GSDMD介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡促進(jìn)放射性肝病進(jìn)展的機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義放射性肝病（Radiation-inducedliverdisease，RILD），又被稱作放射性肝炎，是肝臟組織在受到一定劑量的放射線照射后，肝細(xì)胞發(fā)生一系列生理病理變化而引發(fā)的肝組織損傷。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞和分子生物學(xué)過(guò)程。RILD的發(fā)生與肝臟受照體積、受照劑量及肝功狀態(tài)等綜合因素密切相關(guān)。隨著放療在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用，RILD的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重限制了放療的劑量和療效，成為影響患者預(yù)后的重要因素。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，在接受放療的肝癌患者中，RILD的發(fā)生率可達(dá)10%-30%，且一旦發(fā)生，患者的生存率顯著降低，中位生存期僅為3-6個(gè)月。目前臨床上對(duì)于RILD缺乏有效的治療手段，主要以對(duì)癥支持治療為主，如使用利尿劑減輕腹水、補(bǔ)充白蛋白等，但這些治療方法往往難以從根本上改善患者的病情，患者的預(yù)后較差。因此，深入探究RILD的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)，具有重要的臨床意義。細(xì)胞焦亡作為一種新型的程序性細(xì)胞死亡方式，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。它是一種依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）的細(xì)胞死亡過(guò)程，其形態(tài)學(xué)特征、發(fā)生及調(diào)控機(jī)制與凋亡、壞死等細(xì)胞死亡方式明顯不同。細(xì)胞焦亡主要通過(guò)經(jīng)典途徑NOD樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體活化Caspase-1，進(jìn)而裂解效應(yīng)蛋白消化道皮膚素D（GSDMD），釋放白細(xì)胞介素-18（IL-18）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等促炎細(xì)胞因子，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。越來(lái)越多的研究表明，細(xì)胞焦亡與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝纖維化和肝癌等病變過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。在非酒精性脂肪性肝病中，肝細(xì)胞的焦亡會(huì)導(dǎo)致肝臟炎癥的加劇和脂肪變性的加重，進(jìn)而促進(jìn)疾病的進(jìn)展。在肝纖維化的發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞焦亡所釋放的炎癥因子能夠激活肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，導(dǎo)致肝臟纖維化的形成。GSDMD作為細(xì)胞焦亡通路中的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，在其中扮演著核心角色。正常情況下，GSDMD以無(wú)活性的前體形式存在于細(xì)胞中。當(dāng)細(xì)胞受到病原體感染或其他損傷刺激時(shí)，NLRP3炎癥小體被激活，募集并激活Caspase-1，活化的Caspase-1會(huì)特異性地切割GSDMD，使其N端結(jié)構(gòu)域（GSDMD-N）釋放。GSDMD-N具有很強(qiáng)的膜結(jié)合能力，能夠插入細(xì)胞膜，形成直徑約10-14nm的孔道，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物外流，最終引發(fā)細(xì)胞焦亡。同時(shí)，GSDMD的激活還會(huì)促進(jìn)IL-1β和IL-18等促炎細(xì)胞因子的成熟和釋放，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，加重組織損傷。在急性肝衰竭的研究中發(fā)現(xiàn)，GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡會(huì)通過(guò)上調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白1/CC趨化因子受體2，招募巨噬細(xì)胞，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，從而加速急性肝衰竭的進(jìn)展。在放射性肝病的研究領(lǐng)域，盡管目前已經(jīng)對(duì)其發(fā)病機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí)，但仍存在許多未知之處。關(guān)于GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡在放射性肝病進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究尚處于起步階段，相關(guān)報(bào)道較少。深入探討這一機(jī)制，有望揭示放射性肝病發(fā)病的新機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和思路。如果能夠明確GSDMD在放射性肝病中的作用機(jī)制，就有可能通過(guò)干預(yù)GSDMD的激活或其下游信號(hào)通路，來(lái)抑制肝細(xì)胞焦亡，減輕肝臟炎癥和損傷，從而改善患者的預(yù)后。這對(duì)于提高放射性肝病的治療水平，降低其發(fā)病率和死亡率，具有重要的科學(xué)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。1.2研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入揭示GSDMD介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡在放射性肝病進(jìn)展過(guò)程中的作用和內(nèi)在機(jī)制。通過(guò)多維度的研究手段，從細(xì)胞、動(dòng)物模型以及臨床樣本等層面展開探索，期望為放射性肝病的防治策略提供全新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體而言，本研究擬解決以下關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題：在放射性肝病中，GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡是否發(fā)生以及在何時(shí)、何種程度下發(fā)生？放射線照射如何影響肝細(xì)胞中GSDMD的表達(dá)和活化水平？這一過(guò)程與正常肝臟組織中的情況存在怎樣的差異？GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡通過(guò)何種具體信號(hào)通路和分子機(jī)制促進(jìn)放射性肝病的進(jìn)展？在這一過(guò)程中，是否存在其他關(guān)鍵分子或信號(hào)通路與之相互作用，共同調(diào)控疾病的發(fā)展？干預(yù)GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡對(duì)放射性肝病的病情發(fā)展會(huì)產(chǎn)生怎樣的影響？能否通過(guò)抑制或促進(jìn)這一過(guò)程來(lái)改善放射性肝病的病理變化和預(yù)后？如果可以，其最佳的干預(yù)時(shí)機(jī)和方式是什么？1.3研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及分子生物學(xué)技術(shù)等多種手段，從不同層面深入探究GSDMD介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡促進(jìn)放射性肝病進(jìn)展的作用和機(jī)制。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選擇人正常肝細(xì)胞系LO2和人肝癌細(xì)胞系HepG2作為研究對(duì)象，以不同劑量的X射線對(duì)其進(jìn)行照射，構(gòu)建體外肝細(xì)胞放射性損傷模型。利用CCK-8實(shí)驗(yàn)、EdU實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力、DNA合成能力和細(xì)胞周期分布，以評(píng)估射線照射對(duì)肝細(xì)胞活力和增殖的影響。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)GSDMD、Caspase-1、IL-1β、IL-18等細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，運(yùn)用免疫熒光染色技術(shù)觀察GSDMD在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá)變化，從而明確射線照射后肝細(xì)胞焦亡的發(fā)生情況。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GSDMD在肝細(xì)胞焦亡中的作用，采用RNA干擾技術(shù)（RNAi）沉默GSDMD基因的表達(dá)，或轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)GSDMD的質(zhì)粒，然后再次進(jìn)行射線照射，觀察細(xì)胞焦亡水平的變化以及細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的改變。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選取健康的C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和照射組。采用直線加速器對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行局部照射，建立小鼠放射性肝病模型。在照射后的不同時(shí)間點(diǎn)，處死小鼠并采集肝臟組織和血清樣本。通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色以及天狼星紅染色觀察肝臟組織的病理學(xué)變化，評(píng)估肝損傷程度和纖維化程度。采用生化指標(biāo)檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）等肝功能指標(biāo)的水平，以反映肝臟的損傷情況。利用ELISA法檢測(cè)血清和肝臟組織勻漿中IL-1β、IL-18等炎癥因子的含量，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察肝臟組織中GSDMD、Caspase-1等蛋白的表達(dá)和分布情況。為了探究干預(yù)GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡對(duì)放射性肝病的影響，在照射前或照射后給予小鼠GSDMD抑制劑（如Necrosulfonamide）或激動(dòng)劑，觀察小鼠肝臟病理變化、肝功能指標(biāo)以及炎癥因子水平的改變。分子生物學(xué)技術(shù)：采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞和肝臟組織中GSDMD、NLRP3、Caspase-1等相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，以從基因?qū)用娼沂酒湓诜派湫愿尾≈械淖兓?guī)律。運(yùn)用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)和蛋白質(zhì)譜分析篩選與GSDMD相互作用的蛋白，通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)GSDMD介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡的潛在信號(hào)通路，然后利用Westernblot、免疫熒光等技術(shù)對(duì)關(guān)鍵信號(hào)通路中的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。此外，還將構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體，檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與GSDMD啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合活性，以明確GSDMD表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)構(gòu)建放射性損傷模型，接著從細(xì)胞水平、動(dòng)物水平以及分子水平對(duì)GSDMD介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡促進(jìn)放射性肝病進(jìn)展的作用和機(jī)制進(jìn)行研究，最后通過(guò)干預(yù)GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡，觀察其對(duì)放射性肝病的治療效果。通過(guò)這一系列的研究方法和技術(shù)路線，有望全面揭示GSDMD在放射性肝病中的作用機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和策略。[此處插入技術(shù)路線圖1]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1放射性肝病概述放射性肝病是一種因肝臟組織受到一定劑量放射線照射，進(jìn)而引發(fā)肝細(xì)胞一系列生理病理變化，最終導(dǎo)致肝組織損傷的病癥。在臨床上，放射性肝病主要表現(xiàn)出多種癥狀，包括肝功能異常，如轉(zhuǎn)氨酶升高、膽紅素升高等；腹水，這是由于肝功能受損，導(dǎo)致液體在腹腔內(nèi)積聚；黃疸，患者的皮膚和眼睛會(huì)出現(xiàn)黃染現(xiàn)象，這是膽紅素代謝障礙的結(jié)果；肝性腦病，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)神經(jīng)精神癥狀，如意識(shí)障礙、行為異常等。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，在接受放療的肝癌患者中，放射性肝病的發(fā)生率約在10%-30%。這一疾病的發(fā)生嚴(yán)重限制了放療在癌癥治療中的劑量提升，進(jìn)而影響了放療的療效，成為制約患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。放射性肝病的發(fā)病與多種危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。肝臟受照體積是一個(gè)重要因素，當(dāng)受照體積越大，肝臟受到的損傷也就越嚴(yán)重，發(fā)生放射性肝病的風(fēng)險(xiǎn)也就越高。受照劑量同樣關(guān)鍵，隨著劑量的增加，肝細(xì)胞受到的損害程度加劇，疾病發(fā)生的可能性顯著上升。此外，患者自身的肝功狀態(tài)也起著重要作用，肝功能較差的患者在接受放療時(shí)，更容易受到放射線的影響，從而引發(fā)放射性肝病。在一項(xiàng)針對(duì)100例接受放療的肝癌患者的研究中，發(fā)現(xiàn)受照體積超過(guò)肝臟總體積30%的患者，放射性肝病的發(fā)生率高達(dá)40%，而受照劑量超過(guò)60Gy的患者，發(fā)生率更是達(dá)到了50%。同時(shí)，合并有肝硬化等基礎(chǔ)肝病的患者，其發(fā)生放射性肝病的風(fēng)險(xiǎn)是肝功能正常患者的2-3倍。在診斷方面，放射性肝病主要依據(jù)患者的放療病史、典型臨床表現(xiàn)以及相關(guān)檢查來(lái)綜合判斷。對(duì)于有明確放療史，且在放療后出現(xiàn)上述肝功能異常、腹水、黃疸等癥狀的患者，應(yīng)高度懷疑放射性肝病的可能。實(shí)驗(yàn)室檢查中，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）等指標(biāo)的升高，以及堿性磷酸酶（ALP）的顯著升高，都有助于診斷。影像學(xué)檢查如CT、MRI等也具有重要價(jià)值，在CT圖像上，放射性肝病常表現(xiàn)為肝放療劑量區(qū)周圍出現(xiàn)寬窄不一、形狀各異的低密度區(qū)，與肝臟解剖結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)；增強(qiáng)掃描時(shí)，在不同階段呈現(xiàn)出不同的強(qiáng)化特點(diǎn)，有助于與其他肝臟疾病相鑒別。對(duì)于一些難以確診的病例，肝穿刺活檢進(jìn)行病理檢查可以明確診斷，其典型病理表現(xiàn)為照射區(qū)肝臟靜脈閉塞癥，根據(jù)病程不同可分為急性期、亞急性期和慢性期，急性期主要表現(xiàn)為中央肝小葉腫脹、充血，肝竇明顯破壞；慢性期改變?yōu)榈湫偷母斡不憩F(xiàn)為嚴(yán)重的血管損傷、肝細(xì)胞萎縮，小葉坍陷、變形，以門靜脈和膽管為中心的脈管纖維化；亞急性期則兼有急性、慢性期的改變。2.2細(xì)胞焦亡的機(jī)制與特點(diǎn)細(xì)胞焦亡是一種炎癥性程序性細(xì)胞死亡方式，其英文“Pyroptosis”一詞由希臘詞根“pyro”（意為著火、發(fā)燒）和“ptosis”（意為下降）組合而成，生動(dòng)地反映了這種死亡方式的炎癥本質(zhì)。它在形態(tài)學(xué)、生化特征以及發(fā)生機(jī)制上，都與凋亡、壞死等其他細(xì)胞死亡方式存在顯著差異。在形態(tài)學(xué)方面，細(xì)胞焦亡表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大，直至細(xì)胞膜破裂，形成大量的膜泡結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。與細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞膜保持完整并形成凋亡小體，以及細(xì)胞壞死時(shí)細(xì)胞膜迅速破裂、細(xì)胞內(nèi)容物瞬間釋放的特征明顯不同。在一項(xiàng)關(guān)于巨噬細(xì)胞的研究中，通過(guò)電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)生焦亡的巨噬細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)許多大小不一的泡狀結(jié)構(gòu)，這些泡狀結(jié)構(gòu)逐漸融合，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物溢出到細(xì)胞外環(huán)境中。而凋亡的巨噬細(xì)胞則呈現(xiàn)出細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)凝集、細(xì)胞體積變小等特征，細(xì)胞膜完整且包裹著凋亡小體。壞死的巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)為細(xì)胞膜的突然破裂，細(xì)胞內(nèi)容物迅速泄漏，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則。細(xì)胞焦亡的生化特征主要包括炎癥小體的形成、Caspase和Gasdermin的激活以及大量促炎癥因子的釋放。炎癥小體是一種由模式識(shí)別受體（PRR）、銜接蛋白ASC和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）組成的多蛋白復(fù)合物，在細(xì)胞焦亡的啟動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到病原體相關(guān)分子模式（PAMP）或損傷相關(guān)分子模式（DAMP）等刺激時(shí)，PRR會(huì)識(shí)別這些危險(xiǎn)信號(hào)，并招募ASC和Caspase，形成炎癥小體。經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑主要依賴于Caspase-1的激活，非經(jīng)典途徑則涉及Caspase-4、Caspase-5（人源）或Caspase-11（鼠源）的活化。激活的Caspase會(huì)特異性地切割Gasdermin家族蛋白，其中研究最為廣泛的是GSDMD。GSDMD被切割后，其N端結(jié)構(gòu)域（GSDMD-N）會(huì)釋放出來(lái)，并多聚化形成直徑約10-14nm的膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)容物外流，同時(shí)也促進(jìn)了白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）等促炎細(xì)胞因子的成熟和釋放，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到細(xì)菌脂多糖（LPS）刺激時(shí)，LPS會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體識(shí)別，激活炎癥小體，進(jìn)而活化Caspase-1。活化的Caspase-1切割GSDMD，釋放出GSDMD-N，GSDMD-N在細(xì)胞膜上形成孔道，使得細(xì)胞內(nèi)的IL-1β和IL-18前體得以釋放到細(xì)胞外，在細(xì)胞外被進(jìn)一步加工成成熟的IL-1β和IL-18，引發(fā)炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡主要通過(guò)經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑發(fā)生。經(jīng)典途徑依賴于Caspase-1的激活，在細(xì)菌、病毒等病原體感染或細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體NLRP3、NLRP1b、NLRC4等會(huì)識(shí)別PAMP或DAMP，招募銜接蛋白ASC和Caspase-1前體，形成炎癥小體。炎癥小體組裝完成后，會(huì)激活Caspase-1，活化的Caspase-1一方面切割I(lǐng)L-1β和IL-18前體，使其成熟并釋放；另一方面切割GSDMD，產(chǎn)生GSDMD-N，引發(fā)細(xì)胞焦亡。在巨噬細(xì)胞感染金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁成分作為PAMP被巨噬細(xì)胞內(nèi)的NLRP3識(shí)別，NLRP3招募ASC和Caspase-1前體，形成炎癥小體。炎癥小體激活Caspase-1，Caspase-1切割I(lǐng)L-1β和IL-18前體，使其成熟并釋放到細(xì)胞外，同時(shí)切割GSDMD，GSDMD-N在細(xì)胞膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡。非經(jīng)典途徑則由來(lái)自革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS）直接激活Caspase-4、Caspase-5（人源）或Caspase-11（鼠源），這些Caspase切割GSDMD，引發(fā)細(xì)胞焦亡。在非經(jīng)典途徑中，雖然IL-1β和IL-18前體的裂解仍然依賴于Caspase-1的活性，但Caspase-4、Caspase-5或Caspase-11可以直接識(shí)別LPS并被激活，繞過(guò)了經(jīng)典途徑中炎癥小體的形成步驟。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到大腸桿菌感染時(shí)，大腸桿菌釋放的LPS可以直接與細(xì)胞內(nèi)的Caspase-11結(jié)合，激活Caspase-11。激活的Caspase-11切割GSDMD，引發(fā)細(xì)胞焦亡。同時(shí)，Caspase-11還可以間接激活Caspase-1，促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟和釋放。細(xì)胞焦亡與其他細(xì)胞死亡方式既有區(qū)別又存在一定的聯(lián)系。與細(xì)胞凋亡相比，細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，主要依賴于Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等凋亡相關(guān)Caspase的激活，其過(guò)程不伴有炎癥反應(yīng)。而細(xì)胞焦亡則是一種炎癥性程序性細(xì)胞死亡，依賴于炎性Caspase的激活，會(huì)釋放大量促炎細(xì)胞因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)發(fā)生染色質(zhì)凝集、細(xì)胞核碎片化等現(xiàn)象，細(xì)胞膜會(huì)內(nèi)陷形成凋亡小體，這些凋亡小體會(huì)被吞噬細(xì)胞吞噬清除，不會(huì)引起炎癥反應(yīng)。而在細(xì)胞焦亡過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)發(fā)生腫脹、細(xì)胞膜破裂等現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外，激活炎癥反應(yīng)。然而，在某些情況下，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡也可能相互轉(zhuǎn)化。在化療藥物處理腫瘤細(xì)胞時(shí)，如果腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)GSDME，激活的Caspase-3會(huì)切割GSDME，將原本的細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)化為細(xì)胞焦亡。與細(xì)胞壞死相比，細(xì)胞壞死通常是一種非程序性的細(xì)胞死亡，是由于物理、化學(xué)等外界因素導(dǎo)致細(xì)胞膜的突然破裂，細(xì)胞內(nèi)容物迅速釋放，引起周圍組織的炎癥反應(yīng)。而細(xì)胞焦亡雖然也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞內(nèi)容物釋放，但它是一種程序性的細(xì)胞死亡，受到特定信號(hào)通路的調(diào)控。在細(xì)胞壞死過(guò)程中，細(xì)胞的死亡是隨機(jī)的，沒(méi)有明顯的信號(hào)通路參與。而在細(xì)胞焦亡過(guò)程中，細(xì)胞的死亡是由特定的信號(hào)通路激活引起的，具有一定的程序性。細(xì)胞焦亡與其他細(xì)胞死亡方式在不同的生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮著各自獨(dú)特的作用，它們之間的相互關(guān)系也為深入理解細(xì)胞死亡的調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。2.3GSDMD的結(jié)構(gòu)與功能GSDMD在gasdermin家族中占據(jù)著核心地位，是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。人類gasdermin家族包含GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME/DFNA5和PVJK/DFNB59六個(gè)成員，其中GSDMD的研究最為廣泛和深入。GSDMD基因定位于人染色體8q24.3，其編碼的蛋白質(zhì)由534個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為59kDa。GSDMD蛋白包含兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：N端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（GSDMD-N）和C端抑制結(jié)構(gòu)域（GSDMD-C）。在未被激活的狀態(tài)下，GSDMD的C端結(jié)構(gòu)域通過(guò)分子內(nèi)相互作用，緊密結(jié)合并抑制N端結(jié)構(gòu)域的活性，使其處于無(wú)活性的前體狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到病原體感染、炎癥刺激或其他損傷信號(hào)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的炎癥小體被激活，招募并活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）。在經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑中，活化的Caspase-1會(huì)特異性地切割GSDMD，在天冬氨酸殘基（Asp276）處將其裂解為N端和C端兩個(gè)片段。被切割釋放的GSDMD-N具有高度的膜結(jié)合活性，能夠迅速轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，并發(fā)生多聚化，形成直徑約10-14nm的孔道結(jié)構(gòu)。這些孔道的形成導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性急劇增加，細(xì)胞內(nèi)的離子失衡，水分子大量涌入，細(xì)胞發(fā)生腫脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，GSDMD-N形成的孔道還為白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）等促炎細(xì)胞因子的釋放提供了通道，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，吸引免疫細(xì)胞聚集到炎癥部位，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御反應(yīng)。GSDMD的表達(dá)和活化受到多種機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控。在轉(zhuǎn)錄水平上，一些轉(zhuǎn)錄因子如核因子-κB（NF-κB）、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）等可以結(jié)合到GSDMD基因的啟動(dòng)子區(qū)域，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性。在炎癥刺激下，NF-κB被激活并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，與GSDMD基因啟動(dòng)子上的特定序列結(jié)合，促進(jìn)GSDMD的轉(zhuǎn)錄，從而增加細(xì)胞內(nèi)GSDMD蛋白的表達(dá)水平。在翻譯后修飾方面，GSDMD可以發(fā)生多種修飾，如磷酸化、棕櫚酰化等，這些修飾能夠影響GSDMD的穩(wěn)定性、活性以及與其他蛋白的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD的棕櫚酰化修飾能夠增強(qiáng)其與Caspase-1的相互作用，促進(jìn)GSDMD的切割和活化，從而推動(dòng)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。細(xì)胞內(nèi)還存在一些負(fù)調(diào)控因子，如Gasdermin結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白（GSDMD-bindingprotein，GBP）等，它們可以與GSDMD相互作用，抑制GSDMD的活化和細(xì)胞焦亡的發(fā)生。GBP能夠與GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻止其多聚化和膜孔形成，從而發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。這些復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制確保了GSDMD在正常生理狀態(tài)下保持低水平表達(dá)和非活化狀態(tài)，只有在細(xì)胞受到適當(dāng)?shù)拇碳r(shí)，才會(huì)被精準(zhǔn)激活，啟動(dòng)細(xì)胞焦亡程序，維持機(jī)體的免疫平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。三、GSDMD介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡在放射性肝病中的作用3.1放射性肝病中肝細(xì)胞焦亡的發(fā)生為了深入探究放射性肝病中肝細(xì)胞焦亡的發(fā)生情況，本研究首先對(duì)臨床樣本進(jìn)行了詳細(xì)分析。收集了接受放療后出現(xiàn)放射性肝病癥狀患者的肝臟組織樣本，同時(shí)選取了未接受放療且肝功能正常的肝臟組織作為對(duì)照樣本。對(duì)這些樣本進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，放射性肝病患者的肝臟組織呈現(xiàn)出明顯的病理變化，肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、氣球樣變，部分肝細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)容物溢出，呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞焦亡形態(tài)學(xué)特征。而對(duì)照組肝臟組織的肝細(xì)胞形態(tài)則較為正常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列有序。進(jìn)一步運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，對(duì)肝臟組織樣本中的GSDMD、Caspase-1和IL-1β等細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在放射性肝病患者的肝臟組織中，GSDMD、Caspase-1和IL-1β的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組。在細(xì)胞核周圍和細(xì)胞膜上可以觀察到明顯的GSDMD陽(yáng)性染色，Caspase-1的表達(dá)也明顯增強(qiáng)，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。IL-1β則在細(xì)胞間質(zhì)和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。這表明在放射性肝病中，肝細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白被激活，細(xì)胞焦亡通路可能被啟動(dòng)。為了更直觀地觀察細(xì)胞焦亡的發(fā)生情況，采用TUNEL染色和碘化丙啶（PI）染色相結(jié)合的方法，對(duì)肝臟組織切片進(jìn)行雙染。TUNEL染色可以特異性地標(biāo)記凋亡和焦亡細(xì)胞中的DNA斷裂，而PI染色則可以標(biāo)記細(xì)胞膜受損的細(xì)胞。通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在放射性肝病患者的肝臟組織切片中，出現(xiàn)了大量TUNEL陽(yáng)性和PI陽(yáng)性的細(xì)胞，這些細(xì)胞呈現(xiàn)出明亮的綠色和紅色熒光，表明這些細(xì)胞發(fā)生了DNA斷裂和細(xì)胞膜損傷，符合細(xì)胞焦亡的特征。而在對(duì)照組肝臟組織切片中，TUNEL陽(yáng)性和PI陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量極少。為了進(jìn)一步驗(yàn)證臨床樣本分析的結(jié)果，本研究建立了小鼠放射性肝病模型。選取健康的C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和照射組。采用直線加速器對(duì)照射組小鼠的肝臟進(jìn)行局部照射，劑量為15Gy，模擬臨床放療過(guò)程。對(duì)照組小鼠則不進(jìn)行照射處理。在照射后的不同時(shí)間點(diǎn)（3天、7天、14天、28天），處死小鼠并采集肝臟組織樣本。對(duì)小鼠肝臟組織樣本進(jìn)行病理分析，HE染色結(jié)果顯示，在照射后3天，小鼠肝臟組織開始出現(xiàn)輕微的炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度腫脹；照射后7天，炎癥反應(yīng)加重，肝細(xì)胞腫脹明顯，部分肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，可見少量細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)改變；照射后14天，肝細(xì)胞損傷進(jìn)一步加劇，細(xì)胞焦亡現(xiàn)象更為明顯，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多；照射后28天，肝臟組織出現(xiàn)明顯的纖維化改變，細(xì)胞焦亡數(shù)量仍維持在較高水平。而對(duì)照組小鼠肝臟組織在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均保持正常的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)小鼠肝臟組織中細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，照射組小鼠肝臟組織中GSDMD、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)水平在照射后均顯著上調(diào)。在照射后7天，GSDMD的表達(dá)開始明顯升高，Caspase-1的活化形式也顯著增加，同時(shí)IL-1β和IL-18的表達(dá)水平也隨之升高。隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，這些蛋白的表達(dá)水平持續(xù)上升，在照射后28天達(dá)到峰值。這進(jìn)一步證實(shí)了在放射性肝病小鼠模型中，肝細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和活化明顯增強(qiáng)，細(xì)胞焦亡發(fā)生。為了觀察細(xì)胞焦亡在肝臟組織中的具體分布情況，利用免疫熒光染色技術(shù)對(duì)小鼠肝臟組織切片進(jìn)行檢測(cè)。將GSDMD抗體與熒光標(biāo)記的二抗結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在照射組小鼠肝臟組織中，GSDMD呈現(xiàn)出強(qiáng)陽(yáng)性熒光信號(hào)，主要分布在肝細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，且在損傷較為嚴(yán)重的區(qū)域，GSDMD的表達(dá)更為明顯。而對(duì)照組小鼠肝臟組織中GSDMD的熒光信號(hào)較弱，分布較為均勻。綜合臨床樣本分析和動(dòng)物模型研究的結(jié)果，可以明確在放射性肝病中，肝細(xì)胞焦亡確實(shí)發(fā)生。隨著肝臟受到放射線照射，肝細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白被激活，細(xì)胞焦亡通路啟動(dòng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生焦亡，且細(xì)胞焦亡的程度與病情的發(fā)展密切相關(guān)。這為進(jìn)一步研究GSDMD介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡在放射性肝病進(jìn)展中的作用和機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.2GSDMD在放射性肝病肝細(xì)胞焦亡中的關(guān)鍵作用為了深入探究GSDMD在放射性肝病肝細(xì)胞焦亡中的關(guān)鍵作用，本研究進(jìn)行了一系列細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，選取人正常肝細(xì)胞系LO2和人肝癌細(xì)胞系HepG2，分別用不同劑量的X射線進(jìn)行照射，以構(gòu)建體外肝細(xì)胞放射性損傷模型。在照射后，采用CCK-8實(shí)驗(yàn)和EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，隨著照射劑量的增加，細(xì)胞的增殖活性顯著降低。同時(shí)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期明顯阻滯在G2/M期，這表明射線照射對(duì)肝細(xì)胞的活力和增殖產(chǎn)生了顯著的抑制作用。進(jìn)一步采用RNA干擾技術(shù)（RNAi）沉默GSDMD基因的表達(dá)，以驗(yàn)證GSDMD在肝細(xì)胞焦亡中的作用。設(shè)計(jì)并合成了針對(duì)GSDMD基因的小干擾RNA（siRNA），將其轉(zhuǎn)染到LO2和HepG2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)GSDMD蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞中GSDMD蛋白的表達(dá)量顯著降低，表明RNAi干擾效果良好。隨后，對(duì)干擾GSDMD表達(dá)后的細(xì)胞進(jìn)行射線照射，再通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞焦亡水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未干擾組相比，干擾GSDMD表達(dá)后，射線照射誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡率顯著降低，這表明沉默GSDMD基因可以有效抑制射線照射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GSDMD的作用，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)GSDMD的質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到LO2和HepG2細(xì)胞中。通過(guò)Westernblot檢測(cè)確認(rèn)GSDMD蛋白的過(guò)表達(dá)效果后，對(duì)過(guò)表達(dá)GSDMD的細(xì)胞進(jìn)行射線照射。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)GSDMD的細(xì)胞在射線照射后，細(xì)胞焦亡率明顯高于對(duì)照組，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)IL-1β和IL-18等促炎細(xì)胞因子的釋放也顯著增加。這表明過(guò)表達(dá)GSDMD可以增強(qiáng)射線照射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡，進(jìn)一步證實(shí)了GSDMD在肝細(xì)胞焦亡中的關(guān)鍵作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，為了進(jìn)一步驗(yàn)證GSDMD在放射性肝病中的關(guān)鍵作用，構(gòu)建了GSDMD基因敲除小鼠。將C57BL/6小鼠分為野生型小鼠組（WT）和GSDMD基因敲除小鼠組（GSDMD-/-），每組各10只。采用直線加速器對(duì)兩組小鼠的肝臟進(jìn)行局部照射，劑量為15Gy，建立放射性肝病小鼠模型。對(duì)照組小鼠則不進(jìn)行照射處理。在照射后的不同時(shí)間點(diǎn)（3天、7天、14天、28天），處死小鼠并采集肝臟組織和血清樣本。對(duì)肝臟組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠在照射后肝臟組織出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞腫脹、壞死，細(xì)胞焦亡現(xiàn)象明顯；而GSDMD基因敲除小鼠的肝臟組織損傷程度明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞焦亡現(xiàn)象顯著減少。通過(guò)Masson染色和天狼星紅染色評(píng)估肝臟纖維化程度，結(jié)果顯示，野生型小鼠在照射后肝臟纖維化程度逐漸加重，而GSDMD基因敲除小鼠的肝臟纖維化程度明顯低于野生型小鼠。檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和總膽紅素（TBIL）等肝功能指標(biāo)，結(jié)果表明，野生型小鼠在照射后血清中ALT、AST和TBIL水平顯著升高，而GSDMD基因敲除小鼠的這些指標(biāo)升高幅度明顯低于野生型小鼠，這說(shuō)明GSDMD基因敲除可以減輕放射性肝病小鼠的肝功能損傷。采用ELISA法檢測(cè)血清和肝臟組織勻漿中IL-1β和IL-18等炎癥因子的含量，結(jié)果顯示，野生型小鼠在照射后血清和肝臟組織中IL-1β和IL-18的含量顯著增加，而GSDMD基因敲除小鼠的這些炎癥因子含量明顯低于野生型小鼠。這表明GSDMD基因敲除可以抑制放射性肝病小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GSDMD在放射性肝病中的關(guān)鍵作用，對(duì)GSDMD基因敲除小鼠進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。將過(guò)表達(dá)GSDMD的腺病毒載體注射到GSDMD基因敲除小鼠體內(nèi)，使其肝臟組織中重新表達(dá)GSDMD。對(duì)回補(bǔ)GSDMD的小鼠進(jìn)行射線照射，結(jié)果顯示，回補(bǔ)GSDMD后，小鼠肝臟組織的損傷程度、細(xì)胞焦亡水平、炎癥因子釋放以及肝功能損傷等指標(biāo)均恢復(fù)到與野生型小鼠相似的水平。這進(jìn)一步證實(shí)了GSDMD在放射性肝病肝細(xì)胞焦亡中的關(guān)鍵作用，即GSDMD的缺失可以減輕放射性肝病的病理?yè)p傷，而重新表達(dá)GSDMD則可以恢復(fù)其促進(jìn)肝細(xì)胞焦亡和加重肝臟損傷的作用。3.3GSDMD介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡對(duì)放射性肝病病理進(jìn)程的影響在放射性肝病的發(fā)展進(jìn)程中，GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其對(duì)肝臟病理進(jìn)程的影響主要體現(xiàn)在炎癥反應(yīng)、肝功能損傷以及肝纖維化等多個(gè)關(guān)鍵方面。在炎癥反應(yīng)方面，GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡能夠引發(fā)并加劇炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)肝細(xì)胞受到放射線照射后，NLRP3炎癥小體被激活，進(jìn)而活化Caspase-1，切割GSDMD，釋放出GSDMD-N端結(jié)構(gòu)域。GSDMD-N端結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，其中包括大量的促炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）。這些促炎細(xì)胞因子具有強(qiáng)大的炎癥激活能力，它們能夠吸引單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞向肝臟炎癥部位趨化聚集。巨噬細(xì)胞被招募到肝臟后，會(huì)進(jìn)一步釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等多種炎癥因子，形成炎癥因子的“瀑布效應(yīng)”，使肝臟局部的炎癥反應(yīng)不斷放大。研究表明，在放射性肝病小鼠模型中，給予GSDMD抑制劑后，肝臟組織中IL-1β、IL-18、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)水平顯著降低，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)也明顯減少，說(shuō)明抑制GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡能夠有效減輕肝臟的炎癥反應(yīng)。在肝功能損傷方面，GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡直接損害肝細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致肝功能指標(biāo)異常。隨著肝細(xì)胞焦亡的發(fā)生，大量肝細(xì)胞受損死亡，肝臟的代謝、解毒、合成等功能受到嚴(yán)重影響。血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）等肝功能指標(biāo)會(huì)顯著升高，這是因?yàn)楦渭?xì)胞焦亡導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)氨酶釋放到血液中，同時(shí)肝臟對(duì)膽紅素的代謝能力下降，使得血清膽紅素水平升高。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，對(duì)人正常肝細(xì)胞系LO2進(jìn)行射線照射，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的ALT和AST含量明顯增加，表明細(xì)胞焦亡導(dǎo)致了肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的釋放。在放射性肝病患者和小鼠模型中，也觀察到了類似的肝功能指標(biāo)變化，且這些指標(biāo)的升高程度與肝細(xì)胞焦亡的程度呈正相關(guān)。在肝纖維化方面，GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡通過(guò)多種途徑促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。一方面，細(xì)胞焦亡釋放的炎癥因子能夠激活肝星狀細(xì)胞（HSCs），使其從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)。活化的HSCs會(huì)大量增殖，并合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），如膠原蛋白、纖連蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟組織中過(guò)度沉積，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的形成。研究表明，在放射性肝病小鼠模型中，抑制GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡可以減少炎癥因子的釋放，從而降低肝星狀細(xì)胞的活化程度，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成，減輕肝纖維化的程度。另一方面，細(xì)胞焦亡導(dǎo)致的肝細(xì)胞死亡會(huì)刺激肝臟的修復(fù)反應(yīng)，促使肝臟內(nèi)的成纖維細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步加劇細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，加速肝纖維化的進(jìn)程。通過(guò)對(duì)放射性肝病小鼠肝臟組織進(jìn)行Masson染色和天狼星紅染色，發(fā)現(xiàn)抑制GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡后，肝臟組織中的膠原纖維含量明顯減少，纖維化程度顯著降低。四、GSDMD介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡促進(jìn)放射性肝病進(jìn)展的機(jī)制4.1激活炎癥小體信號(hào)通路在放射性肝病的發(fā)病機(jī)制中，炎癥小體信號(hào)通路的激活扮演著關(guān)鍵角色，而NLRP3炎癥小體作為其中的重要成員，與GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。NLRP3炎癥小體是一種由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）前體組成的多蛋白復(fù)合物，在機(jī)體的免疫防御和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)肝臟受到放射線照射后，肝細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致?lián)p傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的釋放，如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、ATP等。這些DAMPs可以作為危險(xiǎn)信號(hào)，被NLRP3識(shí)別，從而啟動(dòng)NLRP3炎癥小體的激活過(guò)程。研究表明，在放射性肝病小鼠模型中，肝臟組織內(nèi)的HMGB1水平在照射后顯著升高，且與NLRP3炎癥小體的激活程度呈正相關(guān)。當(dāng)肝細(xì)胞受到放射線損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ATP會(huì)釋放到細(xì)胞外，細(xì)胞外的高濃度ATP可以與P2X7受體結(jié)合，導(dǎo)致離子通道開放，引起鉀離子外流，進(jìn)而激活NLRP3炎癥小體。活性氧（ROS）的產(chǎn)生也是NLRP3炎癥小體激活的重要觸發(fā)因素。放射線照射會(huì)使肝細(xì)胞內(nèi)的線粒體功能受損，電子傳遞鏈?zhǔn)茏瑁瑥亩鴮?dǎo)致ROS的大量產(chǎn)生。ROS可以通過(guò)氧化修飾蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子，造成細(xì)胞損傷，同時(shí)也可以激活NLRP3炎癥小體。在體外實(shí)驗(yàn)中，用放射線照射人正常肝細(xì)胞系LO2，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，同時(shí)NLRP3炎癥小體被激活，Caspase-1的活性增加。NLRP3炎癥小體激活后，會(huì)發(fā)生一系列的組裝和活化過(guò)程。首先，NLRP3蛋白在識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)后發(fā)生構(gòu)象改變，從而招募ASC蛋白。ASC蛋白通過(guò)其CARD結(jié)構(gòu)域與NLRP3蛋白相互作用，形成ASC-NLRP3復(fù)合物。隨后，ASC-NLRP3復(fù)合物通過(guò)其PYD結(jié)構(gòu)域招募Caspase-1前體，形成具有活性的NLRP3炎癥小體復(fù)合物。在這個(gè)過(guò)程中，NLRP3蛋白的多個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，其中NACHT結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)核苷酸結(jié)合和水解，為炎癥小體的組裝和激活提供能量；LRR結(jié)構(gòu)域則參與識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)，調(diào)節(jié)NLRP3的活性。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NLRP3蛋白的NACHT結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，導(dǎo)致核苷酸結(jié)合和水解功能受損時(shí)，NLRP3炎癥小體的組裝和激活受到顯著抑制。活化的NLRP3炎癥小體可以激活Caspase-1，使其從無(wú)活性的前體形式裂解為具有活性的p20和p10亞基。激活的Caspase-1具有多種生物學(xué)功能，一方面，它可以切割GSDMD，使其在天冬氨酸殘基（Asp276）處裂解為N端結(jié)構(gòu)域（GSDMD-N）和C端結(jié)構(gòu)域（GSDMD-C）。GSDMD-N具有很強(qiáng)的膜結(jié)合能力，能夠插入細(xì)胞膜，形成直徑約10-14nm的孔道，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的離子失衡，水分子大量涌入，細(xì)胞發(fā)生腫脹，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，引發(fā)細(xì)胞焦亡。另一方面，Caspase-1還可以切割白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）前體，使其成熟并釋放。成熟的IL-1β和IL-18具有強(qiáng)大的炎癥激活能力，它們可以吸引單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞向肝臟炎癥部位趨化聚集，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。在放射性肝病小鼠模型中，給予NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950后，肝臟組織中Caspase-1的活性顯著降低，GSDMD的切割減少，細(xì)胞焦亡水平下降，同時(shí)IL-1β和IL-18的釋放也明顯減少，肝臟的炎癥反應(yīng)得到有效緩解。除了經(jīng)典的NLRP3炎癥小體激活途徑外，在放射性肝病中還可能存在其他炎癥小體參與GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡過(guò)程。NLRC4炎癥小體也可以被某些細(xì)菌感染或DAMPs激活，進(jìn)而激活Caspase-1，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，在放射性肝病患者的肝臟組織中，NLRC4炎癥小體的表達(dá)水平也有所升高，但其具體作用和機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。一些非經(jīng)典的炎癥小體激活途徑，如Caspase-4、Caspase-5（人源）或Caspase-11（鼠源）介導(dǎo)的途徑，也可能在放射性肝病中發(fā)揮作用。這些Caspase可以直接識(shí)別革蘭氏陰性菌的脂多糖（LPS）等病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），被激活后切割GSDMD，引發(fā)細(xì)胞焦亡。雖然在放射性肝病中，細(xì)菌感染并非主要的致病因素，但在肝臟受到放射線損傷后，腸道屏障功能可能受損，導(dǎo)致腸道內(nèi)的細(xì)菌及其產(chǎn)物易位進(jìn)入肝臟，從而激活非經(jīng)典的炎癥小體途徑。目前關(guān)于非經(jīng)典炎癥小體途徑在放射性肝病中的研究還相對(duì)較少，需要進(jìn)一步的研究來(lái)明確其在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制。4.2調(diào)控細(xì)胞因子的釋放在放射性肝病的發(fā)病過(guò)程中，GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡對(duì)細(xì)胞因子的釋放起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，而白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）等細(xì)胞因子在其中扮演著核心角色，它們的釋放顯著影響著肝臟微環(huán)境和疾病的進(jìn)展。IL-1β是一種具有強(qiáng)大促炎活性的細(xì)胞因子，在GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡過(guò)程中，其釋放機(jī)制與經(jīng)典的炎癥小體激活途徑密切相關(guān)。當(dāng)肝細(xì)胞受到放射線照射后，損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、三磷酸腺苷（ATP）等釋放，這些DAMPs被NOD樣受體蛋白3（NLRP3）識(shí)別，從而激活NLRP3炎癥小體。活化的NLRP3炎癥小體招募并激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1），激活的Caspase-1一方面切割GSDMD，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡；另一方面，它能夠特異性地切割I(lǐng)L-1β前體（pro-IL-1β），使其轉(zhuǎn)化為具有生物活性的成熟IL-1β。成熟的IL-1β通過(guò)GSDMD在細(xì)胞膜上形成的孔道釋放到細(xì)胞外，引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。在放射性肝病小鼠模型中，通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，射線照射后，肝臟組織中IL-1β的表達(dá)和釋放顯著增加，且與肝細(xì)胞焦亡的程度呈正相關(guān)。研究表明，IL-1β可以激活肝臟內(nèi)的免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等，促使它們釋放更多的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，進(jìn)一步加劇肝臟的炎癥反應(yīng)。IL-1β還可以誘導(dǎo)肝臟內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的黏附和浸潤(rùn)，加重肝臟組織的損傷。IL-18同樣是一種重要的促炎細(xì)胞因子，在GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡過(guò)程中，其釋放與IL-1β類似，也依賴于Caspase-1的激活。Caspase-1切割I(lǐng)L-18前體（pro-IL-18），使其成熟并釋放。IL-18具有多種生物學(xué)功能，它可以與IL-12協(xié)同作用，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）產(chǎn)生干擾素-γ（IFN-γ），增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。在放射性肝病中，IL-18的釋放會(huì)導(dǎo)致肝臟內(nèi)的免疫細(xì)胞活化，引發(fā)過(guò)度的免疫反應(yīng)，對(duì)肝臟組織造成損傷。研究發(fā)現(xiàn)，在放射性肝病患者的血清和肝臟組織中，IL-18的水平明顯升高，且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。通過(guò)給予IL-18抗體或抑制IL-18的信號(hào)通路，可以減輕肝臟的炎癥反應(yīng)和組織損傷，提示IL-18在放射性肝病的進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。除了IL-1β和IL-18外，GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡還可能導(dǎo)致其他細(xì)胞因子的釋放，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）等。MCP-1是一種重要的趨化因子，它可以吸引單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向肝臟炎癥部位遷移，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和聚集，加重肝臟的炎癥反應(yīng)。在放射性肝病小鼠模型中，檢測(cè)到肝臟組織中MCP-1的表達(dá)顯著上調(diào)，且與肝細(xì)胞焦亡的程度相關(guān)。IL-17是一種由Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，它可以促進(jìn)肝臟內(nèi)的炎癥細(xì)胞活化，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，同時(shí)還可以刺激肝星狀細(xì)胞增殖和活化，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生。研究表明，在放射性肝病患者的肝臟組織中，IL-17的表達(dá)水平升高，且與肝纖維化的程度呈正相關(guān)。GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡通過(guò)調(diào)控IL-1β、IL-18等多種細(xì)胞因子的釋放，顯著改變了肝臟的微環(huán)境，引發(fā)了強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了免疫細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)，進(jìn)而推動(dòng)了放射性肝病的進(jìn)展。深入了解這些細(xì)胞因子在放射性肝病中的作用機(jī)制，有助于為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。4.3影響肝細(xì)胞的代謝與功能GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡對(duì)肝細(xì)胞的代謝和功能產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而推動(dòng)放射性肝病的進(jìn)展。肝臟作為人體重要的代謝器官，承擔(dān)著物質(zhì)合成、解毒、能量代謝等多種關(guān)鍵功能，而肝細(xì)胞是執(zhí)行這些功能的主要細(xì)胞類型。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，這些正常的代謝和功能會(huì)受到嚴(yán)重破壞。在物質(zhì)合成功能方面，肝細(xì)胞負(fù)責(zé)合成多種重要的蛋白質(zhì)，如白蛋白、凝血因子等。研究表明，在放射性肝病中，隨著GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡發(fā)生，肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)，導(dǎo)致白蛋白和凝血因子等合成減少。通過(guò)對(duì)放射性肝病小鼠模型的肝臟組織進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)白蛋白和凝血因子Ⅶ的表達(dá)水平在照射后明顯降低，且與肝細(xì)胞焦亡的程度呈負(fù)相關(guān)。這是因?yàn)榧?xì)胞焦亡導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)的核糖體功能受損，蛋白質(zhì)合成的起始、延伸和終止過(guò)程受到干擾，從而影響了蛋白質(zhì)的合成效率。此外，細(xì)胞焦亡釋放的炎癥因子如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，也會(huì)抑制蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步減少蛋白質(zhì)的合成。白蛋白是維持血漿膠體滲透壓的重要物質(zhì)，其合成減少會(huì)導(dǎo)致血漿膠體滲透壓降低，引起腹水等癥狀；凝血因子的減少則會(huì)影響血液的凝固功能，增加患者出血的風(fēng)險(xiǎn)。在解毒功能方面，肝臟通過(guò)一系列復(fù)雜的酶促反應(yīng)，對(duì)體內(nèi)的有害物質(zhì)進(jìn)行代謝和解毒。肝細(xì)胞中的細(xì)胞色素P450酶系是參與解毒過(guò)程的關(guān)鍵酶，它們能夠催化多種外源性和內(nèi)源性物質(zhì)的氧化、還原、水解等反應(yīng)，使其轉(zhuǎn)化為易于排出體外的物質(zhì)。在放射性肝病中，GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素P450酶系的活性顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，在受到射線照射的肝細(xì)胞中，細(xì)胞色素P4502E1、細(xì)胞色素P4503A4等關(guān)鍵酶的表達(dá)和活性均明顯下降，使得肝臟對(duì)藥物、毒素等有害物質(zhì)的代謝能力減弱。這是由于細(xì)胞焦亡破壞了肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)，而細(xì)胞色素P450酶系主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷導(dǎo)致酶的合成、折疊和運(yùn)輸過(guò)程受到影響，從而降低了酶的活性。此外，細(xì)胞焦亡引發(fā)的炎癥反應(yīng)也會(huì)抑制細(xì)胞色素P450酶系的表達(dá)，進(jìn)一步削弱肝臟的解毒功能。當(dāng)肝臟的解毒功能受損時(shí)，體內(nèi)的有害物質(zhì)不能及時(shí)被清除，會(huì)在體內(nèi)蓄積，對(duì)其他器官和組織造成損害，加重患者的病情。在能量代謝方面，肝細(xì)胞主要通過(guò)糖代謝、脂代謝和線粒體呼吸鏈等途徑產(chǎn)生能量，以維持細(xì)胞的正常生理功能。在放射性肝病中，GSDMD介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡會(huì)干擾肝細(xì)胞的能量代謝過(guò)程。研究表明，射線照射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖攝取減少，糖酵解和三羧酸循環(huán)相關(guān)酶的活性降低，從而影響葡萄糖的氧化分解和能量產(chǎn)生。通過(guò)對(duì)射線照射后的肝細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)和酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2的表達(dá)下降，己糖激酶、丙酮酸激酶等糖酵解關(guān)鍵酶以及檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶等三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶的活性均顯著降低。在脂代謝方面，細(xì)胞焦亡會(huì)導(dǎo)致脂肪酸β-氧化過(guò)程受阻，脂肪酸在肝細(xì)胞內(nèi)堆積，形成脂肪變性。這是因?yàn)榧?xì)胞焦亡破壞了線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，而脂肪酸β-氧化主要在線粒體內(nèi)進(jìn)行，線粒體的損傷使得脂肪酸β-氧化相關(guān)酶的活性降低，從而影響了脂肪酸的代謝。此外，細(xì)胞焦亡還會(huì)導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合物的表達(dá)和活性下降，影響電子傳遞和ATP的合成，進(jìn)一步降低細(xì)胞的能量水平。肝細(xì)胞能量代謝的紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，影響肝臟的正常生理功能，加速放射性肝病的進(jìn)展。五、研究結(jié)論與展望5.1研究成果總結(jié)本研究圍繞GSDMD介導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡促進(jìn)放射性肝病進(jìn)展的作用和機(jī)制展開深入探究，取得了一系列具有重要理論和實(shí)踐意義的成果。通過(guò)對(duì)臨床樣本和動(dòng)物模型的系統(tǒng)研究，明確了在放射性肝病中肝細(xì)胞焦亡確實(shí)發(fā)生。在臨床樣本中，放射性肝病患者肝臟組織呈現(xiàn)典型細(xì)胞焦亡形態(tài)，相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；小鼠放射性肝病模型中，病理分析、蛋白檢測(cè)和免疫熒光染色均證實(shí)肝細(xì)胞焦亡發(fā)生，且程度與病情發(fā)展緊密相關(guān)。深入研究GSDMD在放射性肝病肝細(xì)胞焦亡中的關(guān)鍵作用，發(fā)現(xiàn)射線照射抑制肝細(xì)胞活力和增殖，而沉默GSDMD