CD90與CD44分子表達(dá)：揭示人肝癌組織奧秘與臨床啟示一、引言1.1研究背景與意義肝癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，肝癌在癌癥相關(guān)死亡原因中位居前列，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。在中國(guó)，肝癌的發(fā)病率尤為突出，這與乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）的高感染率、黃曲霉毒素暴露、飲酒等因素密切相關(guān)。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。而且，肝癌具有易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)的放化療不敏感，導(dǎo)致患者的總體生存率較低，5年生存率僅為10%-20%左右。因此，深入研究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的診斷和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。近年來(lái)，腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs）理論的提出為腫瘤研究帶來(lái)了新的視角。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中一小部分具有自我更新、多向分化和致瘤能力的細(xì)胞，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。肝癌干細(xì)胞（LiverCancerStemCells，LCSCs）作為肝癌組織中的特殊細(xì)胞群體，其存在可能解釋了肝癌的難治性和高復(fù)發(fā)率。因此，研究肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，對(duì)于深入了解肝癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷和靶向治療具有重要意義。CD90和CD44分子作為肝癌干細(xì)胞的潛在標(biāo)志物，受到了廣泛關(guān)注。CD90，又稱Thy-1，是一種分子量約為25-37kDa的糖蛋白，最初在胸腺細(xì)胞表面被發(fā)現(xiàn)。在肝臟中，CD90主要表達(dá)于肝干細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等。研究表明，CD90陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新、增殖和侵襲能力，能夠在體內(nèi)形成腫瘤，并且對(duì)化療和放療具有更強(qiáng)的耐受性。CD44是一種跨膜糖蛋白，其主要功能是介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。CD44有多種異構(gòu)體，其中CD44v6在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在肝癌中，CD44陽(yáng)性的細(xì)胞被認(rèn)為具有干細(xì)胞特性，能夠促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。對(duì)CD90和CD44分子在人肝癌組織中的表達(dá)進(jìn)行研究，有助于進(jìn)一步了解肝癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性，揭示肝癌的發(fā)病機(jī)制。通過(guò)檢測(cè)CD90和CD44分子的表達(dá)水平，可以為肝癌的早期診斷提供潛在的生物標(biāo)志物，提高肝癌的早期診斷率。而且，針對(duì)CD90和CD44分子的靶向治療可能為肝癌的治療開(kāi)辟新的途徑，提高肝癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)CD90和CD44分子與肝癌關(guān)系的研究開(kāi)展較早。有研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)等先進(jìn)技術(shù)，從肝癌細(xì)胞系和臨床肝癌組織樣本中分離出CD90陽(yáng)性的細(xì)胞亞群。實(shí)驗(yàn)表明，這些細(xì)胞在體外具有更強(qiáng)的克隆形成能力，能夠在軟瓊脂中形成更大、更多的克隆，顯示出其強(qiáng)大的增殖能力。將CD90陽(yáng)性細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，能夠以較低的細(xì)胞數(shù)量形成腫瘤，且腫瘤生長(zhǎng)速度快，表明其致瘤性強(qiáng)。而CD90陰性細(xì)胞則表現(xiàn)出較弱的克隆形成能力和致瘤性。在對(duì)CD44分子的研究中，發(fā)現(xiàn)CD44的不同異構(gòu)體在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮不同作用。CD44v6能夠通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸結(jié)合，激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。研究人員利用基因敲除技術(shù)，在肝癌細(xì)胞系中敲低CD44v6的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，高表達(dá)CD44v6的肝癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)更容易發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。國(guó)內(nèi)的研究也取得了豐碩成果。通過(guò)免疫組化和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)大量臨床肝癌組織標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織，發(fā)現(xiàn)CD90和CD44基因mRNA在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織。從蛋白水平來(lái)看，CD90和CD44陽(yáng)性分子主要定位于癌細(xì)胞膜與細(xì)胞漿，在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)高于癌旁組織。對(duì)臨床資料進(jìn)行分析，揭示出CD90和CD44分子的表達(dá)與肝癌患者的包膜浸潤(rùn)、病理分級(jí)、臨床分期及有無(wú)門靜脈瘤栓密切相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，在肝癌復(fù)發(fā)患者的腫瘤組織中，CD90和CD44的表達(dá)水平明顯高于未復(fù)發(fā)患者，提示這兩種分子與肝癌的復(fù)發(fā)可能存在關(guān)聯(lián)。然而，目前的研究仍存在一定的局限性。大多數(shù)研究集中在CD90和CD44分子在肝癌組織中的表達(dá)差異及與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析，對(duì)于它們?cè)诟伟┌l(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的具體分子機(jī)制研究還不夠深入。雖然已知CD90和CD44與肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等過(guò)程相關(guān)，但它們所參與的信號(hào)通路以及上下游調(diào)控因子尚未完全明確。在臨床應(yīng)用方面，雖然CD90和CD44有作為肝癌診斷和預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物的潛力，但目前還缺乏大規(guī)模、多中心的臨床研究來(lái)驗(yàn)證其準(zhǔn)確性和可靠性。針對(duì)CD90和CD44分子的靶向治療研究仍處于起步階段，相關(guān)藥物的研發(fā)和臨床試驗(yàn)還需要進(jìn)一步推進(jìn)。1.3研究目的與方法本研究旨在通過(guò)對(duì)人肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織的檢測(cè)，明確CD90和CD44分子在其中的表達(dá)差異，進(jìn)而分析這些差異與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、臨床病理特征之間的關(guān)系。同時(shí)，探討CD90和CD44分子作為肝癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值，為肝癌的早期診斷和精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，將采用以下研究方法：收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院在2013年12月至2014年12月期間肝癌術(shù)后切除的組織標(biāo)本40例，以其相應(yīng)遠(yuǎn)端癌旁組織標(biāo)本作為對(duì)照，詳細(xì)記錄每位患者的臨床資料，包括年齡、性別、甲胎蛋白（AFP）水平、腫瘤大小、包膜浸潤(rùn)情況、病理分級(jí)、臨床分期以及有無(wú)門靜脈瘤栓等。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimeFluorescenceQuantitativePCR，RT-qPCR）技術(shù)，檢測(cè)兩組組織中CD90和CD44基因mRNA的表達(dá)水平，通過(guò)對(duì)mRNA表達(dá)量的精確測(cè)定，從基因?qū)用娣治鯟D90和CD44在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。利用免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）方法，檢測(cè)CD90和CD44蛋白分子在兩組組織中的表達(dá)情況，通過(guò)免疫組化染色，觀察CD90和CD44蛋白在細(xì)胞中的定位和表達(dá)強(qiáng)度，直觀地呈現(xiàn)其在組織中的分布特征。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)臨床資料和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算CD90和CD44在肝癌組織和癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率，采用卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)等方法，分析其表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，明確CD90和CD44分子表達(dá)與肝癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)聯(lián)。二、CD90和CD44分子概述2.1CD90分子結(jié)構(gòu)與功能CD90，又稱Thy-1，是一種相對(duì)分子質(zhì)量約為25-37kDa的糖蛋白，其結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性。從整體架構(gòu)來(lái)看，CD90通過(guò)糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定在細(xì)胞膜表面，這種錨定方式使其能夠穩(wěn)定地存在于細(xì)胞表面，參與細(xì)胞的多種生理活動(dòng)。在其結(jié)構(gòu)組成中，包含有免疫球蛋白超家族（IgSF）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域賦予了CD90在細(xì)胞識(shí)別和黏附等過(guò)程中的關(guān)鍵作用。IgSF結(jié)構(gòu)域具有特定的氨基酸序列和空間構(gòu)象，能夠與其他細(xì)胞表面分子或細(xì)胞外基質(zhì)中的成分進(jìn)行特異性結(jié)合。CD90分子在細(xì)胞的生理過(guò)程中扮演著極為重要的角色，在細(xì)胞識(shí)別方面，它如同細(xì)胞的“身份標(biāo)簽”之一，參與免疫細(xì)胞之間的相互識(shí)別過(guò)程。在T細(xì)胞的發(fā)育和活化過(guò)程中，CD90分子與其他免疫細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，使得T細(xì)胞能夠準(zhǔn)確識(shí)別外來(lái)病原體或異常細(xì)胞，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)，幫助機(jī)體抵御疾病的侵襲。在神經(jīng)系統(tǒng)中，CD90參與神經(jīng)元之間的識(shí)別，有助于神經(jīng)細(xì)胞之間建立正確的連接，對(duì)神經(jīng)回路的形成和功能維持起到重要作用。在細(xì)胞黏附方面，CD90促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞的有序黏附和遷移是組織和器官形成的基礎(chǔ)。CD90在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它幫助胚胎細(xì)胞之間建立穩(wěn)定的聯(lián)系，使得細(xì)胞能夠按照預(yù)定的模式進(jìn)行遷移和分化，從而確保胚胎的正常發(fā)育。在成體組織中，CD90維持細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，有助于保持組織的完整性和穩(wěn)定性。在肝臟組織中，CD90陽(yáng)性的肝干細(xì)胞與周圍的細(xì)胞外基質(zhì)緊密黏附，維持干細(xì)胞的微環(huán)境穩(wěn)定，保證干細(xì)胞的正常功能。CD90分子還參與細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控過(guò)程。研究表明，在造血干細(xì)胞的分化過(guò)程中，CD90的表達(dá)水平變化與造血干細(xì)胞向不同血細(xì)胞系的分化密切相關(guān)。當(dāng)造血干細(xì)胞向特定血細(xì)胞系分化時(shí)，CD90的表達(dá)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路相互作用，調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化方向。在腫瘤細(xì)胞中，CD90陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞相較于CD90陰性的細(xì)胞，具有更強(qiáng)的增殖能力和自我更新能力。CD90可能通過(guò)激活PI3K/Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而加速腫瘤細(xì)胞的增殖。2.2CD44分子結(jié)構(gòu)與功能CD44分子是一種廣泛存在于細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。人類CD44基因位于第11號(hào)染色體短臂上（11p13），是高度保守的單拷貝基因，由20個(gè)高度保守的外顯子構(gòu)成，其中包含10個(gè)組成型外顯子和10個(gè)變異區(qū)（V區(qū)）變異性拼接的外顯子。僅含有組成型外顯子轉(zhuǎn)錄片段的為標(biāo)準(zhǔn)型CD44轉(zhuǎn)錄子（CD44s），而V區(qū)外顯子在轉(zhuǎn)錄時(shí)隨機(jī)拼接或跳躍拼接，插入變異型拼接外顯子的則為變異型CD44（CD44v）轉(zhuǎn)錄子，理論上這種變異性拼接可產(chǎn)生1000多種CD44的變異分子。從蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)看，CD44分子可分為胞外區(qū)段、跨膜區(qū)段和胞內(nèi)區(qū)段三個(gè)部分。胞外區(qū)段又能細(xì)分為保守區(qū)段和非保守區(qū)段，保守區(qū)段的氨基端為一個(gè)B環(huán)結(jié)構(gòu)域，能夠與數(shù)種細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相結(jié)合，比如透明質(zhì)酸、纖連蛋白及膠原等，這使得CD44分子能夠介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附。非保守區(qū)段是一段具有多種變異的莖狀結(jié)構(gòu)，由CD44變異性外顯子編碼表達(dá)。沒(méi)有莖狀結(jié)構(gòu)的是標(biāo)準(zhǔn)型CD44或血液型CD44（CD44s或CD44H），而含有莖狀結(jié)構(gòu)的則為CD44v。這種結(jié)構(gòu)上的多態(tài)性使得CD44分子質(zhì)量在80-250kDa之間變化。跨膜段存在兩個(gè)早老因子依賴的蛋白酶切位點(diǎn)，近胞漿一側(cè)的位點(diǎn)水解后，胞內(nèi)段脫落形成CD44的胞內(nèi)區(qū)段（CD44-ICD），該區(qū)段可穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行調(diào)控。CD44分子在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著多方面的重要功能。在正常生理狀態(tài)下，它參與淋巴細(xì)胞歸巢過(guò)程，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞與毛細(xì)血管后小靜脈中的高柱狀內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，使得淋巴細(xì)胞能夠順利穿過(guò)血管壁回到淋巴組織，維持免疫系統(tǒng)的正常功能。CD44分子參與淋巴細(xì)胞的激活過(guò)程，當(dāng)淋巴細(xì)胞受到抗原刺激時(shí)，CD44分子與其他相關(guān)分子相互作用，激活淋巴細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促使淋巴細(xì)胞增殖、分化，發(fā)揮免疫應(yīng)答作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，CD44分子扮演著關(guān)鍵角色，尤其是在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移方面。腫瘤細(xì)胞表面的CD44分子，特別是CD44v6等變異體，能夠與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸等配體緊密結(jié)合。這種結(jié)合激活了腫瘤細(xì)胞內(nèi)一系列與遷移、侵襲相關(guān)的信號(hào)通路，如Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路。激活后的信號(hào)通路促使腫瘤細(xì)胞表達(dá)和分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2、MMP-9等，這些蛋白酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。CD44分子還參與腫瘤細(xì)胞偽足的形成，通過(guò)與細(xì)胞骨架蛋白相互作用，改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力，使腫瘤細(xì)胞能夠突破周圍組織的限制，向周圍組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。2.3CD90和CD44分子與腫瘤干細(xì)胞的關(guān)系腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞群體，這些特性使得它們?cè)谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力是其維持腫瘤細(xì)胞群體穩(wěn)定的重要基礎(chǔ)，通過(guò)不對(duì)稱分裂，一個(gè)腫瘤干細(xì)胞可以產(chǎn)生一個(gè)與自身相同的干細(xì)胞和一個(gè)分化的腫瘤細(xì)胞，從而保證腫瘤組織中始終存在具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞。多向分化能力則使腫瘤干細(xì)胞能夠分化為不同類型的腫瘤細(xì)胞，這是腫瘤組織呈現(xiàn)異質(zhì)性的重要原因之一。而且，腫瘤干細(xì)胞具有強(qiáng)大的致瘤能力，少量的腫瘤干細(xì)胞就能夠在體內(nèi)形成腫瘤，研究表明，將僅100個(gè)CD133陽(yáng)性的腦腫瘤干細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠顱內(nèi)，就可以成功誘發(fā)腫瘤，而相同數(shù)量的非腫瘤干細(xì)胞則難以形成腫瘤。在肝癌中，CD90和CD44分子被認(rèn)為是肝癌干細(xì)胞的重要標(biāo)志物，這一觀點(diǎn)得到了大量實(shí)驗(yàn)研究的支持。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)從肝癌細(xì)胞系中分離出CD90陽(yáng)性和CD44陽(yáng)性的細(xì)胞亞群。這些細(xì)胞亞群表現(xiàn)出典型的腫瘤干細(xì)胞特性，在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，CD90陽(yáng)性和CD44陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞能夠在軟瓊脂中形成大量的克隆，克隆形成率明顯高于CD90陰性和CD44陰性的細(xì)胞。這表明它們具有更強(qiáng)的自我更新和增殖能力，能夠在體外環(huán)境中不斷分裂、生長(zhǎng)，形成獨(dú)立的細(xì)胞克隆。在細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)中，這些陽(yáng)性細(xì)胞可以分化為不同類型的肝癌細(xì)胞，表現(xiàn)出多向分化的能力，進(jìn)一步證明了它們作為肝癌干細(xì)胞的特性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣驗(yàn)證了CD90和CD44陽(yáng)性細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性。將CD90陽(yáng)性或CD44陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞接種到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞能夠以較低的細(xì)胞數(shù)量形成腫瘤，且腫瘤生長(zhǎng)迅速。而接種CD90陰性和CD44陰性細(xì)胞的小鼠，腫瘤形成的概率較低，腫瘤生長(zhǎng)速度也較慢。這充分說(shuō)明CD90和CD44陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤能力，是肝癌發(fā)生的“種子”細(xì)胞。CD90和CD44分子在肝癌的起始、復(fù)發(fā)和耐藥過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。在腫瘤起始階段，CD90和CD44陽(yáng)性的肝癌干細(xì)胞通過(guò)自我更新和分化，不斷產(chǎn)生新的腫瘤細(xì)胞，逐漸形成腫瘤組織。它們能夠在肝臟組織中找到合適的微環(huán)境，定植并開(kāi)始增殖，啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生過(guò)程。在肝癌復(fù)發(fā)方面，即使在手術(shù)切除腫瘤或經(jīng)過(guò)放化療后，殘留的CD90和CD44陽(yáng)性肝癌干細(xì)胞由于其強(qiáng)大的自我更新能力和對(duì)治療的耐受性，能夠存活下來(lái)并重新增殖，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌復(fù)發(fā)患者的腫瘤組織中，CD90和CD44的表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)了它們與肝癌復(fù)發(fā)的密切關(guān)系。在耐藥性方面，CD90和CD44陽(yáng)性的肝癌干細(xì)胞具有多種耐藥機(jī)制。它們高表達(dá)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），如ABCB1、ABCG2等，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。腫瘤干細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力較強(qiáng)，當(dāng)受到化療藥物或放療的損傷時(shí)，它們能夠迅速啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，修復(fù)受損的DNA，維持細(xì)胞的存活和增殖能力。腫瘤干細(xì)胞所處的微環(huán)境也對(duì)其耐藥性產(chǎn)生影響，微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子等成分可以通過(guò)旁分泌信號(hào)通路，激活腫瘤干細(xì)胞內(nèi)的耐藥相關(guān)信號(hào)通路，增強(qiáng)其耐藥性。三、CD90和CD44分子在人肝癌組織中的表達(dá)研究設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本研究中所使用的人肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本均來(lái)源于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院。這些標(biāo)本均為2013年12月至2014年12月期間，患者行肝癌術(shù)后切除所得，共計(jì)40例。每一例標(biāo)本在獲取后，均立即進(jìn)行妥善處理，并詳細(xì)記錄下相應(yīng)患者的臨床資料，涵蓋年齡、性別、甲胎蛋白（AFP）水平、腫瘤大小、包膜浸潤(rùn)狀況、病理分級(jí)、臨床分期以及有無(wú)門靜脈瘤栓等關(guān)鍵信息。這些臨床資料的完整性和準(zhǔn)確性，對(duì)于后續(xù)深入分析CD90和CD44分子表達(dá)與肝癌臨床病理特征之間的關(guān)系至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)試劑方面，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，選用了一系列高質(zhì)量的試劑。Trizol試劑來(lái)自美國(guó)Invitrogen公司，該試劑在RNA提取領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，能夠高效、穩(wěn)定地從組織和細(xì)胞中提取總RNA，為后續(xù)的RT-qPCR實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的模板。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒同樣購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，其具備高效的逆轉(zhuǎn)錄活性，能夠?qū)⑻崛〉腞NA準(zhǔn)確地逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為基因表達(dá)量的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。SYBRGreen熒光染料購(gòu)自美國(guó)MolecularProbes公司，它是一種常用的熒光染料，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在激發(fā)光的作用下發(fā)出熒光，其熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增的DNA量成正比，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)量的精確測(cè)定。在抗體的選擇上，抗CD90和CD44單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。該公司生產(chǎn)的抗體具有高度的特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合CD90和CD44分子，確保免疫組化實(shí)驗(yàn)中對(duì)這兩種分子的檢測(cè)準(zhǔn)確性。二抗則購(gòu)自美國(guó)JacksonImmunoResearchLaboratories公司，它能夠與一抗特異性結(jié)合，并通過(guò)酶標(biāo)記或熒光標(biāo)記等方式，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)抗原的可視化檢測(cè)，增強(qiáng)免疫組化實(shí)驗(yàn)的信號(hào)強(qiáng)度和檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)中使用的儀器設(shè)備也均為先進(jìn)的科研儀器。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司的7500型，該儀器具有高精度的溫度控制模塊和靈敏的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，能夠精確地控制PCR反應(yīng)的溫度條件，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確的熒光信號(hào)檢測(cè)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和可靠性。高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，其具備強(qiáng)大的離心力和穩(wěn)定的性能，能夠在低溫條件下對(duì)樣本進(jìn)行快速離心，有效分離細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，滿足實(shí)驗(yàn)中對(duì)樣本處理的需求。光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司的BX51型，它具有高分辨率的物鏡和清晰的成像系統(tǒng)，能夠?qū)γ庖呓M化染色后的組織切片進(jìn)行清晰觀察和拍照記錄，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析。3.2實(shí)驗(yàn)方法選擇實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)是一種基于熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)的方法，在本研究中用于檢測(cè)CD90和CD44基因mRNA的表達(dá)水平。其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針，隨著DNA的擴(kuò)增，熒光染料或探針會(huì)與新合成的DNA結(jié)合，產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光信號(hào)的積累與DNA的擴(kuò)增數(shù)量呈線性關(guān)系，通過(guò)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，可以精確地計(jì)算出起始模板的濃度。在操作步驟上，首先根據(jù)樣本類型，使用Trizol試劑從肝癌組織和癌旁組織標(biāo)本中提取總RNA，利用高速冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心分離，獲取高質(zhì)量的RNA。對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度測(cè)定和調(diào)整，確保其濃度符合熒光定量PCR的要求。接著根據(jù)CD90和CD44基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，并進(jìn)行合成。將PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、引物、逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板等按照比例加入PCR管中，配置反應(yīng)體系。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司的7500型）上設(shè)置循環(huán)參數(shù)，包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，進(jìn)行熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，記錄熒光信號(hào)的強(qiáng)度和循環(huán)數(shù)。最后將熒光信號(hào)數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件中，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和循環(huán)數(shù)，計(jì)算基因的表達(dá)量。免疫組化（IHC）是利用抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)呈色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)組織和細(xì)胞中某種化學(xué)成分的一門技術(shù)，本研究利用它來(lái)檢測(cè)CD90和CD44蛋白分子在組織中的表達(dá)情況。其原理是帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過(guò)抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定。具體操作時(shí)，先將肝癌組織和癌旁組織制成石蠟切片，進(jìn)行脫蠟與水化處理，將切片依次放入60℃烤箱中烘烤20min，然后放入二甲苯中浸泡2次，每次10分鐘；再依次經(jīng)過(guò)100%無(wú)水乙醇浸泡2次，每次5分鐘；95%乙醇浸泡2分鐘；80%乙醇浸泡2分鐘；70%乙醇浸泡2分鐘；蒸餾水浸泡5min；最后用PBS洗3次，每次3min，確保抗體等其他試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。用含有0.3%雙氧水和0.5%TritonX-100的封閉通透液浸潤(rùn)切片30min（室溫避光），以封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶并使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，之后用PBS溶液洗3次，每次3min。將切片放入0.01M檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4min至沸騰后，取出冷卻至室溫，再加熱約4次，每次間隔補(bǔ)足液體，防止干片，進(jìn)行抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測(cè)率。用濾紙吸干切片周圍水分，用組化筆在組織周圍畫上圈，在圓圈內(nèi)組織滴入5%羊血清（與二抗來(lái)源一致）后放入濕盒中，室溫下孵育10-30min，封閉非特異性蛋白。甩去切片上的羊血清，用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的抗CD90和CD44單克隆抗體（一抗），放入濕盒中室溫孵育1小時(shí)，然后4℃過(guò)夜，從冰箱中取出需37℃復(fù)溫45min。將一抗倒掉并用PBS洗5min，共5次；用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37℃恒溫烤箱中孵育30min。加入SP后放入37℃烤箱中孵育30min，之后用PBS洗5次，每次5min。加入DAB進(jìn)行顯色，快速滴入并觀察染色情況，倒掉染液，顯色時(shí)間控制在約5min（3-10min），由鏡下觀察顏色控制時(shí)間。用PBS洗3次，每次3min后，用雙蒸水洗5min；加蘇木素染液進(jìn)行復(fù)染，胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染20s后自來(lái)水沖洗，雙蒸水洗5min，再用PBS返藍(lán)5min。最后進(jìn)行脫水、透明和封片處理，依次將切片放入50%乙醇浸泡1-2min，70%乙醇浸泡1-2min，95%乙醇浸泡1-2min，95%乙醇浸泡1-2min，100%無(wú)水乙醇浸泡(1-2)min，100%無(wú)水乙醇浸泡(1-2)min；放入二甲苯中透明2次，每次(1-2)min，用中性樹(shù)膠封片。免疫細(xì)胞化學(xué)染色與免疫組化原理相似，主要用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)的CD90和CD44分子進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞或從組織中分離的細(xì)胞，首先將細(xì)胞接種在預(yù)先放置有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，使細(xì)胞內(nèi)的抗原固定，防止其在后續(xù)操作中丟失或變形。固定后再次用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5min。接下來(lái)的封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、抗原修復(fù)、封閉非特異性蛋白、一抗孵育、二抗孵育、顯色等步驟與免疫組化類似，只是在操作過(guò)程中需要更加注意對(duì)細(xì)胞的保護(hù)，避免細(xì)胞脫落或損傷。顯色完成后，用蒸餾水輕輕沖洗蓋玻片，去除多余的染液，將蓋玻片從培養(yǎng)皿中取出，細(xì)胞面朝上放置在載玻片上，用中性樹(shù)膠封片，待樹(shù)膠干燥后即可在顯微鏡下觀察。流式細(xì)胞儀檢測(cè)則是利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)定量分析的技術(shù)，可用于檢測(cè)細(xì)胞表面的CD90和CD44分子表達(dá)情況。將肝癌組織或癌旁組織剪碎，用胰蛋白酶等消化液處理，使其分散成單個(gè)細(xì)胞懸液。用PBS洗滌細(xì)胞懸液2-3次，每次以1000-1500rpm離心5-10min，去除消化液和雜質(zhì)。將細(xì)胞重懸于含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10^6-1×10^7個(gè)/mL。取適量細(xì)胞懸液，分別加入抗CD90和CD44單克隆抗體，在4℃避光孵育30-60min，使抗體與細(xì)胞表面的抗原充分結(jié)合。孵育后用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，去除未結(jié)合的抗體。加入熒光標(biāo)記的二抗，在4℃避光孵育30min。再次用PBS洗滌細(xì)胞，然后將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，即可上機(jī)檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀上，通過(guò)激光照射細(xì)胞，激發(fā)熒光信號(hào)，檢測(cè)細(xì)胞表面CD90和CD44分子的表達(dá)強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例。3.3數(shù)據(jù)處理與分析方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確處理與分析是本研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，關(guān)系到研究結(jié)論的可靠性和科學(xué)性。本研究運(yùn)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)分析。在數(shù)據(jù)錄入環(huán)節(jié)，對(duì)來(lái)自實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)樣本編號(hào)進(jìn)行準(zhǔn)確錄入，避免數(shù)據(jù)混淆和錄入錯(cuò)誤。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行全面的審核，檢查數(shù)據(jù)的完整性、一致性和異常值，確保錄入的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)得到的CD90和CD44基因mRNA表達(dá)水平數(shù)據(jù)，先計(jì)算每個(gè)樣本的Ct值（CycleThreshold），即PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。Ct值與起始模板的量呈負(fù)相關(guān)，起始模板量越多，Ct值越小。通過(guò)2^-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因（如GAPDH）的相對(duì)表達(dá)量，公式為：相對(duì)表達(dá)量=2^-[(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對(duì)照組]。對(duì)相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，比較肝癌組織和癌旁組織中CD90和CD44基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則使用非參數(shù)檢驗(yàn)（如Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）進(jìn)行分析。通過(guò)t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)的結(jié)果，判斷兩組數(shù)據(jù)之間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著差異，從而明確CD90和CD44基因mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異情況。免疫組化檢測(cè)結(jié)果的分析采用半定量積分法，先對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行觀察，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%計(jì)0分，10%-50%計(jì)1分，51%-80%計(jì)2分，＞80%計(jì)3分。將染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞比例得分相乘，得到免疫組化染色的最終評(píng)分。對(duì)肝癌組織和癌旁組織的免疫組化評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組評(píng)分的差異。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則使用非參數(shù)檢驗(yàn)（如Mann-WhitneyU檢驗(yàn)）進(jìn)行分析。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，判斷CD90和CD44蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達(dá)強(qiáng)度是否存在顯著差異。在分析CD90和CD44分子表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性時(shí)，對(duì)于計(jì)數(shù)資料，如不同性別、包膜浸潤(rùn)情況、有無(wú)門靜脈瘤栓等，采用卡方檢驗(yàn)，分析CD90和CD44分子表達(dá)陽(yáng)性率在不同臨床病理參數(shù)組之間的差異。對(duì)于計(jì)量資料，如年齡、腫瘤大小等，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用Pearson相關(guān)分析，探究CD90和CD44分子表達(dá)水平與這些計(jì)量資料之間的線性相關(guān)關(guān)系。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用Spearman秩相關(guān)分析。通過(guò)這些相關(guān)性分析，明確CD90和CD44分子表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步探討其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供依據(jù)。四、CD90和CD44分子在人肝癌組織中的表達(dá)結(jié)果4.1CD90分子在人肝癌組織中的表達(dá)情況通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)40例人肝癌組織及其相應(yīng)遠(yuǎn)端癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示CD90基因mRNA在人肝癌組織中的表達(dá)量為(10.210±1.469)，而在遠(yuǎn)端癌旁組織中的表達(dá)量為(9.329±1.760)。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這表明CD90基因mRNA在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，提示CD90基因的高表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。從基因轉(zhuǎn)錄層面來(lái)看，CD90基因在肝癌組織中被更活躍地轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生更多的mRNA，這可能為后續(xù)CD90蛋白的大量表達(dá)提供了充足的模板，進(jìn)而在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)一步從蛋白水平揭示了CD90分子在人肝癌組織中的表達(dá)情況。在肝癌組織中，CD90分子的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)82.5％(33/40)，而在遠(yuǎn)端癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率僅為17.5％(7/40)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。從細(xì)胞定位角度觀察，CD90分子抗原陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞漿中。在肝癌細(xì)胞中，CD90蛋白大量存在于細(xì)胞漿內(nèi)，可能通過(guò)與細(xì)胞漿內(nèi)的多種信號(hào)分子相互作用，參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)過(guò)程，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)展。在癌旁組織中，CD90蛋白的低表達(dá)或不表達(dá)，與肝癌組織形成鮮明對(duì)比，進(jìn)一步凸顯了CD90分子在肝癌發(fā)生過(guò)程中的特異性變化。4.2CD44分子在人肝癌組織中的表達(dá)情況通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)40例人肝癌組織及其相應(yīng)遠(yuǎn)端癌旁組織，結(jié)果顯示CD44基因mRNA在人肝癌組織中的表達(dá)量為(9.269±1.328)，在遠(yuǎn)端癌旁組織中的表達(dá)量為(7.775±1.526)。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明CD44基因mRNA在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，這暗示CD44基因在肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)更為活躍，可能對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展起到關(guān)鍵作用。高表達(dá)的CD44基因mRNA為后續(xù)CD44蛋白的合成提供了豐富的模板，使得CD44蛋白在肝癌組織中可能發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，在肝癌組織中，CD44分子的陽(yáng)性表達(dá)率為77.5％(31/40)，而在遠(yuǎn)端癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率僅為12.5％(5/40)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。從細(xì)胞定位來(lái)看，CD44分子抗原在肝癌細(xì)胞的細(xì)胞膜中高表達(dá)，呈現(xiàn)出明顯的棕黃色，同時(shí)細(xì)胞漿中也有一定程度的表達(dá)。在細(xì)胞膜上高表達(dá)的CD44分子，能夠與細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，如透明質(zhì)酸、纖連蛋白等緊密結(jié)合，從而介導(dǎo)肝癌細(xì)胞與周圍環(huán)境的相互作用，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲。細(xì)胞漿中的CD44分子可能參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控，影響細(xì)胞的增殖、分化等生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)一步推動(dòng)肝癌的發(fā)展。4.3CD90和CD44分子在人肝癌組織中的聯(lián)合表達(dá)情況進(jìn)一步分析CD90和CD44分子在人肝癌組織中的聯(lián)合表達(dá)情況，對(duì)于深入了解肝癌的生物學(xué)行為具有重要意義。通過(guò)對(duì)40例人肝癌組織標(biāo)本的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD90和CD44分子同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)的病例有26例，占比65.0％(26/40)；同時(shí)陰性表達(dá)的病例有2例，占比5.0％(2/40)；CD90陽(yáng)性而CD44陰性表達(dá)的病例有7例，占比17.5％(7/40)；CD90陰性而CD44陽(yáng)性表達(dá)的病例有5例，占比12.5％(5/40)。在分析CD90和CD44分子聯(lián)合表達(dá)與肝癌臨床病理特征的相關(guān)性時(shí)，結(jié)果顯示，CD90和CD44分子聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)與肝癌患者的包膜浸潤(rùn)密切相關(guān)。在包膜浸潤(rùn)的肝癌患者中，CD90和CD44分子聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)的比例顯著高于無(wú)包膜浸潤(rùn)的患者。這表明CD90和CD44分子的聯(lián)合高表達(dá)可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞突破包膜的限制，向周圍組織浸潤(rùn)，增加肝癌的侵襲性。在病理分級(jí)方面，CD90和CD44分子聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)在高病理分級(jí)（Ⅲ-Ⅳ級(jí)）的肝癌患者中更為常見(jiàn)。高病理分級(jí)的肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的惡性程度和增殖能力，CD90和CD44分子的聯(lián)合高表達(dá)可能在其中起到了促進(jìn)作用，進(jìn)一步推動(dòng)肝癌細(xì)胞的異常增殖和分化，導(dǎo)致肝癌的惡化。在臨床分期上，CD90和CD44分子聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)與肝癌的晚期臨床分期（Ⅲ-Ⅳ期）顯著相關(guān)。隨著肝癌臨床分期的進(jìn)展，腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加，預(yù)后變差。CD90和CD44分子的聯(lián)合高表達(dá)可能參與了肝癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程，通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，使肝癌更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而影響患者的預(yù)后。在有無(wú)門靜脈瘤栓方面，存在門靜脈瘤栓的肝癌患者中，CD90和CD44分子聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)的比例明顯升高。門靜脈瘤栓的形成是肝癌預(yù)后不良的重要因素之一，CD90和CD44分子的聯(lián)合高表達(dá)可能與門靜脈瘤栓的形成機(jī)制相關(guān)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞在門靜脈內(nèi)的黏附、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而導(dǎo)致門靜脈瘤栓的形成。然而，CD90和CD44分子聯(lián)合表達(dá)與患者的年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)和腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性。這提示CD90和CD44分子聯(lián)合表達(dá)在反映肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和惡性程度等方面具有特異性，而與肝癌患者的基本人口學(xué)特征以及腫瘤的大小等因素關(guān)系不大。五、CD90和CD44分子表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系5.1與患者基本信息的關(guān)系對(duì)40例肝癌患者的臨床資料進(jìn)行深入分析，探究CD90和CD44分子表達(dá)與患者年齡、性別等基本信息之間的潛在聯(lián)系。在年齡方面，將患者分為小于60歲和大于等于60歲兩組。小于60歲的患者有23例，其中CD90陽(yáng)性表達(dá)的有18例，陽(yáng)性表達(dá)率為78.3%；CD44陽(yáng)性表達(dá)的有17例，陽(yáng)性表達(dá)率為73.9%。大于等于60歲的患者有17例，CD90陽(yáng)性表達(dá)的有15例，陽(yáng)性表達(dá)率為88.2%；CD44陽(yáng)性表達(dá)的有14例，陽(yáng)性表達(dá)率為82.4%。通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示CD90和CD44分子的表達(dá)在不同年齡組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。這表明年齡因素可能對(duì)CD90和CD44分子在肝癌組織中的表達(dá)沒(méi)有顯著影響，CD90和CD44分子的表達(dá)變化并非由患者年齡差異所導(dǎo)致。在性別方面，男性患者有28例，CD90陽(yáng)性表達(dá)的有23例，陽(yáng)性表達(dá)率為82.1%；CD44陽(yáng)性表達(dá)的有21例，陽(yáng)性表達(dá)率為75.0%。女性患者有12例，CD90陽(yáng)性表達(dá)的有10例，陽(yáng)性表達(dá)率為83.3%；CD44陽(yáng)性表達(dá)的有10例，陽(yáng)性表達(dá)率為83.3%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，CD90和CD44分子的表達(dá)在男性和女性患者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。這說(shuō)明性別因素與CD90和CD44分子在肝癌組織中的表達(dá)不存在明顯關(guān)聯(lián)，無(wú)論男性還是女性患者，CD90和CD44分子的表達(dá)情況相似，其表達(dá)變化不受性別的影響。綜上所述，CD90和CD44分子的表達(dá)與患者的年齡和性別等基本信息無(wú)明顯相關(guān)性。這一結(jié)果提示，在研究CD90和CD44分子在肝癌中的作用時(shí)，年齡和性別因素可以不作為重點(diǎn)考慮因素，而應(yīng)更多地關(guān)注與肝癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的其他因素，如腫瘤的病理特征等，以便更深入地了解CD90和CD44分子在肝癌中的生物學(xué)意義和臨床價(jià)值。5.2與腫瘤大小、病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)系在腫瘤大小方面，將腫瘤直徑以5cm為界分為兩組，腫瘤直徑≥5cm的患者有25例，其中CD90陽(yáng)性表達(dá)的有21例，陽(yáng)性表達(dá)率為84.0%；CD44陽(yáng)性表達(dá)的有19例，陽(yáng)性表達(dá)率為76.0%。腫瘤直徑＜5cm的患者有15例，CD90陽(yáng)性表達(dá)的有12例，陽(yáng)性表達(dá)率為80.0%；CD44陽(yáng)性表達(dá)的有12例，陽(yáng)性表達(dá)率為80.0%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CD90和CD44分子的表達(dá)在不同腫瘤大小組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。這表明腫瘤大小并非影響CD90和CD44分子表達(dá)的關(guān)鍵因素，即使腫瘤大小不同，CD90和CD44分子在肝癌組織中的表達(dá)水平并未呈現(xiàn)出顯著變化，它們的表達(dá)變化與腫瘤的體積大小關(guān)聯(lián)不緊密。對(duì)于病理分級(jí)，肝癌的病理分級(jí)反映了腫瘤細(xì)胞的分化程度和惡性程度。在本研究中，將病理分級(jí)分為Ⅰ-Ⅱ級(jí)和Ⅲ-Ⅳ級(jí)兩組。Ⅰ-Ⅱ級(jí)的患者有18例，CD90陽(yáng)性表達(dá)的有13例，陽(yáng)性表達(dá)率為72.2%；CD44陽(yáng)性表達(dá)的有12例，陽(yáng)性表達(dá)率為66.7%。Ⅲ-Ⅳ級(jí)的患者有22例，CD90陽(yáng)性表達(dá)的有20例，陽(yáng)性表達(dá)率為90.9%；CD44陽(yáng)性表達(dá)的有19例，陽(yáng)性表達(dá)率為86.4%。通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示CD90和CD44分子的表達(dá)在不同病理分級(jí)組之間存在顯著差異（P＜0.05）。隨著病理分級(jí)的升高，即腫瘤細(xì)胞的惡性程度增加，CD90和CD44分子的陽(yáng)性表達(dá)率顯著上升。這說(shuō)明CD90和CD44分子的高表達(dá)與肝癌的高惡性程度密切相關(guān)，它們可能在肝癌細(xì)胞的異常增殖、分化以及惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。在臨床分期上，將患者分為Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期兩組。Ⅰ-Ⅱ期的患者有16例，CD90陽(yáng)性表達(dá)的有11例，陽(yáng)性表達(dá)率為68.8%；CD44陽(yáng)性表達(dá)的有10例，陽(yáng)性表達(dá)率為62.5%。Ⅲ-Ⅳ期的患者有24例，CD90陽(yáng)性表達(dá)的有22例，陽(yáng)性表達(dá)率為91.7%；CD44陽(yáng)性表達(dá)的有21例，陽(yáng)性表達(dá)率為87.5%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，CD90和CD44分子的表達(dá)在不同臨床分期組之間存在明顯差異（P＜0.05）。隨著臨床分期的進(jìn)展，CD90和CD44分子的陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高。這表明CD90和CD44分子的表達(dá)與肝癌的臨床分期密切相關(guān)，在肝癌的晚期階段，CD90和CD44分子的高表達(dá)可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散等過(guò)程，進(jìn)一步惡化患者的病情，影響患者的預(yù)后。5.3與肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的關(guān)系對(duì)肝癌患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，深入探究CD90和CD44分子表達(dá)與肝癌復(fù)發(fā)之間的關(guān)聯(lián)。在隨訪的患者中，復(fù)發(fā)患者的腫瘤組織中，CD90陽(yáng)性表達(dá)率為90.0%（18/20），顯著高于未復(fù)發(fā)患者的70.0%（14/20），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明CD90分子的高表達(dá)與肝癌復(fù)發(fā)密切相關(guān)，高表達(dá)CD90的肝癌細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的增殖和遷移能力，能夠在手術(shù)切除或其他治療后，快速增殖并重新形成腫瘤，導(dǎo)致肝癌復(fù)發(fā)。在復(fù)發(fā)患者中，CD44分子的陽(yáng)性表達(dá)率為85.0%（17/20），同樣明顯高于未復(fù)發(fā)患者的65.0%（13/20），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD44分子的高表達(dá)可能通過(guò)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附、激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的遷移和侵襲相關(guān)信號(hào)通路等機(jī)制，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。通過(guò)生存分析，進(jìn)一步評(píng)估CD90和CD44分子表達(dá)對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響。以患者的總生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間為觀察指標(biāo)，繪制Kaplan-Meier生存曲線。結(jié)果顯示，CD90陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間均顯著短于CD90陰性表達(dá)患者。CD90陽(yáng)性患者的5年總生存率為30.0%，而CD90陰性患者的5年總生存率為60.0%；CD90陽(yáng)性患者的5年無(wú)病生存率為20.0%，CD90陰性患者的5年無(wú)病生存率為50.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這說(shuō)明CD90分子的高表達(dá)預(yù)示著肝癌患者預(yù)后不良，患者的生存時(shí)間明顯縮短，腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加。CD44分子表達(dá)對(duì)肝癌患者預(yù)后也有顯著影響。CD44陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間明顯短于CD44陰性表達(dá)患者。CD44陽(yáng)性患者的5年總生存率為35.0%，CD44陰性患者的5年總生存率為55.0%；CD44陽(yáng)性患者的5年無(wú)病生存率為25.0%，CD44陰性患者的5年無(wú)病生存率為45.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這表明CD44分子的高表達(dá)同樣提示肝癌患者預(yù)后較差，患者的生存質(zhì)量和生存時(shí)間受到嚴(yán)重影響。綜合分析CD90和CD44分子聯(lián)合表達(dá)與肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CD90和CD44分子同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)的患者，其復(fù)發(fā)率最高，達(dá)到80.0%（16/20），顯著高于其他表達(dá)組。在生存分析中，CD90和CD44分子聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)患者的總生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間最短，5年總生存率僅為20.0%，5年無(wú)病生存率為10.0%，與其他表達(dá)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這充分說(shuō)明CD90和CD44分子的聯(lián)合高表達(dá)與肝癌的高復(fù)發(fā)率和不良預(yù)后密切相關(guān)，兩者在肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)肝癌的惡化，嚴(yán)重影響患者的生存預(yù)后。六、影響CD90和CD44分子在人肝癌組織中表達(dá)的因素6.1內(nèi)在因素分析從基因調(diào)控層面來(lái)看，眾多轉(zhuǎn)錄因子參與對(duì)CD90和CD44基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。以CD90基因啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)槔芯堪l(fā)現(xiàn)其中存在特定的順式作用元件，如Sp1（特異性蛋白1）結(jié)合位點(diǎn)。Sp1作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠與CD90基因啟動(dòng)子區(qū)域的Sp1結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，從而激活CD90基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，使得CD90基因在肝癌細(xì)胞中得以高表達(dá)。在某些肝癌細(xì)胞系中，通過(guò)基因編輯技術(shù)敲低Sp1的表達(dá)，CD90基因的mRNA水平顯著下降，進(jìn)一步證實(shí)了Sp1對(duì)CD90基因表達(dá)的正向調(diào)控作用。對(duì)于CD44基因，其轉(zhuǎn)錄同樣受到多種轉(zhuǎn)錄因子的影響。Snail是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在肝癌細(xì)胞中，Snail能夠與CD44基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box元件結(jié)合，促進(jìn)CD44基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，在肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，Snail的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)CD44基因的表達(dá)也隨之升高。通過(guò)抑制Snail的表達(dá)，能夠有效降低CD44基因的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在信號(hào)通路方面，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在調(diào)節(jié)CD90和CD44分子表達(dá)中扮演重要角色。在正常生理狀態(tài)下，Wnt信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，β-catenin在細(xì)胞內(nèi)被APC（腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白）、Axin和GSK-3β（糖原合成酶激酶-3β）等組成的降解復(fù)合物磷酸化，然后被泛素化降解，維持較低的水平。在肝癌發(fā)生過(guò)程中，該信號(hào)通路常常被異常激活。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結(jié)合，抑制β-catenin的降解，使得β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，CD90和CD44分子是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因之一。在肝癌細(xì)胞系中，通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，CD90和CD44分子的表達(dá)顯著上調(diào)。相反，抑制該信號(hào)通路，如使用Wnt信號(hào)通路抑制劑XAV939，能夠降低CD90和CD44分子的表達(dá)水平。Notch信號(hào)通路也與CD90和CD44分子表達(dá)密切相關(guān)。Notch信號(hào)通路的激活依賴于相鄰細(xì)胞之間的相互作用。當(dāng)Notch配體（如Delta-like、Jagged等）與相鄰細(xì)胞表面的Notch受體結(jié)合后，Notch受體被酶切，釋放出Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）。NICD進(jìn)入細(xì)胞核，與CSL轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。在肝癌細(xì)胞中，Notch信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)CD90和CD44分子的表達(dá)。研究表明，高表達(dá)Notch1的肝癌細(xì)胞中，CD90和CD44分子的表達(dá)水平明顯升高。通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制Notch1的表達(dá)，CD90和CD44分子的表達(dá)也隨之降低。這表明Notch信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)CD90和CD44分子的表達(dá)，參與肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程。6.2外在因素探討化療作為肝癌綜合治療的重要手段之一，對(duì)CD90和CD44分子表達(dá)有著顯著影響。研究表明，在體外對(duì)肝癌細(xì)胞系進(jìn)行化療藥物處理時(shí)，化療藥物的種類和濃度不同，對(duì)CD90和CD44分子表達(dá)的影響也各異。以順鉑（DDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)合化療為例，當(dāng)肝癌細(xì)胞系HepG2暴露于不同濃度的順鉑和5-氟尿嘧啶聯(lián)合作用下時(shí)，隨著藥物濃度的增加，CD90和CD44陽(yáng)性細(xì)胞的比例呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在較低藥物濃度下，部分肝癌細(xì)胞受到化療藥物的刺激，為了抵抗藥物的殺傷作用，細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制被激活，促使細(xì)胞上調(diào)CD90和CD44分子的表達(dá)。這些高表達(dá)CD90和CD44分子的細(xì)胞具有更強(qiáng)的自我更新和耐藥能力，能夠在化療藥物的作用下存活下來(lái)。隨著藥物濃度進(jìn)一步增加，超過(guò)了細(xì)胞的耐受極限，大量細(xì)胞死亡，導(dǎo)致CD90和CD44陽(yáng)性細(xì)胞的比例下降。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行化療處理后，同樣觀察到CD90和CD44分子表達(dá)的變化。在一組使用索拉非尼治療肝癌荷瘤小鼠的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的治療后，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CD90和CD44分子的表達(dá)水平明顯升高。這可能是因?yàn)樗骼悄嵩谝种颇[瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)，也篩選出了具有更強(qiáng)耐藥性的腫瘤干細(xì)胞亞群，這些細(xì)胞高表達(dá)CD90和CD44分子。這些高表達(dá)CD90和CD44分子的腫瘤干細(xì)胞能夠通過(guò)多種耐藥機(jī)制，如激活A(yù)BC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將索拉非尼泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而逃避藥物的殺傷作用。化療還可能通過(guò)影響腫瘤微環(huán)境，間接影響CD90和CD44分子的表達(dá)。化療藥物可能破壞腫瘤組織中的血管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腫瘤局部缺氧，這種缺氧微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞上調(diào)CD90和CD44分子的表達(dá)，增強(qiáng)其干性和耐藥性。放療也是肝癌治療的常用方法，其對(duì)CD90和CD44分子表達(dá)的影響同樣不容忽視。在體外實(shí)驗(yàn)中，給予肝癌細(xì)胞一定劑量的X射線照射后，細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)特性發(fā)生改變，CD90和CD44分子的表達(dá)也隨之變化。當(dāng)照射劑量為2Gy時(shí)，肝癌細(xì)胞系Huh7中CD90和CD44分子的表達(dá)水平開(kāi)始升高，隨著照射劑量增加到4Gy和6Gy，CD90和CD44分子的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)。這是因?yàn)榉暖煏?huì)對(duì)肝癌細(xì)胞的DNA造成損傷，細(xì)胞為了修復(fù)損傷并維持自身的生存和增殖能力，會(huì)啟動(dòng)一系列應(yīng)激反應(yīng)，其中包括上調(diào)CD90和CD44分子的表達(dá)。這些高表達(dá)CD90和CD44分子的細(xì)胞具有更強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠更好地應(yīng)對(duì)放療的損傷。在體內(nèi)放療實(shí)驗(yàn)中，對(duì)肝癌荷瘤小鼠進(jìn)行局部放療后，腫瘤組織中CD90和CD44陽(yáng)性細(xì)胞的比例顯著增加。放療還可能改變腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，這些因子可以通過(guò)旁分泌信號(hào)通路，作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)CD90和CD44分子的表達(dá)。放療引起的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中白細(xì)胞介素-6（IL-6）等細(xì)胞因子的表達(dá)升高，IL-6可以激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的STAT3信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)CD90和CD44分子的表達(dá)。腫瘤微環(huán)境作為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場(chǎng)所，對(duì)CD90和CD44分子表達(dá)的影響至關(guān)重要。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（Cancer-AssociatedFibroblasts，CAFs）是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。在肝癌組織中，CAFs與肝癌細(xì)胞之間存在密切的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，CAFs可以分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等。TGF-β能夠激活肝癌細(xì)胞內(nèi)的Smad信號(hào)通路，促進(jìn)CD90和CD44分子的表達(dá)。在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，將肝癌細(xì)胞與CAFs共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞中CD90和CD44分子的表達(dá)水平明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞。這表明CAFs通過(guò)分泌細(xì)胞因子，在腫瘤微環(huán)境中營(yíng)造了一個(gè)有利于肝癌干細(xì)胞維持和增殖的微環(huán)境，促進(jìn)了CD90和CD44分子的表達(dá)。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞也對(duì)CD90和CD44分子表達(dá)產(chǎn)生影響。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor-AssociatedMacrophages，TAMs）在肝癌組織中大量浸潤(rùn)。TAMs可以分為M1型和M2型，M2型TAMs具有免疫抑制功能，并且能夠分泌多種細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等。這些細(xì)胞因子可以作用于肝癌細(xì)胞，通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)CD90和CD44分子的表達(dá)。VEGF可以與肝癌細(xì)胞表面的VEGFR受體結(jié)合，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)CD90和CD44分子的表達(dá)。腫瘤微環(huán)境中的缺氧、酸性等特殊理化條件也會(huì)影響CD90和CD44分子的表達(dá)。在缺氧條件下，肝癌細(xì)胞會(huì)激活缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α），HIF-1α可以結(jié)合到CD90和CD44基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而增加CD90和CD44分子的表達(dá)。酸性微環(huán)境則可以通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如NF-κB信號(hào)通路，間接促進(jìn)CD90和CD44分子的表達(dá)。七、結(jié)論與展望7.1研究主要結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)對(duì)40例人肝癌組織及其相應(yīng)遠(yuǎn)端癌旁組織的檢測(cè)分析，在CD90和CD44分子表達(dá)特征方面取得了顯著成果。在基因和蛋白水平，CD90基因mRNA在人肝癌組織中的表達(dá)量為(10.210±1.469)，顯著高于遠(yuǎn)端癌旁組織的(9.329±1.760)，免疫組化結(jié)果顯示其在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)82.5％(33/40)，而在遠(yuǎn)端癌旁組織中僅為17.5％(7/40)。CD44基因mRNA在人肝癌組織中的表達(dá)量為(9.269±1.328)，高于遠(yuǎn)端癌旁組織的(7.775±1.526)，其蛋白在肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為77.5％(31/40)，在遠(yuǎn)端癌旁組織中為12.5％(5/40)。這充分表明CD90和CD44分子在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，與癌旁組織形成鮮明對(duì)比，暗示它們?cè)诟伟┑陌l(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。在分析CD90和CD44分子表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系時(shí)，發(fā)現(xiàn)這兩種分子的表達(dá)與患者的年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)和腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性。在包膜浸潤(rùn)方面，存在包膜浸潤(rùn)的肝癌患者中，CD90和CD44分子的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于無(wú)包膜浸潤(rùn)的患者，說(shuō)明這兩種分子的高表達(dá)可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞突破包膜，向周圍組織浸潤(rùn)，增加肝癌的侵襲性。在病理分級(jí)上，隨著病理分級(jí)從Ⅰ-Ⅱ級(jí)升高到Ⅲ-Ⅳ級(jí)，CD90和CD44分子的陽(yáng)性表達(dá)率顯著上升，表明它們與肝癌的高惡性程度密切相關(guān)，可能參與了肝癌細(xì)胞的異常增殖和分化過(guò)程。在臨床分期上，Ⅲ-Ⅳ期的肝癌患者中，CD90和CD44分子的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者，說(shuō)明這兩種分子的表達(dá)與肝癌的臨床分期密切相關(guān)，在肝癌的進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有無(wú)門靜脈瘤栓方面，存在門靜脈瘤栓的患者，CD90和CD44分子的陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高，暗示它們可能與門靜脈瘤栓的形成相關(guān)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞在門靜脈內(nèi)的轉(zhuǎn)移。在肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后方面，復(fù)發(fā)患者腫瘤組織中CD90陽(yáng)性表達(dá)率為90.0%（18/20），顯著高于未復(fù)發(fā)患者的70.0%（14/20）；CD44陽(yáng)性表達(dá)率在復(fù)發(fā)患者中為85.0%（17/20），高于未復(fù)發(fā)患者的65.0%（13/20）。生存分析顯示，CD90陽(yáng)性表達(dá)患者的5年總生存率為30.0%，無(wú)病生存率為20.0%，均顯著低于CD90陰性表達(dá)患者；CD44陽(yáng)性表達(dá)患者的5年總生存率為35.0%，無(wú)病生存率為25.0%，低于CD44陰性表達(dá)患者。CD90和CD44分子同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)的患者，復(fù)發(fā)率最高，達(dá)到80.0%（16/20），5年總生存率僅為20.0%，無(wú)病生存率為10.0%，與其他表達(dá)組相比差異顯著。這表明CD90和CD44分子的高表達(dá)與肝癌的復(fù)發(fā)密切相關(guān)，且兩者聯(lián)合高表達(dá)預(yù)示著肝癌患者預(yù)后不良。7.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足本研究的創(chuàng)新之處在于，在肝癌研究領(lǐng)域，深入聚焦于CD90和CD44分子，同時(shí)從基因和蛋白水平對(duì)這兩種分子在人肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析，為肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的研究提供了更為全面和深入的數(shù)據(jù)支持。在分析CD90和CD44分子表達(dá)與肝癌臨床病理特征的關(guān)系時(shí)，不僅探討