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文檔簡介
農產品食品檢驗員主講教師:徐英菊糧食理化檢驗——谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定2第十節谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定3學習目標掌握谷物及制品中β-葡聚糖含量測定主要依據;掌握β-葡聚糖含量測定的原理;掌握試樣制備的要求;掌握β-葡聚糖含量測定的操作步驟;掌握β-葡聚糖含量測定的結果分析。4β-葡聚糖通常存在于植物種子的皮層及糊粉層中。生物醫學界普遍認為β-葡聚糖具有清腸、降低膽固醇、調節血糖、提高免疫力等四大生理作用,已引起了全世界的廣泛關注。一、測定原理5NY/T2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的測定》一、測定原理1、依據6利用地衣聚糖酶(或稱葡聚糖酶)和β-葡萄糖苷酶對樣品中(1→3)(1→4)-β-D-葡聚糖(混聯β-D-葡聚糖,或簡稱β-葡聚糖)的酶解作用,由地衣聚糖酶專一性地水解β-葡聚糖成寡糖,β-葡萄糖苷酶則將寡糖水解成葡萄糖。一、測定原理2、原理7葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸和過氧化氫,過氧化氫在過氧化物酶作用下,與4-氨基安替比林氧化縮合生成紅色錕類化合物。此化合物在510nm有吸收,其吸光度值與葡萄糖含量成正比。一、測定原理2、原理8(1)50U/mL地衣聚糖酶溶液:將1mL地衣聚糖酶溶被(1000U/mL)用磷酸鈉緩沖液(20mmol/L、pH6.5)稀釋至20.0mL,把酶液等分成4份,每份5mL,置于聚丙烯塑料瓶中,在-20℃下冷凍保存,備用。二、試劑與設備1、試劑9(2)2U/mLβ-葡萄糖苷酶溶液:將lmL-葡萄糖苷酶榕液(40U/mL)用乙酸鈉緩沖液(50mmol/L、pH4.0)稀釋至20.0mL,把酶液等分成4份,每份5mL,置于聚丙烯塑料瓶中,在-20℃冷凍保存,備用。二、試劑與設備1、試劑10(3)葡萄糖氧化酶-過氧化物酶-緩沖液混合物。內含葡萄糖氧化酶(>12000U/L)、過氧化物酶(6>50U/L)、4-氨基安替比林(0.4mmol/L)。二、試劑與設備1、試劑11(3)葡萄糖氧化酶-過氧化物酶-緩沖液混合物。緩沖液的配制:稱取13.6gKH2PO4、4.2gNaOH和3.0g4-羥基苯甲酸,溶于水中,調節pH7.4,定容至100mL。葡萄糖氧化酶-過氧化物酶-緩沖液混合物的配制:取50mL緩沖液稀釋至1000mL;用該稀釋緩沖液溶解葡萄糖氧化酶-過氧化物酶混合試劑,使之達到所需濃度。二、試劑與設備1、試劑12二、試劑與設備1、試劑(4)50%乙醇溶液。(5)20mmol/L、pH6.5磷酸鈉緩沖液。稱取3.12gNaH2PO4·2H2O,加900mL水溶解;調節pH6.5,定容至1000mL。(6)乙酸鈉緩沖液。13二、試劑與設備1、試劑(7)200mmol/L、pH4.0乙酸鈉緩沖液:取7.6mL冰醋酸于900mL水中,加入4.8g三水乙酸鈉,溶解;調節pH4.0,定容至1000mL。(8)50mmol/L、pH4.0乙酸鈉緩沖液:取250mL200mmol/L、pH4.0乙酸鈉緩沖液稀釋至1000mL。14二、試劑與設備1、試劑(9)1000mg/mL葡萄糖標準貯存溶液:將葡萄糖粉末(純度大于99%)于100℃常壓干燥2h,置于干燥器中冷卻,室溫下密閉保存。準確稱取0.1000g干燥葡萄糖,用50mmol/L、pH4.0乙酸鈉緩沖液溶解并定容至100mL。15二、試劑與設備2、儀器與設備(1)旋風磨或粉碎機。樣品粉碎后可過0.5mm或35目篩網。(2)離心機。能容納15mm×100mm或10mm×75mm的玻璃試管,離心力1000×g。(3)水浴鍋。溫度穩定性±0.2℃。(4)旋渦混合儀。(5)pH計。精度0.01。16二、試劑與設備2、儀器與設備(6)分析天平。感量0.0001g。(7)干燥箱。可保持105℃±1℃。(8)分光光度計。檢測波長510nm。(9)比色皿。(10)移液器。量程10~100μL、20~200μL、1000~5000μL,配備一次性吸頭。17二、試劑與設備2、儀器與設備(11)容量瓶。容積100mL、1000mL。(12)具塞玻璃試管。容積15~20mL。(13)試管架。30孔或40孔,能放置15~20mL具塞玻璃試管。(14)計時器(秒表)。18三、試樣制備1.待測樣品:按照GB/T5491的規定取樣。粉末狀樣品:取50g以上,充分混勻后于廣口瓶中密閉保存。顆粒或片狀樣品:取50g以上,使用粉碎機粉碎,混勻后于廣口瓶中密閉保存。19三、試樣制備2.葡萄糖標準工作液:平行移取100μL葡萄糖標準貯存溶液至3支試管中,分別添加100μL50mmol/L乙酸鈉緩沖液。3.試劑空白:移取200μL50mmol/L乙酸鈉緩沖液至試管中。20四、分析步驟
在樣品測定時,需同時進行葡萄糖標準工作液3個平行的測定,分光光度計用試劑空白調零。必要時可添加一個已知β-葡聚糖含量的對照樣品以檢驗結果的準確性。(一)樣品稱取
精確稱取待測樣品0.0800~0.1000g,放入玻璃試管底部。21四、分析步驟(二)酶解前處理
向待測樣品試管中添加0.2mL50%乙醇溶液,于旋渦混合儀上振蕩分散;加入4.0mL磷酸鈉緩沖液,充分振蕩。將試管放入沸水浴中,保持lmin;取出試管,在旋渦混合儀上劇烈振蕩數秒;沸水浴中繼續保持2min,振蕩處理同前。22四、分析步驟(三)酶解反應
試管在50℃水浴中保溫5min,添加0.2mL地衣聚糖酶溶液,劇烈振蕩數秒;加蓋試管塞50℃水浴繼續保溫60min;其間將試管取出,振蕩處理3~4次。取出試管,向其中添加5mL200mmol/L乙酸鈉緩沖液,混合均勻,室溫下冷卻5~10min;離心(1000×g,10min),取上清液備用。23四、分析步驟(三)酶解反應
分別準確移取0.1mL上清液至3支試管的底部,向其中2支試管中分別添加0.1mLβ-葡萄糖苷酶溶液;另一支試管中添加0.1mL50mmol/L乙酸鈉緩沖,作為反應空白,將上述試管在50℃保溫10min。24四、分析步驟(四)顯色反應
分別移取3.0mL葡萄糖氧化酶-過氧化物酶-緩沖液混合物至各試管(包括2個測試樣、1個反應空白、3個D-葡萄糖標準工作溶液、1個試劑空白,50℃反應20min;取出試管,冷卻至室溫。25四、分析步驟(五)比色
以試劑空白調零于510nm處測定吸光值。如果試樣中β-葡聚糖的濃度大于10%,將產生比100μg葡萄糖標準工作溶液高的吸光度。26四、分析步驟(五)比色
此時,需在步驟(二)之后,取適量50mmol/L乙酸緩沖液稀釋上清液,然后繼續3以下步驟,結果計算時應把稀釋因子考慮在內。27五、結果分析1、樣品濕基中β-葡聚糖的質量分數(%),按下式計算:式中ΔA——樣品吸光值與反應空白吸光值的差值F——吸光值轉化為μg葡萄糖的轉換因子,F=100μg葡萄糖/100μg葡萄的吸光值94——體積校正因子(從9.4mL取0.lmL用于分析)W——固體樣品質量(g)0.9——葡萄糖轉化為自葡聚糖的脫水轉換因子28五、結果分析2、樣品干基中β-葡聚糖的質量分數(%),按下式計算:29五、結果分析3、精密度(1)重復性在重復性條件下測試結果的相對標準偏差(RSDr)不超過5%。(2)再現性在再現性條件下測試結果的相對標準偏差(RSDR)不超過10%。30隨堂測試1、簡答題(1)植物中β-葡聚糖
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