第二章蛋白質的化學第五節(jié)蛋白質的分離純化和含量測定第四節(jié)蛋白質的功能和分類第三節(jié)蛋白質的理化性質第二節(jié)蛋白質的分子結構第一節(jié)蛋白質的化學組成內

容

提

要第六節(jié)多肽和蛋白質類藥物第三節(jié)蛋白質的理化性質二、蛋白質的兩性電離性質和等電點一、蛋白質的膠體性質三、蛋白質的變性和復性四、蛋白質的沉淀六、蛋白質的呈色反應五、蛋白質的紫外吸收

回顧已有的知識，膠粒的大小是多少呢？膠體溶液有哪些特性？蛋白質是生物大分子化合物，其顆粒大小介于1~100nm之間，屬于膠粒的范疇，因此蛋白質溶液是膠體溶液，具有膠體溶液的性質。如不能透過半透膜，具有布朗運動、丁達爾現(xiàn)象等。一、蛋白質的膠體性質1.水化膜

阻止蛋白質顆粒相互聚集而沉淀。

2.帶電荷

同性電荷相互排斥，使蛋白質顆粒不易聚集而沉淀。

蛋白質親水膠體示意圖蛋白質膠體溶液穩(wěn)定的兩大因素ProH2OH2OH2O某蛋白粗品中含有尿素分子，利用膠體溶液什么性質可以達到分離純化蛋白質的目的？利用蛋白分子不能透過半透膜的特性，應用透析法可以達到分離純化蛋白質的目的。蛋白質不能透過半透膜的應用——透析透析裝置血液透析儀原理尿毒癥患者透析日常D:\2021\蛋白質化學——蛋白質性質\12f58bb90b2144da286184259dd49938.mp4中國血液透析機研制第一人二、蛋白質的兩性電離和等電點蛋白質分子除兩端的α-NH2和α-COOH可解離外，氨基酸殘基側鏈上尚有不少可解離的基團，比如-NH2、-COOH、-OH、咪唑基、胍基。所以蛋白質是兩性電解質。PrNH2COOHPrNH3+COO-pH=pIpH>pI+OH-+H+pH<pI兼性離子正離子負離子PrNH2COO-PrNH3+COOH

pI狀態(tài)下蛋白質溶解度最低，可采用等電點沉淀法分離制備蛋白質。

蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點(pI)。

等電點

在一定的pH條件下，不同的蛋白質所帶電荷不同，可用離子交換層析法和電泳法分離純化。

例：兩種蛋白質的pI分別為5.35和7.80，在pH6.5的緩沖溶液中電泳，泳向陽極的是哪種蛋白質？只有帶負電荷才能泳向陽極，當溶液pH＞pI時，蛋白質帶負電荷，所以泳向陽極的是pI為5.35的蛋白質。三、蛋白質的變性和復性在某些理化因素的作用下，蛋白質分子的空間構象發(fā)生改變或破壞，導致其生物活性的喪失和某些理化性質的改變，這種現(xiàn)象叫做蛋白質的變性作用。蛋白質的變性作用物理因素：高溫、紫外線、X射線、超聲波和劇烈震蕩、高壓、攪拌和研磨等。

化學因素：強酸、強堿、尿素、去污劑（如十二烷基磺酸鈉，縮寫為SDS）、有機溶劑（如濃乙醇）、重金屬鹽和生物堿試劑（如三氯醋酸）變性主要破壞了維持空間構象的二硫鍵和次級鍵，不涉及肽鍵的斷裂，故一級結構不被破壞。1.變性因素2.變性的本質（1）生物活性喪失

如：煮熟的雞蛋孵不出雞仔；血紅蛋白失去運輸O2和CO2的能力，脊髓灰質炎糖丸用熱水吞服會降低藥效，酶失去催化活性等。（2）某些理化性質的改變

變性的蛋白質疏水基團外露，溶解度降低，易產(chǎn)生沉淀；蛋白質溶液的黏度增加、旋光度改變、pI提高；色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基外露，紫外吸收能力增強；變性后容易被蛋白酶水解，如，煮熟的牛肉容易消化。3.變性作用的特征在工業(yè)生產(chǎn)和臨床上，常利用變性的因素進行滅菌和消毒，比如蒸汽滅菌，酒精、紫外線的消毒；中草藥有效成分的提取或其注射液的制備也常用變性的方法（加熱、濃乙醇等）除去雜蛋白；生化制品包括多肽、激素、酶制劑和其他生物制品如疫苗等，在生產(chǎn)和儲運過程中也要有效防止其變性失活。4.變性的應用牛核糖核酸酶的變性與復性

若蛋白質的變性程度較輕，去除變性因素，有些蛋白質可恢復或部分恢復其原有的構象和生物活性，稱為復性。蛋白質的復性重組人血管內皮抑制素（化學本質是蛋白質）系采用大腸埃希菌作為蛋白表達體系生產(chǎn)出的，主要能抑制腫瘤新生血管形成，阻斷腫瘤細胞的營養(yǎng)供應，最終達到“餓死”腫瘤細胞的目的。其變性和復性，就是采用加入8mol/L尿素，使其變性，然后逐漸降低尿素濃度，達到除去尿素使其復性的目的。四、蛋白質的沉淀蛋白質顆粒相互聚集從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質的沉淀。沉淀方法1.中性鹽沉淀（鹽析）2.有機溶劑沉淀3.加熱沉淀4.重金屬鹽沉淀5.生物堿試劑沉淀向蛋白質溶液中加入高濃度的中性鹽，破壞了蛋白質的水化層并中和其電荷，使蛋白質顆粒相互聚集而沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。常用的中性鹽包括（NH4)2SO4、NaCl、Na2SO4等。

鹽析出的蛋白質不變性。本法常用于各種蛋白質類生物活性物質的分離制備。

1．中性鹽沉淀（鹽析）向雞蛋清蛋白中加入高濃度的NaCl，雞蛋清蛋白會發(fā)生什么現(xiàn)象？在蛋白質溶液中加入一定量的與水互溶的有機溶劑（如乙醇、甲醇和丙酮），破壞蛋白質表面的水化層，使蛋白質顆粒相互聚集而沉淀。

有機溶劑沉淀常引起變性，用此法分離制備生物活性蛋白質時，應確保在低溫下操作，盡可能縮短操作時間，同時也要掌握好有機溶劑的濃度。2．有機溶劑沉淀加熱可使蛋白質變性沉淀，但與pH密切相關。在pI時加熱最易沉淀，但偏離pI即使加熱也不易沉淀。比如，在鏈霉素的生產(chǎn)中就是采用加熱除去菌體蛋白的方法達到分離純化的目的。3．加熱沉淀蛋白質在pH>pI的條件下帶負電荷，可與重金屬離子（Ag+、Hg2+、Pb2+）結合成不溶性蛋白鹽而變性沉淀。臨床上常用口服大量蛋白質（如牛奶、蛋清）和催吐劑搶救誤服重金屬中毒的病人。4．重金屬鹽沉淀蛋白質在pH<pI的條件下帶正電荷，與生物堿試劑（鞣酸、苦味酸、鎢酸）和三氯醋酸、磺基水楊酸、硝酸等結合成不溶性的鹽而沉淀。無蛋白血濾液的制備、中草藥注射液中蛋白的檢查以及鞣酸、苦味酸的收斂作用皆以此原理為依據(jù)。

5．生物堿試劑沉淀五、蛋白質的紫外吸收色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸由于含有共軛雙鍵，在280nm附近有最大吸收峰，測定蛋白質在280nm光吸收度，是定量分析溶液中蛋白質濃度的快速簡便方法。色氨酸酪氨酸苯丙氨酸紫外分光光度計

六、蛋白質的呈色反應（一）雙縮脲反應（二）Folin-酚反應（三）茚三酮反應含兩個或兩個以上肽鍵的蛋白質和多肽，在堿性條件下與CuSO4共熱，形成紫色或紅色的絡合物。肽鍵越多，反應的顏色越深。氨基酸和二肽無此反應，此法可用于蛋白質的定性和定量。

（一）雙縮脲反應在堿性條件下，蛋白質分子中的酪氨酸、色氨酸可與酚試劑（主要成分是磷鎢酸-磷鉬酸）反應生成藍色化合物（鎢藍-鉬藍）。在680nm處有最大吸收。藍色的強度與蛋白質的量成正比。此法是測定蛋白質濃度的常用方法。

在pH5~7時，蛋白質與茚三酮丙酮液加熱可產(chǎn)生藍紫色（脯氨酸顯黃色）。凡是含-NH2的化合物皆有此反應，可用于氨基酸、蛋白質、肽類化合物的定性和定量測定。（二）Folin-酚反應（三）茚三酮反應第四節(jié)

蛋白質的功能和分類

一、蛋白質的生理功能

二、蛋白質的分類1.生物催化作用：酶2.代謝調節(jié)作用：激素3.免疫保護作用：抗體、補體4.轉運和貯存作用：血紅蛋白、血漿脂蛋白5.運動與支持作用：肌球蛋白和肌動蛋白；膠原蛋白、彈性蛋白和角蛋白6.控制生長和分化作用：核蛋白7.接收和傳遞信息的作用：受體蛋白8.參與生物膜組成作用一、蛋白質的生理功能*根據(jù)分子組成分類單純蛋白質：僅由氨基酸組成*根據(jù)分子形狀和空間構象分類纖維狀蛋白質球狀蛋白質纖維狀蛋白質(長軸:短軸>10)結合蛋白質=蛋白質+非蛋白質（輔基）球狀蛋白質(長軸:短軸<10)二、蛋白質的分類第五節(jié)

蛋白質的分離純化和含量測定一、蛋白質的提取二、蛋白質的分離純化三、蛋白質的含量測定一、蛋白質的提取勻漿法，超聲破碎法先用纖維素酶處理，再用研磨法細胞破碎方法動物細胞植物細胞微生物細胞對于細菌添加溶菌酶，再配合研磨法總的要求是既要盡量提取所需蛋白質，又要防止蛋白酶的水解和其他因素對蛋白質特定構象的破壞作用。（一）根據(jù)溶解度不同的分離純化方法（二）根據(jù)分子大小和形狀不同的分離純化方法（三）根據(jù)帶電性質不同的分離純化方法（四）根據(jù)配體特異性不同的分離純化方法二、蛋白質的分離純化1.鹽析法2.低溫有機溶劑沉淀法3.等電點沉淀法（一）根據(jù)溶解度不同的分離純化方法

1.鹽析法鹽析沉淀的蛋白質一般保持著天然構象而不變性。有時不同鹽濃度可有效地使蛋白質分級沉淀。對不同的蛋白質進行鹽析時，需要采用不同的鹽濃度和不同的pH。鹽析時的pH多選擇在pI附近。例如，在pH7.0附近時，血清清蛋白（白蛋白）溶于半飽和的(NH4)2SO4中，球蛋白沉淀下來；當(NH4)2SO4達到飽和濃度時，清蛋白也隨之析出。所以鹽析可將蛋白質初步分離。2.低溫有機溶劑沉淀法

此法沉淀蛋白質的選擇性較高，且無需脫鹽，較為常用。但應注意低溫操作，以避免蛋白質變性。如用丙酮沉淀時，必須在0~4℃低溫條件下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。除了丙酮之外，也常用乙醇。

3.等電點沉淀法

此法很少單獨使用，常與其他方法結合使用。近年來新興的免疫沉淀法，是指將某一純化蛋白免疫動物，獲得抗該蛋白的特異抗體，形成抗原抗體復合物，然后從復合物中中分離獲得抗原蛋白，這就是免疫沉淀法。1.透析2.超濾3.凝膠過濾法4.離心分離法

（二）根據(jù)分子大小和形狀不同的分離純化方法

利用蛋白質大分子對半透膜的不可通過性而與小分子物質分開。如火棉膠、玻璃紙等，可用來做成透析袋常用于鹽析法中除去中性鹽，以及離心法純化蛋白質混入的氯化銫、蔗糖等小分子物質。

1.透析透析裝置利用超濾膜在一定的壓力或離心力的作用下，大分子物質被截留而小分子物質則濾過排出。選擇不同孔徑的超濾膜可截留不同相對分子質量的物質。常用于蛋白質溶液的濃縮、脫鹽和分級純化等。2.超濾原理：按照蛋白質相對分子質量大小進行分離。又稱分子篩層析或排阻層析。常用的凝膠有葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠等。當?shù)鞍踪|分子的直徑大于凝膠的孔徑時，被排阻于凝膠之外；小于孔徑者則進入凝膠。在層析洗脫時，大分子受阻小而最先流出；小分子受阻大而最后流出，從而使相對分子質量不同的蛋白質分開。3.凝膠過濾法離心分離是利用機械的快速旋轉所產(chǎn)生的離心力，將不同密度的物質分離開來的方法。超速離心機可產(chǎn)生比地心吸引力（g）大60萬倍以上的離心力（即600000g），蛋白質分子的沉降速度與其相對分子質量的大小、分子形狀、密度及溶劑的密度有關。目前，超速離心法是分離生物高分子普遍使用的有效方法。

4.離心分離法

1.離子交換層析法利用蛋白質兩性解離特性和pI作為分離依據(jù)的一種方法，應用廣泛。

2.電泳法在一定條件下，各種蛋白質分子因所帶電荷性質、數(shù)量及分子大小不同，其在電場中的電泳遷移率各異，這樣就達到了分離不同蛋白質的目的。（三）

根據(jù)帶電性質不同的分離純化方法

親和層析是根據(jù)具有特異親和力的化合物之間能可逆結合與解離的性質建立的層析方法，是一種具有高度專一性分離純化蛋白質的有效方法。（四）根據(jù)配體特異性不同的分離純化方法

凱式定氮法：缺點是時間較長且易受非蛋白氮化合物的干擾

雙縮脲法：此法簡便，受蛋白質氨基酸組成影響小；但靈敏度低、樣品用量大

Folin-酚法（Lowry法）：優(yōu)點操作簡便、靈敏度高；缺點標準蛋白質中顯色氨基酸的量應與樣品接近紫外分光光度法：考馬斯亮藍法：快速、靈敏度范圍一般25~200μg/mL

BCA比色法：幾乎沒有干擾物質的影響三、蛋白質的含量測定采用Folin-酚法，測定注射用促肝細胞生長素（一種從新鮮乳豬肝臟中提取的多肽類生化制劑，主要用于肝炎、肝硬化及肝癌的治療）的含量，若輔料中加入甘露醇，會對測定結果產(chǎn)生何種影響？為什么？第六節(jié)多肽和蛋白質類藥物

一、多肽和蛋白質類藥物二、常見的多肽和蛋白質類藥物

一、多肽和蛋白質類藥物（一）氨基酸及其衍生物類（二）多肽類（三）蛋白質類藥物降低血氨，用于治療肝硬化、肝昏迷谷.精.鳥氨酸賴氨酸促進生長發(fā)育，為兒童、產(chǎn)婦、恢復期病人的優(yōu)良營養(yǎng)劑甘氨酸用于肌無力癥與缺鐵性貧血的治療甲硫氨酸用于脂肪肝、肝炎、肝硬化的防治（一）氨基酸及其衍生物類（一）氨基酸及其衍生物類天冬氨酸保護心肌L-胱氨酸抗過敏、脫發(fā)癥、肝炎、白細胞減少癥半胱氨酸抗輻射和解毒精氨酸-阿司匹林鎮(zhèn)痛和消炎氨基酸的衍生物N-乙酰半胱氨酸用于化痰，L-多巴（L-二羥苯丙氨酸）可治療帕金森病（二）多肽類分類小類藥物多肽類激素垂體多肽激素促皮質素、促黑激素、脂肪水解激素、催產(chǎn)素、加壓素下丘腦激素促甲狀腺素釋放激素、生長素抑制激素、促性腺激素釋放激素等甲狀腺激素甲狀旁腺激素、降鈣素等胰島激素胰高血糖素、胰解痙多肽等胃腸道激素胃泌素、膽囊收縮素-促胰酶素、腸泌素、腸血管活性肽、抑胃素、緩激肽等胸腺激素胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子等多肽類細胞生長調節(jié)因子表皮生長因子、轉移因子、心鈉素等其他類骨寧、眼生素、血活素、氨肽素、婦血寧、腦氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素、神經(jīng)營養(yǎng)素、胎盤提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心臟激素、醋酸格拉替雷、醋酸亮丙瑞林、醋酸奧曲肽、艾塞那肽、腦苷肌肽等（三）蛋白質類藥物分類小類藥物蛋白質類激素垂體蛋白質激素生長素、催乳激素、促甲狀腺素、促黃體生成激素、促卵泡激素等促性腺激素人絨毛膜促性腺激素、絕經(jīng)尿促性腺激素、血清促性腺激素等胰島素及其他蛋白質激素胰島素、胰抗脂肝素、松弛素、尿抑胃素等血漿蛋白質白蛋白、纖維蛋白溶酶原、血漿纖維結合蛋白、免疫丙種球蛋白及各種免疫球蛋白、纖維蛋白原、抗凝血酶III、凝血因子VIII等蛋白質類細胞生長調節(jié)因子干擾素α、β、γ、白細胞介素1~7、神經(jīng)生長因子、肝細胞生長因子、血小板衍生的生長因子、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、組織纖維溶酶原激活因子、促紅細胞生成素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等粘蛋白胃膜素、硫酸糖肽、內在因子等膠原蛋白明膠、阿膠等堿性蛋白硫酸魚精蛋白等蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑、大豆蛋白酶抑制劑等凝集素植物血凝素、刀豆蛋白A1．醋酸格拉替雷一種人工合成的多肽制劑，由谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸和賴氨酸四種氨基酸組成。用于治療多發(fā)性硬化癥2．醋酸亮丙瑞林一種自然產(chǎn)生的促性腺激素釋放激素或促黃體生成釋放激素的合成九肽類似物。適應癥較廣，包括子宮內膜異位癥、子宮肌瘤、絕經(jīng)前乳腺癌、前列腺癌；中樞性性早熟癥等。3．醋酸奧曲肽一種人工合成的天然生長抑素的八肽衍生物，它保留了與生長抑素類似的藥理作用，且作用持久。適應癥包括肢端肥大癥；緩解與功能性胃腸胰內分泌瘤有關的癥狀和體征；并對具有類癌綜合征表現(xiàn)的類癌腫瘤、VIP瘤、胰高糖素瘤有效。二、常見的多肽和蛋白質類藥物

4．艾塞那肽第一個腸降血糖素類似物，是人工合成的由39個氨基酸組成的肽酰胺，為皮下