CD90與CD44分子表達：揭示人肝癌組織奧秘與臨床啟示一、引言1.1研究背景與意義肝癌是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。據統計，肝癌在癌癥相關死亡原因中位居前列，其發病率和死亡率呈上升趨勢。在中國，肝癌的發病率尤為突出，這與乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）的高感染率、黃曲霉毒素暴露、飲酒等因素密切相關。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者確診時已處于中晚期，失去了手術根治的機會。而且，肝癌具有易復發、轉移的特點，對傳統的放化療不敏感，導致患者的總體生存率較低，5年生存率僅為10%-20%左右。因此，深入研究肝癌的發病機制，尋找有效的診斷和治療靶點，對于提高肝癌患者的生存率和生活質量具有重要意義。近年來，腫瘤干細胞（CancerStemCells，CSCs）理論的提出為腫瘤研究帶來了新的視角。腫瘤干細胞是腫瘤組織中一小部分具有自我更新、多向分化和致瘤能力的細胞，被認為是腫瘤發生、發展、復發和轉移的根源。肝癌干細胞（LiverCancerStemCells，LCSCs）作為肝癌組織中的特殊細胞群體，其存在可能解釋了肝癌的難治性和高復發率。因此，研究肝癌干細胞的表面標志物，對于深入了解肝癌的發病機制、早期診斷和靶向治療具有重要意義。CD90和CD44分子作為肝癌干細胞的潛在標志物，受到了廣泛關注。CD90，又稱Thy-1，是一種分子量約為25-37kDa的糖蛋白，最初在胸腺細胞表面被發現。在肝臟中，CD90主要表達于肝干細胞、膽管上皮細胞和血管內皮細胞等。研究表明，CD90陽性的肝癌細胞具有更強的自我更新、增殖和侵襲能力，能夠在體內形成腫瘤，并且對化療和放療具有更強的耐受性。CD44是一種跨膜糖蛋白，其主要功能是介導細胞與細胞外基質的相互作用。CD44有多種異構體，其中CD44v6在腫瘤的侵襲和轉移中發揮重要作用。在肝癌中，CD44陽性的細胞被認為具有干細胞特性，能夠促進肝癌的生長、轉移和復發。對CD90和CD44分子在人肝癌組織中的表達進行研究，有助于進一步了解肝癌干細胞的生物學特性，揭示肝癌的發病機制。通過檢測CD90和CD44分子的表達水平，可以為肝癌的早期診斷提供潛在的生物標志物，提高肝癌的早期診斷率。而且，針對CD90和CD44分子的靶向治療可能為肝癌的治療開辟新的途徑，提高肝癌的治療效果，改善患者的預后。1.2國內外研究現狀在國外，對CD90和CD44分子與肝癌關系的研究開展較早。有研究通過流式細胞術等先進技術，從肝癌細胞系和臨床肝癌組織樣本中分離出CD90陽性的細胞亞群。實驗表明，這些細胞在體外具有更強的克隆形成能力，能夠在軟瓊脂中形成更大、更多的克隆，顯示出其強大的增殖能力。將CD90陽性細胞接種到免疫缺陷小鼠體內，能夠以較低的細胞數量形成腫瘤，且腫瘤生長速度快，表明其致瘤性強。而CD90陰性細胞則表現出較弱的克隆形成能力和致瘤性。在對CD44分子的研究中，發現CD44的不同異構體在肝癌的侵襲和轉移過程中發揮不同作用。CD44v6能夠通過與細胞外基質中的透明質酸結合，激活一系列信號通路，促進肝癌細胞的遷移和侵襲。研究人員利用基因敲除技術，在肝癌細胞系中敲低CD44v6的表達，發現細胞的遷移和侵襲能力明顯下降。在動物實驗中，高表達CD44v6的肝癌細胞在小鼠體內更容易發生肺轉移。國內的研究也取得了豐碩成果。通過免疫組化和實時熒光定量PCR技術檢測大量臨床肝癌組織標本及其對應的癌旁組織，發現CD90和CD44基因mRNA在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。從蛋白水平來看，CD90和CD44陽性分子主要定位于癌細胞膜與細胞漿，在肝癌組織中的陽性表達率遠高于癌旁組織。對臨床資料進行分析，揭示出CD90和CD44分子的表達與肝癌患者的包膜浸潤、病理分級、臨床分期及有無門靜脈瘤栓密切相關。研究還發現，在肝癌復發患者的腫瘤組織中，CD90和CD44的表達水平明顯高于未復發患者，提示這兩種分子與肝癌的復發可能存在關聯。然而，目前的研究仍存在一定的局限性。大多數研究集中在CD90和CD44分子在肝癌組織中的表達差異及與臨床病理參數的相關性分析，對于它們在肝癌發生、發展過程中的具體分子機制研究還不夠深入。雖然已知CD90和CD44與肝癌的侵襲、轉移、復發等過程相關，但它們所參與的信號通路以及上下游調控因子尚未完全明確。在臨床應用方面，雖然CD90和CD44有作為肝癌診斷和預后評估生物標志物的潛力，但目前還缺乏大規模、多中心的臨床研究來驗證其準確性和可靠性。針對CD90和CD44分子的靶向治療研究仍處于起步階段，相關藥物的研發和臨床試驗還需要進一步推進。1.3研究目的與方法本研究旨在通過對人肝癌組織及相應癌旁組織的檢測，明確CD90和CD44分子在其中的表達差異，進而分析這些差異與肝癌的發生、發展、臨床病理特征之間的關系。同時，探討CD90和CD44分子作為肝癌診斷標志物和治療靶點的潛在價值，為肝癌的早期診斷和精準治療提供理論依據。為實現上述研究目的，將采用以下研究方法：收集廣西醫科大學附屬腫瘤醫院在2013年12月至2014年12月期間肝癌術后切除的組織標本40例，以其相應遠端癌旁組織標本作為對照，詳細記錄每位患者的臨床資料，包括年齡、性別、甲胎蛋白（AFP）水平、腫瘤大小、包膜浸潤情況、病理分級、臨床分期以及有無門靜脈瘤栓等。采用實時熒光定量PCR（Real-TimeFluorescenceQuantitativePCR，RT-qPCR）技術，檢測兩組組織中CD90和CD44基因mRNA的表達水平，通過對mRNA表達量的精確測定，從基因層面分析CD90和CD44在肝癌組織和癌旁組織中的表達差異。利用免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）方法，檢測CD90和CD44蛋白分子在兩組組織中的表達情況，通過免疫組化染色，觀察CD90和CD44蛋白在細胞中的定位和表達強度，直觀地呈現其在組織中的分布特征。運用統計學軟件對臨床資料和實驗檢測數據進行分析，計算CD90和CD44在肝癌組織和癌旁組織中的陽性表達率，采用卡方檢驗、t檢驗等方法，分析其表達與肝癌患者臨床病理參數之間的相關性，明確CD90和CD44分子表達與肝癌發生、發展的關聯。二、CD90和CD44分子概述2.1CD90分子結構與功能CD90，又稱Thy-1，是一種相對分子質量約為25-37kDa的糖蛋白，其結構具有獨特性。從整體架構來看，CD90通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定在細胞膜表面，這種錨定方式使其能夠穩定地存在于細胞表面，參與細胞的多種生理活動。在其結構組成中，包含有免疫球蛋白超家族（IgSF）結構域，該結構域賦予了CD90在細胞識別和黏附等過程中的關鍵作用。IgSF結構域具有特定的氨基酸序列和空間構象，能夠與其他細胞表面分子或細胞外基質中的成分進行特異性結合。CD90分子在細胞的生理過程中扮演著極為重要的角色，在細胞識別方面，它如同細胞的“身份標簽”之一，參與免疫細胞之間的相互識別過程。在T細胞的發育和活化過程中，CD90分子與其他免疫細胞表面的相應配體結合，使得T細胞能夠準確識別外來病原體或異常細胞，從而啟動免疫應答反應，幫助機體抵御疾病的侵襲。在神經系統中，CD90參與神經元之間的識別，有助于神經細胞之間建立正確的連接，對神經回路的形成和功能維持起到重要作用。在細胞黏附方面，CD90促進細胞與細胞之間以及細胞與細胞外基質之間的黏附。在胚胎發育過程中，細胞的有序黏附和遷移是組織和器官形成的基礎。CD90在這個過程中發揮關鍵作用，它幫助胚胎細胞之間建立穩定的聯系，使得細胞能夠按照預定的模式進行遷移和分化，從而確保胚胎的正常發育。在成體組織中，CD90維持細胞與細胞外基質的黏附，有助于保持組織的完整性和穩定性。在肝臟組織中，CD90陽性的肝干細胞與周圍的細胞外基質緊密黏附，維持干細胞的微環境穩定，保證干細胞的正常功能。CD90分子還參與細胞增殖和分化的調控過程。研究表明，在造血干細胞的分化過程中，CD90的表達水平變化與造血干細胞向不同血細胞系的分化密切相關。當造血干細胞向特定血細胞系分化時，CD90的表達會發生相應的改變，通過與細胞內的信號通路相互作用，調控細胞的增殖和分化方向。在腫瘤細胞中，CD90陽性的肝癌細胞相較于CD90陰性的細胞，具有更強的增殖能力和自我更新能力。CD90可能通過激活PI3K/Akt等信號通路，促進細胞周期相關蛋白的表達，從而加速腫瘤細胞的增殖。2.2CD44分子結構與功能CD44分子是一種廣泛存在于細胞表面的跨膜糖蛋白，其結構較為復雜。人類CD44基因位于第11號染色體短臂上（11p13），是高度保守的單拷貝基因，由20個高度保守的外顯子構成，其中包含10個組成型外顯子和10個變異區（V區）變異性拼接的外顯子。僅含有組成型外顯子轉錄片段的為標準型CD44轉錄子（CD44s），而V區外顯子在轉錄時隨機拼接或跳躍拼接，插入變異型拼接外顯子的則為變異型CD44（CD44v）轉錄子，理論上這種變異性拼接可產生1000多種CD44的變異分子。從蛋白結構來看，CD44分子可分為胞外區段、跨膜區段和胞內區段三個部分。胞外區段又能細分為保守區段和非保守區段，保守區段的氨基端為一個B環結構域，能夠與數種細胞外基質（ECM）相結合，比如透明質酸、纖連蛋白及膠原等，這使得CD44分子能夠介導細胞與細胞外基質之間的黏附。非保守區段是一段具有多種變異的莖狀結構，由CD44變異性外顯子編碼表達。沒有莖狀結構的是標準型CD44或血液型CD44（CD44s或CD44H），而含有莖狀結構的則為CD44v。這種結構上的多態性使得CD44分子質量在80-250kDa之間變化。跨膜段存在兩個早老因子依賴的蛋白酶切位點，近胞漿一側的位點水解后，胞內段脫落形成CD44的胞內區段（CD44-ICD），該區段可穿過核膜進入細胞核，對轉錄過程進行調控。CD44分子在細胞的生理和病理過程中發揮著多方面的重要功能。在正常生理狀態下，它參與淋巴細胞歸巢過程，介導淋巴細胞與毛細血管后小靜脈中的高柱狀內皮細胞結合，使得淋巴細胞能夠順利穿過血管壁回到淋巴組織，維持免疫系統的正常功能。CD44分子參與淋巴細胞的激活過程，當淋巴細胞受到抗原刺激時，CD44分子與其他相關分子相互作用，激活淋巴細胞內的信號通路，促使淋巴細胞增殖、分化，發揮免疫應答作用。在腫瘤發生發展過程中，CD44分子扮演著關鍵角色，尤其是在腫瘤的侵襲和轉移方面。腫瘤細胞表面的CD44分子，特別是CD44v6等變異體，能夠與細胞外基質中的透明質酸等配體緊密結合。這種結合激活了腫瘤細胞內一系列與遷移、侵襲相關的信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK信號通路和PI3K/Akt信號通路。激活后的信號通路促使腫瘤細胞表達和分泌基質金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2、MMP-9等，這些蛋白酶能夠降解細胞外基質和基底膜，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路。CD44分子還參與腫瘤細胞偽足的形成，通過與細胞骨架蛋白相互作用，改變細胞的形態和運動能力，使腫瘤細胞能夠突破周圍組織的限制，向周圍組織浸潤和轉移。2.3CD90和CD44分子與腫瘤干細胞的關系腫瘤干細胞是腫瘤組織中一小部分具有干細胞特性的細胞群體，這些特性使得它們在腫瘤的發生、發展過程中發揮著關鍵作用。腫瘤干細胞的自我更新能力是其維持腫瘤細胞群體穩定的重要基礎，通過不對稱分裂，一個腫瘤干細胞可以產生一個與自身相同的干細胞和一個分化的腫瘤細胞，從而保證腫瘤組織中始終存在具有干細胞特性的細胞。多向分化能力則使腫瘤干細胞能夠分化為不同類型的腫瘤細胞，這是腫瘤組織呈現異質性的重要原因之一。而且，腫瘤干細胞具有強大的致瘤能力，少量的腫瘤干細胞就能夠在體內形成腫瘤，研究表明，將僅100個CD133陽性的腦腫瘤干細胞接種到免疫缺陷小鼠顱內，就可以成功誘發腫瘤，而相同數量的非腫瘤干細胞則難以形成腫瘤。在肝癌中，CD90和CD44分子被認為是肝癌干細胞的重要標志物，這一觀點得到了大量實驗研究的支持。在體外實驗中，通過流式細胞術等技術從肝癌細胞系中分離出CD90陽性和CD44陽性的細胞亞群。這些細胞亞群表現出典型的腫瘤干細胞特性，在克隆形成實驗中，CD90陽性和CD44陽性的肝癌細胞能夠在軟瓊脂中形成大量的克隆，克隆形成率明顯高于CD90陰性和CD44陰性的細胞。這表明它們具有更強的自我更新和增殖能力，能夠在體外環境中不斷分裂、生長，形成獨立的細胞克隆。在細胞分化實驗中，這些陽性細胞可以分化為不同類型的肝癌細胞，表現出多向分化的能力，進一步證明了它們作為肝癌干細胞的特性。體內實驗同樣驗證了CD90和CD44陽性細胞的腫瘤干細胞特性。將CD90陽性或CD44陽性的肝癌細胞接種到免疫缺陷小鼠體內，發現這些細胞能夠以較低的細胞數量形成腫瘤，且腫瘤生長迅速。而接種CD90陰性和CD44陰性細胞的小鼠，腫瘤形成的概率較低，腫瘤生長速度也較慢。這充分說明CD90和CD44陽性的肝癌細胞具有更強的致瘤能力，是肝癌發生的“種子”細胞。CD90和CD44分子在肝癌的起始、復發和耐藥過程中扮演著至關重要的角色。在腫瘤起始階段，CD90和CD44陽性的肝癌干細胞通過自我更新和分化，不斷產生新的腫瘤細胞，逐漸形成腫瘤組織。它們能夠在肝臟組織中找到合適的微環境，定植并開始增殖，啟動腫瘤的發生過程。在肝癌復發方面，即使在手術切除腫瘤或經過放化療后，殘留的CD90和CD44陽性肝癌干細胞由于其強大的自我更新能力和對治療的耐受性，能夠存活下來并重新增殖，導致腫瘤復發。研究發現，在肝癌復發患者的腫瘤組織中，CD90和CD44的表達水平明顯升高，進一步證實了它們與肝癌復發的密切關系。在耐藥性方面，CD90和CD44陽性的肝癌干細胞具有多種耐藥機制。它們高表達ATP結合盒轉運蛋白（ABC轉運蛋白），如ABCB1、ABCG2等，這些轉運蛋白能夠將進入細胞內的化療藥物泵出細胞外，降低細胞內藥物濃度，從而使腫瘤干細胞對化療藥物產生耐藥性。腫瘤干細胞的DNA損傷修復能力較強，當受到化療藥物或放療的損傷時，它們能夠迅速啟動DNA損傷修復機制，修復受損的DNA，維持細胞的存活和增殖能力。腫瘤干細胞所處的微環境也對其耐藥性產生影響，微環境中的細胞外基質、細胞因子等成分可以通過旁分泌信號通路，激活腫瘤干細胞內的耐藥相關信號通路，增強其耐藥性。三、CD90和CD44分子在人肝癌組織中的表達研究設計3.1實驗材料準備本研究中所使用的人肝癌組織及癌旁組織標本均來源于廣西醫科大學附屬腫瘤醫院。這些標本均為2013年12月至2014年12月期間，患者行肝癌術后切除所得，共計40例。每一例標本在獲取后，均立即進行妥善處理，并詳細記錄下相應患者的臨床資料，涵蓋年齡、性別、甲胎蛋白（AFP）水平、腫瘤大小、包膜浸潤狀況、病理分級、臨床分期以及有無門靜脈瘤栓等關鍵信息。這些臨床資料的完整性和準確性，對于后續深入分析CD90和CD44分子表達與肝癌臨床病理特征之間的關系至關重要。在實驗試劑方面，為了確保實驗結果的準確性和可靠性，選用了一系列高質量的試劑。Trizol試劑來自美國Invitrogen公司，該試劑在RNA提取領域應用廣泛，能夠高效、穩定地從組織和細胞中提取總RNA，為后續的RT-qPCR實驗提供高質量的模板。逆轉錄試劑盒同樣購自美國Invitrogen公司，其具備高效的逆轉錄活性，能夠將提取的RNA準確地逆轉錄為cDNA，為基因表達量的檢測奠定基礎。SYBRGreen熒光染料購自美國MolecularProbes公司，它是一種常用的熒光染料，在實時熒光定量PCR實驗中，能夠與雙鏈DNA特異性結合，在激發光的作用下發出熒光，其熒光強度與擴增的DNA量成正比，通過檢測熒光強度的變化，可實時監測PCR反應進程，從而實現對基因表達量的精確測定。在抗體的選擇上，抗CD90和CD44單克隆抗體均購自美國Abcam公司。該公司生產的抗體具有高度的特異性和親和力，能夠準確地識別并結合CD90和CD44分子，確保免疫組化實驗中對這兩種分子的檢測準確性。二抗則購自美國JacksonImmunoResearchLaboratories公司，它能夠與一抗特異性結合，并通過酶標記或熒光標記等方式，實現對目標抗原的可視化檢測，增強免疫組化實驗的信號強度和檢測靈敏度。實驗中使用的儀器設備也均為先進的科研儀器。實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司的7500型，該儀器具有高精度的溫度控制模塊和靈敏的熒光檢測系統，能夠精確地控制PCR反應的溫度條件，實現快速、準確的熒光信號檢測，確保實驗結果的重復性和可靠性。高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，其具備強大的離心力和穩定的性能，能夠在低溫條件下對樣本進行快速離心，有效分離細胞、蛋白質和核酸等生物大分子，滿足實驗中對樣本處理的需求。光學顯微鏡為日本Olympus公司的BX51型，它具有高分辨率的物鏡和清晰的成像系統，能夠對免疫組化染色后的組織切片進行清晰觀察和拍照記錄，便于對實驗結果進行直觀分析。3.2實驗方法選擇實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術是一種基于熒光信號的實時監測PCR反應的方法，在本研究中用于檢測CD90和CD44基因mRNA的表達水平。其原理是在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光探針，隨著DNA的擴增，熒光染料或探針會與新合成的DNA結合，產生熒光信號。熒光信號的積累與DNA的擴增數量呈線性關系，通過熒光信號的實時監測，可以精確地計算出起始模板的濃度。在操作步驟上，首先根據樣本類型，使用Trizol試劑從肝癌組織和癌旁組織標本中提取總RNA，利用高速冷凍離心機進行離心分離，獲取高質量的RNA。對提取的RNA進行濃度測定和調整，確保其濃度符合熒光定量PCR的要求。接著根據CD90和CD44基因序列，設計特異性引物，并進行合成。將PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、引物、逆轉錄得到的cDNA模板等按照比例加入PCR管中，配置反應體系。在實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司的7500型）上設置循環參數，包括預變性、變性、退火、延伸等步驟，進行熒光信號的實時檢測，記錄熒光信號的強度和循環數。最后將熒光信號數據導入分析軟件中，進行數據處理和分析，根據熒光信號的強度和循環數，計算基因的表達量。免疫組化（IHC）是利用抗原抗體反應和組織化學呈色反應來檢測組織和細胞中某種化學成分的一門技術，本研究利用它來檢測CD90和CD44蛋白分子在組織中的表達情況。其原理是帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應抗原進行定性、定位、定量測定。具體操作時，先將肝癌組織和癌旁組織制成石蠟切片，進行脫蠟與水化處理，將切片依次放入60℃烤箱中烘烤20min，然后放入二甲苯中浸泡2次，每次10分鐘；再依次經過100%無水乙醇浸泡2次，每次5分鐘；95%乙醇浸泡2分鐘；80%乙醇浸泡2分鐘；70%乙醇浸泡2分鐘；蒸餾水浸泡5min；最后用PBS洗3次，每次3min，確保抗體等其他試劑能夠充分與組織中抗原等結合發生反應。用含有0.3%雙氧水和0.5%TritonX-100的封閉通透液浸潤切片30min（室溫避光），以封閉內源性過氧化物酶并使抗體能夠充分地進入胞內進行結合反應，之后用PBS溶液洗3次，每次3min。將切片放入0.01M檸檬酸鈉緩沖溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火4min至沸騰后，取出冷卻至室溫，再加熱約4次，每次間隔補足液體，防止干片，進行抗原修復，使得細胞內抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。用濾紙吸干切片周圍水分，用組化筆在組織周圍畫上圈，在圓圈內組織滴入5%羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中，室溫下孵育10-30min，封閉非特異性蛋白。甩去切片上的羊血清，用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的抗CD90和CD44單克隆抗體（一抗），放入濕盒中室溫孵育1小時，然后4℃過夜，從冰箱中取出需37℃復溫45min。將一抗倒掉并用PBS洗5min，共5次；用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37℃恒溫烤箱中孵育30min。加入SP后放入37℃烤箱中孵育30min，之后用PBS洗5次，每次5min。加入DAB進行顯色，快速滴入并觀察染色情況，倒掉染液，顯色時間控制在約5min（3-10min），由鏡下觀察顏色控制時間。用PBS洗3次，每次3min后，用雙蒸水洗5min；加蘇木素染液進行復染，胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染20s后自來水沖洗，雙蒸水洗5min，再用PBS返藍5min。最后進行脫水、透明和封片處理，依次將切片放入50%乙醇浸泡1-2min，70%乙醇浸泡1-2min，95%乙醇浸泡1-2min，95%乙醇浸泡1-2min，100%無水乙醇浸泡(1-2)min，100%無水乙醇浸泡(1-2)min；放入二甲苯中透明2次，每次(1-2)min，用中性樹膠封片。免疫細胞化學染色與免疫組化原理相似，主要用于對細胞內的CD90和CD44分子進行檢測。對于培養的肝癌細胞或從組織中分離的細胞，首先將細胞接種在預先放置有蓋玻片的培養皿中，待細胞貼壁生長良好后，用PBS清洗細胞3次，每次5min，以去除細胞表面的雜質。用4%多聚甲醛固定細胞15-20min，使細胞內的抗原固定，防止其在后續操作中丟失或變形。固定后再次用PBS清洗細胞3次，每次5min。接下來的封閉內源性過氧化物酶、抗原修復、封閉非特異性蛋白、一抗孵育、二抗孵育、顯色等步驟與免疫組化類似，只是在操作過程中需要更加注意對細胞的保護，避免細胞脫落或損傷。顯色完成后，用蒸餾水輕輕沖洗蓋玻片，去除多余的染液，將蓋玻片從培養皿中取出，細胞面朝上放置在載玻片上，用中性樹膠封片，待樹膠干燥后即可在顯微鏡下觀察。流式細胞儀檢測則是利用流式細胞儀對細胞進行多參數定量分析的技術，可用于檢測細胞表面的CD90和CD44分子表達情況。將肝癌組織或癌旁組織剪碎，用胰蛋白酶等消化液處理，使其分散成單個細胞懸液。用PBS洗滌細胞懸液2-3次，每次以1000-1500rpm離心5-10min，去除消化液和雜質。將細胞重懸于含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中，調整細胞濃度至1×10^6-1×10^7個/mL。取適量細胞懸液，分別加入抗CD90和CD44單克隆抗體，在4℃避光孵育30-60min，使抗體與細胞表面的抗原充分結合。孵育后用PBS洗滌細胞2-3次，去除未結合的抗體。加入熒光標記的二抗，在4℃避光孵育30min。再次用PBS洗滌細胞，然后將細胞重懸于適量的PBS中，即可上機檢測。在流式細胞儀上，通過激光照射細胞，激發熒光信號，檢測細胞表面CD90和CD44分子的表達強度和陽性細胞比例。3.3數據處理與分析方法實驗數據的準確處理與分析是本研究的關鍵環節，關系到研究結論的可靠性和科學性。本研究運用SPSS22.0統計學軟件對實驗數據進行嚴謹分析。在數據錄入環節，對來自實時熒光定量PCR和免疫組化實驗的數據，嚴格按照實驗樣本編號進行準確錄入，避免數據混淆和錄入錯誤。對數據進行全面的審核，檢查數據的完整性、一致性和異常值，確保錄入的數據質量可靠。對于實時熒光定量PCR檢測得到的CD90和CD44基因mRNA表達水平數據，先計算每個樣本的Ct值（CycleThreshold），即PCR擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數。Ct值與起始模板的量呈負相關，起始模板量越多，Ct值越小。通過2^-ΔΔCt法計算目的基因相對于內參基因（如GAPDH）的相對表達量，公式為：相對表達量=2^-[(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組]。對相對表達量數據進行正態性檢驗，若數據符合正態分布，采用獨立樣本t檢驗，比較肝癌組織和癌旁組織中CD90和CD44基因mRNA相對表達量的差異。若數據不符合正態分布，則使用非參數檢驗（如Mann-WhitneyU檢驗）進行分析。通過t檢驗或非參數檢驗的結果，判斷兩組數據之間是否存在統計學意義上的顯著差異，從而明確CD90和CD44基因mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的表達差異情況。免疫組化檢測結果的分析采用半定量積分法，先對免疫組化染色切片進行觀察，根據染色強度和陽性細胞比例進行評分。染色強度評分標準為：無染色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。陽性細胞比例評分標準為：陽性細胞數＜10%計0分，10%-50%計1分，51%-80%計2分，＞80%計3分。將染色強度得分與陽性細胞比例得分相乘，得到免疫組化染色的最終評分。對肝癌組織和癌旁組織的免疫組化評分數據進行統計學分析，若數據符合正態分布，采用獨立樣本t檢驗比較兩組評分的差異。若數據不符合正態分布，則使用非參數檢驗（如Mann-WhitneyU檢驗）進行分析。通過統計分析結果，判斷CD90和CD44蛋白在肝癌組織和癌旁組織中的表達強度是否存在顯著差異。在分析CD90和CD44分子表達與肝癌患者臨床病理參數的相關性時，對于計數資料，如不同性別、包膜浸潤情況、有無門靜脈瘤栓等，采用卡方檢驗，分析CD90和CD44分子表達陽性率在不同臨床病理參數組之間的差異。對于計量資料，如年齡、腫瘤大小等，先進行正態性檢驗，若數據符合正態分布，采用Pearson相關分析，探究CD90和CD44分子表達水平與這些計量資料之間的線性相關關系。若數據不符合正態分布，則采用Spearman秩相關分析。通過這些相關性分析，明確CD90和CD44分子表達與肝癌患者臨床病理特征之間的關聯，為進一步探討其在肝癌發生、發展中的作用提供依據。四、CD90和CD44分子在人肝癌組織中的表達結果4.1CD90分子在人肝癌組織中的表達情況通過實時熒光定量PCR技術對40例人肝癌組織及其相應遠端癌旁組織進行檢測，結果顯示CD90基因mRNA在人肝癌組織中的表達量為(10.210±1.469)，而在遠端癌旁組織中的表達量為(9.329±1.760)。經獨立樣本t檢驗分析，兩者差異具有統計學意義（P＜0.05），這表明CD90基因mRNA在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，提示CD90基因的高表達可能與肝癌的發生密切相關。從基因轉錄層面來看，CD90基因在肝癌組織中被更活躍地轉錄，產生更多的mRNA，這可能為后續CD90蛋白的大量表達提供了充足的模板，進而在肝癌的發生發展過程中發揮作用。免疫組織化學染色結果進一步從蛋白水平揭示了CD90分子在人肝癌組織中的表達情況。在肝癌組織中，CD90分子的陽性表達率高達82.5％(33/40)，而在遠端癌旁組織中的陽性表達率僅為17.5％(7/40)，兩者差異具有統計學意義(P＜0.05)。從細胞定位角度觀察，CD90分子抗原陽性染色主要定位于細胞漿中。在肝癌細胞中，CD90蛋白大量存在于細胞漿內，可能通過與細胞漿內的多種信號分子相互作用，參與細胞的增殖、分化、遷移等生物學過程，從而促進肝癌的發展。在癌旁組織中，CD90蛋白的低表達或不表達，與肝癌組織形成鮮明對比，進一步凸顯了CD90分子在肝癌發生過程中的特異性變化。4.2CD44分子在人肝癌組織中的表達情況通過實時熒光定量PCR技術檢測40例人肝癌組織及其相應遠端癌旁組織，結果顯示CD44基因mRNA在人肝癌組織中的表達量為(9.269±1.328)，在遠端癌旁組織中的表達量為(7.775±1.526)。經獨立樣本t檢驗分析，兩者差異具有統計學意義（P＜0.05），表明CD44基因mRNA在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，這暗示CD44基因在肝癌組織中的轉錄活動更為活躍，可能對肝癌的發生發展起到關鍵作用。高表達的CD44基因mRNA為后續CD44蛋白的合成提供了豐富的模板，使得CD44蛋白在肝癌組織中可能發揮重要的生物學功能。免疫組織化學染色結果表明，在肝癌組織中，CD44分子的陽性表達率為77.5％(31/40)，而在遠端癌旁組織中的陽性表達率僅為12.5％(5/40)，兩者差異具有統計學意義(P＜0.05)。從細胞定位來看，CD44分子抗原在肝癌細胞的細胞膜中高表達，呈現出明顯的棕黃色，同時細胞漿中也有一定程度的表達。在細胞膜上高表達的CD44分子，能夠與細胞外基質中的多種成分，如透明質酸、纖連蛋白等緊密結合，從而介導肝癌細胞與周圍環境的相互作用，促進肝癌細胞的黏附、遷移和侵襲。細胞漿中的CD44分子可能參與細胞內信號傳導通路的調控，影響細胞的增殖、分化等生物學過程，進一步推動肝癌的發展。4.3CD90和CD44分子在人肝癌組織中的聯合表達情況進一步分析CD90和CD44分子在人肝癌組織中的聯合表達情況，對于深入了解肝癌的生物學行為具有重要意義。通過對40例人肝癌組織標本的檢測，發現CD90和CD44分子同時陽性表達的病例有26例，占比65.0％(26/40)；同時陰性表達的病例有2例，占比5.0％(2/40)；CD90陽性而CD44陰性表達的病例有7例，占比17.5％(7/40)；CD90陰性而CD44陽性表達的病例有5例，占比12.5％(5/40)。在分析CD90和CD44分子聯合表達與肝癌臨床病理特征的相關性時，結果顯示，CD90和CD44分子聯合陽性表達與肝癌患者的包膜浸潤密切相關。在包膜浸潤的肝癌患者中，CD90和CD44分子聯合陽性表達的比例顯著高于無包膜浸潤的患者。這表明CD90和CD44分子的聯合高表達可能促進肝癌細胞突破包膜的限制，向周圍組織浸潤，增加肝癌的侵襲性。在病理分級方面，CD90和CD44分子聯合陽性表達在高病理分級（Ⅲ-Ⅳ級）的肝癌患者中更為常見。高病理分級的肝癌細胞具有更強的惡性程度和增殖能力，CD90和CD44分子的聯合高表達可能在其中起到了促進作用，進一步推動肝癌細胞的異常增殖和分化，導致肝癌的惡化。在臨床分期上，CD90和CD44分子聯合陽性表達與肝癌的晚期臨床分期（Ⅲ-Ⅳ期）顯著相關。隨著肝癌臨床分期的進展，腫瘤的轉移風險增加，預后變差。CD90和CD44分子的聯合高表達可能參與了肝癌的轉移過程，通過促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，使肝癌更容易發生遠處轉移，從而影響患者的預后。在有無門靜脈瘤栓方面，存在門靜脈瘤栓的肝癌患者中，CD90和CD44分子聯合陽性表達的比例明顯升高。門靜脈瘤栓的形成是肝癌預后不良的重要因素之一，CD90和CD44分子的聯合高表達可能與門靜脈瘤栓的形成機制相關，促進肝癌細胞在門靜脈內的黏附、生長和轉移，進而導致門靜脈瘤栓的形成。然而，CD90和CD44分子聯合表達與患者的年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)和腫瘤大小無明顯相關性。這提示CD90和CD44分子聯合表達在反映肝癌的侵襲、轉移和惡性程度等方面具有特異性，而與肝癌患者的基本人口學特征以及腫瘤的大小等因素關系不大。五、CD90和CD44分子表達與肝癌臨床病理特征的關系5.1與患者基本信息的關系對40例肝癌患者的臨床資料進行深入分析，探究CD90和CD44分子表達與患者年齡、性別等基本信息之間的潛在聯系。在年齡方面，將患者分為小于60歲和大于等于60歲兩組。小于60歲的患者有23例，其中CD90陽性表達的有18例，陽性表達率為78.3%；CD44陽性表達的有17例，陽性表達率為73.9%。大于等于60歲的患者有17例，CD90陽性表達的有15例，陽性表達率為88.2%；CD44陽性表達的有14例，陽性表達率為82.4%。通過卡方檢驗分析，結果顯示CD90和CD44分子的表達在不同年齡組之間無明顯差異（P＞0.05）。這表明年齡因素可能對CD90和CD44分子在肝癌組織中的表達沒有顯著影響，CD90和CD44分子的表達變化并非由患者年齡差異所導致。在性別方面，男性患者有28例，CD90陽性表達的有23例，陽性表達率為82.1%；CD44陽性表達的有21例，陽性表達率為75.0%。女性患者有12例，CD90陽性表達的有10例，陽性表達率為83.3%；CD44陽性表達的有10例，陽性表達率為83.3%。經卡方檢驗，CD90和CD44分子的表達在男性和女性患者之間無統計學差異（P＞0.05）。這說明性別因素與CD90和CD44分子在肝癌組織中的表達不存在明顯關聯，無論男性還是女性患者，CD90和CD44分子的表達情況相似，其表達變化不受性別的影響。綜上所述，CD90和CD44分子的表達與患者的年齡和性別等基本信息無明顯相關性。這一結果提示，在研究CD90和CD44分子在肝癌中的作用時，年齡和性別因素可以不作為重點考慮因素，而應更多地關注與肝癌發生、發展密切相關的其他因素，如腫瘤的病理特征等，以便更深入地了解CD90和CD44分子在肝癌中的生物學意義和臨床價值。5.2與腫瘤大小、病理分級、臨床分期的關系在腫瘤大小方面，將腫瘤直徑以5cm為界分為兩組，腫瘤直徑≥5cm的患者有25例，其中CD90陽性表達的有21例，陽性表達率為84.0%；CD44陽性表達的有19例，陽性表達率為76.0%。腫瘤直徑＜5cm的患者有15例，CD90陽性表達的有12例，陽性表達率為80.0%；CD44陽性表達的有12例，陽性表達率為80.0%。經統計學分析，CD90和CD44分子的表達在不同腫瘤大小組之間無明顯差異（P＞0.05）。這表明腫瘤大小并非影響CD90和CD44分子表達的關鍵因素，即使腫瘤大小不同，CD90和CD44分子在肝癌組織中的表達水平并未呈現出顯著變化，它們的表達變化與腫瘤的體積大小關聯不緊密。對于病理分級，肝癌的病理分級反映了腫瘤細胞的分化程度和惡性程度。在本研究中，將病理分級分為Ⅰ-Ⅱ級和Ⅲ-Ⅳ級兩組。Ⅰ-Ⅱ級的患者有18例，CD90陽性表達的有13例，陽性表達率為72.2%；CD44陽性表達的有12例，陽性表達率為66.7%。Ⅲ-Ⅳ級的患者有22例，CD90陽性表達的有20例，陽性表達率為90.9%；CD44陽性表達的有19例，陽性表達率為86.4%。通過卡方檢驗分析，結果顯示CD90和CD44分子的表達在不同病理分級組之間存在顯著差異（P＜0.05）。隨著病理分級的升高，即腫瘤細胞的惡性程度增加，CD90和CD44分子的陽性表達率顯著上升。這說明CD90和CD44分子的高表達與肝癌的高惡性程度密切相關，它們可能在肝癌細胞的異常增殖、分化以及惡性轉化過程中發揮重要作用，促進肝癌的進展。在臨床分期上，將患者分為Ⅰ-Ⅱ期和Ⅲ-Ⅳ期兩組。Ⅰ-Ⅱ期的患者有16例，CD90陽性表達的有11例，陽性表達率為68.8%；CD44陽性表達的有10例，陽性表達率為62.5%。Ⅲ-Ⅳ期的患者有24例，CD90陽性表達的有22例，陽性表達率為91.7%；CD44陽性表達的有21例，陽性表達率為87.5%。經統計學檢驗，CD90和CD44分子的表達在不同臨床分期組之間存在明顯差異（P＜0.05）。隨著臨床分期的進展，CD90和CD44分子的陽性表達率顯著升高。這表明CD90和CD44分子的表達與肝癌的臨床分期密切相關，在肝癌的晚期階段，CD90和CD44分子的高表達可能參與了腫瘤的轉移、擴散等過程，進一步惡化患者的病情，影響患者的預后。5.3與肝癌復發和預后的關系對肝癌患者進行長期隨訪，深入探究CD90和CD44分子表達與肝癌復發之間的關聯。在隨訪的患者中，復發患者的腫瘤組織中，CD90陽性表達率為90.0%（18/20），顯著高于未復發患者的70.0%（14/20），經統計學檢驗，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這表明CD90分子的高表達與肝癌復發密切相關，高表達CD90的肝癌細胞可能具有更強的增殖和遷移能力，能夠在手術切除或其他治療后，快速增殖并重新形成腫瘤，導致肝癌復發。在復發患者中，CD44分子的陽性表達率為85.0%（17/20），同樣明顯高于未復發患者的65.0%（13/20），差異具有統計學意義（P＜0.05）。CD44分子的高表達可能通過增強肝癌細胞與細胞外基質的黏附、激活腫瘤細胞內的遷移和侵襲相關信號通路等機制，促進肝癌細胞的轉移和復發。通過生存分析，進一步評估CD90和CD44分子表達對肝癌患者預后的影響。以患者的總生存時間和無病生存時間為觀察指標，繪制Kaplan-Meier生存曲線。結果顯示，CD90陽性表達患者的總生存時間和無病生存時間均顯著短于CD90陰性表達患者。CD90陽性患者的5年總生存率為30.0%，而CD90陰性患者的5年總生存率為60.0%；CD90陽性患者的5年無病生存率為20.0%，CD90陰性患者的5年無病生存率為50.0%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這說明CD90分子的高表達預示著肝癌患者預后不良，患者的生存時間明顯縮短，腫瘤復發的風險增加。CD44分子表達對肝癌患者預后也有顯著影響。CD44陽性表達患者的總生存時間和無病生存時間明顯短于CD44陰性表達患者。CD44陽性患者的5年總生存率為35.0%，CD44陰性患者的5年總生存率為55.0%；CD44陽性患者的5年無病生存率為25.0%，CD44陰性患者的5年無病生存率為45.0%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這表明CD44分子的高表達同樣提示肝癌患者預后較差，患者的生存質量和生存時間受到嚴重影響。綜合分析CD90和CD44分子聯合表達與肝癌復發和預后的關系，發現CD90和CD44分子同時陽性表達的患者，其復發率最高，達到80.0%（16/20），顯著高于其他表達組。在生存分析中，CD90和CD44分子聯合陽性表達患者的總生存時間和無病生存時間最短，5年總生存率僅為20.0%，5年無病生存率為10.0%，與其他表達組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。這充分說明CD90和CD44分子的聯合高表達與肝癌的高復發率和不良預后密切相關，兩者在肝癌的復發和轉移過程中可能具有協同作用，共同促進肝癌的惡化，嚴重影響患者的生存預后。六、影響CD90和CD44分子在人肝癌組織中表達的因素6.1內在因素分析從基因調控層面來看，眾多轉錄因子參與對CD90和CD44基因表達的精細調控。以CD90基因啟動子區域為例，研究發現其中存在特定的順式作用元件，如Sp1（特異性蛋白1）結合位點。Sp1作為一種重要的轉錄因子，能夠與CD90基因啟動子區域的Sp1結合位點特異性結合，從而激活CD90基因的轉錄過程，使得CD90基因在肝癌細胞中得以高表達。在某些肝癌細胞系中，通過基因編輯技術敲低Sp1的表達，CD90基因的mRNA水平顯著下降，進一步證實了Sp1對CD90基因表達的正向調控作用。對于CD44基因，其轉錄同樣受到多種轉錄因子的影響。Snail是一種鋅指轉錄因子，在腫瘤的上皮-間質轉化（EMT）過程中發揮關鍵作用。在肝癌細胞中，Snail能夠與CD44基因啟動子區域的E-box元件結合，促進CD44基因的轉錄。研究表明，在肝癌細胞發生EMT時，Snail的表達上調，同時CD44基因的表達也隨之升高。通過抑制Snail的表達，能夠有效降低CD44基因的表達水平，進而抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力。在信號通路方面，Wnt/β-catenin信號通路在調節CD90和CD44分子表達中扮演重要角色。在正常生理狀態下，Wnt信號通路處于相對穩定的狀態，β-catenin在細胞內被APC（腺瘤性結腸息肉病蛋白）、Axin和GSK-3β（糖原合成酶激酶-3β）等組成的降解復合物磷酸化，然后被泛素化降解，維持較低的水平。在肝癌發生過程中，該信號通路常常被異常激活。當Wnt信號激活時，Wnt蛋白與細胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結合，抑制β-catenin的降解，使得β-catenin在細胞內積累并進入細胞核。在細胞核內，β-catenin與TCF/LEF轉錄因子家族結合，激活下游靶基因的轉錄。研究發現，CD90和CD44分子是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶基因之一。在肝癌細胞系中，通過激活Wnt/β-catenin信號通路，CD90和CD44分子的表達顯著上調。相反，抑制該信號通路，如使用Wnt信號通路抑制劑XAV939，能夠降低CD90和CD44分子的表達水平。Notch信號通路也與CD90和CD44分子表達密切相關。Notch信號通路的激活依賴于相鄰細胞之間的相互作用。當Notch配體（如Delta-like、Jagged等）與相鄰細胞表面的Notch受體結合后，Notch受體被酶切，釋放出Notch胞內結構域（NICD）。NICD進入細胞核，與CSL轉錄因子結合，形成轉錄激活復合物，激活下游靶基因的轉錄。在肝癌細胞中，Notch信號通路的激活能夠促進CD90和CD44分子的表達。研究表明，高表達Notch1的肝癌細胞中，CD90和CD44分子的表達水平明顯升高。通過RNA干擾技術抑制Notch1的表達，CD90和CD44分子的表達也隨之降低。這表明Notch信號通路可能通過調節CD90和CD44分子的表達，參與肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學過程。6.2外在因素探討化療作為肝癌綜合治療的重要手段之一，對CD90和CD44分子表達有著顯著影響。研究表明，在體外對肝癌細胞系進行化療藥物處理時，化療藥物的種類和濃度不同，對CD90和CD44分子表達的影響也各異。以順鉑（DDP）和5-氟尿嘧啶（5-FU）聯合化療為例，當肝癌細胞系HepG2暴露于不同濃度的順鉑和5-氟尿嘧啶聯合作用下時，隨著藥物濃度的增加，CD90和CD44陽性細胞的比例呈現先上升后下降的趨勢。在較低藥物濃度下，部分肝癌細胞受到化療藥物的刺激，為了抵抗藥物的殺傷作用，細胞內的應激反應機制被激活，促使細胞上調CD90和CD44分子的表達。這些高表達CD90和CD44分子的細胞具有更強的自我更新和耐藥能力，能夠在化療藥物的作用下存活下來。隨著藥物濃度進一步增加，超過了細胞的耐受極限，大量細胞死亡，導致CD90和CD44陽性細胞的比例下降。在體內實驗中，對荷瘤小鼠進行化療處理后，同樣觀察到CD90和CD44分子表達的變化。在一組使用索拉非尼治療肝癌荷瘤小鼠的實驗中，經過一段時間的治療后，對腫瘤組織進行檢測，發現CD90和CD44分子的表達水平明顯升高。這可能是因為索拉非尼在抑制腫瘤細胞增殖的同時，也篩選出了具有更強耐藥性的腫瘤干細胞亞群，這些細胞高表達CD90和CD44分子。這些高表達CD90和CD44分子的腫瘤干細胞能夠通過多種耐藥機制，如激活ABC轉運蛋白，將索拉非尼泵出細胞外，降低細胞內藥物濃度，從而逃避藥物的殺傷作用。化療還可能通過影響腫瘤微環境，間接影響CD90和CD44分子的表達。化療藥物可能破壞腫瘤組織中的血管結構，導致腫瘤局部缺氧，這種缺氧微環境會誘導腫瘤細胞上調CD90和CD44分子的表達，增強其干性和耐藥性。放療也是肝癌治療的常用方法，其對CD90和CD44分子表達的影響同樣不容忽視。在體外實驗中，給予肝癌細胞一定劑量的X射線照射后，細胞的形態和生物學特性發生改變，CD90和CD44分子的表達也隨之變化。當照射劑量為2Gy時，肝癌細胞系Huh7中CD90和CD44分子的表達水平開始升高，隨著照射劑量增加到4Gy和6Gy，CD90和CD44分子的表達進一步上調。這是因為放療會對肝癌細胞的DNA造成損傷，細胞為了修復損傷并維持自身的生存和增殖能力，會啟動一系列應激反應，其中包括上調CD90和CD44分子的表達。這些高表達CD90和CD44分子的細胞具有更強的DNA損傷修復能力，能夠更好地應對放療的損傷。在體內放療實驗中，對肝癌荷瘤小鼠進行局部放療后，腫瘤組織中CD90和CD44陽性細胞的比例顯著增加。放療還可能改變腫瘤微環境中的細胞因子和趨化因子的表達，這些因子可以通過旁分泌信號通路，作用于腫瘤細胞，促進CD90和CD44分子的表達。放療引起的炎癥反應會導致腫瘤微環境中白細胞介素-6（IL-6）等細胞因子的表達升高，IL-6可以激活腫瘤細胞內的STAT3信號通路，進而促進CD90和CD44分子的表達。腫瘤微環境作為腫瘤細胞生長、增殖和轉移的重要場所，對CD90和CD44分子表達的影響至關重要。腫瘤相關成纖維細胞（Cancer-AssociatedFibroblasts，CAFs）是腫瘤微環境的重要組成部分。在肝癌組織中，CAFs與肝癌細胞之間存在密切的相互作用。研究發現，CAFs可以分泌多種細胞因子和生長因子，如轉化生長因子-β（TGF-β）、肝細胞生長因子（HGF）等。TGF-β能夠激活肝癌細胞內的Smad信號通路，促進CD90和CD44分子的表達。在共培養實驗中，將肝癌細胞與CAFs共同培養，結果顯示肝癌細胞中CD90和CD44分子的表達水平明顯高于單獨培養的肝癌細胞。這表明CAFs通過分泌細胞因子，在腫瘤微環境中營造了一個有利于肝癌干細胞維持和增殖的微環境，促進了CD90和CD44分子的表達。腫瘤微環境中的免疫細胞也對CD90和CD44分子表達產生影響。腫瘤相關巨噬細胞（Tumor-AssociatedMacrophages，TAMs）在肝癌組織中大量浸潤。TAMs可以分為M1型和M2型，M2型TAMs具有免疫抑制功能，并且能夠分泌多種細胞因子，如血管內皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子（EGF）等。這些細胞因子可以作用于肝癌細胞，通過激活相關信號通路，促進CD90和CD44分子的表達。VEGF可以與肝癌細胞表面的VEGFR受體結合，激活PI3K/Akt信號通路，進而上調CD90和CD44分子的表達。腫瘤微環境中的缺氧、酸性等特殊理化條件也會影響CD90和CD44分子的表達。在缺氧條件下，肝癌細胞會激活缺氧誘導因子-1α（HIF-1α），HIF-1α可以結合到CD90和CD44基因的啟動子區域，促進其轉錄，從而增加CD90和CD44分子的表達。酸性微環境則可以通過影響細胞內的信號通路，如NF-κB信號通路，間接促進CD90和CD44分子的表達。七、結論與展望7.1研究主要結論總結本研究通過對40例人肝癌組織及其相應遠端癌旁組織的檢測分析，在CD90和CD44分子表達特征方面取得了顯著成果。在基因和蛋白水平，CD90基因mRNA在人肝癌組織中的表達量為(10.210±1.469)，顯著高于遠端癌旁組織的(9.329±1.760)，免疫組化結果顯示其在肝癌組織中的陽性表達率高達82.5％(33/40)，而在遠端癌旁組織中僅為17.5％(7/40)。CD44基因mRNA在人肝癌組織中的表達量為(9.269±1.328)，高于遠端癌旁組織的(7.775±1.526)，其蛋白在肝癌組織中的陽性表達率為77.5％(31/40)，在遠端癌旁組織中為12.5％(5/40)。這充分表明CD90和CD44分子在肝癌組織中呈現高表達狀態，與癌旁組織形成鮮明對比，暗示它們在肝癌的發生過程中可能發揮關鍵作用。在分析CD90和CD44分子表達與肝癌臨床病理特征的關系時，發現這兩種分子的表達與患者的年齡、性別、甲胎蛋白(AFP)和腫瘤大小無明顯相關性。在包膜浸潤方面，存在包膜浸潤的肝癌患者中，CD90和CD44分子的陽性表達率顯著高于無包膜浸潤的患者，說明這兩種分子的高表達可能促進肝癌細胞突破包膜，向周圍組織浸潤，增加肝癌的侵襲性。在病理分級上，隨著病理分級從Ⅰ-Ⅱ級升高到Ⅲ-Ⅳ級，CD90和CD44分子的陽性表達率顯著上升，表明它們與肝癌的高惡性程度密切相關，可能參與了肝癌細胞的異常增殖和分化過程。在臨床分期上，Ⅲ-Ⅳ期的肝癌患者中，CD90和CD44分子的陽性表達率明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者，說明這兩種分子的表達與肝癌的臨床分期密切相關，在肝癌的進展過程中發揮重要作用。有無門靜脈瘤栓方面，存在門靜脈瘤栓的患者，CD90和CD44分子的陽性表達率顯著升高，暗示它們可能與門靜脈瘤栓的形成相關，促進肝癌細胞在門靜脈內的轉移。在肝癌復發和預后方面，復發患者腫瘤組織中CD90陽性表達率為90.0%（18/20），顯著高于未復發患者的70.0%（14/20）；CD44陽性表達率在復發患者中為85.0%（17/20），高于未復發患者的65.0%（13/20）。生存分析顯示，CD90陽性表達患者的5年總生存率為30.0%，無病生存率為20.0%，均顯著低于CD90陰性表達患者；CD44陽性表達患者的5年總生存率為35.0%，無病生存率為25.0%，低于CD44陰性表達患者。CD90和CD44分子同時陽性表達的患者，復發率最高，達到80.0%（16/20），5年總生存率僅為20.0%，無病生存率為10.0%，與其他表達組相比差異顯著。這表明CD90和CD44分子的高表達與肝癌的復發密切相關，且兩者聯合高表達預示著肝癌患者預后不良。7.2研究的創新點與不足本研究的創新之處在于，在肝癌研究領域，深入聚焦于CD90和CD44分子，同時從基因和蛋白水平對這兩種分子在人肝癌組織及相應癌旁組織中的表達進行檢測分析，為肝癌干細胞標志物的研究提供了更為全面和深入的數據支持。在分析CD90和CD44分子表達與肝癌臨床病理特征的關系時，不僅探討