環境生物工程環境生物工程環境中主要污染物生物凈化與生物廢料再生微生物與環保石油污染的生物治理耐熱微生物生物脫硫研究由于石油中含有的有毒硫雜環、氮雜環所造成的酸雨對森林的破壞和城市光化學污染由于石油泄漏所造成大批魚類死亡的可怕景象由于石油污染所造成海鳥死亡的可怕景象微生物處理石油污染的效果石油廢水中常見的有毒烴類有機化合物石油廢水中常見的有毒含硫有機化合物石油廢水中常見的有毒的含氮有機化合物必要性：生物法處理石油廢水比化學法更具有競爭力。由于大部分噻吩類、咔唑類雜環化合物的化學鍵相當牢固，因此在常規的溫度和壓力下，化學法幾乎不可能降解石油污染廢水中的有機硫、有機氮及其它難以降解的雜環化合物。在已經篩選到的幾株特殊微生物基礎上，研究：(1)以噻吩類雜環(Thiophene）作為模式反應物，研究嗜熱、耐有機溶劑細菌的脫有機的代謝反應機制及其硫雜環降解的關鍵基因。一、研究內容(2)以CA(Carbozole，簡稱CA)作為模式降解物，研究一株具有耐有機溶劑且能降解攻擊咔唑能力的細菌氮雜環代謝反應機制及其某些關鍵基因。(3)以十二烷烴或石蠟為模式化合物，研究一株具有油水分離功能的特殊細菌油水分離機制，為進一步的應用打下理論基礎。含原油廢水的處理效果石蠟＋水的處理效果(4)研究高溫嗜熱細菌生長生存(大于75℃,好氧)的生理學和降解雜環和直鏈烷烴化合物的反應機制，并分離這些極端微生物的某些特殊功能基因高效雜環物降解的基因工程菌硫雜環降解微生物氮雜環降解微生物具有油水分離功能的微生物嗜熱、抗有機溶劑特殊微生物(5)糅合上述極端微生物的幾個特殊功能基因，構建高效雜環物降解的工程菌雜環降解微生物高密度發酵目的基因表達的最佳誘導方案(1)減少昂貴的誘導物使用量(2)增加目的基因的表達

(3)方案：

I.無機硫源(氮源)＋有機誘導物II.廉價無機硫源(氮源)高密度培養，再誘導(6)極端微生物和工程菌發酵工藝優化研究齊魯石化濟南煉油廠勝利油田孤島采油廠硫雜環降解微生物氮雜環降解微生物具有油水分離功能的微生物嗜熱、抗有機溶劑特殊微生物(7)提供上述菌株進行小試和現場石油廢水處理中試研究小試中試(1)生長細胞代謝途徑的研究：

分別以DBT、CA、長鏈烷烴和其代謝中間衍生物反應物，檢測胞內外代謝中間物和末端產物，各種反應物的利用及其代謝產物的產生來判斷不同生長條件下的代謝途徑和流向。

(2)休止細胞雜環降解途徑的研究：

在非生長體系中，用具有各種活力的休止細胞作為降解雜環的催化劑，分別用DBT、THA、CA、長鏈烷烴及其代謝中間衍生物作為反應底物，確定生物降解酶催化體系的反應途徑。(3)脫硫基因、脫氮基因及其它特殊降解基因研究：

基因的分離，確認，以及該基因在大腸桿菌中的高效表達，該基因產物的特性分析，基因的序列分析，重組體的構建。二、研究關鍵(對上述特殊微生物，由淺入深，三個層次展開)：(1)微生物油水分離機制的研究：

由于該研究完全屬新發現，很難找到有價值的參考報道。擬從微生物產生表面活性劑或長鏈烷烴聚集固化現象來探討。(2)超高溫微生物的優化培養：

由于我們所獲得的超高溫嗜熱耐熱微生物來源于油田微生物，探討這些微生物超高溫生長的生理和發酵工藝的優化技術是較為關鍵的研究。三、擬解決的技術難點

四、預期達到的研究目標(1)本項研究的成功可以填補多項特殊菌雜環降解途徑研究上的空白。(2)可闡明上述極端微生物雜環降解途徑和反應機制：生長體系雜環化合物的降解機制；休止細胞雜環化合物的降解機制；DBT、THA、CA和長鏈烷烴分解途徑的酶反應機制及其某些關鍵基因。

(3)該項目的相關的研究內容及研究方法分別可在國內外重要雜志每年有4篇以上高質量的論文發表。申報2~3項國內外發明專利。(4)分離、克隆3~4個具有獨立知識產權的具有特殊降解雜環功能基因；提供3~4株有明顯降解處理石油廢水能力的菌株。

六、預期可獲得的發明專利等知識產權

根據我們所掌握的信息資料，至少在下列內容可申報獨立的發明專利權(見查新證明書)：(1)耐熱微生物處理含氮、含硫廢水；(2)超高溫微生物處理石油廢水;(3)石油廢水油水分離的微生物技術；如果經費充足，我們擬申報1~2項國際專利。選取3-4株耐有機溶劑、耐高溫菌株進行模式化合物研究，降解率達到80%每年4篇以上高水平的論文分離、克隆3-4個功能基因片斷申報2-3項專利生長體系、催化劑降解機制研究在采油廠進行石油廢水處理，日處理量達到100-200立方，對雜環及有機烴類降解率達到90%DNA改組進行改造，提高降解活力、底物作用范圍填補特殊菌雜環及有機烴降解的某些研究空白主要研究內容及預期達到的目標總圖八、研究方法與實施方案1研究方法(1)

定性確定極端微生物可能的雜環降解途徑

利用GC/MS定性測定雜環降解途徑中的各反應物，代謝中間物和最終產物。(2)定量確定極端微生物雜環降解活力

利用GC定量測定各種反應物和產物，同時尋找比色方法，如與Gibbs顯色法測定代謝反應終端產物(HBP和DHBP)的方法進行比較。(3)雜環降解基因克隆方案(a)質粒分離：使用熱突變或化學突變，驗證菌株降解有機污染物的性狀是否丟失。如果性狀丟失，那它就是由質粒控制的，則提取質粒，通過酶切轉化，篩選陽性克隆，獲得該DNA片段。反之，則采取下述方案。(b)染色體上目的基因的定位克隆：目的基因在染色體上，采用AFLP分子標記進行基因定位。發酵設備及檢測控制系統

B|Braun公司(4)雜環降解生物催化劑大量制備：用申請者所在課題組從德國貝朗公司引進的計算機全自動控制的2L發酵罐進行發酵，提供該項研究所需要的大量的具有高降解活力的菌體。酶的性質及結構分析以噻吩為模式物進行有機硫雜環降解研究以咔唑為模式物進行有機氮雜環降解研究以石蠟為模式物進行有機烴降解和油水分離機理研究基因分離、克隆酶的分離及純化質粒的分離以AFLP為分子標記，克隆染色體上功能片斷分子改造，并在異源宿主內進