中國養蜂學會團體標準《中草藥防治歐洲幼蟲腐臭病技術規程》編制說明（征求意見稿）起草單位：中國農業科學院蜜蜂研究所江西省養蜂研究所貴州省農業科學院現代農業發展研究所中國養蜂學會蜜蜂專業委員會目錄一、工作簡況（包括任務來源、制定背景、起草過程等）11.1任務來源11.2制定背景11.3起草過程2二、標準編制原則、主要內容及其確定依據32.1標準編制原則32.2主要內容及確定依據3三、試驗驗證的分析、總數報告，技術經濟論證，預期的經濟效益、社會效益和生態效益43.1試驗驗證的分析、綜述報告43.1.1標準名稱43.1.2前言43.1.3主體內容43.1.4范圍的界定43.1.5原理43.1.6試劑和材料43.1.7儀器和設備53.2標準的方法研究內容53.2.1指示菌株的制備53.2.2中草藥水提劑的制備53.2.3中草藥干粉提取物的制備63.2.4牛津杯法檢測中草藥抑菌活性63.2.5中草藥組合物配方的優化篩選73.2.6不同中草藥組合干粉提取物抑制蜂房蜜蜂球菌效果9四、與國際、國外同類標準技術內容的對比情況，或者與測試的國外樣品、樣機的有關數據對比情況9五、以國際標準為基礎的起草情況，以及是否合規引用或者采用國際國外標準，并說明未采用國際標準的原因9六、與有關法律、行政法規及相關標準的關系10七、重大分歧意見的處理經過和依據10八、涉及專利的有關說明10九、實施國家標準的要求，以及組織措施、技術措施、過度期和實施日期的建議等措施建議10十、其他應當說明的事項10十、其他應當說明的事項10參考文獻11一、工作簡況（包括任務來源、制定背景、起草過程等）1.1任務來源2024年1月，中國養蜂學會發布了《關于征集中國養蜂學會團體標準項目》的通知，根據通知要求任務要求，中國農業科學院蜜蜂研究所計劃申報團體標準，項目名稱為《中草藥防治歐洲幼蟲腐臭病技術規程》。項目承擔單位為中國農業科學院蜜蜂研究所、江西省養蜂研究所、貴州省農業科學院現代農業發展研究所、中國養蜂學會蜜蜂保護專業委員會。項目主持人為張麗。1.2制定背景蜜蜂是重要的資源昆蟲，既是全球生態系統中不可或缺的傳粉媒介,又能為人類提供營養豐富的蜂產品。中華蜜蜂（Apisceranacerana）是我國特有的蜜蜂蜂種，除新疆外其他各省均有分布，具有耐寒性高、抗逆性強和善采零星蜜源的優點，其生態和經濟價值不可替代。歐洲幼蟲腐臭?。‥uropeanFoulbrood，EFB），是一種惡性、細菌性蜜蜂傳染病，其發生與農藥暴露、氣候變化和營養不足等壓力因素有關，處于壓力條件下的蜜蜂更容易感染歐洲幼蟲腐臭病。EFB的主要致病菌是蜂房蜜蜂球菌（Melissococcusplutonius）。蜂房蜜蜂球菌是一種革蘭氏陽性厭氧菌。蜂房蜜蜂球菌極易侵染1~2日齡蜜蜂幼蟲，初期幾乎無任何癥狀，具有2～3天的潛伏期，一般在4~5天爆發導致幼蟲死亡?；疾∮紫x體色會從珍珠白逐漸變為淡黃色，嚴重時可能會變為褐色或灰黑色，蟲體塌陷扭曲，干癟后如鱗片狀貼于蜂巢底部，形成無粘性、易清除的鱗片，并伴有難聞的酸臭味。EFB于1885年被首次系統報道，上世紀五十年代首次在我國廣東省發現，六十年代初南方各省相繼出現病害，隨后蔓延全國。近年來，歐洲幼蟲腐臭病呈流行性趨勢，且在中華蜜蜂中危害更大，甚至已造成重大經濟損失，引起了人們的廣泛關注和重視。目前，防治歐洲幼蟲腐臭病的研究呈現多維度發展。在藥物防治方面，抗生素類諸如四環素類、鏈霉素、磺胺藥、泰樂菌素、紅霉素、林可霉素、氯霉素、硝基呋喃類、桿菌肽以及青霉素等抗生素和化學療法對于蜂業治療細菌性疾病具有重要意義。但是，常規使用抗生素在流行病學以及細菌性疾病的控制方面收效甚微，原因在于其無法根除在蜂箱中持續存在的蜂房蜜蜂球菌。在諸多情形下，抗生素被持續不斷地、過度地加以使用，有研究表明，抗生素的運用可能對蜜蜂的壽命以及幼蟲的活力產生影響，還會導致蜂巢正常微生物群落失衡，比如暴露于現場實際濃度的泰樂菌素會影響蜜蜂體內微生物群并增加蜜蜂對病原體的易感性。與抗生素使用相關的另一個問題在于病原菌耐藥菌株的發展，特別是由于長期的濫用，幼蟲對四環素類和磺胺噻唑的耐藥性已極為普遍。而且抗生素殘留可能會污染蜂箱產品，尤其是蜂蜜，影響人類食用的質量和安全。已有研究報道，許多中草藥具有殺菌活性，且對人和蜜蜂安全，因此在防治歐洲幼蟲腐臭病上顯示了巨大的潛力。目前國內還沒有利用草藥防治歐洲幼蟲腐臭病的方法標準，1.3起草過程中國農業科學院蜜蜂研究所、江西省養蜂研究所、貴州省農業科學院現代農業發展研究所、中國養蜂學會蜜蜂保護專業委員會接到標準制定任務后，系統查閱并收集利用中草藥防細菌病害尤其是蜂房蜜蜂球菌的文獻、方法及相關資料。制定實施方案，明確具有抑菌活性的中草藥，并進行對蜂房蜜蜂球菌抑菌活性的篩選及驗證，同時對不同中草藥進行復配，驗證其活性。圖1標準編制的技術路線主要起草過程：1.2024年1月，成立標準編制小組。組織標準編制單位中從事標準制修訂、蜜蜂病蟲害防控等具有豐富技術經驗的專業人員組成標準編制小組。2.2024年2月，召開項目啟動會議，確定了該標準制定的技術路線、技術內容、分工以及時限等要求。3.2024年2月-3月，查閱文獻以及相關標準等資料，收集中草藥及蜂房蜜蜂球菌樣品。4.2024年3月-9月，開展中草藥防治蜂房蜜蜂球菌實驗，篩選對蜂房蜜蜂球菌具有高抑菌效果的中草藥及其組合。5.2024年10月-11月，形成定向征求意見稿補充定向征求意見的具體內容及回復二、標準編制原則、主要內容及其確定依據2.1標準編制原則本標準是根據本標準是根據GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準的結構與編寫規則》、GB/T1.2-2020《標準化工作導則第2部分：標準中規范性技術要素內容的確定方法》的規定進行的編制。2.2主要內容及確定依據在編制過程中，標準編制小組查閱了國內外相關文獻、標準等資料，并對中草藥防治蜜蜂病害的現狀進行了調研，參考各行部門制定的同類的標準，遵循“先進性、實用性、統一性和規范性”的原則，堅持標準的可操作性，完成了中草藥抑制蜂房蜜蜂球菌的抑菌效果實驗工作，形成了標準草案和編制說明。目前，國內外還沒有利用中草藥防治歐幼病的相關方法標準。本標準在參考《復方中草藥對雞大腸桿菌病的防治效果試驗研究》、《蝦夷扇貝膿皰病病原菌的分離鑒定及復方中草藥防治效果研究》及《中草藥防治雞大腸桿菌病的研究進展》相關文獻的基礎上，開展中草藥有效防治歐幼病實驗，確定中草藥有效防治歐幼病的單方及復方制劑。三、試驗驗證的分析、綜述報告，技術經濟論證，預期的經濟效益、社會效益和生態效益3.1實驗驗證的分析、綜述報告3.1.1標準名稱本標準主要解決利用中草藥防治歐洲幼蟲腐臭病的技術問題，所以將本標準的名稱定為：《中草藥防治歐洲幼蟲腐臭病》。因此將本標準的全稱翻譯為“ControltheEuropeanfoulbrooddiseaseusingChineseherbs”。3.1.2前言明確了本標準的起草依據、歸口單位及主要起草單位、起草人。3.1.3主體內容標準的主體內容包括：范圍、規范性引用文件、術語和定義、原理、試劑和材料、儀器設備、樣品、試驗步驟、試驗數據處理、精密度和附錄。3.1.4范圍的界定本文件描述了利用甘草、含甘草的中草藥組合物，茜草、含茜草的中草藥組合物防治歐幼病的方法。本文件適用于利用中草藥防治歐幼病。本文件中草藥包括：甘草，甘草、連翹和大青葉組合物，茜草、茜草和金銀花組合。3.1.5原理中草藥含有有機酸、生物堿、黃酮類，在抑菌、消炎、增強免疫方面具有較好的生理作用，同時采用藥敏片擴散法檢測EFB病原菌對中草藥的敏感性。3.1.6試劑和材料3.1.6.1水：GB/T6682,一級。3.1.6.2供試菌株：蜂房蜜蜂球菌（福建農林科技大學提供）3.1.6.3供試中草藥：山楂葉、山楂、薄荷、蒲公英、枸杞、紫錐菊、靈芝、金銀花、山藥、羅漢果、茜草、菊花、丁香、連翹、甘草、丹參，夏枯草、大青葉、黃連、黃芩、菊花、蒲公英、板藍根、馬齒莧、金銀花、火麻仁、柏子仁、白頭翁、魚腥草、通草、百部、當歸、土茯苓和蒼耳子由北京同仁堂醫院提供，中草藥干粉提取物北京康華遠景科技有限公司提供。3.1.6.3BHI培養基：酵母浸粉1g、葡萄糖1g、可溶性淀粉1g、牛心浸粉1g、瓊脂1g、KH2PO41.36g、蒸餾水100mL、pH用NaOH調至到6.5～7.5之間。3.1.7儀器和設備高壓滅菌鍋，超凈臺，天平：感量為1.0g；分析天平：感量1mg和0.1mg；培養箱。3.2標準的方法研究內容3.2.1指示菌株的制備3.2.1.1蜂房蜜蜂球菌活化從甘油管中挑取一環菌液，在BHI平板上進行劃線。將劃好線的培養基放入細菌培養箱中培養18～24h后，挑取單菌落在相差顯微鏡下觀察。若發現較多的單個菌落或成對呈鏈球狀球菌并具有梅花絡狀，即可確診為蜂房蜜蜂球菌。圖1蜂房蜜蜂球菌菌落及顯微形態（相差顯微鏡×1000）3.2.1.2蜂房蜜蜂球菌菌懸液的制備在超凈工作臺內，用滅接種環挑取活化好的蜂房蜜蜂球菌單個菌落并接種至BHI液體培養基內，靜置于培養箱內，30~35℃培養18~24h。3.2.1.3指示平板的制備將培養18~24h的蜂房蜜蜂球菌菌液懸液稀釋100倍，取100μL均勻涂布到BHI平板，以制備蜂房蜜蜂球菌指示菌平板，該平板現配現用。3.2.2中草藥水提劑的制備稱取烘干后的中草藥100g，加入1L蒸餾水浸泡30min煮沸，然后溫火煎熬60min后用紗布過濾藥液，藥渣再加入1L蒸餾水煮沸，溫火煎熬60min過濾藥液，兩次藥液合并進行煎熬，濃縮至100mL，高壓滅菌后放入4℃冰箱保存備用。3.2.3中草藥干粉提取物的制備稱取中草藥干粉提取物10g，加蒸餾水10mL后充分攪拌，使之均勻溶于水中，高壓滅菌，放入4℃冰箱保存備用。3.2.4牛津杯法檢測中草藥抑菌活性在蜂房蜜蜂球菌指示菌平板上等距離放置三個經過滅菌的牛津杯。每個牛津杯內加200μL的中草藥水提液，在30~35℃溫度下培養24h，利用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，每個抑菌圈呈米字型測量，求平均值。中草藥提取物抑菌效果的判定標準，D<10為低度敏感，10≤D≤15mm為中度敏感，D>15mm為高度敏感。3.2.4對蜂房蜜蜂球菌有抑菌活性的中草藥的篩選供試34種中草藥中，有25種對蜂房蜜蜂球菌都有一定的抑菌效果，其中甘草對蜂房蜜蜂球菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到23.00mm，然后依次是大青葉、連翹、茜草、金銀花、夏枯草、羅漢果、丹參、山楂及菊花（抑菌圈直徑前10的中草藥）。（表1）表1.34種中草藥對蜂房蜜蜂球菌的抑菌圈直徑編號藥名抑菌圈（mm）敏感程度1山楂葉12.21++2山楂14.05++3薄荷13.15++4蒲公英12.70++5枸杞11.14++6紫錐菊12.68++7靈芝10.14++8金銀花16.91+++9山藥8.14+10羅漢果15.92+++11茜草18.66+++12菊花13.79++13連翹20.00+++14甘草23.00+++15丹參15.00+++16夏枯草16.00+++17大青葉21.00+++18丁香<10.00+19黃連<15.00++202122232425黃岑菊花蒲公英板藍根馬齒莧金銀花<15.0013.79<15.00<15.00<15.00<15.00++++++++++++2627282930313233火麻仁柏子仁白頭翁魚腥草通草百部當歸土茯苓00000000－－－－－－－－34蒼耳子0－注：+++表示敏感，++表示中度敏感，+表示低度敏感，“－”表示不抑制蜂房蜜蜂球菌。3.2.5中草藥組合物配方的優化篩選按照表2中的配比，取中草藥組合物，制備中草藥組合物水提劑，利用牛津杯法檢測不同組合及不同比例的中草藥組合物水提藥液對蜂房蜜蜂球菌的抑制效果。結果顯示，連翹:甘草:大青葉按1：1：1配比，對蜂房蜜蜂球菌具有最好的抑菌效果，抑菌圈直徑達到24mm,具有協同增效的現象。同時，連翹:甘草（1:1）、連翹:大青葉（1:1）、甘草:大青葉（1:1）的組合對蜂房蜜蜂球菌也具有較好的抑菌效果，抑菌直徑分別為21mm、20mm及20mm。此外，在利用茜草為主要配方的組合中，茜草、金銀花（4:1）的組合對蜂房蜜蜂球菌具有最好的抑菌效果，抑菌圈直徑達到19mm，且隨著茜草比例的增加，抑菌圈直徑也增大。表2.不同組合、比例中草藥組合物水提藥液對蜂房蜜蜂球菌抑菌圈直徑中草藥組合物配方重量份數比直徑∕mm判定標準（mm）D<10低度敏感10≤D≤15中度敏感D>15敏感連翹:甘草1:121－－＋連翹:夏枯草1:118－－＋連翹:大青葉1:120－－＋甘草:夏枯草1:118－－＋甘草:大青葉1:120－－＋夏枯草:大青葉1:118－－＋連翹:甘草:夏枯草1:1:119－－＋連翹:甘草:大青葉1:1:124－－＋連翹:夏枯草:大青葉1:1:118－－＋甘草:夏枯草:大青葉1:1:119－－＋連翹:甘草:夏枯草:大青葉1:1:1:117－－＋茜草、金銀花1:117－－＋茜草、金銀花2:117－－＋茜草、金銀花3:118－－＋茜草、金銀花4:119－－＋茜草、金銀花1:216－－＋茜草、金銀花1:316－－＋茜草、金銀花1:416－－＋茜草、菊花1:114－＋－茜草、山楂1:113－＋－茜草、金銀花、菊花、山楂1:1:1:115－－＋茜草、金銀花、菊花、山楂2：1：1：116－－＋茜草、金銀花、菊花、山楂4：2：1：117－－＋3.2.6不同中草藥組合干粉提取物抑制蜂房蜜蜂球菌效果為了比較中草藥水提物與干粉提取物對蜂房蜜蜂球菌的抑制效果，我們選取了成本相對較低的以茜草為主的中草藥組合，制備其干粉提取物，采用牛津杯法檢測干粉提取物對蜂房蜜蜂球菌的抑制效果。結果顯示，各中草藥配方的干粉提取物對蜂房蜜蜂球菌的抑菌圈均小于相應的水提物抑菌圈，說明水提法更能有效提取中草藥中的有效抑菌成分。表3四種中草藥干粉提取物的抑菌效果及其配方蜜蜂球菌對其敏感性配方重量份數比抑菌圈直徑（mm）敏感程度茜草、金銀花1:112.29++茜草、菊花1:17.96+茜草、山楂1:110.92++茜草、金銀花、菊花、山楂1:1:1:112.01++綜合以上實驗結果，在單個中草藥組分中，甘草對蜂房蜜蜂球菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到23.00mm，然后依次是大青葉、連翹、茜草、金銀花、夏枯草、羅漢果、丹參、山楂及菊花。部分中草藥組合配方可以顯著提高對蜂房蜜蜂球菌的抑菌效果，如連翹:甘草:大青葉按1：1：1配比，達到了最好的抑菌效果，抑菌圈直徑達到24mm。而考慮到成本因素時，茜草，茜草：金銀花（4:1）組合具有較低的成本，且對蜂房蜜蜂球菌也具有最好的抑菌效果，抑菌圈直徑分別達到18.66mm和19mm。四、與國際、國外同類標準技術內容的對比情況，或者與測試的國外樣品、樣機的有關數據對比情況無。五、以國際標準為基礎的起草情況，以及是否合規引用或者采用國際國外標準，并說明未采用國際標準的原因目前利用中草藥防治歐幼病無國際標準和國外先進標準可參照。本標準在制定過程中對利用中草藥防治歐幼病的研究進展、實際應用情況及市場進行了充分的調查研究，并廣泛征求和采納了國內相關領域專家的意見和建議，所制定的標準適合我國國情，具有先進性、科學性、實用性和可操作性。六、與有關法律、行政法規及相關標準的關系標準所確定的各項技術指標和內容符合我國現行的有關方針、政策，并與相關法律、法規、標準吻合。本標準頒布實施后，填補行業利用中草藥防治歐幼病標準方法的空白，更有利于行業應用；與現行的法律、法規及相關標準沒有矛盾。七、重大分歧意見的處理經過和依據本標準無重大分歧意見。八、涉及專利的有關說明本標準未明確涉及某一具體專利，但某些內容可能涉及專利，本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。九、實施團體標準的要求，以及組織措施、技術措施、過渡期和實施日期的建議等措施建議（1）首先應在實施前保證文本的充足供應，讓每個使用者都能及時得到文本；（2）為了貫徹好本標準，使其有效發揮作用，建議在標準發布后、實施前應將信息在媒體上廣為宣傳，并在相關企業和檢測機構進行宣傳和貫徹，組織有關部門和人員進行學習和培訓。