蛋白純化之微生物細胞破碎技術

為了能有效地破碎細胞，并盡可能減少產物的破壞，已發展了多種細胞破碎

的方法，通?？煞譃闄C械法和非機械法兩類。

一、機械法

常用的機械破碎方法是基于液相或固相剪切力，這些剪切力可以在高壓勾漿

器或機械驅動的破碎機如膠質磨、珠磨等設備中獲得。在高壓勻漿器中，進入高

壓室中的細胞懸浮液被強迫通過一個狹窄的小孔，由于產生液相剪切力引起細胞

破碎。在機械驅動的破碎機中，剪切力是由細胞與設備中的固體表面間的相互作

用產生的，這種剪切力場之間的相互作用較復雜，目前了解得還不夠深入，工程

設計大多數靠經驗。

1、高壓勻漿器：高壓漿器是用作細胞破碎的較好的設備，它是由可產生高

壓的正向排代泵和排出閥組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調節。細胞

漿液通過止逆閥進入泵體內，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中沖擊，并高速撞

擊在撞擊環上，使細胞得到破碎。在操作方式上，可以采用單次通過勻漿器或多

次循環通過等方式。某些較難破碎的細胞，如小球菌、鏈球菌、群母菌和乳酸桿

菌等，以及處于生長靜止期的細胞或通入的細胞濃度較高時，應采用多次循環的

方式才能達到較高的破碎率

2、高速珠磨機：珠磨是另一種常用的機械破碎細胞的方法。利用玻璃小珠

與細胞懸浮液一起快速攪拌，由于研磨作用，使細胞獲得破碎。

3、超聲波振蕩器：超聲波具有頻率高、波長短、定向傳播等特點,通常在15?

25kHz的頻率下操作。超聲波振蕩器有不同的類型,常用的為電聲型，它是由發聲

器和換能器組成，發生器能產生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉換成機

械振動。超聲波振蕩器又可分為槽式和探頭直接插入介質兩種型式，一般破碎效

果后者比前者好。超聲波對細胞的破碎作用與液體中空穴的形成有關。當超聲波

在液體中傳播時，液體中的某一小區域交替重復地產生巨大的壓力和拉力。由于

拉力的作用，使液體拉伸而破裂，從而出現細小的空穴。這種空穴泡在超聲波的

繼續作用下，又迅速閉合，產生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性漩

渦在懸浮細胞上造成了剪切應力，促使其內部液體發生流動，而使細胞破碎。超

聲波處理細胞懸浮液時,破碎作用受許多因素的影響，如超聲波的聲強、頻率、液

體的溫度、壓強和處理時間等，此外介質的離子強度、PH值和菌種的性質等也有

很大的影響。不同的菌種，用超聲波處理的效果也不同，桿菌比球菌易破碎，革蘭

氏陰性菌細胞比革蘭氏陽性菌易破碎,酵母菌效果較差。

二、非機械法

適合于破碎微生物細胞的非機械法有多種，包括化學法、酶解法、物理法和

干燥法等。

1、化學法：采用化學試劑處理微生物細胞可以溶解細胞或抽提某些細抱組

分。用堿處理細胞，可以溶解除去細胞壁以外的大部分組分。酸處理可以使蛋白

質水解成游離氨基酸，通常采用6mol/LHCl處理。此外，某些表而活性劑（如洗滌

劑）也常能引起細胞溶解或使某些組分從細胞內滲漏出來，如對胞內的異淀粉醐

可加入0.1%十二烷基硫酸鈉或0.4機ritonXTOO于菌液中，30℃振蕩30小時就

能較完全地將異淀粉酶抽提出來，且酶的比活較機械破碎法的高。除上述酸、堿

及表面活性劑外，也可采用某些脂溶性有機溶劑,如J.醇、丙酮、氯仿等它們能溶

解細胞膜上的脂質化合物，使細胞結構破壞，將胞內產物抽提出來。但是，這些溶

劑容易引起生化物質破壞，使用時應考慮其穩定性，操作要在低溫下進行，處理

后，還必須將抽提液中的有機溶劑從生化物質中分離回收。

2、酶解法：酶解法是利用酶反應分解破壞細胞壁上特殊的鍵，以達到破壁

的目的。酶解的方法可以在細胞懸浮液中加入特定的酶，也可采用自溶作用。應

用酶解需要選擇適宜的酶和酶系統，并要控制特定的反應條件，某些微生物體可

能僅在生長的某一階段或生長處于特定的情況下,對酶解才是靈敏的。有時，還需

附加其他的處理，如輻射，滲透壓沖擊、反復凍融等或加金屬整合劑EDTA,除去

與膜蛋白結合的金屬離了，暴露出對酶解敏感的結構部分，也可利用生物因素以

促進活性，變得對酶解作用敏感。

對于微牛物細胞，常用的酶是菌酶，它能專一的分解.細胞壁上犍蛋白分子的

P（1、4）糖甘鍵，使多糖分解，經菌酶處理后的細胞移至低滲溶液中，細胞就會破

裂。例如在巨大芽抱桿菌或小球菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產生溶菌現象。

除溶菌酶外，還可選用蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明質酸酶等。

自溶作用是利用微生物自身產生的酶來溶菌，而不需外加其他的酶。在微生

物代謝過程中，大多數都能產生一種能水解細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程

繼續下去。有時改變其生長的環境，可以誘發產生過剩的這種酶或激發產生其它

的自溶酶，以達到自溶目的。影響自溶過程的因素有溫度、時間、pH、緩沖液濃

度、細胞代謝途徑等。微生物細胞的自溶常采用加熱法或干燥法。例如，谷氨酸

產生菌，可加入0.028mol/LNa2C03和0.018mol/LNaHC03pH10的緩沖液，制成3%

的懸浮液,加熱至70c保溫攪拌20分鐘，菌體即自溶。乂如酵母細胞的自溶需在

45?50c溫度下保持12?24小時。

采用抑制細胞壁合成的方法能導致類似于酶解的結果。某些抗生素如青毒素

或環絲氨酸等,能阻止新細胞壁物質的合成。但是抑制劑加入的時間很重要，應在

發酵過程中細胞生長的后期加入，只有當抑制劑加入后，生物合成和再生還在繼

續進行，溶胞的條件才是有利的，因為在細胞分裂階段，細胞壁就造成缺陷，即達

到溶胞作用。

3、滲透壓沖擊法：先把細胞放在高滲溶液中（例如一定濃度的甘油或蔗糖溶

液）由于滲透壓的作用，細胞內水分便向外滲出，細胞發生收縮，當達到平衡后，

將介質快速稀釋或將細胞轉入水或緩沖液中，由于滲透壓發生突然變化,胞外的

水分迅速滲入胞內，使細胞快速膨脹而破裂。

4、凍結-融化法：將細胞放在低溫下冷凍（約-15℃）,然后在室溫中融化，如

此反復多次，就能使細胞壁破裂。凍結-融化法破壁的機理有兩方面:一方面在冷

凍過程中會促使細胞膜的疏水鍵結構破裂，從而增加細胞的親水性能。另一方面,

冷凍時胞內水結晶,形成冰晶粒,引起細胞膨脹而破裂。

5、干燥法：經干燥后的菌體，其細胞膜的滲透性發生變化，同時部分菌體

會產生自溶，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內物質就會被抽提出

來。

干燥法的操作可分空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。酵母菌常

用空氣干燥,在25?30℃的熱空氣流中吹干,部分酵母產生自溶,再用水,緩沖液

或其他溶劑抽提時，效果就較好。真空干燥適用干細菌，把干燥成塊的菌體磨碎

再進行抽提。冷凍干燥適用于制備不穩定的生化物質，在冷凍條件下磨成粉，再

用緩沖液抽提。

三、各種破碎方法的優劣和選擇依據

由上述可見，細胞破碎的方法很多，但是它們的破碎效率和適用范圍不司。

其中許多方法僅適用于實驗室和小規模的破碎，迄今為止，能適用于工業化的大

規模破碎方法還很少，由于高壓勻漿和珠磨兩種機械破碎方法，處理量大，速度

非?？?，目前在工業生產上應用最廣泛。

在機械法破碎過程中，由于消耗機械能而產生大量的熱量，使料液溫度升高，

而易造成生化物質的破壞，這是機械法破碎中存在的共同問題，因此，在大多數

情況下都要采取冷卻措施，對于較小的設備,可采用冷卻夾套或直接投入冰塊冷

卻，但是在大型設備中熱量的除去是必須考慮的一個主要問題。特別在超聲波處

理時，熱量的驅散不太容易，很容易引起介質溫度的迅速上升,這就限制了它的放

大使用，因為要輸入很高的能來提供必要的冷卻，在經濟上是不合算的。因此，

超聲波振蕩法主要適用于實驗室或小規模的細胞破碎。

非機械法中的化學法和酶法應用最廣泛。采用化學法時，特別應注意的問題

是所選擇的溶劑（酸、堿、表面活性劑和有機溶劑等）對生化物質不能具有損害作

用，在操作后，還必須采用常規的分離手段，從產物中除去這些試劑，以保證產品

的純凈。酶解法的優點是專一性強，發生酶解的條件溫和，采用該法時必須選擇

好特定的酶和適宜的操作條件。由于溶菌酶價格較高，一般僅適用于小規模應用。

但是對于酵母細胞壁的破碎，已有應用于工業規模的報道。自溶法價格較低，在

一定程度上能用于工業規模，但是，對不穩定的微生物容易引起所需蛋白質的變

性，自溶后的細胞培養液過濾速度也會降低。抑制細胞壁合成的方法由于要加入

抗生素，費用也很高。

滲透壓沖擊和凍結-融解法都屬于較溫和的方法，但破碎作用較弱，它們只

適用于細胞壁較脆弱的微生物菌體或者細胞壁合成受抑制、強度減弱了的微生物,

它們常與酶解法結合起來使用，提高破碎效果。

干燥法屬于較劇烈的一種破碎方法，容易引起蛋白質或其他組分變性，當提

取不穩定的生化物質時，常加入一些試劑進行保護，如可加入少量還原劑半胱氨

酸、硫基乙醇、亞硫酸鈉等。

選擇破碎方法時，需要考慮下列因素:細胞的數量和細胞壁的強度：產物對破

碎條件（溫度、化學試劑、酶等）的敏感性;要達到的破碎程度及破碎所必要的速

度等，具有大規模應用潛力的生化產品應選擇適合于放大的破碎技術。同時還應

把破碎條件和后面的提取步驟結合起來考慮。在固-液分離中，細胞碎片的大小

是重要因素，太小的碎片很難分離除去，因此，破碎時既要獲得高的產物釋放率

又不能使細胞碎片太小，如果在碎片很小的情況下才能獲得高的產物釋放率，這

種操作條件仍不是合適的，適宜的細胞破碎條件應該從高的產物釋放率、低的能

耗和便于后步提取這三方面進行權衡。

為了能有效地破碎細胞，并盡川能減少產物的破壞，己發展了多種細胞破碎

的方法通常可分為機械法和非機械法兩類。

①，機械法

常用的機械破碎方法是基于液相或固相剪切力，這些剪切力可以在高壓勻漿

器或機械驅動的破碎機如膠質磨、珠磨等設備中獲得。在高壓勻漿器中，進入高

壓室中的細胞懸浮液被強迫通過一個狹窄的小孔，由于產生液相剪切力引起細胞

破碎。在機械驅動的破碎機中，剪切力是由細胞與設備中的固體表面間的相互作

用產生的，這種剪切力場之間的相互作用較復雜，目前了解得還不夠深入，工程

設計大多數靠經驗。

1、高壓勻漿器：高壓漿器是用作細胞破碎的較好的設備，它是由可產生高

壓的正向排代泵和排出閥組成，排出閥具有狹窄的小孔，其大小可以調節。細胞

漿液通過止逆閥進入泵體內，在高壓下迫使其在排出閥的小孔中沖擊,并高速撞

擊在撞擊環上，使細胞得到破碎。在操作方式上，可以采用單次通過勻漿器或多

次循環通過等方式。某些較難破碎的細胞，如小球菌、鏈球菌、群母菌和乳酸桿

菌等，以及處于生長靜止期的細胞或通入的細胞濃度較高時，應采用多次循環的

方式才能達到較高的破碎率

2、高速珠磨機：珠磨是另一種常用的機械破碎細胞的方法。利用玻璃小珠

與細胞懸浮液一起快速攪拌，由于研磨作用，使細胞獲得破碎。

3、超聲波振蕩器：超聲波具有頻率高、波長短、定向傳播等特點,通常在15?

25kllz的頻率下操作。超聲波振蕩器有不同的類型，常用的為電聲型，它是由發聲

器和換能器組成，發生器能產生高頻電流，換能器的作用是把電磁振蕩轉換成機

械振動。超聲波振蕩器乂可分為槽式和探頭直接插入介質兩種型式，一般破碎效

果后者比前者好°超聲波對細胞的破碎作用與液體中空穴的形成有關。當超聲波

在液體中傳播時，液體中的某一小區域交替重復地產生巨大的壓力和拉力。由于

拉力的作用，使液體拉沖而破裂，從而出現細小的空穴。這種空穴泡在超聲波的

繼續作用下，又迅速閉合，產生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性漩

漏在懸浮細胞上造成了剪切應力，促使其內部液體發生流動，而使細胞破碎。超

聲波處理細胞懸浮液時,破碎作用受許多因素的影響，如超聲波的聲強、頻率、液

體的溫度，壓強和處理時間等，此外介質的離子強度，PH值和菌種的性質等也有

很大的影響。不同的菌種，用超聲波處理的效果也不同，桿菌比球菌易破碎，革蘭

氏陰性菌細胞比革蘭氏陽性菌易破碎，酵母菌效果較差。

②，非機械法

適合于破碎微生物細胞的非機械法有多種，包括化學法、酶解法、物理法和

干燥法等。

1、化學法：采用化學試劑處理微生物細胞可以溶解細胞或抽提某些細抱組

分。用堿處理細胞，可以溶解除去細胞壁以外的大部分組分。酸處理可以使蛋白

質水解成游離氨基酸，通常采用6mol/LHCl處理。此外，某些表而活性劑（如洗滌

劑）也常能引起細胞溶解或使某些組分從細胞內滲漏出來，如對胞內的異淀粉醐

可加入0.1%十二烷基硫酸鈉或0.4機rilonXTOO于菌液中，30℃振蕩30小時就

能較完全地將異淀粉酶抽提出來，且酶的比活較機械破碎法的高。除上述酸、堿

及表面活性劑外，也可采用某些脂溶性有機溶劑，如丁醇、丙酮、氯仿等它們能溶

解細胞膜上的脂質化合物，使細胞結構破壞，將胞內產物抽提出來。但是，這些溶

劑容易引起生化物質破壞，使用時應考慮其穩定性，操作要在低溫卜.進行，處理

后，還必須將抽提液中的有機溶劑從生化物質中分離回收。

2、酶解法：酶解法是利用酶反應分解破壞細胞壁上特殊的鍵，以達到破壁

的目的。酶解的方法可以在細胞懸浮液中加入特定的酶，也可采用自溶作用。應

用酶解需要選擇適宜的酶和酶系統，并要控制特定的反應條件，某些微生物體可

能僅在生長的某一階段或生長處于特定的情況下,對酶解才是靈敏的。有時，還需

附加其他的處理，如輻射，滲透壓沖擊、反復凍融等或加金屬整合劑EDTA,除去

與膜蛋白結合的金屬離了，暴露出對酶解敏感的結構部分，也可利用生物因素以

促進活性，變得對酶解作用敏感。

對于微生物細胞，常用的酶是菌酶，它能專一的分解細胞壁上糖蛋白分子的

B（1、4）糖首鍵，使多轆分解，經菌酶處理后的細胞移至低滲溶液中，細胞就會破

裂。例如在巨大芽抱桿菌或小球菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產生溶菌現象。

除溶菌酶外，還可選用蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明質酸酶等。

自溶作用是利用微生物自身產生的酶來溶菌，而不需外加其他的酶。在微生

物代謝過程中，大多數都能產生一種能水解細胞壁上聚合物的酶，以便生長過程

繼續下去。有時改變其生長的環境，可以誘發產生過剩的這種酶或激發產生其它

的自溶酶，以達到自溶目的。影響自溶過程的因素有溫度，時間，pH,緩沖液濃

度、細胞代謝途徑等。微生物細胞的自溶常采用加熱法或干燥法。例如,谷氨酸

產生菌，可加入0.028mol/LNa2CO3和0.018mol/LNaIIC03pH10的緩沖液,制成3%

的懸浮液,加熱至70℃保溫攪拌20分鐘，菌體即自溶。又如酵母細胞的自溶需在

45?50℃溫度下保持12?24小時。

采用抑制細胞壁合成的方法能導致類似于酶解的結果。某些抗生素如青毒素

或環絲氨酸等,能阻止新細胞壁物質的合成。但是抑制劑加入的時間很重要，應在

發酵過程中細胞生長的后期加入，只有當抑制劑加入后,生物合成和再生還在繼

續進行，溶胞的條件才是有利的，因為在細胞分裂階段，細胞壁就造成缺陷，即達

到溶胞作用。

3、滲透壓沖擊法：先把細胞放在高滲溶液中（例如一定濃度的甘油或蔗糖溶

液）由于滲透壓的作用，細胞內水分便向外滲出，細胞發生收縮，當達到平衡后，

將介質快速稀釋或將細胞轉入水或緩沖液中，由于滲透壓發生突然變化,胞外的

水分迅速滲入胞內，使細胞快速膨脹而破裂。

4、凍結-融化法：將細胞放在低溫下冷凍（約-15℃）,然后在室溫中融化，如

此反復多次，就能使細胞壁破裂。凍結-融化法破壁的機理有兩方面:一方面在冷

凍過程中會促使細胞膜的疏水鍵結構破裂，從而增加細胞的親水性能。另一方面,

冷凍時胞內水結晶,形成冰晶粒,引起細胞膨脹而破裂。

5、干燥法：經干燥后的菌體，其細胞膜的滲透性發生變化，同時部分菌體

會產生自溶，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內物質就會被抽提出

來。

干燥法的操作可分空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。酵母菌常

用空氣干燥,在25?30℃的熱空氣流中吹干,部分酵母產生自溶,再用水,緩沖液

或其他溶劑抽提時，效果就較好。真空干燥適用于細菌，把干燥成塊的菌體磨碎

再進行抽提。冷凍干燥適用干制備不穩定的牛化物質，在冷凍條件下磨成粉，再

用緩沖液抽提。

四、各種破碎方法的優劣和選擇依據

由上述可見，細胞破碎的方法很多，但是它們的破碎效率和適用范圍不司。

其中許多方法僅適用于實驗室和小規模的破碎，迄今為止，能適用于工業化的大

規模破碎方法還很少，由于高壓勻漿和珠磨兩種機械破碎方法，處理量大，速度

非?？欤壳霸诠I生產上應用最廣泛。

在機械法破碎過程中，由于消耗機械能而產生大量的熱量，使料液溫度升高，

而易造成生化物質的破壞，這是機械法破碎中存在的共同問題，因此，在大多數

情況下都要采取冷卻措施，對于較小的設備,可采用冷卻夾套或直接投入冰塊冷

卻，但是在大型設備中熱量的除去是必須考慮的一個主要問題。特別在超聲波處

理時，熱量的驅散不太容易，很容易引起介質溫度的迅速上升,這就限制了它的放

大使用，因為要輸入很高的能來提供必要