn)定性的原因1、動力學(xué)穩(wěn)定性：無規(guī)則布朗運動強，對抗重力影響的能力強。2、聚集穩(wěn)定性：（1）膠體帶電相斥（憎水性膠體）（2）膠體表面水化膜（親水性膠體）方法選擇的目的破壞雙電層結(jié)構(gòu)破壞水化膜因合并而沉降1.等電點沉淀法等電點（PI）：蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，在酸性溶液中帶正電荷，堿性溶液中帶負電荷，而在某一PH值下，凈電荷為零，稱為等電點。此時在水中溶解度最小，能沉淀除去。一般羧基電離度大于氨基，所以很多蛋白質(zhì)的等電點都在酸性范圍內(nèi)（pH4.0~5.5）pH值對蛋白質(zhì)荷電情況的影響

蛋白質(zhì)的滴定曲線

不同的蛋白質(zhì)由于其氨基酸組成的差異，具有不同的等電點（pI），當(dāng)溶液（環(huán)境）pH值低于其pI時，蛋白質(zhì)帶正電荷，而當(dāng)環(huán)境pH值高于其等電點時，蛋白質(zhì)帶負電荷，且偏離等電點越多，其所帶電荷越多.沉淀方法：加酸常用酸化劑：硫酸、鹽酸、磷酸、草酸等1.等電點沉淀法等電點沉淀法的特點不同的蛋白質(zhì)，具有不同的等電點同一種蛋白質(zhì)在不同條件下，等電點不同避免直接用強酸強堿調(diào)節(jié)PH，引起目的藥物成分蛋白或酶的變性各種蛋白質(zhì)在等電點時，仍存在一定的溶解度，使沉淀不完全，可以考慮采用幾種方法結(jié)合來實現(xiàn)沉淀分離。變性沉淀方法加熱：利用蛋白質(zhì)等生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱破壞某些組分，而保存另一些組分。加入化學(xué)試劑：金屬鹽、表面活性劑、某些有機酸、酚、鹵代烷等可使混合液中的蛋白質(zhì)或部分蛋白質(zhì)發(fā)生變性而沉淀。調(diào)節(jié)pH值：當(dāng)溶液的酸堿性發(fā)生劇烈變化時，可引起蛋白質(zhì)的變性而沉淀。變性沉淀特點使蛋白質(zhì)溶解度變小，變性沉淀使液體黏度降低，加快過濾速度只適用于對熱穩(wěn)定的生化物質(zhì)3．鹽析沉淀法當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度增大（2）“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降鹽析機理中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導(dǎo)致沉淀。鹽離子與蛋白質(zhì)表面具有相反電性的離子基團結(jié)合，形成離子對，即鹽離子部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間的電排斥作用減弱而相互靠攏、聚集形成沉淀。常用的鹽析劑硫酸銨：溶解度大（767g/L）硫酸鈉磷酸鹽檸檬酸鹽鹽析的影響因素鹽析劑的性質(zhì)和加入量

（1）符合鹽析分布曲線（2）一般陰離子的鹽析效果比陽離子好。對于陰離子，帶電荷較多者，鹽析能力較強，對于陽離子，帶電荷較多者，鹽析能力較低。鹽析的影響因素蛋白質(zhì)類化合物溶液的濃度：蛋白質(zhì)濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質(zhì)濃度小，鹽的用量大，分辨率高溫度：大多數(shù)情況下，高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降。鹽析的影響因素pH值：影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量，通常調(diào)整體系pH值，使其在pI附近。蛋白質(zhì)類化合物的性質(zhì)：各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，鹽析沉淀的鹽濃度、pH、溫度等操作條件不同。4.有機溶劑沉淀法定義：在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑（甲醇、乙醇、丙酮等），降低溶質(zhì)的溶解度，使其沉淀析出。有機溶劑沉淀機理降低了溶質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致沉淀。由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，降低了親水性，導(dǎo)致脫水凝聚。常用的有機溶劑沉淀劑乙醇：沉淀作用強，揮發(fā)性適中，無毒。常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉淀作用更強，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣。

有機溶劑沉淀的特點分辨率高；溶劑容易分離，并可回收使用；產(chǎn)品潔凈；容易使蛋白質(zhì)等生物大分子失活；應(yīng)注意在低溫下操作；成本高溶劑選擇介電常數(shù)要小致變性作用要小（甲醇）毒性要小、揮發(fā)性適中水溶性要好影響有機溶劑沉淀的主要因素溫度：低溫有利于防止溶質(zhì)變性；有利于提高收率（溶解度下降）；攪拌速度：散熱溶液pH值：原則是避免目標蛋白與雜質(zhì)帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。（pI）離子強度：離子強度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L樣品濃度：0.5~2%

稀：溶劑用量大，回收率低，但共沉淀作用小濃：節(jié)省溶劑用量，共沉作用強，分辨率低金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+5.反應(yīng)沉淀法定義：在反應(yīng)液中加入某些不影響目的藥物的化學(xué)反應(yīng)試劑，使其與雜質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成不溶性沉淀的方法。常用