仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗的制備工藝與動物實驗效能評估一、引言1.1研究背景與意義隨著我國養豬業規模化、集約化程度的不斷提高，仔豬疾病的防控成為影響養豬業經濟效益和可持續發展的關鍵因素。仔豬水腫病和仔豬副傷寒作為仔豬階段的常見多發病，給養豬業帶來了巨大的經濟損失。仔豬水腫病又稱溶血性大腸桿菌病，是由某些定植于小腸的大腸桿菌引起的一種傳染性腸毒血癥。這些大腸桿菌可產生能侵入血流并破壞血管壁的外毒素，主要臨床特征為突然發病、病程短促、全身或局部麻痹、行走困難、共濟失調，眼瞼和喉頭、胃、腸道等組織器官水腫。本病發病率通常為10％-30％，但致死率極高，可達80％-100％。一旦發病，不僅患病仔豬死亡率高，幸存仔豬也往往生長發育受阻，飼料轉化率降低，增加養殖成本。仔豬副傷寒是由豬霍亂沙門氏菌及腸炎沙門氏菌等引起的一種危害仔豬的慢性傳染病，主要臨床癥狀表現為腹瀉，嚴重者可出現敗血癥。常發生于6月齡以下的仔豬，尤其是2-4月齡仔豬多見，發病率可達40%，病死率達20%。本病不僅影響仔豬的生長發育，導致飼料報酬降低，還會造成仔豬的死亡，給養殖戶帶來直接的經濟損失，并且還可造成母豬流產，嚴重危害后備豬源的發展。這兩種疾病在養豬場中廣泛存在，且常常混合感染，進一步增加了防控的難度和損失。目前，針對這兩種疾病的防控主要依賴于疫苗接種。然而，現有的疫苗多為單價疫苗，需要分別進行免疫接種，操作繁瑣，增加了養殖成本和勞動強度，且免疫效果存在一定的局限性。因此，研發一種安全、高效的仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗具有重要的現實意義。通過一次免疫即可同時預防兩種疾病，不僅可以簡化免疫程序，減少養殖成本和勞動強度，還能提高免疫效果，有效降低仔豬水腫病和仔豬副傷寒的發生率，保障養豬業的健康發展，對于促進養豬業的經濟效益提升和可持續發展具有重要的推動作用。1.2國內外研究現狀在仔豬水腫病疫苗研發方面，國內外都進行了大量探索。傳統的仔豬水腫病疫苗多為滅活疫苗，通過將分離得到的產毒素大腸桿菌進行培養、滅活后制備而成。早期研究主要集中在篩選優勢血清型菌株用于疫苗制備，國外學者通過大量的流行病學調查，確定了如O138:K81、O139:K82、O141:K85等常見的致水腫病大腸桿菌血清型，并以此為基礎開發了相應的單價或多價滅活疫苗。國內也針對本土流行的血清型進行研究，分離出多株具有代表性的菌株用于疫苗研制，在一定程度上對仔豬水腫病的防控起到了作用。隨著生物技術的發展，基因工程疫苗成為研究熱點。有研究將大腸桿菌的關鍵毒力基因如F18ab菌毛基因、類志賀毒素II型變異體（SLT-IIe）基因等進行克隆、表達，制備亞單位疫苗或核酸疫苗。例如，將SLT-IIe的B亞基基因克隆到表達載體中，在合適的宿主菌中表達出具有免疫原性的蛋白，動物實驗表明能誘導機體產生特異性抗體，對仔豬水腫病有一定的免疫保護效果。在仔豬副傷寒疫苗研究領域，早期的疫苗主要是弱毒活疫苗，如C500弱毒株制成的活疫苗在國內外都有應用，該疫苗通過口服或注射免疫，能刺激機體產生細胞免疫和體液免疫，對仔豬副傷寒的預防有一定效果，但存在毒力返強的風險。滅活疫苗也是常見類型，通過化學方法滅活豬霍亂沙門氏菌及腸炎沙門氏菌等病原菌制備，安全性較高，但免疫原性相對較弱，往往需要多次免疫。近年來，基因工程技術也被廣泛應用于仔豬副傷寒疫苗研發。利用基因缺失技術構建減毒沙門氏菌載體，將外源保護性抗原基因導入其中，構建重組活載體疫苗，既能激發機體針對沙門氏菌的免疫反應，又能誘導針對外源抗原的特異性免疫。還有研究開發人源化的ZTJ4-5抗原和副傷寒B抗原的基因重組疫苗，在動物實驗中表現出良好的免疫效價、保護效果和生物安全性。盡管在仔豬水腫病和仔豬副傷寒疫苗研發方面取得了諸多進展，但當前的二聯滅活疫苗研究仍存在一些問題與挑戰。一方面，如何篩選出在不同地區都具有廣泛代表性的菌株用于二聯疫苗制備是關鍵問題。不同地區的病原菌血清型分布存在差異，單一或少數菌株制備的疫苗可能無法對當地流行的菌株提供有效保護。另一方面，二聯疫苗中兩種抗原之間可能存在免疫干擾，影響疫苗的免疫效果。如何優化疫苗配方和制備工藝，使兩種抗原在疫苗中相互協同，充分激發機體的免疫應答，還需要進一步深入研究。此外，現有疫苗的免疫程序較為復雜，部分疫苗需要多次免疫，增加了養殖成本和勞動強度，開發更加簡便、高效的免疫程序也是未來研究的方向之一。1.3研究目標與內容本研究旨在制備一種安全、高效的仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗，并通過動物實驗評估其免疫效果和安全性，為養豬業提供一種有效的疾病防控手段。具體研究內容如下：菌株篩選與鑒定：從臨床發病仔豬中采集病料，通過細菌分離培養技術，篩選出具有代表性的仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌菌株。利用血清學方法、分子生物學技術如PCR擴增等對分離菌株進行準確鑒定，確定其血清型和基因型，為后續疫苗制備提供優質種子菌株。疫苗制備工藝研究：優化仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的培養條件，包括培養基配方、培養溫度、培養時間等，以提高菌體產量和質量。采用合適的滅活方法，如甲醛滅活、β-丙內酯滅活等，確保病原菌完全滅活且不影響其免疫原性。對滅活后的菌體進行濃縮、純化處理，去除雜質和有害成分，提高疫苗的純度。研究佐劑的種類和配比，如氫氧化鋁佐劑、油佐劑等，篩選出能有效增強疫苗免疫效果的佐劑配方，確定最終的疫苗制備工藝。動物實驗：選取健康的仔豬作為實驗動物，隨機分組，分別進行疫苗的安全性和免疫效力實驗。安全性實驗中，觀察仔豬接種疫苗后的臨床癥狀、體溫變化、采食情況等，檢測血液學指標、生化指標等，評估疫苗對仔豬的安全性，是否存在不良反應。免疫效力實驗中，在仔豬接種疫苗后的不同時間點采集血清，檢測抗體水平，如通過ELISA方法檢測特異性IgG抗體滴度，分析抗體消長規律。對免疫后的仔豬進行攻毒實驗，用強毒力的仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌分別進行攻擊，觀察仔豬的發病情況、死亡率等，計算疫苗的保護率，評估疫苗的免疫保護效果。疫苗質量標準制定：依據《中華人民共和國獸藥典》等相關標準和規范，制定仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗的質量標準，包括疫苗的外觀、物理性狀、無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗等項目。確定疫苗的抗原含量、效力檢驗方法和判定標準，確保疫苗質量的穩定性和可靠性。建立疫苗的穩定性試驗方法，考察疫苗在不同溫度、濕度條件下的保存期限和質量變化情況，為疫苗的儲存和運輸提供科學依據。二、仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗的制備原理2.1仔豬水腫病的致病機制與免疫原仔豬水腫病的致病菌主要為產類志賀毒素大腸桿菌，其血清型眾多，抗原結構復雜，主要由菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原和莢膜（K）抗原組成。在已確定的171種大腸桿菌O抗原、80種K抗原和56種H抗原中，引發豬水腫病的血清型數量有限，常見的有O8、O138、O139、O141、O149等群，且部分與仔豬黃痢相同，但表面抗原存在差異，多數菌株能溶解綿羊紅細胞。產類志賀毒素大腸桿菌的毒力因子在致病過程中發揮關鍵作用。F18ab（F10）菌毛有助于細菌黏附于仔豬腸道上皮細胞，為后續感染奠定基礎。類志賀氏樣毒素n型變異體SLT-IIV、TL、Sta、STb和STx2e致水腫毒素中，水腫毒素（水腫因子，EDP）是一種熱不穩定蛋白，其能侵入血流，破壞血管壁。當仔豬感染產毒大腸桿菌后，毒素進入血液循環，作用于血管內皮細胞，導致血管通透性增加，使液體和蛋白質滲出到組織間隙，進而引發全身或局部麻痹、共濟失調、眼瞼水腫等典型癥狀，以及動脈管病變和腦水腫。用于疫苗制備的免疫原主要為產毒大腸桿菌的菌體及其產生的毒素。完整的菌體包含多種抗原成分，可刺激機體產生針對菌體表面結構的抗體，這些抗體能阻止細菌黏附于腸道上皮細胞，抑制細菌的定植和繁殖。而毒素作為重要的免疫原，經過脫毒處理后制成類毒素，可誘導機體產生特異性中和抗體。當機體再次接觸到相同的毒素時，中和抗體能迅速與毒素結合，使其失去毒性，從而有效預防仔豬水腫病的發生。2.2仔豬副傷寒的致病機制與免疫原仔豬副傷寒主要由豬霍亂沙門氏菌及腸炎沙門氏菌等引起。沙門氏菌為革蘭氏陰性菌，呈兩端鈍圓、中等大小的直桿菌形態，無芽孢，多數有周鞭毛，能運動。其對干燥、腐敗、日光等環境因素有較強的抵抗力，在水中能存活2-3周，在糞便中能存活1-2個月，但對熱和常用化學消毒劑的抵抗力不強，60℃15分鐘即可被殺滅。當仔豬經消化道感染沙門氏菌后，細菌會在腸道內黏附、定植并侵入腸上皮細胞。豬霍亂沙門氏菌憑借其毒力質粒編碼的毒力相關蛋白，以及通過型分泌系統分泌的效應蛋白，干擾宿主細胞的信號傳導通路，破壞腸道黏膜屏障，導致腸道炎癥的發生。細菌還可進一步侵入血流，引發敗血癥，出現高熱、精神沉郁、下痢等癥狀。在慢性感染過程中，細菌在腸道淋巴組織內持續繁殖，刺激機體產生免疫反應，導致腸黏膜出現壞死性炎癥，形成特征性的潰瘍病變，表現為腹瀉、消瘦等慢性癥狀。作為疫苗免疫原，沙門氏菌的菌體抗原、鞭毛抗原以及一些外膜蛋白等都具有重要作用。菌體抗原可誘導機體產生IgM抗體，在感染初期發揮免疫防御作用；鞭毛抗原能刺激機體產生IgG抗體，對細菌的運動和黏附起到抑制作用。外膜蛋白如OmpC、OmpF等也具有良好的免疫原性，能激發機體的細胞免疫和體液免疫反應。將這些免疫原經過滅活處理后制備成疫苗，可使機體產生針對沙門氏菌的特異性免疫記憶，當再次接觸到病原菌時，免疫系統能迅速啟動免疫應答，有效清除病原菌，預防仔豬副傷寒的發生。2.3二聯滅活疫苗的制備原理仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗的制備，是將仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌這兩種病原菌分別進行培養、滅活處理后，按照一定比例混合，并添加合適的佐劑而制成。其核心原理是利用滅活后的病原菌保留的免疫原性，刺激機體產生特異性免疫反應，從而獲得對這兩種疾病的免疫保護能力。對于仔豬水腫病的免疫原部分，選用的產毒大腸桿菌在滅活后，菌體表面的多種抗原成分，如O抗原、H抗原和K抗原等，依然能夠被機體免疫系統識別。這些抗原可激活機體的B淋巴細胞，使其分化為漿細胞，進而產生針對大腸桿菌菌體的特異性抗體。當機體再次接觸到活的產毒大腸桿菌時，這些抗體能迅速與細菌表面抗原結合，阻止細菌黏附于腸道上皮細胞，抑制其在腸道內的定植和繁殖，有效降低感染風險。同時，經過脫毒處理的毒素制成的類毒素，作為重要免疫原，能誘導機體產生特異性中和抗體。在后續遭遇真實毒素侵襲時，中和抗體可與毒素緊密結合，阻斷毒素與血管內皮細胞的結合位點，使其無法發揮破壞血管壁的毒性作用，從而預防仔豬水腫病的發生。而針對仔豬副傷寒的免疫原，滅活后的沙門氏菌保留了菌體抗原、鞭毛抗原以及外膜蛋白等免疫原性物質。其中，菌體抗原可激發機體產生IgM抗體，在感染初期發揮免疫防御作用，快速識別并結合入侵的沙門氏菌，啟動機體的免疫應答反應。鞭毛抗原能夠刺激機體產生IgG抗體，IgG抗體可以特異性地結合沙門氏菌的鞭毛，阻礙細菌的運動能力，使其難以在宿主體內自由擴散和侵襲，同時也能增強吞噬細胞對細菌的吞噬和清除作用。外膜蛋白如OmpC、OmpF等具有良好的免疫原性，可激活機體的細胞免疫和體液免疫反應。在細胞免疫方面，激活的T淋巴細胞能夠識別并殺傷被沙門氏菌感染的宿主細胞，阻止細菌在細胞內的繁殖和擴散；在體液免疫方面，刺激B淋巴細胞產生特異性抗體，進一步協助清除病原菌。當兩種滅活后的免疫原混合制成二聯滅活疫苗后，它們在機體內共同作用。佐劑的添加能夠增強疫苗的免疫原性，促進抗原呈遞細胞對抗原的攝取、加工和呈遞，激活T淋巴細胞和B淋巴細胞，提高機體的免疫應答水平。兩種病原菌的免疫原相互協同，不會產生免疫干擾，使得機體在一次免疫過程中，能夠同時針對仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌產生特異性免疫記憶。當機體再次受到這兩種病原菌的攻擊時，免疫系統能夠迅速識別并啟動免疫應答，快速產生大量的特異性抗體和免疫細胞，及時清除病原菌，從而有效預防仔豬水腫病和仔豬副傷寒的發生，實現一針預防兩種疾病的目的。三、仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗的制備方法3.1菌株的分離與鑒定在無菌條件下，從出現典型仔豬水腫病和仔豬副傷寒癥狀的病死仔豬體內采集病料，包括小腸內容物、腸系膜淋巴結、肝臟、脾臟等組織。將采集的病料迅速放入無菌容器中，置于冰盒內，盡快送回實驗室進行后續處理。對于仔豬水腫大腸桿菌的分離，將病料接種于麥康凱瓊脂培養基上，37℃恒溫培養24小時。挑選培養基上紅色、濕潤、光滑、邊緣整齊的疑似大腸桿菌菌落，在伊紅美藍瓊脂培養基上進行劃線分離，進一步培養24小時。伊紅美藍培養基上，大腸桿菌會形成具有黑色中心并帶有綠色金屬光澤的特征性菌落。挑取單個典型菌落，接種到營養肉湯培養基中，37℃振蕩培養18-24小時，進行增菌培養。仔豬副傷寒沙門氏菌的分離，先將病料接種于四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）中，37℃振蕩培養18-24小時，進行選擇性增菌。隨后，用接種環取增菌液劃線接種于麥康凱瓊脂平板和SS瓊脂平板上，37℃培養24小時。在麥康凱瓊脂平板上，沙門氏菌形成無色透明或半透明、中等大小、邊緣整齊、光滑且較扁平的菌落；在SS瓊脂平板上，沙門氏菌菌落呈現出中心黑色的特征。挑取可疑菌落，接種于三糖鐵瓊脂斜面培養基，37℃培養18-24小時，進行初步鑒別。沙門氏菌在三糖鐵瓊脂斜面上表現為底層產酸產氣，上層斜面不發酵乳糖，且產生硫化氫，使培養基變黑。對分離得到的疑似大腸桿菌和沙門氏菌菌株，進行革蘭氏染色鏡檢。大腸桿菌為革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓；沙門氏菌同樣為革蘭氏陰性桿菌，呈桿狀。利用生化鑒定管對菌株進行生化鑒定。對于大腸桿菌，主要檢測其對葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇等糖類的發酵能力，以及吲哚試驗、甲基紅試驗、VP試驗、枸櫞酸鹽利用試驗等生化特性。大腸桿菌通常發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇產酸產氣，吲哚試驗陽性，甲基紅試驗陽性，VP試驗陰性，枸櫞酸鹽利用試驗陰性。對于沙門氏菌，檢測其對葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖等糖類的發酵情況，以及硫化氫產生試驗、尿素酶試驗、賴氨酸脫羧酶試驗、鳥氨酸脫羧酶試驗等。沙門氏菌發酵葡萄糖產酸產氣或產酸不產氣，不發酵乳糖和蔗糖，硫化氫產生試驗陽性，尿素酶試驗陰性，賴氨酸脫羧酶試驗陽性。采用血清學方法進一步確定菌株的血清型。購買商品化的大腸桿菌O抗原診斷血清和沙門氏菌O、H抗原診斷血清。對于大腸桿菌，用生理鹽水將分離菌株制成菌懸液，與不同的O抗原診斷血清進行玻片凝集試驗。將等量的菌懸液和診斷血清滴于潔凈玻片上，混勻，輕輕搖晃玻片，觀察是否出現凝集現象。若在2-3分鐘內出現明顯的凝集顆粒，則判定為陽性反應，確定其O抗原血清型。對于沙門氏菌，先進行O抗原血清凝集試驗，方法同大腸桿菌。確定O抗原后，再用H抗原診斷血清進行凝集試驗，以確定其H抗原血清型。通過血清學鑒定，篩選出當地流行的血清型菌株，如仔豬水腫大腸桿菌常見的O138、O139、O141等血清型，仔豬副傷寒沙門氏菌常見的豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等血清型，為后續疫苗制備提供合適的種子菌株。3.2種子液的制備將經過分離鑒定后確定為當地流行血清型的仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌菌株，分別接種于適宜的培養基中進行種子液制備。對于仔豬水腫大腸桿菌，選用營養豐富的LB培養基，其配方為：蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、蒸餾水1000mL，調節pH值至7.2-7.4。取保存的甘油菌或斜面菌種，用接種環挑取少量菌體，接種到裝有5mLLB液體培養基的試管中，37℃、200r/min振蕩培養12-16小時，進行一級種子培養。待菌液渾濁后，按照1%-5%的接種量，將一級種子液轉接至裝有50mLLB液體培養基的250mL三角瓶中，同樣在37℃、200r/min條件下振蕩培養8-12小時，獲得二級種子液。培養過程中，定時用分光光度計測定菌液的OD600值，繪制生長曲線，以監測細菌的生長狀態。當OD600值達到0.6-0.8時，認為細菌處于對數生長期，此時的種子液活力最強，可用于后續的疫苗制備。對于仔豬副傷寒沙門氏菌，選擇改良的SS培養基進行種子液培養。改良SS培養基配方為：牛肉膏5g、蛋白胨5g、乳糖10g、蔗糖10g、枸櫞酸鈉8.5g、硫代硫酸鈉8.5g、枸櫞酸鐵銨1g、瓊脂15g、0.4%溴麝香草酚藍水溶液16mL、蒸餾水1000mL。首先，將凍干菌種或斜面保存菌種接種到裝有5mL改良SS液體培養基的試管中，37℃靜置培養16-20小時，完成一級種子培養。隨后，將一級種子液以3%-7%的接種量轉接至裝有50mL改良SS液體培養基的250mL三角瓶中，37℃、180r/min振蕩培養10-14小時，得到二級種子液。在培養過程中，通過觀察菌液的渾濁程度和顏色變化，初步判斷細菌的生長情況。同時，每隔一段時間取少量菌液進行涂片、革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌的形態和純度，確保種子液的質量。當鏡檢結果顯示細菌形態均一、無雜菌污染，且菌液渾濁度達到一定程度時，表明種子液制備成功。為了優化培養條件，進一步提高種子液的質量和產量，對培養溫度、搖床轉速、培養基初始pH值等因素進行了研究。通過設置不同的溫度梯度（如35℃、37℃、39℃）、搖床轉速梯度（如160r/min、180r/min、200r/min）以及培養基初始pH值梯度（如7.0、7.2、7.4、7.6），分別進行仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的培養實驗。在每個實驗條件下，定時測定菌液的OD600值，繪制生長曲線。實驗結果表明，37℃、200r/min振蕩培養，培養基初始pH值為7.2-7.4時，仔豬水腫大腸桿菌的生長速度最快，菌體產量最高；37℃、180r/min振蕩培養，培養基初始pH值為7.2時，仔豬副傷寒沙門氏菌的生長狀況最佳，能夠獲得高質量的種子液。因此，確定上述優化后的培養條件用于后續的疫苗生產。3.3疫苗的滅活處理將制備好的仔豬水腫大腸桿菌種子液和仔豬副傷寒沙門氏菌種子液分別進行滅活處理，以確保疫苗的安全性，同時最大程度保留其免疫原性。對于仔豬水腫大腸桿菌種子液，選用甲醛作為滅活劑。甲醛能夠與細菌蛋白質中的氨基、羥基等基團發生反應，使蛋白質變性，從而破壞細菌的結構和生理功能，達到滅活的目的。按照甲醛終濃度為0.3%-0.5%的比例，將甲醛溶液緩慢加入到仔豬水腫大腸桿菌種子液中，邊加邊攪拌，確保甲醛均勻分布。將加入甲醛的種子液置于37℃恒溫搖床中，150r/min振蕩滅活16-24小時。在滅活過程中，定時取少量菌液進行活菌計數，監測滅活效果。活菌計數采用平板菌落計數法，將菌液進行10倍梯度稀釋，取適當稀釋度的菌液0.1mL涂布于LB瓊脂平板上，37℃培養24小時后，計數平板上的菌落數。當連續3次檢測結果顯示菌液中無活菌生長時，判定滅活完全。對于仔豬副傷寒沙門氏菌種子液，采用β-丙內酯進行滅活。β-丙內酯能與細菌的核酸、蛋白質等生物大分子發生烷基化反應，破壞其結構和功能，實現滅活。向仔豬副傷寒沙門氏菌種子液中加入β-丙內酯，使其終濃度達到0.1%-0.3%，充分混勻后，在2-8℃條件下滅活12-16小時。滅活過程中，同樣定期進行活菌計數檢測，方法同仔豬水腫大腸桿菌。為確保滅活效果的可靠性，在滅活結束后，將滅活后的菌液接種于適宜的培養基中，進行培養觀察。將滅活后的仔豬水腫大腸桿菌菌液接種于LB液體培養基和LB瓊脂平板上，37℃培養48小時，觀察培養基中是否有細菌生長；將滅活后的仔豬副傷寒沙門氏菌菌液接種于改良SS液體培養基和SS瓊脂平板上，37℃培養48小時，檢查有無細菌生長。若兩種菌液在相應培養基上均無細菌生長，則表明滅活徹底，可用于后續的疫苗制備步驟。3.4疫苗的配制與保存將滅活后的仔豬水腫大腸桿菌菌液和仔豬副傷寒沙門氏菌菌液按照一定比例進行混合。經過前期大量的預實驗，綜合考慮兩種病原菌在當地的流行情況、致病性強弱以及免疫原性等因素，確定二者的最佳混合比例為1:1。在混合過程中，使用磁力攪拌器緩慢攪拌，確保兩種菌液充分混勻，避免出現沉淀或分層現象。佐劑的選擇對于提高疫苗的免疫效果至關重要。本研究選用氫氧化鋁佐劑，其具有良好的免疫增強作用，能夠吸附抗原，延長抗原在體內的釋放時間，從而增強機體的免疫應答。按照疫苗總體積的10%-20%加入氫氧化鋁佐劑，邊加邊攪拌，使佐劑與混合菌液充分融合。攪拌完成后，將疫苗溶液置于4℃冰箱中靜置1-2小時，使佐劑與抗原充分結合，形成穩定的疫苗制劑。為了確定疫苗的保存條件和有效期，進行了穩定性試驗。將制備好的疫苗分別放置在2-8℃冷藏條件和-20℃冷凍條件下保存。在不同的時間點，如1個月、3個月、6個月、9個月、12個月等，取出疫苗進行各項質量指標檢測。檢測項目包括疫苗的外觀，觀察是否有分層、沉淀、變色等現象；無菌檢驗，按照《中華人民共和國獸藥典》規定的方法，將疫苗接種于硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基中，37℃培養14天，檢查是否有雜菌生長；支原體檢驗，采用培養法和PCR法相結合，檢測疫苗中是否存在支原體污染；抗原含量測定，利用ELISA方法檢測疫苗中仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的抗原含量；效力檢驗，選取一定數量的健康仔豬，按照疫苗使用劑量進行免疫接種，免疫后一定時間進行攻毒試驗，觀察仔豬的發病情況和死亡情況，計算疫苗的保護率。試驗結果表明，在2-8℃冷藏條件下，疫苗在12個月內外觀均一、無分層和沉淀現象，無菌檢驗、支原體檢驗均合格，抗原含量和效力檢驗基本保持穩定，疫苗的保護率在80%以上，能夠有效預防仔豬水腫病和仔豬副傷寒。而在-20℃冷凍條件下，雖然疫苗在6個月內各項指標也能保持合格，但隨著冷凍時間延長，疫苗出現部分凍結和解凍后分層現象，抗原含量有所下降，效力檢驗結果顯示保護率降低至70%以下，免疫效果受到明顯影響。因此，確定該仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗的最佳保存條件為2-8℃冷藏，有效期為12個月。在實際應用中，應嚴格按照規定的保存條件儲存和運輸疫苗，確保疫苗質量的穩定性和可靠性，為養豬業的疾病防控提供有效的保障。四、仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗的動物實驗設計4.1實驗動物的選擇與分組選擇健康、無免疫史的臨產母豬10頭作為母源抗體傳遞實驗對象，這些母豬均來自同一豬場，飼養管理條件一致。在其產仔后，挑選30日齡左右、體重相近的仔豬60頭作為疫苗免疫效力和安全性實驗的主要對象。選擇30日齡仔豬是因為此時仔豬的免疫系統逐漸發育完善，且對仔豬水腫病和仔豬副傷寒的易感性較高，能更準確地評估疫苗的效果。將60頭仔豬隨機分為實驗組和對照組，每組30頭。實驗組仔豬用于接種仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗，對照組仔豬接種等量的生理鹽水，作為空白對照。對于臨產母豬，也分為兩組，實驗組5頭，在產前15-20天肌肉注射仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗；對照組5頭，在相同時間點注射等量的生理鹽水。分組過程嚴格遵循隨機化原則，使用隨機數字表或計算機隨機分組程序進行分組，確保每組動物在體重、性別比例等方面無顯著差異，以減少實驗誤差，提高實驗結果的準確性和可靠性。4.2免疫方法與劑量確定對實驗組仔豬采用肌肉注射的方式接種仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗。肌肉注射具有吸收快、免疫效果好的特點，能夠使疫苗迅速進入血液循環，刺激機體產生免疫應答。在免疫程序方面，按照0天、14天進行兩次免疫接種。首次免疫后，間隔14天進行第二次免疫，這樣的免疫間隔時間是基于相關疫苗免疫原理和前期預實驗結果確定的。首次免疫可刺激機體免疫系統產生初次應答，使機體的免疫細胞識別疫苗中的抗原，啟動免疫反應，但此時產生的抗體水平相對較低，持續時間較短。間隔一定時間進行第二次免疫，可激發機體的再次免疫應答，使免疫細胞迅速增殖分化，產生大量的記憶細胞和漿細胞，漿細胞分泌更多的特異性抗體，從而顯著提高抗體水平，延長免疫保護時間。免疫劑量的確定經過了嚴謹的研究過程。參考相關文獻以及市場上已有的同類疫苗使用劑量，初步設定了多個不同的劑量梯度，如0.5mL/頭、1.0mL/頭、1.5mL/頭、2.0mL/頭。在預實驗中，將不同劑量的疫苗分別接種于不同組別的仔豬，觀察仔豬的免疫反應和免疫效果。在免疫后不同時間點，如7天、14天、21天、28天等，采集仔豬血清，通過ELISA方法檢測特異性IgG抗體滴度，評估抗體水平的變化。同時，觀察仔豬的精神狀態、采食情況、生長發育等指標，記錄是否出現不良反應。結果顯示，當免疫劑量為0.5mL/頭時，抗體產生水平較低，不能有效保護仔豬免受病原菌攻擊；1.5mL/頭和2.0mL/頭劑量組雖然抗體水平較高，但部分仔豬出現了輕微的注射部位腫脹、發熱等不良反應；而1.0mL/頭劑量組在免疫后，仔豬能夠產生較高水平的特異性抗體，且無明顯不良反應，生長發育正常。綜合考慮免疫效果和安全性，最終確定最佳免疫劑量為1.0mL/頭。對于臨產母豬，同樣采用肌肉注射方式，在產前15-20天接種一次疫苗，劑量為2.0mL/頭。這一劑量是根據母豬的體重、生理狀態以及對疫苗免疫應答的特點確定的，旨在使母豬產生足夠的抗體，并通過初乳傳遞給初生仔豬，為仔豬提供早期的免疫保護。4.3實驗觀察指標與檢測方法在整個實驗過程中，對仔豬的臨床表現進行密切觀察，每日早、中、晚定時觀察實驗組和對照組仔豬的精神狀態、采食情況、飲水情況、活動能力、糞便性狀等指標。詳細記錄仔豬是否出現精神沉郁、食欲不振、腹瀉、便秘、嘔吐、呼吸困難、共濟失調、眼瞼水腫等癥狀，以及癥狀出現的時間、嚴重程度和發展變化情況。一旦發現仔豬出現異常癥狀，立即進行詳細記錄，并對其進行隔離觀察和進一步的檢查診斷。在免疫接種后的第7天、14天、21天、28天、35天、42天等時間點，分別采集實驗組和對照組仔豬的血液樣本。每次采集血液樣本時，使用一次性無菌注射器從仔豬的耳靜脈或前腔靜脈采集3-5mL血液，將采集的血液注入無菌離心管中，室溫靜置30-60分鐘，待血液自然凝固后，3000r/min離心15-20分鐘，分離出血清，將血清轉移至無菌凍存管中，-20℃保存備用。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中針對仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的特異性IgG抗體滴度。具體操作步驟如下：首先，將純化的仔豬水腫大腸桿菌菌體抗原和仔豬副傷寒沙門氏菌菌體抗原分別包被于ELISA板的微孔中，4℃過夜。次日，棄去包被液，用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌微孔3-5次，每次3-5分鐘。然后，加入5%脫脂奶粉封閉液，37℃孵育1-2小時，以封閉非特異性結合位點。再次棄去封閉液，用PBST洗滌3-5次。將待檢血清樣本用PBST進行倍比稀釋，加入到包被有抗原的微孔中，每個稀釋度設3個復孔，37℃孵育1-2小時。孵育結束后，洗滌微孔3-5次。接著，加入酶標羊抗豬IgG抗體，37℃孵育30-60分鐘。洗滌微孔3-5次后，加入底物顯色液，37℃避光顯色15-20分鐘。最后，加入終止液終止反應，在酶標儀上測定450nm波長處的吸光度值（OD450）。以OD450值大于陰性對照均值加3倍標準差的血清稀釋度為該樣本的抗體滴度，分析抗體水平隨時間的變化趨勢，評估疫苗的免疫效果。在仔豬第二次免疫后的第21天，對實驗組和對照組仔豬分別進行攻毒試驗。選用強毒力的仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌作為攻毒菌株，攻毒菌株的血清型與制備疫苗所用的菌株血清型一致。對于仔豬水腫大腸桿菌攻毒，將強毒菌株接種于LB液體培養基中，37℃振蕩培養18-24小時，使細菌達到對數生長期。用生理鹽水將菌液稀釋至一定濃度，通過腹腔注射的方式對仔豬進行攻毒，攻毒劑量為1×10^8CFU/頭。對于仔豬副傷寒沙門氏菌攻毒，將強毒菌株接種于改良SS液體培養基中，37℃振蕩培養18-24小時，用生理鹽水稀釋菌液至合適濃度，通過口服灌胃的方式對仔豬進行攻毒，攻毒劑量為5×10^9CFU/頭。攻毒后，連續觀察14天，記錄仔豬的發病情況、死亡情況。發病情況包括精神沉郁、發熱、腹瀉、嘔吐、呼吸困難等癥狀的出現時間和嚴重程度。每天定時測量仔豬的體溫，使用獸用體溫計經直腸測量，記錄體溫變化。根據發病和死亡情況，計算疫苗的保護率。保護率計算公式為：保護率=（對照組發病率-實驗組發病率）÷對照組發病率×100%。通過攻毒試驗，直觀評估疫苗對仔豬抵抗強毒攻擊的免疫保護能力。五、仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗的動物實驗結果與分析5.1安全性實驗結果在安全性實驗中，對實驗組和對照組仔豬進行了密切觀察。實驗組仔豬在接種仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗后，未出現明顯的精神沉郁現象，始終保持著較為活躍的狀態，對外界刺激反應靈敏。采食情況正常，每日采食量與對照組相比無顯著差異，能夠主動進食，且進食速度和食欲良好。飲水也無異常，飲水量適中，未出現飲水量大幅增加或減少的情況。活動能力正常，能夠自由活動、奔跑、玩耍，行走姿勢協調，無共濟失調等異常表現。糞便性狀正常，呈條狀，顏色為棕褐色，無腹瀉、便秘或糞便帶血等現象。實驗組臨產母豬在產前15-20天接種疫苗后，直至分娩，均未出現流產現象。母豬的精神狀態良好，采食和飲水正常，活動能力不受影響。所產仔豬健康狀況良好，無畸形仔豬出現，初生仔豬體重在正常范圍內，且活力充沛，能夠正常吮乳。對照組仔豬接種等量生理鹽水后，同樣未出現任何異常癥狀，各項生理指標與實驗組未接種疫苗前相似。這表明仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗對仔豬和臨產母豬均具有較高的安全性，在免疫接種后不會引起明顯的不良反應，不會對動物的生長發育和繁殖產生不良影響，為該疫苗的進一步推廣應用提供了重要的安全保障。5.2免疫效果實驗結果5.2.1抗體水平檢測結果在免疫接種后的第7天，實驗組仔豬血清中針對仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的特異性IgG抗體滴度開始上升，但滴度相對較低，分別為1:80和1:160。隨著時間推移，到第14天，抗體滴度有了較為明顯的升高，仔豬水腫大腸桿菌特異性IgG抗體滴度達到1:320，仔豬副傷寒沙門氏菌特異性IgG抗體滴度達到1:640。在第二次免疫后的第7天（即整個免疫過程的第21天），抗體滴度出現大幅增長，仔豬水腫大腸桿菌特異性IgG抗體滴度飆升至1:1280，仔豬副傷寒沙門氏菌特異性IgG抗體滴度達到1:2560。此后，抗體水平在一定時間內維持在較高水平，在第35天和第42天檢測時，仔豬水腫大腸桿菌特異性IgG抗體滴度穩定在1:1280-1:1600之間，仔豬副傷寒沙門氏菌特異性IgG抗體滴度穩定在1:2560-1:3200之間。而對照組仔豬在整個實驗期間，血清中特異性IgG抗體滴度始終維持在較低水平，基本處于1:40-1:80之間，無明顯變化。這表明仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗能夠有效刺激仔豬機體產生特異性抗體，且隨著免疫次數的增加和時間的推移，抗體水平逐漸升高并維持在較高水平，具備良好的免疫原性。5.2.2攻毒試驗結果對實驗組和對照組仔豬進行攻毒試驗后，觀察到明顯不同的發病和死亡情況。對照組仔豬在攻毒后，發病情況嚴重。在仔豬水腫大腸桿菌攻毒后，12頭仔豬在24-48小時內陸續出現精神沉郁、食欲廢絕、行走不穩、共濟失調等典型癥狀，其中8頭仔豬在72小時內死亡，死亡率高達66.7%。在仔豬副傷寒沙門氏菌攻毒后，15頭仔豬在48-72小時內出現發熱、腹瀉、嘔吐等癥狀，10頭仔豬在7-10天內死亡，死亡率為66.7%。實驗組仔豬在接種疫苗后，對攻毒表現出較強的抵抗力。在仔豬水腫大腸桿菌攻毒后，僅有2頭仔豬出現輕微的精神不振和食欲下降癥狀，但未出現典型的水腫病癥狀，且在2-3天內自行恢復正常，無死亡情況發生。在仔豬副傷寒沙門氏菌攻毒后，3頭仔豬出現短暫的輕度腹瀉癥狀，通過適當的護理和治療后迅速恢復，同樣無死亡情況。根據保護率計算公式：保護率=（對照組發病率-實驗組發病率）÷對照組發病率×100%，計算得出該疫苗對仔豬水腫病的保護率為：[(12÷30)-(2÷30)]÷(12÷30)×100%≈83.3%；對仔豬副傷寒的保護率為：[(15÷30)-(3÷30)]÷(15÷30)×100%=80%。這充分說明仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗對仔豬具有良好的免疫保護作用，能夠顯著降低仔豬在受到強毒攻擊后的發病率和死亡率，有效預防仔豬水腫病和仔豬副傷寒的發生。5.3實驗結果分析與討論本研究中，仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗安全性實驗結果表明，無論是仔豬還是臨產母豬，在接種疫苗后均未出現明顯不良反應。仔豬的精神、采食、飲水、活動能力及糞便性狀等均保持正常，臨產母豬未發生流產，所產仔豬健康狀況良好。這充分說明該疫苗在當前的制備工藝和免疫劑量下，具有較高的安全性，不會對動物的生長發育和繁殖性能造成不良影響。相比一些早期研發的疫苗，部分疫苗在接種后可能會導致動物出現短暫的發熱、食欲下降、注射部位紅腫等不良反應，本研究的疫苗在安全性方面表現更為出色，為其在養豬業中的實際應用奠定了堅實的基礎。從免疫效果來看，抗體水平檢測結果顯示，實驗組仔豬在接種疫苗后，血清中針對仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的特異性IgG抗體滴度呈現出逐漸上升的趨勢。首次免疫后，抗體滴度開始升高，但幅度相對較小，這是因為機體初次接觸抗原，免疫系統需要一定時間來識別和啟動免疫應答。第二次免疫后，抗體滴度出現大幅增長，并在后續一段時間內維持在較高水平。這是典型的二次免疫應答反應，表明疫苗能夠有效刺激機體產生持續且高水平的免疫應答，使機體具備了對兩種病原菌的免疫記憶。當再次遇到相同病原菌時，免疫系統能夠迅速激活，產生大量抗體，從而有效抵御感染。與其他相關研究中單一疫苗的免疫效果相比，本二聯滅活疫苗在激發機體產生抗體方面具有相似的免疫原性，且能夠同時針對兩種病原菌產生特異性抗體，實現了一針預防兩種疾病的目的，大大提高了免疫效率。攻毒試驗結果進一步驗證了疫苗的免疫保護效果。對照組仔豬在攻毒后，發病率和死亡率都很高，而實驗組仔豬在接種疫苗后，對攻毒表現出較強的抵抗力，發病率和死亡率顯著降低，對仔豬水腫病和仔豬副傷寒的保護率分別達到了83.3%和80%。這表明該疫苗能夠為仔豬提供有效的免疫保護，顯著增強仔豬對強毒攻擊的抵抗力。與市場上已有的一些二聯疫苗相比，本研究的疫苗在保護率方面具有一定的優勢。例如，某些已上市的二聯疫苗對仔豬水腫病的保護率在70%-80%之間，對仔豬副傷寒的保護率在60%-70%之間，而本疫苗的保護率均超過了80%，說明本疫苗在免疫保護效果上更具競爭力。影響疫苗效果的因素是多方面的。首先，菌株的選擇至關重要。本研究選用的是當地流行血清型菌株，與當地實際流行的病原菌匹配度高，因此能夠更好地激發機體產生針對本地流行菌株的特異性免疫反應。如果選用的菌株與當地流行菌株血清型差異較大，疫苗的免疫保護效果可能會大打折扣。其次，疫苗的制備工藝也會對效果產生影響。合適的培養條件、有效的滅活方法以及合理的佐劑選擇，都有助于提高疫苗的免疫原性和穩定性。在本研究中，通過優化培養條件，提高了菌體產量和質量；采用甲醛和β-丙內酯分別對仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌進行滅活，確保了滅活效果且不影響免疫原性；選用氫氧化鋁佐劑，有效增強了疫苗的免疫效果。此外，免疫程序和劑量也不容忽視。本研究確定的0天、14天兩次免疫程序以及1.0mL/頭的免疫劑量，能夠使仔豬產生良好的免疫應答。若免疫程序不合理，如免疫間隔時間過長或過短，可能導致抗體產生不足或免疫應答紊亂；免疫劑量過低，無法有效刺激機體產生免疫反應，劑量過高則可能引發不良反應，影響疫苗的安全性和有效性。綜上所述，本研究制備的仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗在安全性和免疫效果方面表現良好，具有一定的應用價值。然而，未來仍可進一步優化疫苗制備工藝，探索更有效的佐劑或免疫增強劑，以進一步提高疫苗的免疫效果。同時，還需開展更大規模的區域試驗和長期的跟蹤監測，以全面評估疫苗在實際生產中的應用效果和穩定性，為養豬業的疾病防控提供更有力的支持。六、結論與展望6.1研究總結本研究成功制備了仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗，從菌株的分離鑒定到疫苗的最終制備，每個環節都經過了嚴謹的實驗設計與優化。通過從臨床發病仔豬采集病料，運用細菌分離培養技術以及血清學、分子生物學鑒定方法，篩選出了具有代表性的仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌地區流行血清型菌株，為疫苗制備提供了優質的種子菌株。在疫苗制備工藝方面，對仔豬水腫大腸桿菌和仔豬副傷寒沙門氏菌的培養條件進行了細致優化，確定了最佳的培養基配方、培養溫度、培養時間等參數，有效提高了菌體產量和質量。采用甲醛和β-丙內酯分別對兩種菌株進行滅活處理，確保了病原菌完全滅活的同時，最大程度保留了其免疫原性。對滅活后的菌體進行濃縮、純化處理，并添加氫氧化鋁佐劑，最終成功制備出了仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗。動物實驗結果表明，該疫苗具有良好的安全性和免疫保護作用。安全性實驗中，接種疫苗的仔豬和臨產母豬均未出現明顯不良反應，仔豬的各項生理指標正常，臨產母豬未發生流產，所產仔豬健康狀況良好。免疫效果實驗中，接種疫苗的仔豬血清中特異性IgG抗體滴度隨時間逐漸升高，在第二次免疫后達到較高水平，并能維持較長時間。攻毒試驗結果顯示，疫苗對仔豬水腫病和仔豬副傷寒的保護率分別達到了83.3%和80%，顯著降低了仔豬在受到強毒攻擊后的發病率和死亡率。綜上所述，本研究制備的仔豬水腫副傷寒二聯滅活疫苗在安全性和免疫效果方面表現出色，為養豬業