課程名稱(chēng)：微生物學(xué)基礎(chǔ)微生物的菌種選育一、常見(jiàn)微生物（一）細(xì)菌工業(yè)常用微生物第一節(jié)工業(yè)常用微生物及要求醋桿菌屬——食醋生產(chǎn)乳酸菌——酸奶生產(chǎn)芽孢桿菌屬——益生菌制劑（二）酵母工業(yè)常用微生物啤酒酵母——酒類(lèi)生產(chǎn)產(chǎn)朊假絲酵母——青貯飼料面包酵母——焙烤食品（三）霉菌工業(yè)常用微生物曲霉屬——醬油、醋生產(chǎn)青霉屬——抗生素生產(chǎn)根霉屬——黃酒、白酒生產(chǎn)（四）放線(xiàn)菌工業(yè)常用微生物鏈霉菌——抗生素生產(chǎn)二、微生物工業(yè)對(duì)菌種的要求工業(yè)常用微生物01原料廉價(jià)，生長(zhǎng)迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高02易控制培養(yǎng)條件，發(fā)酵周期較短03抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)04不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)和毒素選育方法:自然選育誘變育種基因工程育種選育目的：1、產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)2、改變產(chǎn)品組分，改進(jìn)質(zhì)量3、簡(jiǎn)化工藝條件、縮短生產(chǎn)周期4、適應(yīng)新的原材料5、提高產(chǎn)量菌種的選育菌種選育工作任務(wù)：為某白酒企業(yè)選育一株高產(chǎn)淀粉酶的菌種采樣篩選分離發(fā)酵優(yōu)化誘變處理自然選育任務(wù)1產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選采樣富集培養(yǎng)篩選分離目標(biāo)菌1.采樣菌種選育土壤河流大海土壤是微生物的大本營(yíng)，自然界選育菌種的主要來(lái)源1.采樣菌種選育選擇地點(diǎn)中性偏堿的土壤細(xì)菌和放線(xiàn)菌酸性紅土壤和森林土壤霉菌果園、菜園等含碳水化合物土壤酵母和霉菌確定時(shí)間雨量不多，溫度適中的秋初水分、溫度、通風(fēng)、pH1.采樣菌種選育無(wú)菌采樣取離地面50-150mm的土標(biāo)注樣品種類(lèi)、采樣日期、地點(diǎn)及其地理、生態(tài)參數(shù)2.富集培養(yǎng)菌種選育目的提高目的菌的數(shù)量，增加篩選分離的概率方法（1）控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分（碳源：糖類(lèi)、纖維素、淀粉、CO2）（2）控制培養(yǎng)條件（好氧或厭氧、溫度、pH）（3）添加抑制因子（根據(jù)菌種特性）3.篩選分離菌種選育目的培養(yǎng)微生物，篩選出可疑目的菌株原理目標(biāo)菌代謝產(chǎn)物產(chǎn)生酶，與選擇性培養(yǎng)基中成分發(fā)現(xiàn)生理生化反應(yīng)方法透明圈3.篩選分離菌種選育01平板劃線(xiàn)法：簡(jiǎn)單、快捷3.篩選分離菌種選育02平板稀釋涂布法。菌落單一均勻4.目標(biāo)菌菌種選育方法：

分光光度法測(cè)定測(cè)酶活透明圈目的：進(jìn)行生產(chǎn)性能的測(cè)定，確定適合生產(chǎn)要求的目的菌株。步驟：

初篩（1株1瓶）復(fù)篩（1株3瓶）再次復(fù)篩（1株3瓶）單株純種分離生產(chǎn)性能試驗(yàn)毒性試驗(yàn)菌種鑒定二、特定產(chǎn)物菌株的鑒定菌種選育平板反應(yīng)快速檢出法紙片培養(yǎng)顯色法透明圈法變色圈法生長(zhǎng)圈法抑制圈法原理：以飽浸含有某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙置于培養(yǎng)皿中，用牛津杯架空，下放小團(tuán)浸有3%甘油的脫脂棉以保濕，用接種環(huán)取適量細(xì)胞懸液接于濾紙上，保溫培養(yǎng)，得到分散的單菌落，菌落周?chē)a(chǎn)生對(duì)應(yīng)的顏色改變，由指示劑變色圈和菌落直徑之比可知產(chǎn)量性狀的相對(duì)大小。指示劑待檢菌接種培養(yǎng)菌種選育紙片培養(yǎng)顯色法指示劑指示劑原理：菌株生產(chǎn)在過(guò)程中產(chǎn)生特定的產(chǎn)物，分解培養(yǎng)基中某特定成分，即可形成透明圈，可被檢測(cè)出淀粉淀粉待檢菌涂布培養(yǎng)淀粉酶淀粉菌種選育透明圈法淀粉淀粉待檢菌涂布培養(yǎng)淀粉酶淀粉碘液碘液菌種選育變色圈法原理：直接用顯色劑或指示劑摻入培養(yǎng)基中，或噴灑已生長(zhǎng)菌落的培養(yǎng)基表面，使其形成顯色圈而被檢出。-A工具菌-A工具菌待檢菌涂布培養(yǎng)+A單菌落工具菌菌種選育生長(zhǎng)圈法原理：將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，若分離的菌株能在一般的培養(yǎng)條件下（缺乏上述營(yíng)養(yǎng)要求物質(zhì)）生長(zhǎng)而合成該營(yíng)養(yǎng)物，工具菌因獲得所需的營(yíng)養(yǎng)而生長(zhǎng)，在該菌株的菌落周?chē)纬闪藴啙岬纳L(zhǎng)圈。-A單菌落培養(yǎng)菌種選育抑制圈法原理：將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，若分離的菌株能生長(zhǎng)且分泌產(chǎn)生某些抑制工具菌生長(zhǎng)的物質(zhì)B，工具菌因生長(zhǎng)受到抑制，在該菌株的菌落周?chē)纬晒ぞ呔荒苌L(zhǎng)的抑制圈。工具菌工具菌待檢菌涂布培養(yǎng)B工具菌菌種選育三、微生物實(shí)驗(yàn)操作技能1、無(wú)菌取樣2、檢樣稀釋3、涂布法實(shí)驗(yàn)二：誘變育種利用篩選培養(yǎng)基分離能產(chǎn)葡聚糖酶的菌株，采用測(cè)定透明圈大小的方法比較各菌株的產(chǎn)酶能力舊知回顧實(shí)驗(yàn)原理：葡聚糖+剛果紅菌懸液涂布葡聚糖+剛果紅葡聚糖酶分解葡聚糖，形成透明圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀(guān)察實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)葡聚糖酶菌株透明圈直徑（mm）01疑似菌株的判定依據(jù)：透明圈02疑似菌株的鑒別：圈出、編號(hào)、測(cè)量透明圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀(guān)察實(shí)驗(yàn)結(jié)果03實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：操作和結(jié)果思考：為什么會(huì)出現(xiàn)這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果？實(shí)驗(yàn)方案如何改進(jìn)？誘變育種什么是誘變？青霉素生產(chǎn)菌誘變育種1927：MullerHJ.使用X射線(xiàn)在果蠅上發(fā)現(xiàn)了很大數(shù)量的突變體。誘變育種誘變育種：

是指利用物理或化學(xué)誘變劑處理均勻分散的微生物細(xì)胞群，促進(jìn)其突變頻提高，篩選出少數(shù)符合育種目的的突變株，以供生產(chǎn)實(shí)踐或科學(xué)實(shí)驗(yàn)之用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍龠M(jìn)目標(biāo)菌株發(fā)生正突變，提高產(chǎn)酶（代謝產(chǎn)物）量，得到高產(chǎn)菌株誘變育種一、誘變育種試驗(yàn)設(shè)計(jì)和準(zhǔn)備工作1、誘變前對(duì)出發(fā)菌株的了解（菌落類(lèi)型）2、了解菌種的特性及其與生產(chǎn)性能的關(guān)系3、了解影響菌種生長(zhǎng)繁殖的主要原因4、了解菌種有效產(chǎn)物中的各組分在代謝合成過(guò)程中與培養(yǎng)條件的關(guān)系5、建立準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)產(chǎn)物的方法6、研究最佳的菌種保藏培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件誘變育種的一般步驟原始菌株（出發(fā)菌株）細(xì)胞或孢子懸液制備誘變處理中間培養(yǎng)突變株分離誘變劑選擇誘變育種初篩復(fù)篩生產(chǎn)性能試驗(yàn)同步培養(yǎng)(一)出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株：用來(lái)進(jìn)行誘變處理的起始菌株誘變育種合適的出發(fā)菌株就是通過(guò)育種能有效地提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量及質(zhì)量的菌株首先應(yīng)考慮出發(fā)菌株是否具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力。誘變育種

出發(fā)菌株的來(lái)源：主要有三方面(1)自然界直接分離到的野生型菌株

這些菌株的特點(diǎn)是：①酶系完整，染色體或DNA未損傷②生產(chǎn)性能差③誘變育種后正突變的可能性大(一)出發(fā)菌株的選擇誘變育種(2)遺傳特性好的菌株

這些菌株的特點(diǎn)是：①有一定的生產(chǎn)力②具有有利的性狀，如生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求低(3)對(duì)誘變劑敏感的菌株

這些菌株的特點(diǎn)是：①可提高變異頻率(一)出發(fā)菌株的選擇在誘變育種中，處理材料一般采用生理狀態(tài)一致的單倍體、單核細(xì)胞，即菌懸液的細(xì)胞應(yīng)盡可能達(dá)到同步生長(zhǎng)狀態(tài)——生理活性一致，稱(chēng)為同步培養(yǎng)。細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)誘變處理會(huì)產(chǎn)生很大的影響。細(xì)菌在對(duì)數(shù)期誘變處理效果較好；霉菌或放線(xiàn)菌的分生孢子一般都處于休眠狀態(tài)，所以培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)孢子影響不大，但稍加萌發(fā)后的孢子則可提高誘變效率。（二）同步培養(yǎng)誘變育種細(xì)菌一般要求培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)群體生長(zhǎng)狀態(tài)比較同步，比較容易變異，重復(fù)性較好。如亞硝基胍誘變時(shí)作用于復(fù)制叉處，生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞中復(fù)制叉點(diǎn)較多，堿基類(lèi)似物也在此時(shí)期比較容易進(jìn)入DNA鏈中。霉菌處理使用分生孢子，應(yīng)該將分生孢子在液體培養(yǎng)基中短時(shí)間培養(yǎng)，使孢子孵化，處于活化狀態(tài)，并恰好未形成菌絲體，易于誘變。

誘變育種（三）單細(xì)胞(或單孢子)懸液的制備要求：①菌齡適宜：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體②濃度適宜：霉菌孢子或酵母菌細(xì)胞的濃度大約為106-107個(gè)／mL，放線(xiàn)菌和細(xì)菌的濃度大約為108個(gè)/mL③均勻分散④一般可用生理鹽水或緩沖溶液配制目的：細(xì)胞可均勻地接觸誘變劑誘變育種誘變育種接種培養(yǎng)離心轉(zhuǎn)入棄去上清液達(dá)到所需細(xì)胞濃度如何制備？出發(fā)菌株培養(yǎng)基離心管混勻生理鹽水或緩沖液（四）誘變處理誘變育種誘變處理的步驟：1、選擇合適的誘變劑2、確定誘變劑使用劑量常用誘變劑有兩大類(lèi)：

物理誘變劑

化學(xué)誘變劑

1、選擇合適的誘變劑——誘變劑的種類(lèi)誘變育種

物理誘變劑誘變育種

物理誘變劑誘變育種誘變育種

物理誘變劑電離輻射可引起DNA分子結(jié)構(gòu)中堿基的變化則造成基因突變誘變育種

化學(xué)誘變劑種類(lèi)：①烷化劑②堿基類(lèi)似物③疊氮化合物57誘變育種1、選擇合適的誘變劑——選擇的原則誘變劑選擇的原則：①根據(jù)菌種特性和遺傳穩(wěn)定性來(lái)選擇誘變劑②在同樣效果下，應(yīng)選用最簡(jiǎn)便的因素；而在同樣簡(jiǎn)便的條件下，應(yīng)選用最高效的因素58誘變育種

２、選擇合適的誘變劑量誘變劑量的確定：①正突變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變則較多地出現(xiàn)于偏高的劑量中；②最適的誘變劑量：在高誘變率的基礎(chǔ)上既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量(五)中間培養(yǎng)中間培養(yǎng)也叫后培養(yǎng)：將誘變過(guò)的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，使得突變基因穩(wěn)定、純合并表達(dá)。誘變育種(六)分離和篩選突變株的分離：分離正突變的菌株初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主誘變育種

紫外線(xiàn)誘變誘變育種紫外線(xiàn)是陽(yáng)光中波長(zhǎng)為10～400納米（nm）的光線(xiàn)，不可見(jiàn)光

紫外線(xiàn)誘變誘變育種誘變機(jī)理：形成T=T二聚體，也可形成C=T或C=C二聚體，導(dǎo)致DNA分子結(jié)構(gòu)局部變形，嚴(yán)重干擾復(fù)制和轉(zhuǎn)錄

紫外線(xiàn)誘變誘變育種劑量選擇：①一般采用15W紫外線(xiàn)殺菌燈，最有效波長(zhǎng)為253.7nm。②燈與處理物的距離為15～30cm③照射時(shí)間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜

紫外線(xiàn)誘變誘變育種特點(diǎn)：①穿透力不強(qiáng)，照射液厚度約0.5～1.0cm，同時(shí)要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻②由于紫外線(xiàn)照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或者用黑色不透光布包裹培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)二：產(chǎn)酶菌株的誘變實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾岣弋a(chǎn)酶菌株的產(chǎn)酶量實(shí)驗(yàn)方法：紫外線(xiàn)誘變實(shí)驗(yàn)對(duì)象：產(chǎn)葡聚糖酶菌株實(shí)驗(yàn)任務(wù)：1.查閱資料，了解紫外線(xiàn)誘變的方法及注意事項(xiàng)2.制定實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)設(shè)備：誘變育種紫外線(xiàn)誘變操作步驟01出發(fā)菌株選擇02前培養(yǎng)①制備營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基②將菌體培養(yǎng)到最佳生理狀態(tài)

產(chǎn)酶量較大的菌株誘變育種03制備菌懸液

①方法：生理鹽水洗脫離心生理鹽水沖洗離心

②要求：分散度：90％-95％菌體濃度：1×108mL-1（OD600=0.5）

誘變育種04紫外線(xiàn)照射

①預(yù)熱:紫外燈預(yù)熱20min

②加樣：取4mL菌液加到直徑9cm無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，放入無(wú)菌磁力攪拌子，置磁力攪拌器上、15W紫外線(xiàn)下30cm處

③紫外線(xiàn)照射：打開(kāi)紫外燈，開(kāi)啟皿蓋，在攪拌下照射60s后用黑布包住誘變育種05暗箱培養(yǎng)①梯度稀釋?zhuān)鹤贤饩€(xiàn)照射后的菌懸液進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-6②接種培養(yǎng)：選擇后3個(gè)稀釋度，平板涂布法接種至篩選培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)48h06分離將紫外線(xiàn)照射后的菌懸液用黑布包住，35℃培養(yǎng)2h誘變育種07篩選鑒定1、樣液梯度稀釋2、平板涂布法接種篩選培養(yǎng)基誘變育種08實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、致死率=（對(duì)照組菌落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)）/對(duì)照組菌落數(shù)*100%2、單菌落D/d值=透明圈直徑Dmm/菌落直徑dmm菌株編號(hào)誘變前D/d誘變后D/d表1單菌落D/d值比較一、菌種的衰退

菌種的衰退、復(fù)壯與保藏1.衰退：菌種在培養(yǎng)或保藏過(guò)程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象，稱(chēng)為菌種的衰退。衰退的原因：①基因突變，②分離現(xiàn)象。常見(jiàn)的衰退現(xiàn)象：菌落和細(xì)胞形態(tài)的改變；生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少；抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對(duì)宿主寄生能力下降；菌種的衰退、復(fù)壯與保藏復(fù)壯：使衰退的菌種恢復(fù)原來(lái)優(yōu)良性狀。菌種的復(fù)壯措施：

①純種分離：（平板劃線(xiàn)法、涂布法、傾注法、單細(xì)胞挑取法等）。

②通過(guò)寄主體內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)行復(fù)壯（如Bacillusthuringiensis的復(fù)壯）；

③淘汰已衰退的個(gè)體（采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體）。

④采用有效的菌種保藏方法。二、菌種的復(fù)壯

1、菌種保藏的目的

①菌種存活，不丟失，不污染

②防止優(yōu)良性狀喪失

③隨時(shí)為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種菌種的衰退、復(fù)壯與保藏三、菌種保藏2、菌種保藏的方法斜面保藏法穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷凍保藏法液氮保藏法低溫保藏法菌種的衰退、復(fù)壯與保藏斜面低溫保藏法方法：接種適宜斜面培養(yǎng)基→培養(yǎng)→4℃保藏原理：低溫下，微生物代謝強(qiáng)度明顯下降適用：各大類(lèi)保藏期：3-6個(gè)月缺點(diǎn)：保存期短，傳代多，易退化菌種的衰退、復(fù)壯與保藏菌種的衰退、復(fù)壯與保藏

半固體穿刺保藏法方法：適宜半固體→培養(yǎng)→4℃保藏原理：缺氧、低溫適用：好氣性細(xì)菌，酵母等保藏期：6-12個(gè)月步驟：用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養(yǎng)基中心自上而下刺入，至培養(yǎng)基的1/2處，待微生物生長(zhǎng)良好后覆蓋2-3mm無(wú)菌液體石蠟.石蠟可防止培養(yǎng)基失水又隔絕氧氣,降低代謝.但不適用于可以石蠟為碳源的微生物.菌種的衰退、復(fù)壯與保藏菌種的衰退、復(fù)壯與保藏

砂土管干燥保藏法方法：將干燥砂粒與細(xì)土混合后滅菌制成砂土管，然后接種保藏。原理：無(wú)營(yíng)養(yǎng)，缺氧，干燥適用：產(chǎn)孢子的絲狀真菌、放線(xiàn)菌；有芽孢的細(xì)菌保藏期：2-10年或更長(zhǎng)菌種的衰退、復(fù)壯與保藏河沙60目篩棄去大顆粒及雜質(zhì)80目篩去掉細(xì)沙吸鐵石吸去鐵質(zhì)10％～20％的鹽酸浸泡24h去除有機(jī)物水洗至中性烘干或曬干土：取地面下40～60cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過(guò)篩，水洗至中性，烘干。

將處理后的沙、土按質(zhì)量比2∶1混合。混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃高壓間歇滅菌2-3次，烘干備用。孢子或芽孢懸液→加入無(wú)菌砂土管中→干燥→封口→4-6℃保藏步驟：沙：菌種的衰退、復(fù)壯與保藏?zé)o菌條件下打開(kāi)沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出菌落后再轉(zhuǎn)接一次。或取沙土粒于適宜的液體培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)接斜面。沙土管恢復(fù)培養(yǎng)菌種的衰退、復(fù)壯與保藏真空冷凍干燥保藏法：方法：菌種培養(yǎng)→用保護(hù)劑懸浮→加入安醅管中→低溫凍結(jié)（-25—-40℃）→抽真空→真空封口→4-5℃保藏措施：低溫、干燥，缺氧，保護(hù)劑適用：各大類(lèi)保藏期：5-10年或更長(zhǎng)菌種的衰退、復(fù)壯與保藏步驟1安瓿管的處理

直徑8-10mm，長(zhǎng)度不小于100mm，洗凈高壓滅菌備用。2保護(hù)劑

低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等。常用的是脫脂奶和血清。3菌懸液制備

最適培養(yǎng)條件、生長(zhǎng)后期。產(chǎn)孢子的微生物須適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間以獲得成熟的孢子。4冷凍干燥5安瓿管的保藏

4-5℃保藏菌種的衰退、復(fù)壯與保藏菌種的衰退、復(fù)壯與保藏

液氮超低溫保藏法方法：菌懸液→加入保護(hù)劑→分裝至安醅管中（0.2-1cm菌懸液）→逐步降溫至-25℃→液氮罐（-196℃）保藏措施：低溫、加保護(hù)劑（10%甘油）適用：范圍廣泛保藏期：一般2～3年，長(zhǎng)則9年。菌種的衰退、復(fù)壯與保藏菌種凍存管菌種的衰退、復(fù)壯與保藏7種常用菌種保藏方法的比較方法主要措施適宜菌種保藏期評(píng)價(jià)斜面低溫保藏法低溫（4℃）各大類(lèi)約1～6月簡(jiǎn)便冰箱保藏法（半固體）低溫（4℃），避氧細(xì)菌，酵母菌約6