第52講基因工程的基本工具和基本操作程序1.闡明DNA重組技術(shù)的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構(gòu)建、目的基因?qū)胧荏w細胞和目的基因及其表達產(chǎn)物的檢測鑒定等步驟。3.實驗：DNA的提取和鑒定。4.實驗：利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟件進行虛擬PCR實驗。考點1重組DNA技術(shù)的基本工具一、基因工程的概念二、重組DNA技術(shù)的基本工具1．限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)1．(選擇性必修3P71“旁欄思考”)存在于原核生物中的限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。2．(選擇性必修3P71“正文”)用兩種不同的限制酶切割目的基因的優(yōu)點是防止質(zhì)粒和目的基因的自我環(huán)化及質(zhì)粒和目的基因的反向連接。2．DNA連接酶E．coliDNA連接酶可連接具有黏性末端的DNA片段，而連接具有平末端的DNA片段的效率要遠遠低于T4DNA連接酶。T4DNA連接酶可連接具有黏性末端的DNA片段，而連接具有平末端的DNA片段的效率要遠遠高于E.coliDNA連接酶。3．載體3．(選擇性必修3P72“旁欄思考”)DNA連接酶和DNA聚合酶的作用不相同，主要區(qū)別在于DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是將單個的脫氧核苷酸連接到脫氧核苷酸鏈上。4．(選擇性必修3P73“正文”)實踐中常用某些病毒載體作為基因工程工具，除具備普通“質(zhì)粒載體”的條件外，還應(yīng)具有的條件是對靶細胞具有較高的轉(zhuǎn)化效率；不能增殖，對細胞無害。限制酶的選擇原則(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類①應(yīng)選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，如圖可選擇PstⅠ。②不能選擇切割位點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，防止破壞目的基因，如圖不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖也可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種限制酶的切割位點，而且這兩種限制酶切割后不會破壞標記基因)。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類(3)根據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶，圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，丙Ti質(zhì)粒宜選取(設(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ)。1．基因工程的原理是基因重組，此種變異是定向的。(√)2．重組DNA技術(shù)的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體。(×)提示：載體是DNA重組技術(shù)所需的工具，不是工具酶。3．DNA連接酶“縫合”目的基因與載體之間的氫鍵。(×)提示：DNA連接酶將兩個DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。4．大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成。(√)5．作載體的質(zhì)粒都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。(√)CRISPR—Cas9基因組編輯系統(tǒng)由向?qū)NA(也叫SgRNA)和Cas9蛋白組成，向?qū)NA識別并結(jié)合靶基因DNA，Cas9蛋白切斷雙鏈DNA形成兩個末端。這兩個末端通過“斷裂修復(fù)”重新連接時通常會有個別堿基對的插入或缺失，從而實現(xiàn)基因敲除，原理如圖所示。CRISPR－Cas9基因組編輯技術(shù)有時存在編輯出錯而造成脫靶，脫靶最可能原因是其他DNA序列也含有與向?qū)NA(SgRNA)互補配對的序列，造成向?qū)NA(SgRNA)錯誤結(jié)合DNA序列而脫靶，而且SgRNA的序列越短，脫靶率會越高。基因工程工具酶的應(yīng)用1．下圖1表示某DNA片段及限制酶酶切位點，用限制酶XhoⅠ和SalⅠ分別處理該DNA片段后，酶切產(chǎn)物電泳分離的結(jié)果如圖2所示。下列敘述錯誤的是()A．不同的限制酶切割DNA后形成的黏性末端可能相同B．限制酶XhoⅠ與限制酶SalⅠ識別的核苷酸序列不同C．泳道①②分別是限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ處理得到的產(chǎn)物D．用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同時處理該DNA片段，可得到6種電泳產(chǎn)物C[不同的限制酶識別的序列不同，但可能會產(chǎn)生相同的黏性末端，A正確；結(jié)合圖1和圖2可知，限制酶XhoⅠ與限制酶SalⅠ識別的核苷酸序列不同，B正確；由題圖分析可知，泳道①②分別是限制酶SalⅠ和限制酶XhoⅠ處理得到的產(chǎn)物，C錯誤；用限制酶XhoⅠ和限制酶SalⅠ同時處理該DNA片段，該片段共有5個酶切位點，可得到6種電泳產(chǎn)物，D正確。]2．(2025·廣東深圳模擬)下表列舉了幾種限制酶的識別序列及其切割位點(箭頭表示相關(guān)酶的切割位點)。下列有關(guān)說法正確的是()限制酶AluⅠBamHⅠSmaⅠSau3AⅠ識別序列及切割位點A．BamHⅠ切割的是氫鍵，AluⅠ切割的是磷酸二酯鍵B．能被BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ識別和切割C．限制酶AluⅠ和SmaⅠ切割產(chǎn)生的末端屬于黏性末端D．上述限制酶切割產(chǎn)生的任意末端均可被T4DNA連接酶連接B[BamHⅠ和AluⅠ切割的都是磷酸二酯鍵，A錯誤；BamHⅠ的識別序列是-GGATCC-，Sau3AⅠ的識別序列是GATC，前者的識別序列比后者長，且包括后者的識別序列，所以能被BamHⅠ切割的序列也能被Sau3AⅠ識別和切割，B正確；限制酶AluⅠ和SmaⅠ切割產(chǎn)生的末端屬于平末端，C錯誤；T4DNA連接酶既可以連接具有黏性末端的DNA片段，又可以連接具有平末端的DNA片段，只是連接平末端的效率相對較低，但不是任意末端都可被T4DNA連接酶連接，如AluⅠ產(chǎn)生的末端和BamHⅠ產(chǎn)生的末端，不可被T4DNA連接酶連接，D錯誤。]基因工程載體的應(yīng)用3．表面展示技術(shù)是通過重組DNA技術(shù)，將外源蛋白與細胞表面的蛋白質(zhì)組裝成融合蛋白，從而可展示在細胞表面。回答下列問題。(1)若要將芽孢表面蛋白基因cotB與外源的綠色熒光蛋白基因gfp構(gòu)建成基因表達載體，下圖中最適合通過綠色熒光(綠色熒光蛋白在紫外光下會產(chǎn)生綠色熒光)確定融合蛋白成功表達的是。ABCD注：AmpR為氨芐青霉素抗性基因；→表示轉(zhuǎn)錄方向；UAG，UAA，UGA是終止密碼子，AUG是起始密碼子。(2)芽孢表面蛋白是實現(xiàn)表面展示技術(shù)的關(guān)鍵蛋白，結(jié)合上述材料，試分析該蛋白在表面展示技術(shù)中的作用是_______________________________________________________________________________________________________________。(3)導(dǎo)入基因表達載體后的芽孢桿菌接種在含有________的固體培養(yǎng)基上，以獲得攜帶載體的單菌落，該過程被稱為微生物的________培養(yǎng)。(4)培養(yǎng)基中可能既有含基因表達載體的單菌落，也有含________的單菌落，因此還需要對DNA進行提取，常用酒精初步分離DNA和蛋白質(zhì)，這里酒精的作用原理是_________________________________________________________。(5)若要確定表面展示技術(shù)在芽孢桿菌上構(gòu)建成功，應(yīng)在紫外光環(huán)境下對其進行水平的檢測。解析：(1)若要將芽孢表面蛋白基因cotB與外源的綠色熒光蛋白基因gfp構(gòu)建成基因表達載體，則需要將cotB和gfp一起表達，即使用一個啟動子和終止子，并且cotB在前，gfp在后，才能通過綠色熒光(綠色熒光蛋白在紫外光下會產(chǎn)生綠色熒光)確定融合蛋白成功表達，為了能夠順利表達gfp，則中間不能出現(xiàn)終止密碼子，轉(zhuǎn)錄時模板鏈的方向應(yīng)是3′到5′，D中mRNA中間會出現(xiàn)終止密碼子，只有C符合題意。(2)蛋白在表面展示技術(shù)中的作用是芽孢表面蛋白是可以定位在細胞表面的，在與外源蛋白形成融合蛋白后，可將外源蛋白展示(定位在芽孢桿菌表面)。(3)由于表達載體中含有AmpR基因，若轉(zhuǎn)基因成功，該芽孢桿菌能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長。該過程被稱為微生物的選擇培養(yǎng)。(4)培養(yǎng)基中可能既有含基因表達載體的單菌落，也有含空載體(不含目的基因的載體)的單菌落，因此還需要對DNA進行提取，然后進行鑒定，由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，所以可以用酒精初步分離DNA和蛋白質(zhì)。(5)由于綠色熒光蛋白在紫外光下會產(chǎn)生綠色熒光，所以可在紫外光環(huán)境下對芽孢桿菌進行個體(細胞)水平進行檢測。答案：(1)C(2)芽孢表面蛋白是可以定位在細胞表面的，在與外源蛋白形成融合蛋白后，可將外源蛋白展示(定位在芽孢桿菌表面)(3)氨芐青霉素(Amp)選擇(4)空載體DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精(5)個體(細胞)考點2基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲取1．篩選合適的目的基因(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因。主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。(2)篩選目的基因的方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。2．利用PCR獲取和擴增目的基因(1)原理：DNA半保留復(fù)制。(2)條件：DNA模板、2種引物、耐高溫的DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸。(3)PCR反應(yīng)過程(4)PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。1．(選擇性必修3P78“圖3-5”)PCR反應(yīng)體系中需要同時加入兩種引物的原因是DNA聚合酶只能從引物的3′二、基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心1．構(gòu)建基因表達載體的目的(1)使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。(2)使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2．基因表達載體的組成3．基因表達載體的構(gòu)建過程三、將目的基因?qū)胧荏w細胞四、目的基因的檢測與鑒定2．(選擇性必修3P82“正文”)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉培育過程中，檢測目的基因是否成功表達的常見方法有抗原—抗體雜交、采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲。(1)目的基因的獲取方法①利用PCR獲取和擴增目的基因。②人工合成目的基因a．逆轉(zhuǎn)錄法：主要用于相對分子質(zhì)量較大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA為模板，借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成雙鏈DNA，其過程如下：eq\x(目的基因的mRNA)eq\o(→,\s\up7(逆轉(zhuǎn)錄))eq\x(\a\al(雙鏈DNA,目的基因))b．化學合成法：依據(jù)某一蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出其基因序列，然后直接合成目的基因，其過程如下：③從基因文庫中獲取目的基因根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如：根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。(2)基因表達載體中啟動子、終止子的來源①如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，目的基因中已含有啟動子、終止子，在構(gòu)建基因表達載體時，不需要在質(zhì)粒上接上特定的啟動子、終止子。②如果目的基因是通過逆轉(zhuǎn)錄或人工方法合成的，則目的基因中不含啟動子和終止子。因此，構(gòu)建基因表達載體時，在目的基因與質(zhì)粒結(jié)合之前，需要在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。1．目的基因主要指編碼蛋白質(zhì)的基因。(√)2．Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因。(√)3．DNA復(fù)制的引物使DNA聚合酶能夠從引物的5′端開始連接脫氧核苷酸。(×)提示：DNA復(fù)制的引物使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。4．PCR擴增完成后，常用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。(√)5．隨著轉(zhuǎn)化方法的研究，農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。(√)6．檢測目的基因是否表達可用抗原—抗體雜交技術(shù)。(√)1．設(shè)計引物是PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵步驟之一。下圖為某同學設(shè)計的兩組引物(只標注了部分堿基序列)，請判斷是否合理并說明理由。(1)第1組：不合理，引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效；(2)第2組：不合理，引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效。2．URA3基因位于酵母菌5號染色體上，編碼的酶參與酵母菌尿嘧啶核苷酸的合成。科研人員利用基因工程敲除酵母菌中的URA3基因，以獲得尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型酵母菌。從獲得的轉(zhuǎn)基因酵母菌中篩選出了多株尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型酵母菌，現(xiàn)需驗證這些菌株是因URA3基因缺失而導(dǎo)致的。選擇實驗材料寫出實驗設(shè)計思路。實驗材料：轉(zhuǎn)基因酵母菌、完全培養(yǎng)基、尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基、含URA3基因的重組質(zhì)粒、不含URA3基因的空質(zhì)粒。實驗設(shè)計思路：將轉(zhuǎn)基因酵母菌隨機分為兩組，一組導(dǎo)入含有URA3基因的重組質(zhì)粒，一組導(dǎo)入不含URA3基因的空質(zhì)粒，再將兩組酵母菌接種到尿嘧啶缺陷型培養(yǎng)基，觀察生長狀況。PCR技術(shù)及應(yīng)用1．β-丙氨酸作為重要的中間體，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等領(lǐng)域。L-天冬氨酸-α-脫羧酶(PanD)能夠催化β-丙氨酸的生成，但天然PanD活力(酶活力是指酶催化一定化學反應(yīng)的能力)較低且易失活。研究人員運用蛋白質(zhì)工程對酶基因進行分子改造，在未知PanD三維結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的情況下，通過易錯PCR技術(shù)引入隨機突變，再進行定向篩選，最終獲得活力和穩(wěn)定性均較高的PanD。回答下列問題：(1)易錯PCR與普通PCR相似，每次循環(huán)也包括了__________________三步，但可通過改變PCR反應(yīng)條件來提高堿基錯配的概率。在PCR反應(yīng)體系中，Mg2＋可以提高已發(fā)生錯配區(qū)域的穩(wěn)定性，Mn2＋可以降低DNA聚合酶對底物的專一性。因此，與普通PCR相比，易錯PCR的反應(yīng)體系中應(yīng)適當__________(填“提高”或“降低”)Mg2＋濃度、__________(填“提高”或“降低”)Mn2＋濃度。通過多輪的易錯PCR及篩選，可以獲取所需的PanD基因。(2)研究人員對比改造前后的兩種PanD，發(fā)現(xiàn)改造后的PanD的第305位氨基酸由賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸，推測突變后酶活力升高的原因是_____________________________________________________________________________________。(3)為將能表達高活力PanD的大腸桿菌應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)β-丙氨酸，研究人員還探究了發(fā)酵的最佳反應(yīng)條件，研究中發(fā)現(xiàn)了隨著底物濃度升高，β-丙氨酸產(chǎn)量下降的現(xiàn)象，推測其原因可能是___________________________________________________________________________________________________________。因此在工業(yè)生產(chǎn)中，要采用_________________(填“一次足量添加”或“多次分批補料”)的投料策略。解析：(1)易錯PCR與普通PCR相似，每次循環(huán)也包括了變性、復(fù)性、延伸三步。PCR技術(shù)是指通過DNA的雙鏈復(fù)制，在耐高溫的DNA聚合酶的催化下，遵循堿基互補配對原則，擴增DNA片段。耐高溫的DNA聚合酶負責將堿基與模板鏈正確的互補配對，Mn2＋可以降低DNA聚合酶對底物的專一性，也就是說Mn2＋能提高堿基與模板鏈的錯配的概率，增大突變率；非互補的堿基對由于氫鍵不易形成，穩(wěn)定性差，Mg2＋可以提高已發(fā)生錯配區(qū)域的穩(wěn)定性，因此與普通PCR相比，易錯PCR的反應(yīng)體系中應(yīng)適當提高Mg2＋濃度和Mn2＋濃度。(2)組成PanD的第305位氨基酸由賴氨酸突變?yōu)榻z氨酸后，由于該酶的氨基酸種類改變，導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，結(jié)構(gòu)決定功能，進而使酶活力升高。(3)將能表達高活力PanD的大腸桿菌應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)β-丙氨酸，隨著底物濃度升高，發(fā)酵液濃度增加，進而使大腸桿菌失水較多，甚至死亡，不能高效地表達高活力PanD，為了維持發(fā)酵液的濃度，在工業(yè)生產(chǎn)中，要采用多次分批補料的投料策略。答案：(1)變性、復(fù)性、延伸提高提高(2)組成PanD的氨基酸種類改變，導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進而使酶活力升高(3)隨著底物濃度升高，發(fā)酵液濃度增加，進而使大腸桿菌失水較多，甚至死亡，不能高效地表達高活力PanD多次分批補料基因工程的基本操作程序2．(2025·廣東汕頭模擬)科研人員利用細胞工程和基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗狂犬病毒抗體，基本流程如圖所示。下列敘述錯誤的是()A．過程③是獲得轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的核心工作B．細胞A為已免疫B淋巴細胞并且可以從小鼠的脾中獲取C．檢測V1基因在大腸桿菌體內(nèi)是否成功表達可采用抗原—抗體雜交法D．從大腸桿菌的培養(yǎng)液中提取的抗體可直接制成用于注射的藥劑進行臨床使用D[過程③表示基因表達載體的構(gòu)建，是獲得轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的核心工作，A正確；分析題圖可知，細胞A是從已免疫的小鼠體內(nèi)分離得到的，是已免疫的B淋巴細胞，可以從小鼠的脾中獲取，B正確；要檢測V1基因是否表達成功，需要從大腸桿菌細胞中提取有關(guān)蛋白質(zhì)，用抗原—抗體雜交的方法來檢測，C正確；大腸桿菌產(chǎn)生的抗體沒有經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的加工，故從大腸桿菌細胞內(nèi)提取的抗體可能沒有生物活性，不可直接制成用于注射的藥劑進行臨床使用，D錯誤。]3．(2023·廣東卷)種子大小是作物重要的產(chǎn)量性狀。研究者對野生型擬南芥(2n＝10)進行誘變篩選到一株種子增大的突變體。通過遺傳分析和測序，發(fā)現(xiàn)野生型DAI基因發(fā)生一個堿基G到A的替換，突變后的基因為隱性基因，據(jù)此推測突變體的表型與其有關(guān)，開展相關(guān)實驗。回答下列問題：(1)擬采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與____________植株的種子大小相近。(2)用PCR反應(yīng)擴增DAI基因，用限制性內(nèi)切核酸酶對PCR產(chǎn)物和________進行切割，用DNA連接酶將兩者連接。為確保插入的DAI基因可以正常表達，其上下游序列需具備________________。(3)轉(zhuǎn)化后，T-DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換)可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點。在插入片段均遵循基因分離及自由組合定律的前提下，選出單一位點插入的植株，并進一步獲得目的基因穩(wěn)定遺傳的植株(如圖)，用于后續(xù)驗證突變基因與表型的關(guān)系。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T0代植株并自交，將T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基上，能夠萌發(fā)并生長的陽性個體即表示其基因組中插入了________________________。②T1代陽性植株自交所得的T2代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，選擇陽性率約________%的培養(yǎng)基中的幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③將②中選出的T2代陽性植株________(填“自交”“與野生型雜交”或“與突變體雜交”)所得的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基，陽性率達到________%的培養(yǎng)基中的幼苗即為目標轉(zhuǎn)基因植株。為便于在后續(xù)研究中檢測該突變，研究者利用PCR擴增野生型和突變型基因片段，再使用限制性內(nèi)切核酸酶X切割產(chǎn)物，通過核酸電泳即可進行突變檢測，相關(guān)信息見下，在電泳圖中將酶切結(jié)果對應(yīng)位置的條帶涂黑。解析：(1)根據(jù)題干信息可知，突變后的基因為隱性基因，則野生型DAI基因為顯性基因，因此采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將野生型DAI基因轉(zhuǎn)入突變體植株，若突變體表型確由該突變造成，則轉(zhuǎn)基因植株的種子大小應(yīng)與野生型植株的種子大小相近。(2)利用PCR技術(shù)擴增DAI基因后，應(yīng)該用同種限制性內(nèi)切核酸酶對DAI基因和載體進行切割，再用DNA連接酶將兩者連接起來；在基因表達載體中，啟動子位于目的基因的首端，終止子位于目的基因的尾端，因此為確保插入的DAI基因可以正常表達，其上下游序列需具備啟動子和終止子。(3)①根據(jù)題干信息和圖形分析，將T0代植株的花序浸沒在農(nóng)桿菌(T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)液中轉(zhuǎn)化，再將獲得的T1代種子播種在選擇培養(yǎng)基(含有卡那霉素)上，若在選擇培養(yǎng)基上有能夠萌發(fā)并生長的陽性個體，則說明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因組中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代陽性植株都含有DAI基因，由于T-DNA(其內(nèi)部基因在減數(shù)分裂時不發(fā)生交換)可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點，所以不確定是單一位點插入還是多位點插入，若是單一位點插入，相當于一對等位基因的雜合子，其自交后代應(yīng)該出現(xiàn)3∶1的性狀分離比，而題干要求選出單一位點插入的植株，因此應(yīng)該選擇陽性率約75%的培養(yǎng)基中的幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。③將以上獲得的T2代陽性植株自交，再將得到的T3代種子按單株收種并播種于選擇培養(yǎng)基上，若某培養(yǎng)基上全部為具有卡那霉素抗性的植株，即陽性率達到100%，則該培養(yǎng)基中的幼苗即為目標轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)圖形分析，野生型和突變型基因片段的長度都是150bp，野生型的基因沒有限制酶X的切割位點，而突變型的基因有限制酶X的切割位點，結(jié)合題圖中的數(shù)據(jù)分析可知，經(jīng)限制酶X切割后，野生型只有長度為150bp的基因片段，突變型有長度為50bp和100bp的基因片段，電泳圖如答案所示。答案：(1)野生型(2)載體(基因表達載體)啟動子和終止子(3)①DAI基因和卡那霉素抗性基因②75③自交1004．科研人員構(gòu)建了可表達J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進行了檢測，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。(1)與圖甲中啟動子結(jié)合的酶是________。除圖甲中標出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有________________________(答出2個結(jié)構(gòu)即可)。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物________。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的______(填“a鏈”或“b鏈”)相應(yīng)部分的序列相同。(3)重組質(zhì)粒在受體細胞內(nèi)正確表達后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測相應(yīng)蛋白是否表達以及表達水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細胞內(nèi)表達了______________，條帶2所檢出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重組質(zhì)粒上的J基因表達的。解析：(1)基因表達載體的構(gòu)建中啟動子是為了啟動下游基因的“表達”，表達首先需要轉(zhuǎn)錄，因此RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位才是轉(zhuǎn)錄的起始。作為載體必須具備的條件：要具有限制酶的切割位點；要有標記基因(如抗性基因)，以便于重組后重組質(zhì)粒的篩選；能在宿主細胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制；是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來，圖中甲有啟動子和終止子等，因此質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有限制酶的切割位點、標記基因、復(fù)制原點等。(2)用PCR擴增分析法確定重組質(zhì)粒中目的基因插入方向是否正確時，常設(shè)計一對引物，一個引物與目的基因序列互補，另一個引物與質(zhì)粒序列互補，兩引物延伸方向相反，以擴增出兩引物間的序列，若插入方向正確，則可擴增出相應(yīng)序列，反之，則不能擴增出相應(yīng)序列，故選用的引物應(yīng)為F2、R1或F1、R2，若選用引物F1、R1，不論目的基因插入方向是否正確，都可擴增出目的基因序列。因為J基因的b鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈，啟動子在左側(cè)，所以轉(zhuǎn)錄方向為從左到右，由于轉(zhuǎn)錄沿模板鏈3′到5′端方向合成RNA，所以J基因b鏈左側(cè)為3′端，引物要與DNA的3′端互補配對，所以F1與b鏈互補，a鏈也與b鏈互補，由此推知引物F1與a鏈相應(yīng)部分序列相同。(3)抗J蛋白抗體和抗V5抗體均能檢測到條帶1，說明條帶1為J-V5融合蛋白，條帶2僅能由抗J蛋白抗體檢測到，說明該蛋白僅含J蛋白，不含V5標簽，故條帶2檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達的。答案：(1)RNA聚合酶限制酶的切割位點、標記基因、復(fù)制原點等(2)F2和R1(或F1和R2)a鏈(3)J-V5融合蛋白不是考點3(探究·實踐)DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增及電泳鑒定一、DNA的粗提取與鑒定1．實驗原理2．實驗步驟二、DNA片段的擴增及電泳鑒定1．實驗基礎(chǔ)(1)PCR原理：利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。(2)電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。(3)PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。2．實驗步驟(1)DNA片段的擴增(2)DNA片段的電泳鑒定①根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量分數(shù)為0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。②將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。③待凝膠溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。④將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。⑤將擴增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。⑥接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。⑦取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。1．DNA粗提取中的注意事項(1)本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作實驗材料，原因是哺乳動物成熟的紅細胞無細胞核(無DNA)。可選用雞血細胞作材料。(2)加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。(3)二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會影響鑒定的效果。(4)提取植物細胞的DNA時，加入的洗滌劑能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放；加入食鹽(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。(5)在DNA進一步提純時，選用冷卻的體積分數(shù)為95%的酒精溶液的作用是溶解雜質(zhì)和析出DNA。2．DNA片段的擴增及電泳鑒定的注意事項(1)為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。(2)緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在－20℃(3)在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。(4)在進行操作時，一定戴好一次性手套。1．不同生物的DNA的提取方法有所不同，DNA提取的原理和實驗流程大致相同(如圖所示)。下列說法錯誤的是()A．破碎細胞在冷凍條件下進行，可將組織材料凍裂和降低DNA酶的活性B．溶于酒精中的可能有某些鹽類、蛋白質(zhì)、糖類或其他大分子物質(zhì)C．DNA粗提取時離心需使用塑料離心管，用二苯胺試劑對離心結(jié)果進行鑒定D．鑒定絮狀物中DNA時，需用2mol·L－1NaCl溶液溶解DNA后加入二苯胺試劑直接觀察D[破碎細胞在冷凍條件下進行，可將組織材料凍裂，方便研磨，低溫可以降低DNA酶的活性，防止DNA被降解，A正確；DNA不溶于酒精，但細胞中的某些物質(zhì)卻可以溶于酒精，據(jù)此推測，溶于酒精中的可能有某些鹽類、蛋白質(zhì)、糖類或其他大分子物質(zhì)，B正確；DNA容易吸附在玻璃表面，使用塑料離心管可減少提取過程中DNA的損失，用二苯胺試劑對離心結(jié)果進行鑒定，C正確；鑒定絮狀物中DNA時，需用2mol·L－1NaCl溶液溶解DNA，向溶液中加入二苯胺試劑后，需要置于沸水中加熱，D錯誤。]2．(2023·廣東卷)“DNA粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是()A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C．沉淀：可反復(fù)多次以提高DNA的純度D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍色D[裂解是在材料中加研磨液后充分研磨，使細胞破裂，釋放出DNA等物質(zhì)，A正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等與DNA分離，B正確；DNA不溶于酒精，而某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可以反復(fù)多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA純度，C正確；將DNA溶解于NaCl，加入二苯胺試劑，沸水浴5min，待冷卻后，能呈現(xiàn)藍色，D錯誤。]3．由于某目的基因酶切后的末端為平末端，載體E只有產(chǎn)生黏性末端的酶切位點，需借助中間載體P將目的基因接入載體E。據(jù)圖分析，下列敘述正確的是()A．通過PCR擴增獲取目的基因是基因工程的核心工作B．為了便于該目的基因接入載體E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割載體PC．載體P只能作為中間載體，是因為其沒有表達該目的基因的啟動子與終止子D．若受體細胞表現(xiàn)出抗性基因的相應(yīng)性狀，表明重組載體成功導(dǎo)入受體細胞C[基因工程的核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建，不是通過PCR擴增獲取目的基因，A錯誤；由于載體E只有產(chǎn)生黏性末端的酶切位點，要使中間載體P接入載體E，同時防止載體E自身環(huán)化，需要用兩種限制酶分別切割載體E和中間載體P，據(jù)圖可知，中間載體P和載體E均含有XhoⅠ和PstⅠ酶識別序列，故可選用XhoⅠ和PstⅠ酶進行酶切，載體P的這兩種酶識別序列中含有EcoRV識別位點，并且其切割的為平末端，可以用于連接目的基因，SmaⅠ酶雖然也能切割得到平末端，但是其識別位點沒有位于XhoⅠ和PstⅠ酶識別位點之間，故不能選擇其對中間載體P進行切割，B錯誤；由圖可知，載體P是中間載體，不含有表達目的基因的啟動子和終止子，C正確；受體細胞表現(xiàn)出抗性基因的相應(yīng)性狀，可能是導(dǎo)入了重組質(zhì)粒，也可能只導(dǎo)入了空質(zhì)粒(不含目的基因的質(zhì)粒)，D錯誤。]課時分層作業(yè)(五十二)1．(2025·廣東茂名模擬)用PCR檢測某轉(zhuǎn)基因植株是否導(dǎo)入目的基因時，電泳鑒定時發(fā)現(xiàn)擴增出多條條帶，其原因最可能是()A．引物長度過短B．引物之間發(fā)生配對C．體系中Mg2＋濃度過低D．電泳時凝膠濃度過高A[引物長度過短可能會導(dǎo)致特異性降低，從而結(jié)合到非目的基因的區(qū)域進行擴增，出現(xiàn)多條條帶，A正確；如果引物之間發(fā)生配對，則引物與模板DNA結(jié)合比例降低，從而影響PCR反應(yīng)的效率，B錯誤；體系中Mg2＋濃度過低會影響DNA聚合酶的活性，可能導(dǎo)致擴增效率降低甚至擴增失敗，C錯誤；電泳時凝膠濃度過高主要影響的是DNA條帶的遷移速度，而不是導(dǎo)致出現(xiàn)多條條帶的原因，D錯誤。]2．OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四個基因分別編碼四種不同的酶，研究人員將這些基因分別與葉綠體轉(zhuǎn)運肽(引導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)進入葉綠體)基因連接，構(gòu)建多基因表達載體(載體中部分序列如下圖所示)，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化水稻，在水稻葉綠體內(nèi)構(gòu)建了一條新代謝途徑，提高了水稻的產(chǎn)量。下列敘述錯誤的是()A．四個基因轉(zhuǎn)錄時不是都以DNA的同一條單鏈為模板B．四個基因都在水稻葉綠體內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄翻譯C．應(yīng)選用含潮霉素的培養(yǎng)基可篩選被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的水稻細胞D．可用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測四種酶在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達情況B[基因的啟動子方向有不同，說明轉(zhuǎn)錄時不是都以DNA的同一條單鏈為模板，A正確；這些基因在葉綠體外合成蛋白質(zhì)，由葉綠體轉(zhuǎn)運肽引導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)進入葉綠體，B錯誤；卡那霉素抗性基因不在T-DNA上，應(yīng)選用潮霉素培養(yǎng)基篩選被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的水稻細胞，C正確；用抗原—抗體雜交技術(shù)檢測是否有相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，從而檢測四種酶在轉(zhuǎn)基因水稻中的表達情況，D正確。]3．溫和噬菌體侵染細菌后，將其基因組整合到細菌的基因組中，當細菌分裂產(chǎn)生子代細菌時，其子代DNA中都帶有整合的噬菌體基因組，這會使細菌不會因噬菌體感染而裂解，此現(xiàn)象稱為細菌的溶源化。下列說法錯誤的是()A．細菌溶源化過程中發(fā)生了基因重組B．溫和噬菌體可以用作基因工程的載體C．子代細菌中噬菌體基因的遺傳遵循分離定律D．可通過檢測子代細菌的DNA探究是否發(fā)生溶源化現(xiàn)象C[細菌溶源化過程中發(fā)生了噬菌體基因和細菌基因的重組，A正確；溫和噬菌體可以將遺傳物質(zhì)注入細菌，并且將遺傳物質(zhì)整合到細菌細胞內(nèi)，所以可以作為基因工程的載體，B正確；分離定律適用于進行有性生殖的真核生物的細胞核遺傳，子代細菌中噬菌體基因的遺傳不遵循分離定律，C錯誤；發(fā)生溶源化的細菌細胞內(nèi)含有噬菌體和細菌的遺傳物質(zhì)，所以通過檢測子代細菌DNA可以證明是否發(fā)生溶源化現(xiàn)象，D正確。]4．PCR引物的3′端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基，5′端無嚴格限制，可用于添加限制酶切點等序列。下列敘述正確的是()A．該圖表示PCR循環(huán)中的變性環(huán)節(jié)B．引物的長度、引物中堿基的比例以及反應(yīng)體系中引物的濃度都與擴增產(chǎn)物的特異性相關(guān)C．脫氧核苷酸作為擴增的原料會依次連接到5′端D．用圖中引物擴增兩個循環(huán)后可獲得目的產(chǎn)物B[該圖表示PCR循環(huán)中的復(fù)性環(huán)節(jié)，A錯誤；引物的長度、引物中堿基的比例以及反應(yīng)體系中引物的濃度都與擴增產(chǎn)物的特異性相關(guān)，B正確；脫氧核苷酸作為擴增的原料會依次連接到3′端，C錯誤；用圖中引物擴增至少三個循環(huán)后可獲得目的產(chǎn)物，D錯誤。]5．(2025·廣東珠海模擬)兩個核酸片段在適宜條件下，經(jīng)過X酶的催化作用，發(fā)生下圖變化。下列相關(guān)敘述正確的是()A．X酶是DNA聚合酶B．X酶可以從大腸桿菌中分離得到C．X酶能催化氫鍵的形成D．X酶催化游離的核苷酸合成DNA單鏈B[分析題圖可知，X酶能將DNA片段連接起來，是DNA連接酶，A錯誤；分析題圖可知，X酶是DNA連接酶，能連接黏性末端，可以從大腸桿菌中分離得到，B正確；X酶是DNA連接酶，能催化磷酸二酯鍵的形成，C錯誤；X酶是DNA連接酶，催化游離的核苷酸合成DNA單鏈的酶為DNA聚合酶，D錯誤。]6．采用CTAB法可獲得高純度的DNA，CTAB是陽離子去污劑，可溶解細胞膜，與核酸形成復(fù)合物，溶于乙醇。具體步驟：將植物葉片研磨成粉末，加入CTAB提取液(含CTAB、2mol/LNaCl)，離心后，取上清液；上清液中加入氯仿、異戊醇混合液，充分混勻，離心取上清液，加入異丙醇于－20℃A．CTAB-核酸復(fù)合物溶于高鹽溶液中，可通過加乙醇使核酸沉淀并去除CTABB．推測氯仿和異戊醇抽提可除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，異丙醇或乙醇可將DNA沉淀分離C．CTAB可通過加速解聚核蛋白用于提取葉綠體DNA和質(zhì)粒DNAD．提取的DNA可在一定溫度下利用二苯胺溶液鑒定C[由題干可知，CTAB-核酸復(fù)合物溶于2mol/LNaCl溶液即高鹽溶液中，DNA不溶于乙醇，因此可通過加乙醇使核酸沉淀并去除CTAB，A正確。由題干“上清液中加入氯仿、異戊醇混合液”可知，氯仿和異戊醇抽提可除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)；由題干“充分混勻，離心取上清液，加入異丙醇于－20℃沉淀，再用RNA酶、95%的乙醇沉淀DNA”7．我國科學家屠呦呦因發(fā)現(xiàn)青蒿素而獲得諾貝爾獎。青蒿細胞中青蒿素的合成途徑如下圖實線方框內(nèi)所示，酵母細胞也能夠產(chǎn)生合成青蒿酸的中間產(chǎn)物FPP(如虛線方框內(nèi)所示)。科學家向酵母菌導(dǎo)入相關(guān)基因培育產(chǎn)青蒿素酵母菌。下列敘述正確的是()A．過程①需要逆轉(zhuǎn)錄酶催化B．培育產(chǎn)青蒿素酵母菌，必須導(dǎo)入FPP合成酶基因和ADS酶基因C．由于ERG9酶等的影響，培育的產(chǎn)青蒿素酵母菌合成的青蒿素仍可能很少D．在野生植物中提取青蒿素治療瘧疾，體現(xiàn)了生物多樣性的間接價值C[過程①是FPP合成酶基因轉(zhuǎn)錄形成mRNA，需要RNA聚合酶，A錯誤；由圖可知，酵母細胞能合成FPP合成酶，但不能合成ADS酶和CYP71AV1酶，即酵母細胞缺乏ADS酶基因和CYP71AV1酶基因。因此，要培育能產(chǎn)生青蒿素的酵母細胞，需要向酵母細胞中導(dǎo)入ADS酶基因、CYP71AV1酶基因，B錯誤；由圖示可知，F(xiàn)PP轉(zhuǎn)化成固醇需要ERG9酶催化，故由于ERG9酶等的影響，培育的產(chǎn)青蒿素酵母菌合成的青蒿素仍可能很少，C正確；在野生植物中提取青蒿素治療瘧疾，體現(xiàn)了生物多樣性的直接價值，D錯誤。]8．研究發(fā)現(xiàn)，MZF1-AS1是一種長鏈非編碼RNA，可以和核蛋白PARP1結(jié)合參與基因的調(diào)控，從而促進腫瘤細胞的增殖。科研人員通過PCR技術(shù)得到PARP1基因全長序列(圖1)，其編碼的蛋白質(zhì)含1014個氨基酸，三個功能區(qū)(圖2)，圖中數(shù)字代表氨基酸對應(yīng)的位置；構(gòu)建含GST標簽的重組載體以獲得不同長度的融合蛋白。(1)欲PCR擴增PARP1基因的編碼區(qū)，需設(shè)計一對引物F1和R1，在圖1中選出兩引物與模板結(jié)合的位置________(填圖中序號)，PCR反應(yīng)體系中需要加________酶，PCR產(chǎn)物一般通過____________________法鑒定。(2)為了得到GST-PARP1融合蛋白，需構(gòu)建不同長度的帶有GST標簽序列的PARP1基因表達載體，GST序列尾端不能含有________________________的序列(不考慮移碼突變)；純化得到6種融合蛋白，分別與體外轉(zhuǎn)錄得到的生物素標記的MZF1-AS1進行體外結(jié)合實驗，形成RNA—蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物可通過一定技術(shù)分離出來，將分離純化獲得的結(jié)合在復(fù)合物上的RNA，經(jīng)RT-PCR后鑒定結(jié)果如圖3所示，據(jù)圖可知__________________