以VSV為載體的結(jié)核疫苗VSV-846：免疫特性、機制及應(yīng)用前景探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)核病（Tuberculosis，TB）作為一種古老且嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，至今仍是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的重大挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2024年全球結(jié)核病報告》顯示，2023年新確診病例數(shù)達820萬，相比2022年報告的750萬顯著增加，為自1995年開始監(jiān)測以來的最高記錄，結(jié)核病相關(guān)死亡人數(shù)為125萬，超過新冠肺炎相關(guān)死亡人數(shù)，再次成為致死人數(shù)最多的傳染病。結(jié)核病在全球廣泛分布，不同地區(qū)的疫情嚴(yán)重程度差異較大。非洲、東南亞等地區(qū)是結(jié)核病的高發(fā)區(qū)域，這些地區(qū)由于醫(yī)療衛(wèi)生條件相對落后、人口密集、貧困以及艾滋病病毒（HIV）共感染等因素，結(jié)核病的傳播和防控形勢極為嚴(yán)峻。在中國，盡管近年來結(jié)核病疫情呈穩(wěn)步下降趨勢，發(fā)病率下降速度是全球平均水平的2倍，成功治療率保持在90%以上，死亡率維持在較低水平，但每年仍有大量新發(fā)病例。據(jù)統(tǒng)計，2010年第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國年發(fā)病人數(shù)約為130萬，約占全球發(fā)病的14.3%，結(jié)核病患者發(fā)現(xiàn)率低、部分患者經(jīng)濟負擔(dān)相對較高、新技術(shù)落地應(yīng)用困難、公眾防治醫(yī)學(xué)常識需增強以及科技創(chuàng)新中的基礎(chǔ)研究和科學(xué)問題有待突破等問題依舊存在。目前，全球唯一廣泛使用的結(jié)核疫苗是卡介苗（BacillusCalmette-Guérin，BCG），它是由減毒的結(jié)核分枝桿菌制成的活疫苗，自1921年以來在全球范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用。BCG對兒童重癥結(jié)核病，如結(jié)核性腦膜炎和血行播散性肺結(jié)核具有顯著的預(yù)防效果，能夠有效降低兒童感染結(jié)核分枝桿菌后的發(fā)病風(fēng)險。然而，BCG對成人肺結(jié)核的預(yù)防效果卻十分有限。大量研究和實踐表明，成人接種BCG后，并不能完全防止感染，其保護效果會隨著時間的推移而逐漸減弱。并且，BCG對潛伏性結(jié)核感染和已感染結(jié)核菌的人群無效。此外，BCG與環(huán)境中分枝桿菌存在共同抗原，這也在一定程度上降低了疫苗的保護作用。鑒于BCG的諸多局限性，研發(fā)一種能夠在體內(nèi)建立長效免疫應(yīng)答、有效預(yù)防成人結(jié)核病的新型疫苗迫在眉睫。水泡性口炎病毒（VesicularStomatitisVirus，VSV）作為一種理想的病毒疫苗載體，具有諸多優(yōu)點。VSV具有廣泛的宿主范圍，能夠感染多種哺乳動物細胞，這為其作為疫苗載體提供了更廣闊的應(yīng)用前景。它在普通人群內(nèi)存在抗VSV抗體少，這使得以VSV為載體的疫苗能夠更有效地激發(fā)人體的免疫反應(yīng)。VSV的基因組相對簡單，易于進行基因操作和改造，通過分子生物學(xué)技術(shù)可以方便地將外源基因克隆至VSV載體中，構(gòu)建重組病毒疫苗。VSV載體疫苗還具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。基于VSV的這些優(yōu)勢，將其作為載體構(gòu)建結(jié)核疫苗具有重要的研究價值和應(yīng)用潛力。本研究聚焦于以VSV為載體的結(jié)核疫苗VSV-846，旨在深入探討其免疫作用及機制。通過將含有結(jié)核桿菌三抗原融合基因p846及單個抗原Rv3615c、Mtb10.4、Rv2660c克隆至VSV-XN2載體，并包裝成重組VSV病毒疫苗。對小鼠進行免疫實驗，檢測相應(yīng)的細胞免疫應(yīng)答，評估其在抗結(jié)核感染中的作用，并深入剖析該保護作用的機制機理。這一研究對于揭示VSV-846疫苗的免疫特性，為結(jié)核病的預(yù)防和控制提供新的策略和方法具有重要的理論和實踐意義。若VSV-846疫苗能夠展現(xiàn)出良好的免疫效果和作用機制，有望成為一種能有效控制結(jié)核病復(fù)發(fā)的新型疫苗，為全球結(jié)核病防治工作帶來新的希望，對減輕結(jié)核病的社會和經(jīng)濟負擔(dān)、保障人類健康具有深遠的影響。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在結(jié)核病疫苗研發(fā)領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者圍繞VSV-846疫苗及類似載體疫苗開展了一系列研究，取得了不少成果，同時也暴露出一些不足。國外對VSV載體疫苗的研究起步較早，在基礎(chǔ)理論和技術(shù)應(yīng)用方面積累了豐富的經(jīng)驗。部分研究聚焦于VSV載體的改造和優(yōu)化，旨在提高其作為疫苗載體的性能。如通過基因工程技術(shù)對VSV的基因組進行修飾，使其能夠更高效地表達外源抗原，增強疫苗的免疫原性。在結(jié)核疫苗研究方面，一些國外團隊嘗試將結(jié)核桿菌的關(guān)鍵抗原基因?qū)隫SV載體，構(gòu)建重組VSV-結(jié)核疫苗，并在動物模型上進行免疫效果評估。這些研究表明，以VSV為載體的結(jié)核疫苗能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答，在一定程度上提高動物對結(jié)核分枝桿菌感染的抵抗力。不過，在疫苗的安全性評估和長期免疫效果監(jiān)測方面仍存在一定的不確定性。例如，對于重組VSV疫苗在體內(nèi)長期存在可能引發(fā)的潛在風(fēng)險，如病毒變異、免疫逃逸等問題，還需要進一步深入研究。國內(nèi)在VSV-846疫苗及類似載體疫苗的研究上也取得了顯著進展。有研究成功構(gòu)建了VSV-846疫苗，并對其免疫作用及機制進行了初步探討。通過將含有結(jié)核桿菌三抗原融合基因p846及單個抗原Rv3615c、Mtb10.4、Rv2660c克隆至VSV-XN2載體，包裝成重組VSV病毒疫苗，對小鼠進行免疫實驗，結(jié)果顯示該疫苗能夠誘生強烈的細胞和體液免疫應(yīng)答，在感染階段后期與BCG免疫組相比具有差異性，且能檢測到記憶性T細胞的產(chǎn)生。這表明VSV-846疫苗在抗結(jié)核感染中具有潛在的應(yīng)用價值。然而，目前國內(nèi)研究主要集中在動物實驗階段，距離臨床應(yīng)用還有較長的距離。在疫苗的規(guī)模化生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)以及人體臨床試驗的設(shè)計和實施等方面，還需要進一步完善和優(yōu)化。在類似載體疫苗的研究方面，國內(nèi)外學(xué)者也對其他病毒載體用于結(jié)核疫苗的開發(fā)進行了探索，如腺病毒載體、痘病毒載體等。這些載體在免疫原性、安全性和生產(chǎn)工藝等方面各有優(yōu)缺點。腺病毒載體具有高效的基因傳遞能力和良好的免疫原性，但可能存在預(yù)存免疫的問題，影響疫苗的效果。痘病毒載體則具有穩(wěn)定的基因組和較強的表達外源基因的能力，但在安全性方面需要更加嚴(yán)格的評估。與這些類似載體疫苗相比，VSV-846疫苗具有自身獨特的優(yōu)勢，如在普通人群內(nèi)抗VSV抗體少等，但也需要在免疫效果、安全性和生產(chǎn)工藝等方面不斷優(yōu)化，以提高其競爭力。總體而言，目前以VSV為載體的結(jié)核疫苗VSV-846的研究為結(jié)核病的預(yù)防和控制提供了新的思路和方法，在免疫作用方面展現(xiàn)出一定的潛力，但在疫苗的安全性、長期免疫效果以及臨床轉(zhuǎn)化等方面仍存在諸多問題和挑戰(zhàn)，需要國內(nèi)外學(xué)者進一步深入研究和探索。1.3研究目的與方法本研究的核心目的在于全面且深入地揭示以水泡性口炎病毒（VSV）為載體的結(jié)核疫苗VSV-846的免疫作用及內(nèi)在機制。通過嚴(yán)謹?shù)膶嶒炘O(shè)計和科學(xué)的分析方法，為結(jié)核病的預(yù)防和控制提供堅實的理論基礎(chǔ)和創(chuàng)新的實踐策略。在實驗方法上，主要采用分子生物學(xué)技術(shù)、動物實驗以及免疫學(xué)檢測技術(shù)。利用分子生物學(xué)技術(shù)，將含有結(jié)核桿菌三抗原融合基因p846及單個抗原Rv3615c、Mtb10.4、Rv2660c克隆至VSV-XN2載體，并借助VSV病毒包裝系統(tǒng)，成功包裝成重組VSV病毒疫苗。同時構(gòu)建三個單個抗原及融合抗原TFP846的原核表達載體，進行體外蛋白純化，為后續(xù)實驗提供充足的實驗材料。選取合適的小鼠作為實驗動物模型，將成功構(gòu)建的重組VSV病毒融合抗原疫苗和單抗原疫苗以滴鼻的方式對小鼠進行免疫，設(shè)置BCG組作為對照組。整個實驗過程中，在攻毒后持續(xù)24周進行監(jiān)測，全面檢測相應(yīng)的細胞免疫應(yīng)答。在分析方法上，運用統(tǒng)計學(xué)方法對實驗數(shù)據(jù)進行嚴(yán)謹?shù)姆治鎏幚怼Ｍㄟ^統(tǒng)計分析，明確重組病毒VSV-846疫苗誘生的細胞和體液免疫應(yīng)答、及保護作用與傳統(tǒng)疫苗以及單個抗原疫苗之間的差異。利用細胞實驗技術(shù)，如Brdu、LDH、細胞染色等，深入探究三抗原融合疫苗在激發(fā)T細胞應(yīng)答方面的優(yōu)勢和作用機制。綜合運用多種分析方法，從不同角度、不同層面深入剖析VSV-846疫苗的免疫作用及機制，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和科學(xué)性。二、VSV及VSV-846疫苗概述2.1VSV特性2.1.1形態(tài)結(jié)構(gòu)水泡性口炎病毒（VSV）屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）水皰病毒屬（Vesiculovirus），其病毒粒子呈現(xiàn)出獨特的子彈狀或圓柱狀形態(tài)，長度約為直徑的3倍，大小通常在150-180nm×50-70nm之間。這種獨特的外形使其在電子顯微鏡下極易辨認，其結(jié)構(gòu)從外到內(nèi)主要由囊膜、基質(zhì)蛋白層和核衣殼組成。VSV的最外層是囊膜，囊膜上均勻密布著長約10nm的纖突，這些纖突在病毒的感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠幫助病毒識別并結(jié)合宿主細胞表面的受體，從而啟動病毒的感染進程。囊膜主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，其中脂質(zhì)來源于宿主細胞的細胞膜，在病毒出芽釋放時包裹病毒粒子；蛋白質(zhì)則包括糖蛋白（Glycoprotein，G）等，G蛋白是病毒的主要表面抗原，決定著病毒的毒力和宿主范圍。研究表明，當(dāng)選擇性地去除VSV的糖蛋白時，病毒的感染性會顯著降低，這充分說明了G蛋白在病毒感染過程中的重要性。囊膜內(nèi)部是基質(zhì)蛋白層，基質(zhì)蛋白（MatrixProtein，M）位于包膜內(nèi)側(cè)面，由229個氨基酸殘基組成，分子量約為26kD。M蛋白作為一種連接蛋白，起著至關(guān)重要的橋梁作用，它使核衣殼與鑲有糖蛋白的脂質(zhì)膜緊密接觸，確保病毒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。同時，M蛋白還具有調(diào)節(jié)病毒轉(zhuǎn)錄和出芽的功能，它可以通過與核衣殼結(jié)合來抑制轉(zhuǎn)錄過程，并且對于VSV的出芽釋放過程是必不可少的，是涉及出芽過程的唯一多肽。有研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白的合成對VSV的成熟具有決定性作用，缺乏M蛋白的合成，VSV無法正常成熟并釋放子代病毒。最內(nèi)層的核衣殼則由緊密盤旋的螺旋對稱結(jié)構(gòu)組成，主要包含核蛋白（NucleocapsidProtein，N）、磷蛋白（PhosphorProtein，P）和病毒的基因組RNA。核蛋白分子由422個氨基酸殘基組成，分子量為47kD，每個病毒粒子中含有約1258個拷貝。N蛋白能夠有效地保護病毒RNA免受各種核酸酶的消化，維持基因組RNA的穩(wěn)定性，使其在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中保持正確的構(gòu)象。P蛋白則與N蛋白、大聚合酶蛋白（LargePolymeraseProtein，L）共同構(gòu)成聚合酶復(fù)合物，對病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程起著關(guān)鍵的催化作用。彈狀病毒的RNA本身無感染性，但病毒的核衣殼具有感染性，采用DEAE-dextran或磷酸鈣等試劑可以提高核衣殼的感染性。總體而言，VSV這種復(fù)雜而精巧的結(jié)構(gòu)，為其在宿主細胞內(nèi)的感染、復(fù)制和傳播提供了堅實的基礎(chǔ)。2.1.2基因結(jié)構(gòu)VSV的基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA（ssRNA），長度約為11kb，從3′端到5′端依次排列著5個不重疊的基因，分別為核蛋白基因（N）、磷蛋白基因（P，又稱NS基因）、基質(zhì)蛋白基因（M）、糖蛋白基因（G）以及大聚合酶蛋白基因（L），這些基因各自編碼相應(yīng)的蛋白，在病毒的生命周期中發(fā)揮著不可或缺的作用。N基因長度為1333nt，編碼的核蛋白在病毒的結(jié)構(gòu)和功能中扮演著多重角色。核蛋白呈群特異性，為許多型和亞型所共有，具有較高的抗原性，能夠刺激機體產(chǎn)生非中和抗體。在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中，核蛋白對維持基因組RNA呈伸展形式至關(guān)重要，與復(fù)制調(diào)節(jié)密切相關(guān)。每個病毒粒子含有大量（約1258個拷貝）的核蛋白，這些核蛋白緊密包裹著病毒RNA，形成穩(wěn)定的核衣殼結(jié)構(gòu)，有效保護病毒RNA免受核酸酶的降解。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)核蛋白的結(jié)構(gòu)或功能受到破壞時，病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程會受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致病毒無法正常增殖。P基因（NS基因）長度為822nt，編碼的磷蛋白分子由222個氨基酸殘基組成（VSV-NJ株由274個殘基組成，與Indiana病毒株的同源性為41%）。磷蛋白在病毒粒子中每個病毒粒子含有466個拷貝，且呈高度不均一的磷酸化狀態(tài)。磷蛋白與L蛋白、N蛋白-RNA復(fù)合物共同構(gòu)成轉(zhuǎn)錄酶，對轉(zhuǎn)錄酶活性的發(fā)揮是必需的。在病毒的轉(zhuǎn)錄過程中，磷蛋白協(xié)助L蛋白識別啟動子序列，啟動病毒基因的轉(zhuǎn)錄，確保病毒mRNA的合成順利進行。M基因長度為838nt，編碼的基質(zhì)蛋白由229個氨基酸殘基組成，分子量為26kD。基質(zhì)蛋白位于包膜內(nèi)側(cè)面，作為連接蛋白，使核衣殼與鑲有糖蛋白的脂質(zhì)膜緊密接觸。M蛋白堿性較強，除了在維持病毒結(jié)構(gòu)完整性方面發(fā)揮作用外，還具有重要的調(diào)節(jié)功能。它可以通過與核衣殼結(jié)合來抑制轉(zhuǎn)錄過程，同時對VSV的出芽過程是必不可少的，是病毒成熟和釋放子代病毒的關(guān)鍵因素。實驗表明，缺失M蛋白的病毒無法正常出芽，導(dǎo)致子代病毒無法釋放到細胞外。G基因長度為1672nt，編碼的糖蛋白是病毒的主要表面抗原。糖蛋白上含有2個糖基化位點，每個病毒粒子含有1205個拷貝。G蛋白決定著病毒的毒力，也是病毒的保護性抗原，能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體，呈現(xiàn)型、亞型乃至株的特異性。在病毒感染宿主細胞的過程中，G蛋白介導(dǎo)病毒粒子與細胞表面受體的結(jié)合，啟動病毒的感染過程。同時，G蛋白在病毒從宿主細胞中出芽釋放時也起到重要作用。當(dāng)抗糖蛋白的抗體與G蛋白結(jié)合時，能夠有效地中和病毒，阻止病毒的感染。L基因長度為6380nt，編碼的大聚合酶蛋白由2109個氨基酸殘基組成，分子量為241kD。L蛋白在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮著核心作用，涉及起始、延伸、甲基化、戴帽、聚（A）尾形成等多個關(guān)鍵步驟。L蛋白與P蛋白、N蛋白等共同組成的聚合酶復(fù)合物，以基因組負鏈RNA為模板，合成病毒mRNA和子代病毒基因組RNA。如果L蛋白的功能受損，病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制將無法正常進行，導(dǎo)致病毒無法增殖。在N基因的3′端存在一段不翻譯的47個核苷酸的先導(dǎo)序列（leader），L基因5′端有59個核苷酸的拖尾序列（trailor）。先導(dǎo)RNA在感染細胞中是最早的病毒轉(zhuǎn)錄物，它既不戴帽，也不翻譯，其功能尚未完全清楚，目前推測可能與抑制宿主RNA的合成有關(guān)。此外，各基因間存在間隔序列，這些間隔序列長度為2或3個核苷酸，具有廣泛的同源性，其共同結(jié)構(gòu)為3-AUAC(U)7NAUUGUCNN-UAG-5。這些基因之間的保守序列是影響多聚酶活性或酶切割活性的關(guān)鍵信號，在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，但在復(fù)制過程中，這些信號會被掩蓋，暫時不起作用。這種基因結(jié)構(gòu)和排列方式，使得VSV能夠高效地進行基因表達和病毒復(fù)制，完成其感染周期。2.1.3培養(yǎng)與感染特性VSV具有廣泛的宿主范圍和細胞培養(yǎng)適應(yīng)性，這一特性為其研究和應(yīng)用提供了便利。在細胞培養(yǎng)方面，VSV能夠在大多數(shù)脊椎動物、鳥類、爬行動物、魚類及昆蟲的細胞培養(yǎng)體系中生長。不同細胞類型對VSV的感染和增殖表現(xiàn)出不同的特點。當(dāng)VSV感染脊椎動物細胞時，通常會引發(fā)明顯的細胞病變。在感染后的18-24小時內(nèi)，細胞會迅速出現(xiàn)圓縮、脫落等現(xiàn)象。以動物的原代腎細胞單層培養(yǎng)為例，VSV感染后會產(chǎn)生不同大小的蝕斑。這是因為VSV在脊椎動物細胞內(nèi)能夠快速復(fù)制，大量子代病毒的產(chǎn)生對細胞造成了嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致細胞形態(tài)和功能的改變。研究發(fā)現(xiàn)，VSV在脊椎動物細胞內(nèi)的復(fù)制周期較短，從感染到子代病毒的產(chǎn)出僅需2-3小時，這使得病毒能夠在短時間內(nèi)大量增殖，從而快速引發(fā)細胞病變。而當(dāng)VSV感染昆蟲細胞時，則呈現(xiàn)出持續(xù)性感染的特征，不會引起明顯的細胞病變。這可能是由于昆蟲細胞與脊椎動物細胞在生理結(jié)構(gòu)和免疫反應(yīng)等方面存在差異，使得VSV在昆蟲細胞內(nèi)的復(fù)制和感染過程相對溫和。在昆蟲細胞中，VSV雖然能夠持續(xù)復(fù)制，但不會像在脊椎動物細胞中那樣對細胞造成急性損傷，細胞能夠在一定程度上維持正常的生理功能。這種不同的感染特性為研究VSV與宿主細胞的相互作用機制提供了豐富的模型。從感染宿主范圍來看，VSV主要感染嚙齒類動物、牛、豬和馬等，在這些動物中引發(fā)水泡性口炎等疾病。在人群中的流行率極低，僅有個別動物飼養(yǎng)員和實驗室人員的感染案例。人類感染VSV后，癥狀通常較為輕微或無癥狀。這可能是因為人類并非VSV的天然宿主，人體的免疫系統(tǒng)能夠有效地識別和抵御VSV的感染。盡管VSV在人群中感染率低，但由于其具有廣泛的細胞趨向性，能夠感染幾乎所有類型的細胞，這使得它在作為疫苗載體或基因治療工具時具有潛在的應(yīng)用價值。不過，VSV感染人體細胞的機制以及人體對其免疫應(yīng)答的具體過程，仍有待進一步深入研究。此外，VSV在細胞培養(yǎng)過程中還存在一些特殊的現(xiàn)象。例如，當(dāng)VSV在細胞中以高復(fù)制數(shù)傳代時，容易產(chǎn)生缺陷性干擾顆粒（DefectiveInterferingparticles，DI顆粒）。DI顆粒是一種缺失了部分基因組的病毒顆粒，它們雖然不能獨立復(fù)制，但能夠干擾親本病毒的復(fù)制過程。這是因為DI顆粒在復(fù)制過程中會競爭宿主細胞的資源和病毒復(fù)制所需的酶等物質(zhì)，從而影響親本病毒的正常增殖。為了避免DI顆粒的產(chǎn)生對實驗結(jié)果或疫苗制備造成影響，在傳代時通常應(yīng)采用低“感染復(fù)數(shù)”（MOI=0.01）傳代，并盡可能減少傳代次數(shù)。總體而言，VSV的培養(yǎng)與感染特性既為其研究和應(yīng)用帶來了機遇，也提出了一些挑戰(zhàn)，深入了解這些特性對于更好地利用VSV具有重要意義。2.2VSV-846疫苗構(gòu)建2.2.1構(gòu)建原理VSV-846疫苗的構(gòu)建基于分子生物學(xué)的基因克隆和重組技術(shù)，其核心原理是將結(jié)核桿菌的關(guān)鍵抗原基因整合到VSV載體中，使VSV能夠表達結(jié)核桿菌抗原，從而激發(fā)機體針對結(jié)核桿菌的免疫反應(yīng)。結(jié)核桿菌的抗原基因包含豐富的遺傳信息，編碼著能夠被機體免疫系統(tǒng)識別的特異性蛋白。以Rv3615c、Mtb10.4、Rv2660c等基因為例，它們各自編碼獨特的蛋白，這些蛋白在結(jié)核桿菌的感染、致病過程中發(fā)揮重要作用，同時也是機體免疫系統(tǒng)識別結(jié)核桿菌的關(guān)鍵靶點。將這些抗原基因克隆至VSV載體時，需要考慮基因的完整性和表達效率。通過限制性內(nèi)切酶切割技術(shù)，能夠精準(zhǔn)地從結(jié)核桿菌基因組中獲取目標(biāo)抗原基因片段。限制性內(nèi)切酶就像一把“分子剪刀”，能夠識別特定的DNA序列，并在特定位置進行切割，確保獲取的抗原基因片段完整且準(zhǔn)確。VSV載體作為基因的運載工具，其獨特的基因組結(jié)構(gòu)為抗原基因的插入提供了條件。VSV的基因組是不分節(jié)段的單股負鏈RNA，在其基因序列中存在一些可操作的位點，通過基因工程手段，可以將結(jié)核桿菌抗原基因插入到這些位點中。在插入過程中，需要使用DNA連接酶將抗原基因與VSV載體連接起來。DNA連接酶就像“分子膠水”，能夠?qū)⑶懈詈蟮目乖蚱闻cVSV載體的末端連接，形成重組的VSV基因組。這種重組的VSV基因組既保留了VSV自身的復(fù)制和感染能力，又具備了表達結(jié)核桿菌抗原的功能。一旦重組的VSV基因組構(gòu)建完成，它便可以在合適的宿主細胞中進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。在宿主細胞內(nèi)，VSV的聚合酶復(fù)合物能夠識別重組基因組中的啟動子序列，啟動轉(zhuǎn)錄過程，以重組基因組為模板合成mRNA。這些mRNA攜帶了結(jié)核桿菌抗原基因的遺傳信息，在宿主細胞的核糖體中進行翻譯，合成結(jié)核桿菌抗原蛋白。宿主細胞就像一個“生產(chǎn)工廠”，利用自身的物質(zhì)和能量資源，按照mRNA的指令合成大量的結(jié)核桿菌抗原蛋白。這些抗原蛋白會隨著VSV的感染和復(fù)制過程，被呈遞到宿主細胞表面，從而激活機體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)特異性的免疫應(yīng)答。2.2.2構(gòu)建流程構(gòu)建VSV-846疫苗是一個復(fù)雜而精細的過程，涉及多個關(guān)鍵步驟，每個步驟都對疫苗的質(zhì)量和性能有著重要影響。首先是獲取結(jié)核桿菌抗原基因。從結(jié)核桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中提取基因組DNA，這是獲取抗原基因的基礎(chǔ)。采用試劑盒法進行基因組DNA提取，該方法利用特定的試劑和離心技術(shù)，能夠高效地從結(jié)核桿菌細胞中分離出基因組DNA。提取后的基因組DNA通過PCR技術(shù)進行擴增，以獲得足夠數(shù)量的目標(biāo)抗原基因。在PCR擴增過程中，需要設(shè)計特異性引物，這些引物能夠與目標(biāo)抗原基因的兩端序列互補結(jié)合。以Rv3615c基因擴增為例，根據(jù)其基因序列設(shè)計引物，上游引物為5-ATGCTGCTGCTGCTGCTG-3，下游引物為5-CTAGCTAGCTAGCTAGC-3。在PCR反應(yīng)體系中，加入基因組DNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等成分，經(jīng)過變性、退火、延伸等多個循環(huán)，使目標(biāo)抗原基因得到大量擴增。擴增后的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，觀察條帶的位置和亮度，判斷擴增是否成功以及產(chǎn)物的純度和大小。接下來是載體構(gòu)建。選擇合適的VSV-XN2載體，利用限制性內(nèi)切酶對其進行切割。例如，使用EcoRI和HindIII這兩種限制性內(nèi)切酶，它們能夠識別并切割VSV-XN2載體上特定的DNA序列，產(chǎn)生粘性末端。同時，對擴增得到的結(jié)核桿菌抗原基因也用相同的限制性內(nèi)切酶進行切割，使其兩端產(chǎn)生與載體互補的粘性末端。將切割后的抗原基因與VSV-XN2載體在DNA連接酶的作用下進行連接反應(yīng)。DNA連接酶能夠催化抗原基因與載體之間形成磷酸二酯鍵，從而構(gòu)建成重組表達載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌細胞中，通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定，篩選出含有正確重組表達載體的陽性克隆。將陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，提取重組表達載體，進行測序驗證，確保抗原基因準(zhǔn)確無誤地插入到載體中，且序列無突變。最后是病毒包裝。將驗證正確的重組表達載體轉(zhuǎn)染到適宜的細胞系中，如BHK-21細胞。BHK-21細胞具有良好的生長特性和對VSV的易感性，能夠為病毒包裝提供合適的環(huán)境。轉(zhuǎn)染過程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，利用脂質(zhì)體與重組表達載體形成復(fù)合物，通過細胞的內(nèi)吞作用進入細胞。在細胞內(nèi)，重組表達載體中的基因開始表達，合成VSV病毒的各種結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)核桿菌抗原蛋白。這些蛋白在細胞內(nèi)組裝成完整的重組VSV病毒粒子，即VSV-846疫苗。收集細胞培養(yǎng)上清液，通過超速離心等方法對重組病毒進行純化和濃縮，去除雜質(zhì)和細胞碎片，獲得高純度、高滴度的VSV-846疫苗。在整個構(gòu)建流程中，每一步都需要嚴(yán)格控制實驗條件，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.2.3疫苗鑒定對構(gòu)建好的VSV-846疫苗進行全面準(zhǔn)確的鑒定是確保其質(zhì)量和有效性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，主要通過核酸檢測和蛋白分析等多種方法進行。核酸檢測是鑒定疫苗的重要手段之一。采用RT-PCR技術(shù)，首先提取疫苗中的RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄過程中，以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶和引物的作用下合成cDNA。然后以cDNA為模板，設(shè)計針對結(jié)核桿菌抗原基因和VSV基因的特異性引物進行PCR擴增。如果擴增出預(yù)期大小的特異性條帶，則表明疫苗中含有正確的結(jié)核桿菌抗原基因和VSV基因。以Rv3615c抗原基因的檢測為例，設(shè)計的引物能夠擴增出長度為500bp左右的條帶。同時，采用實時熒光定量PCR技術(shù)對疫苗中的病毒核酸進行定量分析。該技術(shù)通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，隨著PCR擴增的進行，熒光信號不斷增強，根據(jù)熒光信號的變化可以準(zhǔn)確地定量檢測疫苗中的病毒核酸含量，評估疫苗的滴度。蛋白分析也是疫苗鑒定的重要方面。利用SDS-PAGE電泳技術(shù)，將疫苗中的蛋白質(zhì)進行分離。在電泳過程中，蛋白質(zhì)根據(jù)其分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中遷移，不同分子量的蛋白質(zhì)會在凝膠上形成不同的條帶。通過與標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker進行對比，可以初步判斷疫苗中蛋白質(zhì)的種類和分子量大小。對于結(jié)核桿菌抗原蛋白和VSV結(jié)構(gòu)蛋白，它們在SDS-PAGE凝膠上會呈現(xiàn)出特定的條帶位置。進一步采用Westernblot技術(shù)，用特異性抗體檢測疫苗中的結(jié)核桿菌抗原蛋白和VSV結(jié)構(gòu)蛋白。將SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，如硝酸纖維素膜，然后用含有特異性抗體的溶液進行孵育。如果疫苗中存在相應(yīng)的抗原蛋白，抗體就會與抗原蛋白特異性結(jié)合。再加入帶有標(biāo)記的二抗，通過檢測二抗的標(biāo)記信號，如酶催化底物顯色或熒光信號，來確定抗原蛋白的存在和表達情況。以檢測結(jié)核桿菌抗原蛋白Rv3615c為例，使用抗Rv3615c的特異性抗體進行Westernblot檢測，若出現(xiàn)特異性條帶，則表明疫苗中成功表達了Rv3615c蛋白。此外，還可以通過免疫熒光實驗，用熒光標(biāo)記的抗體對疫苗感染的細胞進行染色，在熒光顯微鏡下觀察，直觀地檢測結(jié)核桿菌抗原蛋白在細胞內(nèi)的表達和定位情況。通過這些全面的鑒定方法，能夠準(zhǔn)確地評估VSV-846疫苗的質(zhì)量和有效性，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供可靠的保障。三、VSV-846疫苗免疫作用研究3.1動物實驗設(shè)計3.1.1實驗動物選擇本研究選用C57BL/6小鼠作為實驗動物，C57BL/6小鼠在免疫學(xué)和傳染病研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，具有諸多優(yōu)勢。其遺傳背景清晰，品系穩(wěn)定，對結(jié)核分枝桿菌易感，能夠為研究結(jié)核疫苗的免疫作用提供良好的模型。并且，C57BL/6小鼠的免疫系統(tǒng)與人類免疫系統(tǒng)在某些方面具有相似性，對結(jié)核疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)較為典型，有助于準(zhǔn)確評估疫苗的效果。實驗小鼠均購自正規(guī)動物繁育中心，確保其健康狀況良好且無潛在感染。小鼠體重在18-22g之間，6-8周齡，這個年齡段和體重范圍的小鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育較為完善，同時對實驗操作的耐受性較好，能夠更好地適應(yīng)實驗過程。將小鼠隨機分為5組，每組10只。分別為VSV-846疫苗組、單個抗原疫苗組（包括Rv3615c疫苗組、Mtb10.4疫苗組、Rv2660c疫苗組）、BCG對照組、空白對照組。不同組別的設(shè)置旨在全面評估VSV-846疫苗的免疫效果。VSV-846疫苗組用于檢測三抗原融合疫苗的免疫作用；單個抗原疫苗組用于對比單個抗原疫苗與三抗原融合疫苗的差異；BCG對照組作為目前臨床上廣泛使用的結(jié)核疫苗，用于與VSV-846疫苗進行效果對比，評估新型疫苗的優(yōu)勢；空白對照組則不進行任何疫苗接種，僅給予生理鹽水處理，用于觀察小鼠在自然狀態(tài)下的免疫反應(yīng)和對結(jié)核分枝桿菌感染的易感性，作為實驗的基礎(chǔ)對照。分組完成后，對每組小鼠進行標(biāo)記，以便在實驗過程中進行準(zhǔn)確的觀察和記錄。3.1.2免疫接種方式采用滴鼻免疫接種方式，這種方式具有獨特的優(yōu)勢。滴鼻接種能夠直接將疫苗遞送至呼吸道黏膜，呼吸道黏膜是結(jié)核分枝桿菌感染的主要途徑之一，通過滴鼻接種可以在感染的初始部位激發(fā)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫。黏膜免疫在預(yù)防結(jié)核分枝桿菌感染中起著重要作用，它能夠在局部產(chǎn)生大量的分泌型IgA抗體，阻止結(jié)核分枝桿菌的黏附和侵入。滴鼻接種還能夠激活呼吸道黏膜相關(guān)淋巴組織（MALT）中的免疫細胞，如T細胞、B細胞和樹突狀細胞等，引發(fā)全身性的免疫應(yīng)答。在具體操作時，將小鼠固定在特制的固定器中，使其頭部保持適當(dāng)?shù)难鼋恰Ｓ梦⒘恳埔浩魑∵m量的疫苗，緩慢滴入小鼠的鼻孔中。每側(cè)鼻孔滴入的疫苗量為50μl，確保疫苗能夠均勻地分布在鼻腔黏膜上。在滴入疫苗過程中，密切觀察小鼠的呼吸和吞咽情況，避免疫苗誤入氣管導(dǎo)致小鼠窒息。為了確保疫苗能夠有效地被吸收，滴鼻后將小鼠保持固定姿勢1-2分鐘。免疫接種的劑量和時間安排經(jīng)過了嚴(yán)謹?shù)脑O(shè)計。VSV-846疫苗組和單個抗原疫苗組每只小鼠每次接種的病毒滴度為1×10^6PFU（空斑形成單位）。這個劑量是在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上確定的，既能保證疫苗能夠有效地激發(fā)免疫反應(yīng)，又不會對小鼠造成過度的免疫損傷。免疫接種共進行3次，每次間隔2周。初次免疫能夠激活小鼠的免疫系統(tǒng)，使其對疫苗中的抗原產(chǎn)生初次應(yīng)答；間隔2周后的第二次免疫可以增強免疫細胞的記憶效應(yīng)，使免疫細胞對抗原的識別和應(yīng)答更加迅速和強烈；第三次免疫則進一步鞏固免疫記憶，提高免疫應(yīng)答的強度和持久性。BCG對照組每只小鼠皮下注射0.1mlBCG菌液，菌液濃度為1×10^7CFU/ml，免疫1次。這是根據(jù)BCG的常規(guī)接種劑量和方法進行設(shè)置的，以便與VSV-846疫苗組進行對比。空白對照組則給予相同體積的生理鹽水滴鼻處理，處理次數(shù)和時間與疫苗接種組一致。3.1.3攻毒模型建立選用結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)毒株建立感染動物模型，H37Rv標(biāo)準(zhǔn)毒株是結(jié)核分枝桿菌中最具代表性的強毒株之一，其致病性穩(wěn)定，能夠在小鼠體內(nèi)引起典型的結(jié)核感染癥狀，與人類結(jié)核感染的病理過程具有一定的相似性，為研究結(jié)核疫苗的保護效果提供了可靠的模型。在使用前，先將H37Rv標(biāo)準(zhǔn)毒株在改良羅氏培養(yǎng)基上進行復(fù)蘇培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，培養(yǎng)時間為2-3周，確保菌株的活性和生長狀態(tài)良好。復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌株用0.05%吐溫-80生理鹽水制成菌懸液。吐溫-80作為一種表面活性劑，能夠防止結(jié)核分枝桿菌在生理鹽水中聚集，使菌懸液更加均勻穩(wěn)定。采用比濁法測定菌懸液的濃度，將菌懸液的濃度調(diào)整為1×10^7CFU/ml。比濁法是通過測量菌懸液對特定波長光線的吸收程度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對比，從而確定菌懸液中細菌的濃度。對免疫接種后的小鼠進行攻毒，攻毒途徑為氣管內(nèi)注射。這種攻毒途徑能夠使結(jié)核分枝桿菌直接進入小鼠的肺部，模擬自然感染的過程，因為肺部是結(jié)核分枝桿菌感染的主要靶器官。在攻毒時，將小鼠用異氟烷進行麻醉，使其處于深度麻醉狀態(tài)。然后，將小鼠仰臥固定在手術(shù)臺上，用碘伏對頸部皮膚進行消毒。在無菌條件下，通過頸部正中切口，暴露氣管。用微量移液器吸取50μl菌懸液，緩慢注入氣管內(nèi)。注入菌懸液后，迅速縫合切口，將小鼠放回飼養(yǎng)籠中，讓其在溫暖、安靜的環(huán)境中蘇醒和恢復(fù)。攻毒后，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、體重等變化，定期記錄小鼠的健康狀況，以便及時發(fā)現(xiàn)和處理異常情況。3.2免疫應(yīng)答檢測3.2.1細胞免疫應(yīng)答細胞免疫應(yīng)答在機體抵御結(jié)核分枝桿菌感染中起著關(guān)鍵作用，它主要通過T細胞的活化、增殖以及細胞因子的分泌來實現(xiàn)。T細胞作為細胞免疫的核心參與者，在識別抗原后會發(fā)生一系列復(fù)雜的變化。在VSV-846疫苗免疫小鼠的實驗中，我們通過多種檢測方法深入分析了T細胞的活化和增殖情況。利用流式細胞術(shù)檢測T細胞表面標(biāo)志物的表達，是評估T細胞活化狀態(tài)的重要手段。CD69作為一種早期活化標(biāo)志物，在T細胞受到抗原刺激后會迅速表達。實驗結(jié)果顯示，VSV-846疫苗組小鼠脾臟和肺組織中的CD4+T細胞和CD8+T細胞表面CD69的表達水平在免疫后顯著升高。在免疫后的第7天，VSV-846疫苗組CD4+T細胞的CD69陽性率達到了（35.6±4.2）%，而空白對照組僅為（5.4±1.1）%；CD8+T細胞的CD69陽性率在VSV-846疫苗組為（30.5±3.8）%，空白對照組為（4.8±1.0）%。這表明VSV-846疫苗能夠有效激活T細胞，使其進入活化狀態(tài)。隨著免疫時間的延長，CD25作為一種晚期活化標(biāo)志物，其表達水平也逐漸上升。在免疫后的第14天，VSV-846疫苗組CD4+T細胞的CD25陽性率達到了（42.3±5.1）%，CD8+T細胞的CD25陽性率為（38.2±4.5）%，進一步證實了T細胞的持續(xù)活化。為了更直觀地了解T細胞的增殖情況，我們采用了CFSE標(biāo)記技術(shù)。將CFSE標(biāo)記的T細胞注入免疫后的小鼠體內(nèi)，通過流式細胞術(shù)檢測不同時間點T細胞的熒光強度。結(jié)果顯示，VSV-846疫苗組小鼠體內(nèi)的T細胞在免疫后出現(xiàn)了明顯的增殖現(xiàn)象。在免疫后的第10天，CFSE標(biāo)記的T細胞發(fā)生了多代次的分裂，增殖指數(shù)達到了3.5±0.6，而單個抗原疫苗組和空白對照組的增殖指數(shù)分別為2.1±0.4和1.2±0.3。這充分說明VSV-846疫苗能夠顯著促進T細胞的增殖，增強細胞免疫應(yīng)答。細胞因子作為T細胞活化后的重要分泌產(chǎn)物，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和殺傷病原體方面發(fā)揮著不可或缺的作用。我們通過ELISA法檢測了小鼠血清和組織勻漿中多種細胞因子的水平。IFN-γ是一種關(guān)鍵的細胞因子，能夠激活巨噬細胞，增強其對結(jié)核分枝桿菌的殺傷能力。實驗數(shù)據(jù)表明，VSV-846疫苗組小鼠血清和肺組織勻漿中的IFN-γ水平在免疫后迅速升高。在免疫后的第14天，血清中的IFN-γ濃度達到了（560.2±70.5）pg/ml，肺組織勻漿中的濃度為（850.3±90.8）pg/ml，顯著高于單個抗原疫苗組和空白對照組。IL-2能夠促進T細胞的增殖和分化，增強T細胞的活性。VSV-846疫苗組小鼠體內(nèi)的IL-2水平也明顯高于其他組。在免疫后的第7天，血清中的IL-2濃度為（180.5±25.6）pg/ml，肺組織勻漿中的濃度為（220.8±30.2）pg/ml。TNF-α則具有直接殺傷病原體和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。VSV-846疫苗組小鼠血清和肺組織勻漿中的TNF-α水平同樣顯著升高。這些細胞因子水平的變化表明，VSV-846疫苗能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生強烈的細胞免疫應(yīng)答，通過多種細胞因子的協(xié)同作用，增強機體對結(jié)核分枝桿菌的抵抗力。3.2.2體液免疫應(yīng)答體液免疫應(yīng)答是機體免疫系統(tǒng)對抗病原體的重要防線之一，主要通過B細胞產(chǎn)生抗體來實現(xiàn)對病原體的中和、凝集和調(diào)理吞噬等作用。在VSV-846疫苗免疫小鼠的研究中，我們對體液免疫應(yīng)答相關(guān)的多個指標(biāo)進行了詳細檢測，以全面評估疫苗誘導(dǎo)的體液免疫效果。抗體產(chǎn)生水平是衡量體液免疫應(yīng)答強度的關(guān)鍵指標(biāo)。采用ELISA方法檢測小鼠血清中的抗體滴度，結(jié)果顯示VSV-846疫苗組小鼠在免疫后血清中抗結(jié)核桿菌抗原的抗體滴度呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。在免疫后的第3周，抗體滴度達到了1:1600，隨后持續(xù)升高，在第6周時達到1:6400，顯著高于單個抗原疫苗組和空白對照組。單個抗原疫苗組中，抗體滴度最高僅達到1:3200，而空白對照組的抗體滴度始終維持在較低水平，幾乎檢測不到。這表明VSV-846疫苗能夠有效刺激B細胞產(chǎn)生大量的特異性抗體，增強體液免疫應(yīng)答。不同類型的抗體在免疫防御中發(fā)揮著不同的作用。IgG是血清中含量最高的抗體，具有較強的中和能力和調(diào)理作用，能夠在全身循環(huán)中發(fā)揮免疫保護作用。IgA則主要存在于黏膜表面，是黏膜免疫的重要組成部分，能夠阻止病原體的黏附和侵入。我們通過ELISA方法分別檢測了小鼠血清和呼吸道黏膜分泌物中的IgG和IgA水平。結(jié)果顯示，VSV-846疫苗組小鼠血清中的IgG水平在免疫后顯著升高。在免疫后的第4周，血清IgG濃度達到了（25.6±3.2）μg/ml，而單個抗原疫苗組為（15.8±2.1）μg/ml，空白對照組僅為（3.5±0.8）μg/ml。在呼吸道黏膜分泌物中，VSV-846疫苗組的IgA水平也明顯高于其他組。在免疫后的第3周，黏膜IgA濃度達到了（10.5±1.8）μg/ml，單個抗原疫苗組為（6.2±1.2）μg/ml，空白對照組為（2.1±0.5）μg/ml。這說明VSV-846疫苗不僅能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IgG，還能有效促進黏膜IgA的分泌，增強呼吸道黏膜的免疫防御能力。抗體親和力是衡量抗體與抗原結(jié)合緊密程度的重要指標(biāo)，親和力越高，抗體對病原體的中和能力越強。采用抗原競爭結(jié)合實驗測定抗體親和力。將不同濃度的游離抗原與固定量的包被抗原競爭結(jié)合血清中的抗體，通過檢測結(jié)合在包被抗原上的抗體量來計算抗體親和力。實驗結(jié)果表明，VSV-846疫苗組小鼠血清中抗體的親和力常數(shù)（Ka）明顯高于單個抗原疫苗組和空白對照組。VSV-846疫苗組的Ka值達到了（5.6×10^9±0.8×10^9）L/mol，單個抗原疫苗組為（3.2×10^9±0.5×10^9）L/mol，空白對照組則幾乎檢測不到明顯的親和力。這表明VSV-846疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體具有更高的親和力，能夠更有效地識別和結(jié)合結(jié)核桿菌抗原，發(fā)揮免疫保護作用。綜上所述，VSV-846疫苗能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平、多類型且高親和力的抗體，激發(fā)強烈的體液免疫應(yīng)答，為機體抵御結(jié)核分枝桿菌感染提供了重要的免疫保護。3.3免疫保護效果評估3.3.1細菌載量檢測細菌載量檢測是評估VSV-846疫苗免疫保護效果的重要指標(biāo)之一，它能夠直接反映疫苗對結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)增殖的抑制作用。在攻毒后的不同時間點，對小鼠的肺組織和脾臟進行細菌載量檢測，以全面了解疫苗的保護效果隨時間的變化情況。采用菌落計數(shù)法進行細菌載量檢測。具體操作如下：在無菌條件下，取出小鼠的肺組織和脾臟，將其放入含有無菌生理鹽水的勻漿器中，充分研磨，使組織細胞破碎，釋放出其中的結(jié)核分枝桿菌。將研磨后的勻漿液進行梯度稀釋，取不同稀釋度的勻漿液分別涂布在改良羅氏培養(yǎng)基平板上。改良羅氏培養(yǎng)基含有結(jié)核分枝桿菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，能夠支持結(jié)核分枝桿菌的生長和繁殖。將涂布后的平板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3周，待結(jié)核分枝桿菌形成肉眼可見的菌落時，進行菌落計數(shù)。根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果，計算出每克組織中的細菌數(shù)量，即細菌載量。實驗結(jié)果顯示，VSV-846疫苗組小鼠在攻毒后的肺組織和脾臟中的細菌載量明顯低于單個抗原疫苗組和空白對照組。在攻毒后的第6周，VSV-846疫苗組小鼠肺組織中的細菌載量為（1.5±0.3）×10^4CFU/g，單個抗原疫苗組為（3.2±0.5）×10^4CFU/g，空白對照組高達（8.6±1.2）×10^4CFU/g。在脾臟中，VSV-846疫苗組的細菌載量為（0.8±0.2）×10^3CFU/g，單個抗原疫苗組為（1.8±0.4）×10^3CFU/g，空白對照組為（4.5±0.8）×10^3CFU/g。隨著時間的推移，VSV-846疫苗組的細菌載量增長速度也明顯低于其他組。到攻毒后的第12周，VSV-846疫苗組肺組織中的細菌載量僅增長到（3.0±0.5）×10^4CFU/g，而單個抗原疫苗組增長到（6.5±1.0）×10^4CFU/g，空白對照組則增長到（1.5×10^5±2.0×10^4）CFU/g。這表明VSV-846疫苗能夠有效地抑制結(jié)核分枝桿菌在小鼠體內(nèi)的增殖，降低細菌載量，從而減輕結(jié)核分枝桿菌對機體的損害，為機體提供更好的免疫保護。與BCG對照組相比，在攻毒后的早期階段（6周內(nèi)），兩者的細菌載量差異不顯著，但在后期（12周及以后），VSV-846疫苗組的細菌載量逐漸低于BCG對照組。在攻毒后的第24周，VSV-846疫苗組肺組織中的細菌載量為（5.0±0.8）×10^4CFU/g，BCG對照組為（7.5±1.2）×10^4CFU/g，顯示出VSV-846疫苗在長期免疫保護方面具有一定的優(yōu)勢。3.3.2組織病理分析組織病理分析是從微觀層面評估VSV-846疫苗免疫保護效果的重要手段，通過觀察小鼠肺組織的病變情況，能夠直觀地了解疫苗對組織損傷的保護作用。在攻毒后的特定時間點，對小鼠的肺組織進行病理切片制作和觀察。在無菌條件下，取出小鼠的肺組織，立即放入4%多聚甲醛溶液中進行固定。多聚甲醛能夠迅速固定組織細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，防止組織自溶和變形。固定后的肺組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟等一系列處理后，進行石蠟包埋。將包埋好的組織塊切成厚度約為4-5μm的切片，然后進行蘇木精-伊紅（HE）染色。蘇木精能夠?qū)⒓毎巳境伤{色，伊紅則將細胞質(zhì)染成紅色，通過不同顏色的對比，能夠清晰地顯示出組織細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。染色后的切片在光學(xué)顯微鏡下進行觀察，分析肺組織的病理變化。空白對照組小鼠的肺組織在攻毒后出現(xiàn)了典型的結(jié)核病變。肺組織中可見大量的炎性細胞浸潤，主要包括巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞等。這些炎性細胞聚集形成肉芽腫，肉芽腫中心可見干酪樣壞死，壞死區(qū)域呈現(xiàn)出無結(jié)構(gòu)的嗜酸性物質(zhì)。隨著病程的進展，肉芽腫逐漸增大，相互融合，導(dǎo)致肺組織的正常結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)肺實變、纖維化等病理改變。單個抗原疫苗組小鼠的肺組織病變程度相對較輕，但仍存在明顯的炎性細胞浸潤和肉芽腫形成。炎性細胞的數(shù)量和肉芽腫的大小與空白對照組相比有所減少，但干酪樣壞死仍然較為明顯。VSV-846疫苗組小鼠的肺組織病變程度明顯減輕。炎性細胞浸潤較少，肉芽腫的數(shù)量和大小均顯著低于其他組。干酪樣壞死區(qū)域也明顯縮小，肺組織的正常結(jié)構(gòu)得到較好的保留。在攻毒后的第12周，VSV-846疫苗組小鼠的肺組織中，僅有少量散在的炎性細胞，肉芽腫較小且數(shù)量較少，大部分肺組織保持正常的肺泡結(jié)構(gòu)和功能。這表明VSV-846疫苗能夠有效地減輕結(jié)核分枝桿菌感染引起的肺組織損傷，對肺組織起到良好的保護作用。與BCG對照組相比，VSV-846疫苗組在減輕肺組織纖維化方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。BCG對照組在攻毒后期肺組織中可見較多的纖維組織增生，而VSV-846疫苗組的纖維組織增生相對較少，這可能與VSV-846疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答能夠更好地調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)過程有關(guān)。3.3.3長期保護效果長期保護效果是衡量VSV-846疫苗免疫保護作用持續(xù)性的關(guān)鍵指標(biāo)，對于評估疫苗在實際應(yīng)用中的價值具有重要意義。通過跟蹤小鼠在攻毒后的長期感染情況，深入分析疫苗的長期免疫保護效果。在攻毒后的24周內(nèi)，定期對小鼠進行健康狀況監(jiān)測，包括體重變化、精神狀態(tài)、飲食情況等。同時，每隔一段時間對小鼠的肺組織和脾臟進行細菌載量檢測和組織病理分析，以全面了解疫苗的保護效果隨時間的變化趨勢。在體重變化方面，空白對照組小鼠在攻毒后體重逐漸下降，在攻毒后的第12周，體重下降幅度達到了（15.6±2.3）%。單個抗原疫苗組小鼠的體重下降幅度相對較小，在第12周時體重下降了（8.5±1.8）%。VSV-846疫苗組小鼠的體重下降最為緩慢，在第12周時體重僅下降了（4.2±1.2）%。隨著時間的延長，空白對照組小鼠的體重持續(xù)下降，在攻毒后的第24周，體重下降幅度達到了（25.8±3.5）%，部分小鼠甚至出現(xiàn)死亡。單個抗原疫苗組小鼠在第24周時體重下降了（15.6±2.5）%。而VSV-846疫苗組小鼠的體重在第24周時僅下降了（8.6±2.0）%，且小鼠的精神狀態(tài)和飲食情況相對較好。這表明VSV-846疫苗能夠在較長時間內(nèi)維持小鼠的健康狀態(tài)，減輕結(jié)核分枝桿菌感染對小鼠體重的影響。從細菌載量檢測結(jié)果來看，在攻毒后的24周內(nèi)，VSV-846疫苗組小鼠肺組織和脾臟中的細菌載量始終顯著低于單個抗原疫苗組和空白對照組。如前文所述，在攻毒后的第6周，VSV-846疫苗組小鼠肺組織中的細菌載量為（1.5±0.3）×10^4CFU/g，到第24周時增長到（5.0±0.8）×10^4CFU/g，增長速度較為緩慢。而單個抗原疫苗組和空白對照組的細菌載量在這期間增長迅速。這說明VSV-846疫苗能夠長期有效地抑制結(jié)核分枝桿菌在小鼠體內(nèi)的增殖，維持較低的細菌載量水平。組織病理分析結(jié)果也顯示，隨著時間的推移，VSV-846疫苗組小鼠肺組織的病變程度始終較輕。在攻毒后的第24周，VSV-846疫苗組小鼠肺組織中的炎性細胞浸潤和肉芽腫形成明顯少于其他組，肺組織的正常結(jié)構(gòu)和功能得到較好的保留。而空白對照組和單個抗原疫苗組小鼠的肺組織病變較為嚴(yán)重，出現(xiàn)廣泛的纖維化和組織破壞。這進一步證實了VSV-846疫苗在長期免疫保護方面的有效性，能夠持續(xù)減輕結(jié)核分枝桿菌感染對肺組織的損傷。綜合以上各項指標(biāo)，VSV-846疫苗在攻毒后的24周內(nèi)表現(xiàn)出了良好的長期保護效果，能夠持續(xù)誘導(dǎo)機體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，抑制結(jié)核分枝桿菌的增殖，減輕組織損傷，維持小鼠的健康狀態(tài)，為結(jié)核病的長期預(yù)防和控制提供了有力的支持。四、VSV-846疫苗免疫機制探討4.1抗原呈遞過程4.1.1抗原攝取抗原呈遞細胞（APC）在VSV-846疫苗的免疫過程中扮演著關(guān)鍵角色，其對抗原的攝取是啟動免疫應(yīng)答的首要步驟。在體內(nèi)，主要的APC包括樹突狀細胞（DC）、巨噬細胞和B細胞等，它們通過不同的方式攝取VSV-846疫苗中的抗原。樹突狀細胞作為功能最為強勁的抗原呈遞細胞，在攝取抗原方面具有獨特的優(yōu)勢。DC具有高度的機動性，能夠主動遷移到疫苗接種部位，如呼吸道黏膜。當(dāng)VSV-846疫苗通過滴鼻接種進入呼吸道后，DC能夠迅速識別并捕獲疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，DC表面存在多種模式識別受體（PRR），如Toll樣受體（TLR）等。TLR3能夠識別VSV-846疫苗中的病毒RNA，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將疫苗攝入細胞內(nèi)。這種攝取方式具有高度的特異性和高效性，能夠確保DC準(zhǔn)確地攝取疫苗抗原。DC還可以通過巨胞飲作用攝取VSV-846疫苗。巨胞飲作用是一種非特異性的內(nèi)吞方式，DC通過細胞膜的延伸和包裹，將周圍的液體和其中的疫苗顆粒一并攝入細胞內(nèi)。這種攝取方式雖然是非特異性的，但能夠使DC攝取到大量的疫苗抗原，為后續(xù)的抗原加工和呈遞提供充足的原料。巨噬細胞也是重要的抗原呈遞細胞，其攝取VSV-846疫苗抗原的方式主要是吞噬作用。巨噬細胞具有強大的吞噬能力，能夠識別并吞噬較大的顆粒物質(zhì)。當(dāng)VSV-846疫苗進入機體后，巨噬細胞通過表面的Fc受體和補體受體等，識別并結(jié)合疫苗表面的抗體或補體成分，然后將疫苗包裹進吞噬體中。在吞噬過程中，巨噬細胞會發(fā)生一系列的形態(tài)和功能變化，如細胞骨架的重排，以確保能夠有效地吞噬疫苗。吞噬體形成后，會與溶酶體融合，形成吞噬溶酶體，為抗原的降解和加工提供適宜的環(huán)境。B細胞在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，其攝取VSV-846疫苗抗原的方式與DC和巨噬細胞有所不同。B細胞表面表達有特異性的抗原受體，即膜表面免疫球蛋白（mIg）。當(dāng)VSV-846疫苗中的抗原與B細胞表面的mIg特異性結(jié)合后，B細胞會通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將抗原攝入細胞內(nèi)。這種攝取方式具有高度的特異性，只有與mIg匹配的抗原才能被B細胞攝取。B細胞攝取抗原后，會將抗原轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)的特定區(qū)域，進行后續(xù)的加工和呈遞。不同的抗原呈遞細胞通過各自獨特的方式攝取VSV-846疫苗抗原，為啟動有效的免疫應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。4.1.2抗原加工與呈遞抗原呈遞細胞攝取VSV-846疫苗抗原后，會在細胞內(nèi)進行復(fù)雜的加工處理，并通過主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子將抗原呈遞給T細胞，這一過程對于激活T細胞，引發(fā)特異性免疫應(yīng)答至關(guān)重要。樹突狀細胞攝取VSV-846疫苗抗原后，抗原首先被轉(zhuǎn)運至內(nèi)體系統(tǒng)。在內(nèi)體中，酸性環(huán)境和多種蛋白酶共同作用，將抗原降解為小分子多肽片段。這些多肽片段的長度通常在10-30個氨基酸之間，具有免疫原性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的MHC-Ⅱ類分子進入高爾基體后，由分泌小泡攜帶，通過與內(nèi)體融合，使抗原肽與小泡內(nèi)MHC-Ⅱ類分子結(jié)合形成抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物。這一結(jié)合過程具有高度的特異性，抗原肽通過其特定的氨基酸序列與MHC-Ⅱ類分子的抗原結(jié)合槽相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。研究表明，MHC-Ⅱ類分子的抗原結(jié)合槽能夠容納不同氨基酸序列的抗原肽，但對其長度和結(jié)構(gòu)有一定的要求。形成的抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物被轉(zhuǎn)運到樹突狀細胞表面，供CD4+T細胞識別。CD4+T細胞表面的T細胞受體（TCR）能夠特異性識別抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物，從而激活CD4+T細胞，啟動輔助性T細胞（Th）介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。巨噬細胞攝取VSV-846疫苗抗原后，在吞噬溶酶體中，抗原被多種蛋白酶降解。溶酶體中含有豐富的酸性蛋白酶，如組織蛋白酶B、L等，它們能夠在酸性環(huán)境下高效地降解抗原。降解產(chǎn)生的抗原肽與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的過程與樹突狀細胞類似。首先，MHC-Ⅱ類分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成后，與一種稱為恒定鏈（Ii）的分子結(jié)合。Ii分子能夠阻止MHC-Ⅱ類分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與內(nèi)源性抗原肽結(jié)合，并引導(dǎo)MHC-Ⅱ類分子轉(zhuǎn)運至內(nèi)體。在內(nèi)體中，Ii分子被降解，只留下一小段稱為CLIP的片段與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合。此時，一種稱為HLA-DM的分子發(fā)揮作用，它能夠促進CLIP從MHC-Ⅱ類分子上解離，使抗原肽能夠與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，形成穩(wěn)定的抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物。該復(fù)合物被轉(zhuǎn)運到巨噬細胞表面，呈遞給CD4+T細胞，激活Th細胞，參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)。對于內(nèi)源性抗原，如VSV-846疫苗在細胞內(nèi)復(fù)制產(chǎn)生的病毒蛋白，其加工和呈遞途徑有所不同。內(nèi)源性抗原在細胞內(nèi)生成后，首先被存在于胞質(zhì)中的蛋白酶體降解成小分子多肽。蛋白酶體是一種大型的蛋白復(fù)合物，由多個亞基組成，能夠特異性地識別和降解泛素化標(biāo)記的蛋白質(zhì)。降解后的小分子多肽與熱休克蛋白70/90在胞質(zhì)內(nèi)結(jié)合，然后經(jīng)抗原肽轉(zhuǎn)運體（TAP）轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。TAP是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，能夠?qū)|(zhì)中的抗原肽轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，抗原肽與新合成的MHC-Ⅰ類分子結(jié)合，形成抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物。這一結(jié)合過程需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的多種伴侶蛋白的參與，如鈣聯(lián)蛋白、鈣網(wǎng)蛋白等，它們能夠幫助MHC-Ⅰ類分子正確折疊，并促進抗原肽與MHC-Ⅰ類分子的結(jié)合。形成的抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物轉(zhuǎn)入高爾基體，再通過分泌小泡將其運送到抗原呈遞細胞表面，供CD8+T細胞識別。CD8+T細胞表面的TCR識別抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物后，被激活成為細胞毒性T細胞（CTL），能夠直接殺傷被VSV-846疫苗感染的細胞，清除病原體。抗原在抗原呈遞細胞內(nèi)的加工和呈遞過程，通過MHC分子與抗原肽的特異性結(jié)合，將抗原信息準(zhǔn)確地傳遞給T細胞，啟動了特異性免疫應(yīng)答，為機體抵御結(jié)核分枝桿菌感染提供了關(guān)鍵的免疫保護。4.2T細胞活化與分化4.2.1T細胞活化信號T細胞的活化是一個復(fù)雜而精細的過程，需要多種信號的協(xié)同作用，其中T細胞受體（TCR）識別抗原以及共刺激信號的提供是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TCR是T細胞表面特有的抗原識別受體，由α和β兩條鏈組成，每條鏈都包含可變區(qū)（V區(qū)）和恒定區(qū)（C區(qū)）。V區(qū)的氨基酸序列具有高度的多樣性，這使得TCR能夠識別多種多樣的抗原。當(dāng)T細胞接觸到VSV-846疫苗免疫后由抗原呈遞細胞（APC）呈遞的抗原肽-MHC復(fù)合物時，TCR通過其V區(qū)與抗原肽-MHC復(fù)合物中的抗原肽特異性結(jié)合。這種結(jié)合具有高度的特異性，就像一把鑰匙對應(yīng)一把鎖，只有特定的TCR才能識別特定的抗原肽。研究表明，TCR與抗原肽-MHC復(fù)合物的結(jié)合親和力決定了T細胞活化的強度和效率。高親和力的結(jié)合能夠更有效地激活T細胞，促進后續(xù)的免疫反應(yīng)。然而，僅有TCR識別抗原這一信號還不足以完全激活T細胞，T細胞還需要共刺激信號的參與。共刺激信號主要由APC表面的共刺激分子提供，如B7-1（CD80）和B7-2（CD86）等。當(dāng)TCR識別抗原后，T細胞表面的CD28分子會與APC表面的B7分子結(jié)合，形成CD28-B7共刺激信號。這一信號對于T細胞的完全活化至關(guān)重要，它能夠增強T細胞對抗原刺激的敏感性，促進T細胞的增殖和分化。如果缺乏共刺激信號，T細胞不僅不能被有效激活，反而會進入無反應(yīng)狀態(tài)或凋亡。在VSV-846疫苗免疫過程中，APC攝取和處理疫苗抗原后，表面的B7分子表達上調(diào)，與T細胞表面的CD28分子結(jié)合，為T細胞提供了關(guān)鍵的共刺激信號，確保T細胞能夠被完全激活，啟動有效的免疫應(yīng)答。此外，除了CD28-B7共刺激信號外，還有其他共刺激分子對T細胞的活化也具有重要作用。如ICOS（誘導(dǎo)性共刺激分子）與其配體ICOSL的相互作用，能夠進一步增強T細胞的活化和功能。ICOS在活化的T細胞表面表達，與ICOSL結(jié)合后，能夠促進T細胞分泌細胞因子，增強T細胞的增殖和存活能力。在VSV-846疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，ICOS-ICOSL信號通路可能參與調(diào)節(jié)T細胞的活化和分化，進一步完善免疫反應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。總之，T細胞活化過程中TCR識別抗原以及共刺激信號的提供，是確保T細胞能夠有效啟動免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，它們相互協(xié)作，共同調(diào)節(jié)T細胞的活化、增殖和分化，為機體抵御結(jié)核分枝桿菌感染提供了重要的免疫保護。4.2.2T細胞分化活化后的T細胞會經(jīng)歷分化過程，形成效應(yīng)T細胞和記憶T細胞，它們在機體的免疫防御中發(fā)揮著不同但又至關(guān)重要的作用。效應(yīng)T細胞是T細胞分化后的重要功能細胞，主要包括細胞毒性T細胞（CTL，CD8+T細胞）和輔助性T細胞（Th，CD4+T細胞）。CTL在殺傷被病原體感染的細胞和腫瘤細胞方面發(fā)揮著核心作用。當(dāng)CTL識別到被VSV-846疫苗感染的細胞表面的抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物后，會通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接殺傷靶細胞。穿孔素能夠在靶細胞膜上形成小孔，使顆粒酶等物質(zhì)進入靶細胞內(nèi)，激活細胞凋亡途徑，導(dǎo)致靶細胞死亡。研究表明，在VSV-846疫苗免疫小鼠的實驗中，CTL能夠有效地殺傷被結(jié)核分枝桿菌感染的細胞，降低細菌載量，減輕組織損傷。Th細胞則通過分泌細胞因子，調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能，參與免疫應(yīng)答的調(diào)控。Th1細胞主要分泌IFN-γ、IL-2等細胞因子，能夠激活巨噬細胞，增強其吞噬和殺傷病原體的能力，同時促進CTL的活化和增殖。在VSV-846疫苗免疫后，Th1細胞分泌的IFN-γ能夠顯著增強巨噬細胞對結(jié)核分枝桿菌的殺傷作用，提高機體的抗感染能力。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等細胞因子，參與體液免疫應(yīng)答，促進B細胞的活化、增殖和抗體產(chǎn)生。Th17細胞分泌IL-17等細胞因子，能夠招募中性粒細胞等免疫細胞到感染部位，增強局部的免疫防御能力。記憶T細胞是T細胞分化形成的另一類重要細胞，它們能夠在體內(nèi)長期存活，為機體提供長期的免疫保護。記憶T細胞可分為中央記憶T細胞（Tcm）和效應(yīng)記憶T細胞（Tem）。Tcm主要存在于淋巴結(jié)等淋巴組織中，具有較強的自我更新能力和增殖潛能。當(dāng)再次遇到相同抗原時，Tcm能夠迅速增殖分化為效應(yīng)T細胞，啟動快速而強烈的免疫應(yīng)答。Tem則主要分布在外周組織中，能夠快速遷移到感染部位，發(fā)揮免疫效應(yīng)。在VSV-846疫苗免疫后，記憶T細胞的產(chǎn)生能夠使機體在再次接觸結(jié)核分枝桿菌時，迅速激活免疫反應(yīng)，有效抵御感染。研究發(fā)現(xiàn)，VSV-846疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的記憶T細胞在體內(nèi)能夠存活較長時間，且在再次感染時，能夠快速分泌細胞因子，增強免疫細胞的活性，從而有效控制結(jié)核分枝桿菌的感染和傳播。效應(yīng)T細胞和記憶T細胞在T細胞分化過程中形成，它們通過各自獨特的功能，共同構(gòu)成了機體抵御結(jié)核分枝桿菌感染的重要防線，VSV-846疫苗通過誘導(dǎo)T細胞的分化，增強了機體的免疫防御能力，為結(jié)核病的預(yù)防和控制提供了有力的支持。4.3細胞因子調(diào)節(jié)作用4.3.1促炎細胞因子促炎細胞因子在VSV-846疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們?nèi)缤庖呦到y(tǒng)的“烽火信號”，在感染初期迅速啟動炎癥反應(yīng)，協(xié)調(diào)免疫細胞的行動，共同抵御結(jié)核分枝桿菌的入侵。干擾素-γ（IFN-γ）作為一種重要的促炎細胞因子，在免疫防御中具有多重功效。IFN-γ能夠激活巨噬細胞，使其吞噬和殺傷結(jié)核分枝桿菌的能力大幅提升。在巨噬細胞內(nèi)，IFN-γ可以誘導(dǎo)產(chǎn)生一氧化氮合酶（iNOS），催化產(chǎn)生一氧化氮（NO），NO具有強大的殺菌活性，能夠有效殺滅結(jié)核分枝桿菌。IFN-γ還能增強巨噬細胞表面MHC-Ⅱ類分子的表達，促進抗原呈遞，使T細胞能夠更有效地識別抗原，增強免疫應(yīng)答。在VSV-846疫苗免疫小鼠的實驗中，IFN-γ的分泌水平在免疫后顯著升高。通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，免疫后的第7天，小鼠血清中的IFN-γ濃度就達到了（250.5±30.2）pg/ml，隨后持續(xù)上升，到第14天達到（560.2±70.5）pg/ml，這表明VSV-846疫苗能夠有效誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，增強機體的免疫防御能力。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）同樣在免疫過程中扮演著重要角色。TNF-α可以直接殺傷結(jié)核分枝桿菌，通過與結(jié)核分枝桿菌表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)細菌的凋亡。它還能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，促進其他免疫細胞的活化和募集。在炎癥部位，TNF-α能夠增加血管內(nèi)皮細胞的通透性，使免疫細胞更容易滲出血管，到達感染部位。同時，TNF-α可以刺激巨噬細胞分泌其他細胞因子，如IL-1、IL-6等，形成細胞因子網(wǎng)絡(luò)，協(xié)同增強免疫應(yīng)答。在VSV-846疫苗免疫后的小鼠體內(nèi)，TNF-α的水平也明顯升高。免疫后的第10天，小鼠肺組織勻漿中的TNF-α濃度達到了（320.8±40.5）pg/ml，與空白對照組相比有顯著差異。這說明VSV-846疫苗能夠激發(fā)機體產(chǎn)生TNF-α，在抗結(jié)核感染中發(fā)揮重要的炎癥調(diào)節(jié)和殺菌作用。白細胞介素-2（IL-2）在促進T細胞的增殖和分化方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IL-2可以與T細胞表面的IL-2受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號通路，促進T細胞的分裂和增殖。在VSV-846疫苗免疫后，IL-2的分泌能夠使T細胞數(shù)量迅速增加，增強免疫應(yīng)答的強度。IL-2還能促進T細胞向效應(yīng)T細胞和記憶T細胞分化，提高T細胞的免疫活性。實驗數(shù)據(jù)顯示，免疫后的第7天，小鼠血清中的IL-2濃度為（180.5±25.6）pg/ml，隨著免疫時間的延長，IL-2的濃度維持在較高水平，為T細胞的活化和增殖提供了持續(xù)的支持。這些促炎細胞因子在VSV-846疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中相互協(xié)作，共同增強機體對結(jié)核分枝桿菌的抵抗力，為免疫保護發(fā)揮著不可或缺的作用。4.3.2抗炎細胞因子抗炎細胞因子在VSV-846疫苗免疫過程中起著維持免疫平衡的重要作用，它們?nèi)缤庖呦到y(tǒng)的“調(diào)節(jié)劑”，防止免疫反應(yīng)過度，避免對機體造成損傷。白細胞介素-10（IL-10）是一種典型的抗炎細胞因子。IL-10主要由T細胞、B細胞和巨噬細胞等免疫細胞分泌。在VSV-846疫苗免疫小鼠的過程中，IL-10的作用十分關(guān)鍵。它能夠抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，如IFN-γ、TNF-α等。IL-10通過與免疫細胞表面的IL-10受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號通路，抑制促炎細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，從而減少其合成和分泌。在免疫后的第14天，當(dāng)促炎細胞因子水平升高時，IL-10的分泌也相應(yīng)增加。通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，此時小鼠血清中的IL-10濃度達到了（120.6±15.3）pg/ml，有效地抑制了促炎細胞因子的過度釋放，避免了炎癥反應(yīng)的失控。IL-10還能調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，抑制巨噬細胞的活化和抗原呈遞能力。巨噬細胞在活化過程中會分泌大量的促炎細胞因子，IL-10可以抑制巨噬細胞表面Toll樣受體（TLR）的表達，減少其對病原體相關(guān)分子模式（PAMP）的識別，從而降低巨噬細胞的活化程度。IL-10能夠抑制巨噬細胞分泌IL-1、IL-6等促炎細胞因子，減少炎癥反應(yīng)的強度。IL-10還能調(diào)節(jié)T細胞的活化和分化，抑制Th1和Th17細胞的分化，促進調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的生成。Treg細胞具有抑制免疫應(yīng)答的作用，能夠維持免疫平衡，防止自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。在VSV-846疫苗免疫后，IL-10的存在促進了Treg細胞的生成，這些Treg細胞通過分泌抑制性細胞因子，如TGF-β等，抑制其他免疫細胞的活性，維持免疫平衡。抗炎細胞因子IL-10在VSV-846疫苗免疫過程中，通過抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，維持了免疫平衡，確保免疫應(yīng)答既能有效抵御結(jié)核分枝桿菌的感染，又不會對機體造成過度的損傷。4.4免疫記憶形成機制4.4.1記憶T細胞產(chǎn)生記憶T細胞的產(chǎn)生是VSV-846疫苗免疫機制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其產(chǎn)生過程涉及復(fù)雜的細胞和分子事件。在VSV-846疫苗免疫小鼠的過程中，初始T細胞在抗原呈遞細胞（APC）呈遞的抗原肽-MHC復(fù)合物以及共刺激信號的作用下被激活。激活后的初始T細胞開始增殖分化，部分細胞逐漸分化為記憶T細胞。這一過程中，多種細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。白細胞介素-7（IL-7）是一種對記憶T細胞產(chǎn)生至關(guān)重要的細胞因子。IL-7主要由基質(zhì)細胞分泌，它能夠與初始T細胞和記憶T細胞表面的IL-7受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號通路。在VSV-846疫苗免疫后，IL-7的水平升高，為初始T細胞的存活和增殖提供了必要的信號。IL-7可以促進初始T細胞表達抗凋亡蛋白Bcl-2，抑制細胞凋亡，從而增加初始T細胞的數(shù)量。IL-7還能促進初始T細胞向記憶T細胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，在IL-7缺陷的小鼠模型中，VSV-846疫苗免疫后記憶T細胞的產(chǎn)生明顯減少，這表明IL-7在記憶T細胞產(chǎn)生過程中起著不可或缺的作用。轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes在記憶T細胞的分化中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。T-bet主要表達于Th1細胞，能夠促進Th1細胞相關(guān)細胞因子如IFN-γ的分泌。在VSV-846疫苗免疫后，T-bet在部分活化的T細胞中表達上調(diào)，這些細胞更傾向于分化為具有記憶潛能的T細胞。T-bet可以通過調(diào)節(jié)一系列基因的表達，影響T細胞的分化方向。Eomes與T-bet具有相似的功能，它也能夠促進T細胞向記憶T細胞的分化。在效應(yīng)T細胞向記憶T細胞轉(zhuǎn)化的過程中，Eomes的表達逐漸增加，它可以抑制效應(yīng)T細胞相關(guān)基因的表達，同時促進記憶T細胞相關(guān)基因的