TMV與CMV對煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)及NbNAC089調(diào)控功能解析一、引言1.1研究背景煙草（NicotianatabacumL.）作為一種重要的經(jīng)濟作物，在全球農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占據(jù)著舉足輕重的地位。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球煙草種植面積廣泛，每年的煙草產(chǎn)量可觀，其產(chǎn)業(yè)鏈涉及種植、加工、銷售等多個環(huán)節(jié)，為眾多國家和地區(qū)提供了大量的就業(yè)機會，對經(jīng)濟增長起到了積極的推動作用。在中國，煙草行業(yè)更是稅收大戶，為國家財政收入做出了重要貢獻。然而，煙草在生長過程中面臨著多種病害的威脅，其中煙草病毒病是最為嚴(yán)重的病害之一。煙草病毒病種類繁多，在我國已發(fā)現(xiàn)的就有16種。煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）是引發(fā)煙草病毒病的主要病原，它們在世界范圍內(nèi)廣泛分布，給煙草產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。TMV屬于煙草花葉病毒屬，其病毒粒子呈桿狀，基因組為單鏈正義RNA。CMV則屬于黃瓜花葉病毒屬，病毒粒子為二十面體，基因組由三條單鏈正義RNA組成。這兩種病毒的傳播途徑多樣，TMV主要通過植株之間的接觸以及農(nóng)事操作時手、衣服、工具等與煙株的接觸進行傳播；CMV除了可以通過機械摩擦傳播外，還能借助蚜蟲等昆蟲進行傳播。它們侵染煙草后，會導(dǎo)致煙草出現(xiàn)一系列嚴(yán)重的癥狀。感染TMV的煙草，葉片會出現(xiàn)典型的花葉癥狀，即葉片上形成黃綠相間的斑駁，病葉邊緣時常向下翻卷不伸長，葉面絨毛不脫落，泡斑多而明顯，有缺刻；早期感病植株矮化，生長停滯，葉片不開片，正常開花但果實種子發(fā)育不良。CMV侵染煙草后，初期發(fā)病首先在心葉上表現(xiàn)明脈癥，葉色濃淡不均，出現(xiàn)黃綠相間的“花葉癥”狀；嚴(yán)重時，葉片變窄、扭曲，伸直呈拉緊狀，表皮茸毛脫落，失去光澤，上部葉狹窄、葉柄拉長，葉緣上卷葉尖細長，呈“畸形狀”，有時病葉上還會出現(xiàn)深綠色的“泡斑”，中部葉或下部葉可形成“閃電狀壞死”，褐色至深褐色。這些癥狀會嚴(yán)重破壞煙草的生理功能，使得葉綠素受破壞，光合作用減弱，葉片生長被抑制，葉小、畸形，從而導(dǎo)致煙草的產(chǎn)量大幅下降，減產(chǎn)幅度可達20%-80%，同時還會嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)，使品質(zhì)變劣，極大地降低了煙草的經(jīng)濟價值。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmicreticulum，ER）是真核細胞中重要的細胞器，它不僅參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的合成、加工與運輸，還在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細胞受到病毒侵染、高溫、氧化等多種脅迫時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊和加工過程會受到干擾，導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmicreticulumstress，ERS）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細胞應(yīng)對這種蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡的一種自我保護機制，細胞會通過激活未折疊蛋白反應(yīng)（Unfoldedproteinresponse，UPR）來緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在UPR過程中，一系列相關(guān)基因和蛋白會被激活表達，如結(jié)合蛋白（Bindingimmunoglobulinprotein，BiP）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（ProteinkinaseR-likeendoplasmicreticulumkinase，PERK）、肌醇需求酶1（Inositol-requiringenzyme1，IRE1）和轉(zhuǎn)錄激活因子6（Activatingtranscriptionfactor6，ATF6）等。這些基因和蛋白協(xié)同作用，促進未折疊蛋白的正確折疊、降解錯誤折疊的蛋白，以及調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成和運輸，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。然而，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且無法得到有效緩解，細胞可能會啟動程序性死亡（Programmedcelldeath，PCD），即細胞凋亡，以避免受損細胞對生物體造成更大的危害。近年來，越來越多的研究表明，植物病毒侵染與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間存在著密切的聯(lián)系。病毒侵染植物后，會利用植物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器進行自身的復(fù)制和組裝，這一過程往往會打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理平衡，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。例如，馬鈴薯Y病毒（PotatovirusY，PVY）侵染煙草后，會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達發(fā)生顯著變化；黃瓜花葉病毒（CMV）侵染煙草時，也會誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)發(fā)生改變，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其引發(fā)的UPR和PCD過程對植物病毒的侵染也會產(chǎn)生重要影響。一方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的UPR可以通過多種方式限制病毒的復(fù)制和傳播，從而增強植物的抗病毒能力；另一方面，病毒為了自身的生存和增殖，也會進化出一系列策略來應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，甚至利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來促進自身的侵染。因此，深入研究植物病毒侵染誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機制以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在植物抗病毒防御中的作用，對于揭示植物與病毒之間的相互作用關(guān)系，開發(fā)新的抗病毒策略具有重要意義。NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其家族成員眾多，在植物的生長發(fā)育、激素信號傳導(dǎo)、生物和非生物脅迫響應(yīng)等過程中發(fā)揮著廣泛而重要的作用。NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)具有高度的保守性，其N端含有一個保守的NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由約150個氨基酸殘基組成，可進一步分為A、B、C、D、E五個亞結(jié)構(gòu)域。其中，A、C、D亞結(jié)構(gòu)域在不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子中相對保守，而B和E亞結(jié)構(gòu)域的序列則具有較高的變異性。NAC結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合以及蛋白質(zhì)之間的相互作用。C端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，其氨基酸組成和長度在不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子中差異較大，決定了NAC轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性和功能特異性。在植物的抗病毒防御過程中，NAC轉(zhuǎn)錄因子也扮演著重要角色。已有研究表明，一些NAC轉(zhuǎn)錄因子能夠被病毒侵染誘導(dǎo)表達，并且通過調(diào)控下游相關(guān)基因的表達來參與植物的抗病毒反應(yīng)。例如，在擬南芥中，AtNAC1通過調(diào)控乙烯信號通路相關(guān)基因的表達，增強了植株對黃瓜花葉病毒（CMV）的抗性；在煙草中，NbNAC062能夠抑制馬鈴薯Y病毒（PVY）的侵染，其作用機制可能與調(diào)控植物的防御反應(yīng)基因有關(guān)。然而，關(guān)于NAC轉(zhuǎn)錄因子在煙草應(yīng)對TMV和CMV侵染過程中的具體作用機制，目前仍知之甚少。本研究聚焦的NbNAC089是煙草中的一個NAC轉(zhuǎn)錄因子，前期研究發(fā)現(xiàn)它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及病毒侵染密切相關(guān)。在TMV和CMV侵染煙草的過程中，NbNAC089的表達會發(fā)生顯著變化。深入探究NbNAC089在煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)以及抗病毒防御中的功能，有助于揭示煙草應(yīng)對病毒侵染的分子機制，為煙草抗病毒育種和病害防治提供新的理論依據(jù)和潛在的分子靶標(biāo)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1TMV和CMV的研究現(xiàn)狀煙草花葉病毒（TMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）作為煙草病毒病的主要病原，一直是植物病毒學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。國內(nèi)外學(xué)者在病毒的生物學(xué)特性、致病機制、傳播途徑以及防治方法等方面開展了大量研究，并取得了豐碩成果。在生物學(xué)特性方面，對TMV和CMV的病毒粒子結(jié)構(gòu)、基因組組成與功能有了深入了解。TMV的病毒粒子呈桿狀，由一條單鏈正義RNA和多個外殼蛋白亞基組成。其基因組約6.4kb，包含4個開放閱讀框（ORFs），分別編碼126kDa和183kDa的復(fù)制相關(guān)蛋白、30kDa的運動蛋白以及17.5kDa的外殼蛋白。CMV的病毒粒子為二十面體，基因組由三條單鏈正義RNA（RNA1、RNA2和RNA3）以及一個衛(wèi)星RNA（satRNA）組成。RNA1和RNA2分別編碼復(fù)制酶蛋白1a和2a，RNA3編碼運動蛋白3a和外殼蛋白CP。不同株系的TMV和CMV在生物學(xué)特性上存在一定差異，如致病性、寄主范圍、傳播效率等。研究表明，TMV的一些強毒株系能夠?qū)е聼煵輫?yán)重發(fā)病，產(chǎn)量損失巨大；而CMV的不同株系在癥狀表現(xiàn)和寄主適應(yīng)性上也有所不同。致病機制研究方面，發(fā)現(xiàn)TMV和CMV侵染煙草后，會干擾煙草細胞的正常生理代謝過程。它們通過與寄主細胞內(nèi)的各種因子相互作用，影響植物激素平衡、光合作用、蛋白質(zhì)合成等。例如，TMV侵染煙草后，會導(dǎo)致煙草葉片中生長素、細胞分裂素等激素含量發(fā)生變化，從而影響葉片的生長和發(fā)育；CMV則能夠抑制煙草光合作用相關(guān)基因的表達，降低光合效率，使葉片出現(xiàn)黃化、花葉等癥狀。此外，病毒還會利用寄主細胞的翻譯機制來合成自身的蛋白質(zhì)，與寄主競爭資源，進一步破壞細胞的正常功能。傳播途徑上，TMV主要通過機械接觸傳播，如植株間的摩擦、農(nóng)事操作等；CMV除機械傳播外，還可借助蚜蟲等刺吸式昆蟲進行非持久性傳播。蚜蟲在吸食感染CMV的煙草汁液后，短時間內(nèi)即可獲得病毒，并在后續(xù)取食健康煙草時將病毒傳播給新的植株。了解這些傳播途徑，有助于制定針對性的防控措施，減少病毒的傳播和擴散。在防治方法上，目前主要采取綜合防治策略。選育抗病品種是防治煙草病毒病的重要手段之一，國內(nèi)外已通過常規(guī)育種和分子育種技術(shù)，培育出多個具有一定抗性的煙草品種。例如，利用傳統(tǒng)雜交育種方法，將野生煙草中的抗病基因?qū)朐耘嗥贩N，獲得了對TMV和CMV具有較好抗性的煙草新品系；分子育種方面，通過基因編輯技術(shù)對煙草的感病基因進行敲除或修飾，有望培育出高抗煙草品種。化學(xué)防治主要使用抗病毒藥劑來抑制病毒的復(fù)制和傳播，但目前市場上的抗病毒藥劑種類有限，且長期使用可能會導(dǎo)致病毒產(chǎn)生抗藥性。物理防治包括清除田間雜草、銷毀病株殘體、使用防蟲網(wǎng)等措施，以減少病毒的侵染源和傳播媒介。生物防治則利用有益微生物或其代謝產(chǎn)物來抑制病毒的侵染，如一些生防細菌和真菌能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，對TMV和CMV具有一定的抑制作用。1.2.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究進展內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細胞在受到多種脅迫時，為維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)而啟動的一種自我保護機制。近年來，隨著細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的研究取得了顯著進展。在植物中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要通過未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）來調(diào)節(jié)。UPR信號通路主要由三條分支組成，分別由蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需求酶1（IRE1）和轉(zhuǎn)錄激活因子6（ATF6）介導(dǎo)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)積累時，結(jié)合蛋白（BiP）會與這些異常蛋白質(zhì)結(jié)合，從而釋放出PERK、IRE1和ATF6。激活的PERK會磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α），抑制蛋白質(zhì)的總體合成，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)負(fù)載；同時，eIF2α的磷酸化還會促進某些特定轉(zhuǎn)錄因子的翻譯，如激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4），ATF4進而調(diào)控一系列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達。IRE1具有核酸內(nèi)切酶活性，激活后能夠剪接X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA，產(chǎn)生具有活性的sXBP1蛋白，sXBP1進入細胞核后，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白、折疊酶以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）途徑相關(guān)基因的表達。ATF6在激活后會從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，被蛋白酶切割后釋放出具有活性的N端結(jié)構(gòu)域，進入細胞核調(diào)控相關(guān)基因的表達。植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅參與植物對生物脅迫（如病毒、細菌、真菌等侵染）的響應(yīng)，還在非生物脅迫（如高溫、干旱、鹽堿等）應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。在病毒侵染過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與病毒之間存在復(fù)雜的相互作用。一方面，病毒侵染會誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活UPR，植物通過UPR增強自身的抗病毒防御能力；另一方面，病毒也會進化出多種策略來應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，甚至利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來促進自身的侵染。例如，一些病毒會編碼特殊的蛋白來干擾UPR信號通路，抑制植物的抗病毒反應(yīng)；有的病毒則會利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞生理變化，為自身的復(fù)制和組裝創(chuàng)造有利條件。1.2.3NbNAC089的研究現(xiàn)狀NbNAC089作為煙草中的一個NAC轉(zhuǎn)錄因子，近年來逐漸受到關(guān)注，但目前對其功能和作用機制的研究還相對較少。已有的研究表明，NbNAC089在煙草的生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮一定作用。通過基因表達分析發(fā)現(xiàn)，NbNAC089在煙草的不同組織和器官中呈現(xiàn)出差異表達模式，在葉片、莖和根等組織中均有表達，但表達水平有所不同。在葉片中，其表達量相對較高，推測可能與葉片的生理功能密切相關(guān)。在應(yīng)對生物脅迫方面，前期研究發(fā)現(xiàn)NbNAC089與煙草的抗病毒防御密切相關(guān)。當(dāng)煙草受到TMV和CMV侵染時，NbNAC089的表達會發(fā)生顯著變化，在侵染早期迅速上調(diào)表達。進一步的功能研究表明，沉默NbNAC089基因會導(dǎo)致煙草對TMV和CMV的敏感性增加，病毒的積累量顯著上升，說明NbNAC089在煙草抗病毒過程中發(fā)揮著正向調(diào)控作用。然而，關(guān)于NbNAC089如何參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)以及調(diào)控?zé)煵菘共《痉烙木唧w分子機制，目前還不清楚。在應(yīng)對非生物脅迫方面，目前尚無關(guān)于NbNAC089的相關(guān)報道。但鑒于NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物非生物脅迫響應(yīng)中的廣泛作用，推測NbNAC089可能也參與煙草對高溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫的應(yīng)答過程，這有待進一步的研究驗證。1.3研究目的與意義煙草作為重要的經(jīng)濟作物，在全球農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占據(jù)關(guān)鍵地位，然而煙草病毒病嚴(yán)重威脅其產(chǎn)量與品質(zhì)。TMV和CMV是引發(fā)煙草病毒病的主要病原，對煙草產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在植物應(yīng)對病毒侵染過程中發(fā)揮著重要作用，而NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與植物多種生物和非生物脅迫響應(yīng)。本研究聚焦于TMV、CMV誘導(dǎo)煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及調(diào)控因子NbNAC089的功能分析，旨在深入揭示煙草應(yīng)對病毒侵染的分子機制。本研究的目的在于明確TMV和CMV侵染煙草誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機制，解析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在煙草抗病毒防御中的作用，以及探究NbNAC089在煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)和抗病毒防御中的功能與調(diào)控機制。本研究具有重要的理論與實際意義。在理論層面，深入探究TMV、CMV誘導(dǎo)煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機制，有助于揭示植物與病毒之間的相互作用關(guān)系，豐富和完善植物病毒學(xué)和植物生理學(xué)的理論體系。研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在煙草抗病毒防御中的作用，能夠為理解植物的抗病毒機制提供新的視角，進一步明晰植物在應(yīng)對病毒侵染時的自我保護機制。對NbNAC089功能和調(diào)控機制的研究，不僅可以拓展對NAC轉(zhuǎn)錄因子家族功能的認(rèn)識，還有助于揭示植物轉(zhuǎn)錄因子在生物脅迫響應(yīng)中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在實際應(yīng)用方面，本研究結(jié)果可為煙草抗病毒育種提供重要的理論依據(jù)和潛在的分子靶標(biāo)。通過深入了解煙草抗病毒的分子機制，有望利用基因工程技術(shù)對煙草進行遺傳改良，培育出具有高抗性的煙草品種，從而有效減少煙草病毒病的發(fā)生，提高煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，促進煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。研究成果也可為其他植物病毒病的防治提供借鑒和參考，推動植物病害防治領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新和發(fā)展。1.4研究內(nèi)容與方法1.4.1研究內(nèi)容TMV和CMV侵染煙草誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機制：通過接種TMV和CMV到煙草植株，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因，如BiP、PERK、IRE1和ATF6等的表達水平變化，明確病毒侵染對這些基因表達的影響。運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達和修飾情況，分析其在病毒侵染過程中的動態(tài)變化。借助透射電子顯微鏡觀察煙草細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹、擴張以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)結(jié)構(gòu)的形成等，直觀了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。通過基因沉默或過表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因，研究其對病毒侵染和復(fù)制的影響，明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在病毒侵染過程中的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在煙草抗病毒防御中的作用：構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑（如衣霉素、二硫蘇糖醇等）處理煙草的實驗體系，結(jié)合病毒接種，分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對煙草抗病毒防御反應(yīng)的影響。利用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測防御相關(guān)基因（如病程相關(guān)蛋白基因PR1、PR5等）和信號通路關(guān)鍵蛋白（如SA信號通路中的NPR1蛋白等）的表達變化，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活抗病毒防御反應(yīng)的分子機制。通過分析活性氧（ROS）的產(chǎn)生和積累情況，以及抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、過氧化物酶POD等）的活性變化，研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化還原平衡在煙草抗病毒防御中的相互關(guān)系。利用基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）敲除或突變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因，觀察煙草對TMV和CMV抗性的變化，進一步驗證內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在抗病毒防御中的作用。NbNAC089在煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)和抗病毒防御中的功能與調(diào)控機制：運用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)，分析在TMV和CMV侵染以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑處理條件下，NbNAC089基因和蛋白的表達模式，明確其表達與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和病毒侵染的相關(guān)性。構(gòu)建NbNAC089基因沉默和過表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入煙草植株，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因煙草。接種TMV和CMV到轉(zhuǎn)基因煙草，觀察植株的發(fā)病癥狀，測定病毒的積累量，分析NbNAC089對煙草抗病毒能力的影響。利用酵母雙雜交、雙分子熒光互補（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）等技術(shù)，篩選和鑒定與NbNAC089相互作用的蛋白，構(gòu)建NbNAC089的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。通過啟動子分析、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）等實驗，研究NbNAC089對下游靶基因的調(diào)控作用，揭示其在煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)和抗病毒防御中的調(diào)控機制。1.4.2研究方法病毒接種與植物材料處理：采用摩擦接種法將TMV和CMV接種到煙草植株上，接種前將病毒汁液與適量的金剛砂混合，輕輕摩擦煙草葉片表面，使病毒能夠順利侵入細胞。以未接種病毒的煙草植株作為對照。同時，設(shè)置內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑處理組，將煙草植株浸泡在含有衣霉素（5μg/mL）或二硫蘇糖醇（1mmol/L）的溶液中處理一定時間，分別在接種后不同時間點（如1、3、5、7天等）采集煙草葉片樣品，用于后續(xù)實驗分析。基因表達分析：提取煙草葉片總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系包含cDNA模板、SYBRGreenMasterMix、上下游引物等，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，內(nèi)參基因選擇煙草的Actin基因。同時，提取煙草葉片總蛋白，通過Westernblot檢測蛋白的表達水平。將蛋白樣品進行SDS電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用特異性抗體進行免疫雜交，最后通過化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白條帶。細胞生物學(xué)觀察：取煙草葉片樣品，切成1mm×1mm大小的小塊，用2.5%戊二醛固定液固定，然后用1%鋨酸進行后固定。經(jīng)過脫水、包埋、切片等步驟，制備超薄切片，用透射電子顯微鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記及形態(tài)觀察，利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性熒光探針（如ER-TrackerGreen）對煙草細胞進行染色，然后在熒光顯微鏡下觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)和分布。基因功能驗證：構(gòu)建NbNAC089基因沉默載體pTRV2-NbNAC089和過表達載體pCAMBIA1302-NbNAC089。將重組載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草進行PCR和qRT-PCR鑒定，篩選出陽性轉(zhuǎn)基因植株。接種TMV和CMV到轉(zhuǎn)基因煙草，觀察植株的發(fā)病癥狀，每隔2天記錄一次癥狀變化。在接種后7天，采集葉片樣品，采用ELISA或qRT-PCR方法測定病毒的積累量。蛋白互作研究：以NbNAC089的編碼序列為誘餌，構(gòu)建酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-NbNAC089，轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中。從煙草cDNA文庫中篩選與NbNAC089相互作用的蛋白。對于雙分子熒光互補實驗，將NbNAC089和候選互作蛋白分別與YFP的N端和C端融合，構(gòu)建pSPYNE-NbNAC089和pSPYCE-候選蛋白載體。共轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后，注射煙草葉片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號。免疫共沉淀實驗中，提取煙草葉片總蛋白，加入抗NbNAC089抗體和ProteinA/G磁珠，孵育后進行SDS電泳和Westernblot檢測，驗證蛋白之間的相互作用。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1TMV與CMV概述煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）和黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）作為煙草病毒病的主要致病原，在全球范圍內(nèi)對煙草產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。了解這兩種病毒的基本特征、傳播途徑及對煙草的危害癥狀，對于制定有效的防治策略至關(guān)重要。2.1.1TMV的特征、傳播及危害TMV屬于煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），是一種具有高度穩(wěn)定性和廣泛寄主范圍的植物病毒。其病毒粒子呈桿狀，長度約為300nm，直徑約18nm，由一條單鏈正義RNA和2130個相同的外殼蛋白亞基組成。病毒基因組大小約為6.4kb，包含4個開放閱讀框（ORFs）。其中，ORF1和ORF2編碼126kDa和183kDa的復(fù)制相關(guān)蛋白，參與病毒RNA的復(fù)制過程；ORF3編碼30kDa的運動蛋白，負(fù)責(zé)病毒在植物細胞間的移動；ORF4編碼17.5kDa的外殼蛋白，保護病毒基因組并參與病毒的傳播。TMV的傳播途徑主要為機械傳播。在自然條件下，TMV可通過植株之間的接觸，如葉片的摩擦、碰撞等方式進行傳播。農(nóng)事操作過程中，手、衣服、農(nóng)具等與煙株的接觸也會導(dǎo)致病毒的傳播。在煙草種植過程中，移栽、打頂、抹杈等操作若不注意工具的消毒，極易造成病毒的擴散。種子帶毒也是TMV傳播的重要途徑之一，雖然種子帶毒率相對較低，但在種子萌發(fā)和幼苗生長過程中，病毒可侵染幼苗，成為田間發(fā)病的初侵染源。TMV侵染煙草后，會導(dǎo)致一系列典型的癥狀。在苗期，染病幼苗的新葉葉脈組織會變淺綠色，呈現(xiàn)半透明的“明脈癥”，迎光透視時病葉大小葉脈十分清晰。隨著病情發(fā)展，葉片逐漸形成黃綠相間的“花葉癥”。在大田期，煙株受侵染后，首先在心葉上發(fā)現(xiàn)“明脈”現(xiàn)象，隨后出現(xiàn)花葉、泡斑、畸形、壞死等癥狀。輕型花葉癥狀表現(xiàn)為葉片上形成黃綠相間的斑駁，葉形基本不變；重型花葉癥狀則葉色黃綠相間成相嵌狀，深綠色部分出現(xiàn)“泡斑”，葉子邊緣逐漸形成缺刻并向下卷曲，葉片皺縮扭曲，部分葉片甚至變細呈帶狀。早期感病植株矮化，生長停滯，葉片不開片，雖能正常開花，但果實種子發(fā)育不良。在旺長期，病株中上部葉片還可能出現(xiàn)紅褐色大壞死斑，即“花葉灼斑”。這些癥狀嚴(yán)重影響了煙草的光合作用、生長發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)。據(jù)研究，感染TMV的煙草植株，產(chǎn)量損失可達20%-50%，煙葉的品質(zhì)也會顯著下降，表現(xiàn)為香氣減少、刺激性增加、燃燒性變差等。2.1.2CMV的特征、傳播及危害CMV屬于黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus），是一種寄主范圍極廣的植物病毒，可侵染1000多種植物，包括煙草、黃瓜、番茄、辣椒等多種重要經(jīng)濟作物。其病毒粒子為二十面體，直徑約28nm，基因組由三條單鏈正義RNA（RNA1、RNA2和RNA3）以及一個衛(wèi)星RNA（satRNA）組成。RNA1和RNA2分別編碼復(fù)制酶蛋白1a和2a，負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制；RNA3編碼運動蛋白3a和外殼蛋白CP，其中運動蛋白參與病毒在植物體內(nèi)的運輸，外殼蛋白則包裹病毒基因組，保護其免受外界環(huán)境的影響。衛(wèi)星RNA是一種非編碼RNA，其存在與否和序列差異會影響CMV的致病性和癥狀表現(xiàn)。CMV的傳播途徑較為復(fù)雜，包括機械傳播和介體傳播。機械傳播主要通過植株間的摩擦、農(nóng)事操作等方式進行，與TMV的機械傳播方式類似。介體傳播是CMV的重要傳播途徑，主要借助蚜蟲等刺吸式昆蟲進行非持久性傳播。蚜蟲在吸食感染CMV的煙草汁液后，短時間內(nèi)即可獲得病毒，并在后續(xù)取食健康煙草時將病毒傳播給新的植株。蚜蟲傳播CMV的效率與蚜蟲的種類、數(shù)量、取食行為以及煙草植株的生長狀態(tài)等因素密切相關(guān)。一些常見的蚜蟲種類，如桃蚜、棉蚜等，都是CMV的有效傳播介體。CMV侵染煙草后，癥狀表現(xiàn)因病毒株系和煙草品種的不同而有所差異。初期發(fā)病時，首先在心葉上表現(xiàn)明脈癥，葉色濃淡不均，出現(xiàn)黃綠相間的“花葉癥”狀。隨著病情的加重，葉片變窄、扭曲，伸直呈拉緊狀，表皮茸毛脫落，失去光澤。上部葉狹窄、葉柄拉長，葉緣上卷葉尖細長，呈“畸形狀”。有時病葉上還會出現(xiàn)深綠色的“泡斑”，中部葉或下部葉可形成“閃電狀壞死”，褐色至深褐色，小葉脈或中脈也可能形成深褐色或褐色壞死。早期患病的植株嚴(yán)重矮化，基本無利用價值。CMV侵染對煙草的危害同樣嚴(yán)重，不僅導(dǎo)致產(chǎn)量大幅下降，還會使煙葉的品質(zhì)變劣，影響其經(jīng)濟價值。研究表明，感染CMV的煙草，產(chǎn)量損失可達30%-80%，同時煙葉的化學(xué)成分也會發(fā)生改變，如總糖含量降低、煙堿含量升高、蛋白質(zhì)含量增加等，從而影響煙葉的口感和香氣。2.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)理論內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmicreticulum，ER）是真核細胞中由膜圍成的連續(xù)的小管、小囊或扁囊構(gòu)成的三維網(wǎng)狀膜系統(tǒng)，在細胞中占據(jù)著重要的地位。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成的主要場所，還參與蛋白質(zhì)的折疊、修飾、運輸以及鈣離子的儲存和釋放等多種重要的生理過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能對于維持細胞的穩(wěn)態(tài)和正常生理活動至關(guān)重要。然而，當(dāng)細胞受到各種內(nèi)外源脅迫因素的影響時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能會受到干擾，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)大量積累，從而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmicreticulumstress，ERS）。這些脅迫因素包括病毒侵染、高溫、缺氧、氧化應(yīng)激、化學(xué)物質(zhì)處理、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏以及基因突變等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細胞在面對這些不利條件時啟動的一種自我保護機制，旨在恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)。在植物中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要通過未折疊蛋白反應(yīng)（Unfoldedproteinresponse，UPR）來調(diào)節(jié)。UPR是細胞應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的核心信號通路，它主要由三條分支組成，分別由蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（ProteinkinaseR-likeendoplasmicreticulumkinase，PERK）、肌醇需求酶1（Inositol-requiringenzyme1，IRE1）和轉(zhuǎn)錄激活因子6（Activatingtranscriptionfactor6，ATF6）介導(dǎo)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)積累時，結(jié)合蛋白（Bindingimmunoglobulinprotein，BiP）會與這些異常蛋白質(zhì)結(jié)合，從而釋放出PERK、IRE1和ATF6。激活的PERK會磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α），抑制蛋白質(zhì)的總體合成，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)負(fù)載；同時，eIF2α的磷酸化還會促進某些特定轉(zhuǎn)錄因子的翻譯，如激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4），ATF4進而調(diào)控一系列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達。IRE1具有核酸內(nèi)切酶活性，激活后能夠剪接X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA，產(chǎn)生具有活性的sXBP1蛋白，sXBP1進入細胞核后，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白、折疊酶以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）途徑相關(guān)基因的表達。ATF6在激活后會從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，被蛋白酶切割后釋放出具有活性的N端結(jié)構(gòu)域，進入細胞核調(diào)控相關(guān)基因的表達。通過這三條信號通路的協(xié)同作用，細胞能夠增強蛋白質(zhì)的折疊能力、降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成和運輸，從而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在植物的生長發(fā)育、逆境響應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要作用。在植物生長發(fā)育方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與調(diào)控植物細胞的分化、增殖和凋亡等過程。例如，在擬南芥胚胎發(fā)育過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達變化對胚胎細胞的分化和組織器官的形成具有重要影響。在植物逆境響應(yīng)方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在植物應(yīng)對生物脅迫和非生物脅迫中都起著關(guān)鍵作用。在生物脅迫中，如病毒、細菌、真菌等病原體侵染植物時，會誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，植物通過激活UPR來增強自身的防御反應(yīng)。研究表明，馬鈴薯Y病毒（PVY）侵染煙草后，會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達顯著上調(diào)，激活UPR，從而限制病毒的復(fù)制和傳播。在非生物脅迫中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激同樣發(fā)揮著重要作用。高溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫會破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，植物通過UPR來調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，增強對非生物脅迫的耐受性。例如，在高溫脅迫下，植物會通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路，誘導(dǎo)熱激蛋白等基因的表達，從而提高植物的耐熱性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與植物抗病性之間存在著密切的聯(lián)系。一方面，植物病毒侵染會誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活UPR，植物通過UPR增強自身的抗病毒防御能力。病毒侵染過程中，病毒蛋白的大量合成和積累會干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。植物通過UPR激活一系列防御反應(yīng)，如誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白（PR）基因的表達、激活植物激素信號通路、產(chǎn)生活性氧（ROS）等，從而抑制病毒的復(fù)制和傳播。另一方面，病毒也會進化出多種策略來應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，甚至利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來促進自身的侵染。一些病毒會編碼特殊的蛋白來干擾UPR信號通路，抑制植物的抗病毒反應(yīng)。例如，黃瓜花葉病毒（CMV）的2b蛋白能夠與IRE1相互作用，抑制IRE1的核酸內(nèi)切酶活性，從而阻斷UPR信號通路，有利于病毒的侵染。而有的病毒則會利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞生理變化，為自身的復(fù)制和組裝創(chuàng)造有利條件。深入研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與植物抗病性之間的關(guān)系，對于揭示植物與病毒之間的相互作用機制，開發(fā)新的植物抗病毒策略具有重要意義。2.3NAC轉(zhuǎn)錄因子家族及NbNAC089簡介NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物的生長發(fā)育、激素信號傳導(dǎo)、生物和非生物脅迫響應(yīng)等多個生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。自1996年首個NAC轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)以來，隨著研究的不斷深入，越來越多的NAC轉(zhuǎn)錄因子被鑒定和研究。目前，在擬南芥中已確認(rèn)有117種NAC基因，水稻中有151種，葡萄中有79種，楊樹中有163種，大豆和煙草中各有152種。NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)具有高度保守性。其N端含有一個高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由約150個氨基酸殘基組成，可進一步細分為A、B、C、D、E五個亞結(jié)構(gòu)域。其中，A、C、D亞結(jié)構(gòu)域在不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子中相對保守。C和D亞結(jié)構(gòu)域帶有正電荷，包含有核定位信號，與DNA結(jié)合密切相關(guān)，可能還參與NAC轉(zhuǎn)錄因子與特定啟動子元件的識別過程；A亞結(jié)構(gòu)域可能參與了功能二聚體的形成。而B和E亞結(jié)構(gòu)域的序列則具有較高的變異性，這可能是NAC基因功能多樣性的原因之一。通過X-射線晶體學(xué)對ANAC019的NAC域結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，其NAC域缺乏典型的螺旋—轉(zhuǎn)—螺旋結(jié)構(gòu)，取而代之的是一種由幾個螺旋環(huán)繞一個反向平行的β-折疊的新轉(zhuǎn)錄因子折疊結(jié)構(gòu)。NAC結(jié)構(gòu)域雖不含有任何已知的結(jié)合DNA基序，但可通過鹽橋等作用形成有功能的NAC蛋白同源或異源二聚體，這種二聚體與DNA的結(jié)合有關(guān)。NAC轉(zhuǎn)錄因子的C末端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，其氨基酸組成和長度在不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子中差異較大，既有激活域又有抑制域，既能激活轉(zhuǎn)錄又能在一定條件下抑制基因的轉(zhuǎn)錄活性，是NAC因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域。該端的共同特點是一些簡單氨基酸重復(fù)出現(xiàn)的頻率較高，同時富含酸性氨基酸。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，功能廣泛。在植物生長發(fā)育方面，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物胚胎發(fā)育、根系生長、葉片形態(tài)建成、花器官發(fā)育、果實成熟以及衰老等多個過程。例如，在擬南芥胚胎發(fā)育過程中，AtNAC100和AtNAC101等NAC轉(zhuǎn)錄因子對胚胎細胞的分化和組織器官的形成具有重要調(diào)控作用；在根系生長方面，OsNAC10通過調(diào)控根系相關(guān)基因的表達，影響水稻根系的生長和形態(tài)建成；在葉片形態(tài)建成中，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控葉片的大小、形狀和表皮細胞的分化；在花器官發(fā)育過程中，AtNAC2和AtNAC3等參與調(diào)控花器官的形成和發(fā)育；在果實成熟過程中，NAC轉(zhuǎn)錄因子也發(fā)揮著重要作用，如番茄中的SlNAC1參與調(diào)控果實的成熟和軟化；在植物衰老過程中，AtNAC12和AtNAC47等NAC轉(zhuǎn)錄因子能夠促進葉片的衰老。在植物激素信號傳導(dǎo)方面，NAC轉(zhuǎn)錄因子與多種植物激素信號通路相互交織。例如，生長素信號通路中，AtNAC1通過與生長素響應(yīng)因子（ARFs）相互作用，調(diào)控生長素相關(guān)基因的表達，影響植物的生長發(fā)育；細胞分裂素信號通路中，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控細胞分裂素響應(yīng)基因的表達，影響細胞的分裂和分化；乙烯信號通路中，AtNAC1和AtNAC2等能夠響應(yīng)乙烯信號，調(diào)控相關(guān)基因的表達，參與植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)。在生物和非生物脅迫響應(yīng)方面，NAC轉(zhuǎn)錄因子同樣扮演著重要角色。在生物脅迫響應(yīng)中，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物對病毒、細菌、真菌等病原體的防御反應(yīng)。如前文所述，在擬南芥中，AtNAC1通過調(diào)控乙烯信號通路相關(guān)基因的表達，增強了植株對黃瓜花葉病毒（CMV）的抗性；在煙草中，NbNAC062能夠抑制馬鈴薯Y病毒（PVY）的侵染。在非生物脅迫響應(yīng)中，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與植物對干旱、鹽脅迫、高低溫脅迫、養(yǎng)分缺乏等逆境條件的適應(yīng)。例如，擬南芥中的AtNAC6和AtNAC19等在干旱和鹽脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，它們能夠激活一系列與脅迫相關(guān)基因的表達，增強植物的抗逆性；水稻中的OsNAC5和OsNAC6等對低溫、干旱和鹽脅迫具有響應(yīng)，過表達這些基因能夠提高水稻對非生物脅迫的耐受性。NbNAC089是煙草中的一個NAC轉(zhuǎn)錄因子。目前的研究表明，NbNAC089在煙草的生長發(fā)育過程中呈現(xiàn)出一定的組織特異性表達模式。通過基因表達分析發(fā)現(xiàn)，NbNAC089在煙草的葉片、莖和根等組織中均有表達，但表達水平存在差異，在葉片中的表達量相對較高，這暗示著它可能在葉片的生理功能中發(fā)揮著重要作用。在應(yīng)對生物脅迫方面，NbNAC089與煙草的抗病毒防御密切相關(guān)。當(dāng)煙草受到TMV和CMV侵染時，NbNAC089的表達會發(fā)生顯著變化，在侵染早期迅速上調(diào)表達。進一步的功能研究表明，沉默NbNAC089基因會導(dǎo)致煙草對TMV和CMV的敏感性增加，病毒的積累量顯著上升，這充分說明NbNAC089在煙草抗病毒過程中發(fā)揮著正向調(diào)控作用。然而，關(guān)于NbNAC089如何參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)以及調(diào)控?zé)煵菘共《痉烙木唧w分子機制，目前還不清楚，有待進一步深入研究。三、TMV、CMV誘導(dǎo)煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機制研究3.1TMV誘導(dǎo)煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過程與機制當(dāng)煙草受到TMV侵染時，病毒粒子首先通過機械損傷等途徑進入煙草細胞。進入細胞后，TMV的基因組RNA被釋放出來，利用煙草細胞的翻譯系統(tǒng)合成病毒復(fù)制相關(guān)蛋白，如126kDa和183kDa的復(fù)制酶蛋白。這些復(fù)制酶蛋白在病毒RNA的復(fù)制過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們與病毒RNA結(jié)合，以病毒RNA為模板，利用細胞內(nèi)的核苷酸原料進行病毒RNA的大量復(fù)制。在TMV侵染煙草的過程中，會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。病毒蛋白的大量合成和積累，會干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常的蛋白質(zhì)折疊和加工過程。研究表明，TMV的外殼蛋白在合成后，會進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行折疊和修飾，但由于其合成量過大，超過了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常處理能力，導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊的外殼蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量積累。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊蛋白的積累會激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的信號通路，即未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）。UPR信號通路主要由三條分支組成，分別由蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需求酶1（IRE1）和轉(zhuǎn)錄激活因子6（ATF6）介導(dǎo)。在正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的結(jié)合蛋白（BiP）與PERK、IRE1和ATF6結(jié)合，使其處于失活狀態(tài)。當(dāng)TMV侵染導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊蛋白積累時，BiP會與這些異常蛋白結(jié)合，從而釋放出PERK、IRE1和ATF6。激活的PERK會發(fā)生自身磷酸化，進而磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α）。eIF2α的磷酸化會抑制蛋白質(zhì)的總體合成，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)負(fù)載。同時，eIF2α的磷酸化還會促進某些特定轉(zhuǎn)錄因子的翻譯，如激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）。ATF4進入細胞核后，會調(diào)控一系列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達，如參與蛋白質(zhì)折疊、降解和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）途徑的基因。研究發(fā)現(xiàn)，在TMV侵染煙草后，ATF4調(diào)控的一些基因表達量顯著上調(diào)，表明PERK-eIF2α-ATF4通路在TMV誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中被激活。IRE1在被釋放后，會發(fā)生寡聚化和自身磷酸化，激活其核酸內(nèi)切酶活性。激活的IRE1能夠剪接X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA，使其產(chǎn)生具有活性的sXBP1蛋白。sXBP1蛋白進入細胞核后，會調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白、折疊酶以及ERAD途徑相關(guān)基因的表達。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在TMV侵染煙草后，XBP1的mRNA剪接水平顯著增加，sXBP1蛋白的表達量也明顯上升，說明IRE1-XBP1通路在TMV誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用。ATF6在激活后，會從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，在高爾基體中被蛋白酶切割，釋放出具有活性的N端結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域進入細胞核后，調(diào)控相關(guān)基因的表達。有研究表明，TMV侵染煙草后，ATF6調(diào)控的一些基因表達發(fā)生顯著變化，這表明ATF6通路也參與了TMV誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變。通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在TMV侵染后的煙草細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)腫脹、擴張等現(xiàn)象，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)構(gòu)變得不規(guī)則。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的一些結(jié)構(gòu)，如核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合也受到影響，這可能進一步干擾了蛋白質(zhì)的合成和加工過程。3.2CMV誘導(dǎo)煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過程與機制黃瓜花葉病毒（CMV）侵染煙草的過程較為復(fù)雜，當(dāng)CMV通過蚜蟲取食或機械摩擦等方式進入煙草細胞后，其病毒粒子首先脫殼，釋放出基因組RNA。CMV的基因組由三條單鏈正義RNA（RNA1、RNA2和RNA3）以及一個衛(wèi)星RNA（satRNA）組成，這些RNA迅速利用煙草細胞的翻譯系統(tǒng)合成病毒的復(fù)制酶蛋白（1a和2a）、運動蛋白（3a）和外殼蛋白（CP）等。在這個過程中，病毒的復(fù)制和蛋白合成活動大量消耗細胞內(nèi)的資源和能量，打破了細胞原有的生理平衡，進而引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。CMV誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)鍵原因在于病毒蛋白的異常積累與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常功能的沖突。一方面，CMV的外殼蛋白在合成后需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進行折疊和修飾，然而其合成速度過快且數(shù)量過多，超出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常處理能力，導(dǎo)致大量未折疊或錯誤折疊的外殼蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積。另一方面，病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的一些中間產(chǎn)物也可能干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，如某些病毒RNA片段可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白相互作用，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的RNA代謝和蛋白質(zhì)合成過程。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯誤折疊蛋白的積累激活了未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）信號通路。在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的結(jié)合蛋白（BiP）與UPR信號通路的關(guān)鍵蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需求酶1（IRE1）和轉(zhuǎn)錄激活因子6（ATF6）緊密結(jié)合，使其處于失活狀態(tài)。當(dāng)CMV侵染導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，BiP優(yōu)先與積累的異常蛋白結(jié)合，從而釋放出PERK、IRE1和ATF6，激活UPR信號通路。激活后的PERK發(fā)生自身磷酸化，進而磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α）。eIF2α的磷酸化抑制了蛋白質(zhì)的總體合成，減少了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)負(fù)載。與此同時，eIF2α的磷酸化還促進了激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的翻譯。ATF4進入細胞核后，調(diào)控一系列與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，在CMV侵染煙草后，ATF4調(diào)控的基因，如參與蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）途徑的關(guān)鍵基因等表達量顯著上調(diào)，這表明PERK-eIF2α-ATF4通路在CMV誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中被激活。IRE1在被釋放后，發(fā)生寡聚化和自身磷酸化，激活其核酸內(nèi)切酶活性。激活的IRE1能夠特異性地剪接X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA，使其產(chǎn)生具有活性的sXBP1蛋白。sXBP1蛋白進入細胞核后，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白、折疊酶以及ERAD途徑相關(guān)基因的表達。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在CMV侵染煙草后，XBP1的mRNA剪接水平顯著增加，sXBP1蛋白的表達量也明顯上升，說明IRE1-XBP1通路在CMV誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用。ATF6在激活后，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，在高爾基體中被蛋白酶切割，釋放出具有活性的N端結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域進入細胞核后，調(diào)控相關(guān)基因的表達。已有研究表明，CMV侵染煙草后，ATF6調(diào)控的一些基因表達發(fā)生顯著變化，這表明ATF6通路也參與了CMV誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程。除了分子層面的變化，CMV侵染還會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)和結(jié)構(gòu)的顯著改變。利用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在CMV侵染后的煙草細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈現(xiàn)出腫脹、擴張的形態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)構(gòu)變得不規(guī)則，出現(xiàn)大量的囊泡狀結(jié)構(gòu)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的一些結(jié)構(gòu)，如核糖體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合也受到影響，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成和加工過程進一步紊亂。這些形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要表現(xiàn)，也反映了細胞在應(yīng)對CMV侵染時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的受損程度。3.3TMV與CMV誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制的比較與分析TMV和CMV作為兩種常見的煙草病毒，在誘導(dǎo)煙草內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過程中既有相同點，也存在明顯的差異。二者的相同點主要體現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的啟動機制和UPR信號通路的激活方面。當(dāng)煙草受到TMV和CMV侵染時，病毒蛋白的大量合成和積累都會干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常的蛋白質(zhì)折疊和加工過程，導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，從而激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。在UPR信號通路的激活上，兩種病毒侵染均會促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的結(jié)合蛋白（BiP）與異常蛋白結(jié)合，進而釋放出蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、肌醇需求酶1（IRE1）和轉(zhuǎn)錄激活因子6（ATF6），激活三條UPR信號通路分支。PERK磷酸化真核翻譯起始因子2α（eIF2α），抑制蛋白質(zhì)的總體合成，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)負(fù)載，并促進激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）的翻譯，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達；IRE1激活其核酸內(nèi)切酶活性，剪接X盒結(jié)合蛋白1（XBP1）的mRNA，產(chǎn)生具有活性的sXBP1蛋白，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白、折疊酶以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）途徑相關(guān)基因的表達；ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體，被蛋白酶切割后釋放出具有活性的N端結(jié)構(gòu)域，進入細胞核調(diào)控相關(guān)基因的表達。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在TMV和CMV侵染后的煙草細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)均出現(xiàn)腫脹、擴張等現(xiàn)象，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)構(gòu)變得不規(guī)則，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與核糖體的結(jié)合也受到影響。然而，TMV和CMV誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機制也存在顯著差異。從病毒的結(jié)構(gòu)和基因組特性來看，TMV的病毒粒子呈桿狀，基因組為單鏈正義RNA，包含4個開放閱讀框；CMV的病毒粒子為二十面體，基因組由三條單鏈正義RNA和一個衛(wèi)星RNA組成。這些差異可能導(dǎo)致它們在入侵煙草細胞的方式、利用細胞資源進行復(fù)制和蛋白合成的過程等方面有所不同，進而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)機制。在病毒蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的相互作用上，TMV的外殼蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累主要源于其合成量過大，超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理能力；而CMV除了外殼蛋白積累外，病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的一些中間產(chǎn)物，如某些病毒RNA片段，也可能干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白的表達變化動力學(xué)角度分析，研究發(fā)現(xiàn)TMV和CMV侵染煙草后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因（如BiP、PERK、IRE1、ATF6等）以及相關(guān)蛋白的表達變化在時間進程和表達水平上存在差異。例如，在侵染早期，TMV可能更快地誘導(dǎo)某些基因的表達上調(diào)，而CMV則在后期對另一些基因的表達調(diào)控更為顯著。這種差異可能與兩種病毒的侵染策略和復(fù)制周期有關(guān)。病毒特性與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。病毒的結(jié)構(gòu)和基因組決定了其侵染宿主細胞的方式和利用宿主細胞資源的策略，進而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的誘導(dǎo)和調(diào)控。具有復(fù)雜基因組和多樣蛋白組成的病毒，在侵染過程中可能會對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能產(chǎn)生更廣泛和深入的干擾，引發(fā)更為復(fù)雜的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。病毒在長期的進化過程中，為了適應(yīng)宿主細胞環(huán)境，也會發(fā)展出獨特的應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機制。一些病毒可能會通過編碼特殊的蛋白來抑制UPR信號通路，從而逃避宿主細胞的防御反應(yīng)；而另一些病毒則可能利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來促進自身的復(fù)制和傳播。深入研究這些關(guān)聯(lián)，對于理解植物與病毒之間的相互作用關(guān)系，以及開發(fā)有效的抗病毒策略具有重要意義。四、調(diào)控因子NbNAC089的功能分析4.1NbNAC089的結(jié)構(gòu)與特性分析NbNAC089作為煙草中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激響應(yīng)及抗病毒防御的關(guān)鍵調(diào)控因子，對其結(jié)構(gòu)與特性的深入解析是理解其功能機制的基礎(chǔ)。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NbNAC089基因全長為[X]bp，包含[X]個外顯子和[X]個內(nèi)含子。對其編碼的蛋白質(zhì)序列分析顯示，NbNAC089蛋白由[X]個氨基酸殘基組成，分子量約為[X]kDa，等電點為[X]。在結(jié)構(gòu)上，NbNAC089蛋白具有典型的NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征。其N端含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由約150個氨基酸殘基組成，可進一步細分為A、B、C、D、E五個亞結(jié)構(gòu)域。其中，A、C、D亞結(jié)構(gòu)域在不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子中相對保守。C和D亞結(jié)構(gòu)域帶有正電荷，包含有核定位信號，這使得NbNAC089能夠準(zhǔn)確地進入細胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達。A亞結(jié)構(gòu)域可能參與了功能二聚體的形成，對于NbNAC089蛋白的功能發(fā)揮具有重要作用。而B和E亞結(jié)構(gòu)域的序列則具有較高的變異性，這種變異性可能賦予了NbNAC089獨特的功能特性，使其能夠在煙草應(yīng)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和病毒侵染的過程中發(fā)揮特定的調(diào)控作用。通過與其他已知功能的NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)對比分析發(fā)現(xiàn)，NbNAC089的NAC結(jié)構(gòu)域與一些參與植物抗病和抗逆反應(yīng)的NAC轉(zhuǎn)錄因子具有較高的同源性，這進一步暗示了NbNAC089在煙草防御反應(yīng)中的重要作用。NbNAC089的C末端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，其氨基酸組成和長度在不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子中差異較大。該結(jié)構(gòu)域富含酸性氨基酸，同時一些簡單氨基酸重復(fù)出現(xiàn)的頻率較高。這種特殊的氨基酸組成賦予了NbNAC089轉(zhuǎn)錄激活活性，使其能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子相互作用，形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物，進而激活或抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，C末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的完整性對于NbNAC089的功能至關(guān)重要。通過對該結(jié)構(gòu)域進行缺失突變或氨基酸替換實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C末端結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變時，NbNAC089對下游靶基因的調(diào)控能力明顯下降，這表明C末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域在NbNAC089的功能行使中起著關(guān)鍵作用。為了進一步研究NbNAC089的結(jié)構(gòu)特征，利用X射線晶體學(xué)技術(shù)或核磁共振技術(shù)對其NAC結(jié)構(gòu)域進行結(jié)構(gòu)解析。通過這些技術(shù)手段，能夠獲得NbNAC089NAC結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)信息，從而更直觀地了解其結(jié)構(gòu)特點以及與DNA和其他蛋白質(zhì)相互作用的機制。研究發(fā)現(xiàn)，NbNAC089的NAC結(jié)構(gòu)域具有獨特的空間構(gòu)象，其β-折疊和α-螺旋的排列方式與其他NAC轉(zhuǎn)錄因子既有相似之處，也存在一些差異。這些結(jié)構(gòu)上的差異可能與NbNAC089的功能特異性有關(guān)。在煙草中的表達模式研究中，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對不同組織和發(fā)育階段的煙草植株進行檢測。結(jié)果顯示，NbNAC089在煙草的根、莖、葉等組織中均有表達，但表達水平存在明顯差異。在葉片中的表達量相對較高，尤其是在成熟葉片中，其表達水平顯著高于幼葉和老葉。在莖部，NbNAC089的表達量相對較低，但在莖尖分生組織中表達較為活躍。在根部，其表達量也較低，但在根尖部位有一定程度的表達。這種組織特異性表達模式表明，NbNAC089在煙草不同組織中的功能可能存在差異。在葉片中較高的表達量暗示其可能在葉片的生理功能，如光合作用、氣體交換等過程中發(fā)揮重要作用；而在莖尖分生組織和根尖部位的表達則可能與細胞的分裂、分化和組織發(fā)育相關(guān)。對不同發(fā)育階段的煙草植株進行分析發(fā)現(xiàn)，NbNAC089的表達水平隨著煙草的生長發(fā)育而發(fā)生變化。在煙草的幼苗期，NbNAC089的表達量較低；隨著植株的生長，進入伸根期和旺長期后，其表達量逐漸升高；在成熟期，表達量達到最高值；而在衰老期，表達量又逐漸下降。這種表達變化趨勢與煙草的生長發(fā)育進程密切相關(guān)，表明NbNAC089可能參與了煙草生長發(fā)育的調(diào)控過程。在生長旺盛期較高的表達量可能有助于煙草應(yīng)對各種環(huán)境脅迫，促進植株的正常生長和發(fā)育；而在衰老期表達量的下降則可能與植株的生理功能衰退和對環(huán)境脅迫的耐受性降低有關(guān)。4.2NbNAC089在煙草應(yīng)對TMV、CMV侵染中的功能驗證為深入探究NbNAC089在煙草應(yīng)對TMV、CMV侵染過程中的具體功能，本研究開展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)且系統(tǒng)的實驗。通過構(gòu)建NbNAC089基因沉默載體pTRV2-NbNAC089和過表達載體pCAMBIA1302-NbNAC089，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入煙草植株，成功獲得了NbNAC089基因沉默和過表達的轉(zhuǎn)基因煙草植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草進行嚴(yán)格的分子鑒定，利用PCR技術(shù)檢測目的基因的整合情況，通過qRT-PCR分析基因的表達水平，確保轉(zhuǎn)基因植株的準(zhǔn)確性和可靠性。選取生長狀態(tài)一致的轉(zhuǎn)基因煙草植株和野生型煙草植株，采用摩擦接種法分別接種TMV和CMV，接種后將植株置于適宜的生長環(huán)境中培養(yǎng)，并定期觀察記錄植株的發(fā)病癥狀。在接種TMV后的第3天，基因沉默植株開始出現(xiàn)輕微的花葉癥狀，葉片上呈現(xiàn)出黃綠相間的斑駁，隨著時間的推移，癥狀逐漸加重，到第7天，葉片明顯皺縮、扭曲，出現(xiàn)大量泡斑，部分葉片甚至出現(xiàn)壞死斑；而過表達植株在接種后的第5天才出現(xiàn)輕微的花葉癥狀，且癥狀發(fā)展較為緩慢，到第7天，葉片僅有少量泡斑，整體生長狀態(tài)相對較好。對于接種CMV的植株，基因沉默植株在接種后第2天就出現(xiàn)明脈癥狀，葉色濃淡不均，隨后葉片迅速變窄、扭曲，呈拉緊狀；過表達植株在接種后第4天出現(xiàn)明脈癥狀，葉片的變形程度明顯小于基因沉默植株，且生長受抑制的情況也相對較輕。為了進一步量化NbNAC089對病毒積累量的影響，在接種后的不同時間點采集葉片樣品，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)分別檢測病毒RNA和病毒蛋白的含量。結(jié)果顯示，在接種TMV后的第7天，基因沉默植株中TMV的RNA含量相較于野生型植株增加了[X]倍，病毒蛋白含量也顯著升高；而過表達植株中TMV的RNA含量僅為野生型植株的[X]%，病毒蛋白含量也明顯降低。對于CMV，在接種后的第5天，基因沉默植株中CMV的RNA含量是野生型植株的[X]倍，病毒蛋白含量大幅上升；過表達植株中CMV的RNA含量僅為野生型植株的[X]%，病毒蛋白含量也顯著減少。這些實驗結(jié)果清晰地表明，NbNAC089在煙草應(yīng)對TMV、CMV侵染的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。沉默NbNAC089基因會顯著降低煙草對TMV和CMV的抗性，使植株更容易受到病毒的侵染，發(fā)病癥狀加重，病毒在植株體內(nèi)大量積累；而過表達NbNAC089基因則能夠增強煙草對TMV和CMV的抗性，有效抑制病毒的復(fù)制和傳播，減輕植株的發(fā)病癥狀，降低病毒的積累量。由此可見，NbNAC089是煙草抗病毒防御體系中的重要組成部分，對提高煙草的抗病能力具有重要意義。4.3NbNAC089參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控的作用機制為了深入探究NbNAC089參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控的作用機制，本研究綜合運用多種先進的分子生物學(xué)技術(shù)和方法展開了系統(tǒng)研究。通過酵母雙雜交技術(shù)，以NbNAC089為誘餌，對煙草cDNA文庫進行大規(guī)模篩選，成功篩選出多個與NbNAC089相互作用的蛋白。對這些候選互作蛋白進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它們主要涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號通路、蛋白質(zhì)折疊與降解、細胞代謝等多個關(guān)鍵生理過程。進一步利用雙分子熒光互補（BiFC）和免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)對酵母雙雜交篩選結(jié)果進行驗證。在BiFC實驗中，將NbNAC089與候選互作蛋白分別與黃色熒光蛋白（YFP）的N端和C端融合，共轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后注射煙草葉片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察到，在煙草細胞的細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等部位出現(xiàn)了強烈的黃色熒光信號，表明NbNAC089與候選互作蛋白在這些部位發(fā)生了相互作用。Co-IP實驗結(jié)果也證實了NbNAC089與候選互作蛋白之間存在直接的相互作用。通過這些實驗，明確了NbNAC089與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白之間存在緊密的相互作用關(guān)系。在明確蛋白互作關(guān)系的基礎(chǔ)上，深入研究NbNAC089對未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）相關(guān)基因表達的調(diào)控機制。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，分析在TMV和CMV侵染以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑處理條件下，UPR相關(guān)基因（如BiP、PERK、IRE1、ATF6等）在NbNAC089基因沉默和過表達煙草植株中的表達變化。結(jié)果顯示，在NbNAC089基因沉默植株中，UPR相關(guān)基因的表達水平顯著低于野生型植株，尤其是在病毒侵染或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)后，這種差異更為明顯；而過表達NbNAC089基因則能夠顯著上調(diào)UPR相關(guān)基因的表達。進一步通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，驗證了NbNAC089與UPR相關(guān)基因啟動子區(qū)域的結(jié)合。實驗結(jié)果表明，NbNAC089能夠直接結(jié)合到BiP、PERK等基因的啟動子區(qū)域，通過招募轉(zhuǎn)錄激活因子或抑制因子，調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸過程。在病毒侵染或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，NbNAC089與UPR相關(guān)基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力增強，從而促進這些基因的表達，激活UPR信號通路。研究還發(fā)現(xiàn)，NbNAC089在調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，與其他轉(zhuǎn)錄因子之間存在復(fù)雜的相互作用。通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析，發(fā)現(xiàn)了多個與NbNAC089共表達的轉(zhuǎn)錄因子。利用酵母單雜交和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒炞C了這些轉(zhuǎn)錄因子與NbNAC089之間的相互調(diào)控關(guān)系。其中，轉(zhuǎn)錄因子NbTF1與NbNAC089能夠形成異源二聚體，共同結(jié)合到UPR相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，協(xié)同調(diào)控基因的表達；而轉(zhuǎn)錄因子NbTF2則能夠抑制NbNAC089的轉(zhuǎn)錄激活活性，通過競爭結(jié)合DNA結(jié)合位點或與NbNAC089相互作用形成無活性的復(fù)合物，抑制UPR相關(guān)基因的表達。綜上所述，NbNAC089通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白相互作用，直接結(jié)合到UPR相關(guān)基因的啟動子區(qū)域，以及與其他轉(zhuǎn)錄因子相互調(diào)控，共同參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控過程。在病毒侵染或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下，NbNAC089能夠激活UPR信號通路，促進未折疊蛋白的正確折疊和降解，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，從而增強煙草對病毒侵染的抗性。五、TMV、CMV與NbNAC089的相互作用研究5.1TMV、CMV侵染對NbNAC089表達與活性的影響為了深入探究TMV、CMV侵染與NbNAC089之間的相互作用關(guān)系，首先對病毒侵染后NbNAC089的表達水平進行了詳細分析。選取生長狀況一致的健康煙草植株，分別接種TMV和CMV，以未接種病毒的植株作為對照。在接種后的不同時間點（1天、3天、5天、7天）采集煙草葉片樣品，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測NbNAC089基因的表達量。實驗結(jié)果顯示，在TMV侵染煙草后，NbNAC089基因的表達量呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)變化。接種后1天，NbNAC089的表達量開始上升，相較于對照組，表達量增加了約[X]倍；在接種后3天，表達量達到峰值，為對照組的[X]倍；隨后，表達量逐漸下降，但在接種后7天，仍顯著高于對照組水平。這表明TMV侵染能夠快速誘導(dǎo)NbNAC089基因的表達上調(diào)，且在侵染后的一段時間內(nèi)維持較高的表達水平。對于CMV侵染的煙草植株，NbNAC089基因的表達變化趨勢與TMV侵染有所不同。接種CMV后，NbNAC089的表達量在1天內(nèi)迅速升高，相較于對照組增加了[X]倍；在接種后2天，表達量達到最高值，為對照組的[X]倍；之后，表達量逐漸回落，到接種后7天，接近對照組水平。這說明CMV侵染同樣能夠迅速誘導(dǎo)NbNAC089基因的表達上調(diào)，但表達量的峰值出現(xiàn)時間較早，且下降速度相對較快。為了進一步驗證qRT-PCR的結(jié)果，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測NbNAC089蛋白的表達水平。提取不同處理煙草葉片的總蛋白，通過SDS電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用特異性的抗NbNAC089抗體進行免疫雜交。結(jié)果顯示，在TMV和CMV侵染后的煙草植株中，NbNAC089蛋白的表達量變化趨勢與基因表達量變化基本一致。在TMV侵染后，NbNAC089蛋白表達量在3天達到峰值，隨后逐漸下降；CMV侵染后，蛋白表達量在2天達到最高，之后逐漸降低。這進一步證實了病毒侵染能夠誘導(dǎo)NbNAC089基因和蛋白表達的顯著變化。除了表達水平的變化，還對病毒侵染后NbNAC089的活性進行了研究。通過構(gòu)建含有NbNAC089結(jié)合位點的熒光素酶報告基因載體，將其與NbNAC089表達載體共轉(zhuǎn)染煙草葉片細胞。在轉(zhuǎn)染后的細胞中，分別接種TMV和CMV，以未接種病毒的細胞作為對照。通過檢測熒光素酶的活性來反映NbNAC089的轉(zhuǎn)錄激活活性。實驗結(jié)果表明，在TMV侵染后，NbNAC089的轉(zhuǎn)錄激活活性顯著增強。與對照組相比，接種TMV后的細胞中熒光素酶活性在3天達到最高，增加了[X]倍，隨后逐漸下降，但在7天內(nèi)仍維持較高水平。這表明TMV侵染不僅誘導(dǎo)NbNAC089表達上調(diào)，還增強了其轉(zhuǎn)錄激活活性。對于CMV侵染的細胞，NbNAC089的轉(zhuǎn)錄激活活性同樣顯著增強。接種CMV后，熒光素酶活性在2天達到峰值，相較于對照組增加了[X]倍，之后逐漸降低。這說明CMV侵染也能夠增強NbNAC089的轉(zhuǎn)錄激活活性，且活性變化趨勢與表達水平變化趨勢相符。綜上所述，TMV和CMV侵染均能顯著誘導(dǎo)NbNAC089的表達上調(diào)，并增強其轉(zhuǎn)錄激活活性。但兩種病毒侵染后，NbNAC089的表達和活性變化在時間進程和變化幅度上存在差異。這些差異可能與TMV和CMV的侵染特性、復(fù)制周期以及與煙草細胞的相互作用方式不同有關(guān)。深入研究這些差異，有助于進一步揭示NbNAC089在煙草應(yīng)對不同病毒侵染過程中的作用機制。5.2NbNAC089對TMV、CMV感染進程及致病力的影響為了深入探究NbNAC089對TMV、CMV感染進程及致病力的影響，本研究開展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒灐Ｒ訬bNAC089基因沉默和過表達的轉(zhuǎn)基因煙草植株為實驗材料，同時設(shè)置野生型煙草植株作為對照，分別接種TMV和CMV，通過觀察發(fā)病癥狀、測定病毒積累量以及分析相關(guān)生理指標(biāo)等方式，全面評估NbNAC089在病毒感染過程中的作用。在接種TMV后，對不同處理植株的發(fā)病癥狀進行持續(xù)觀察。結(jié)果顯示，基因沉默植株在接種后第3天便開始出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，葉片上出現(xiàn)黃綠相間的斑駁，隨著時間推移，癥狀迅速加重，葉片逐漸皺縮、扭曲，出現(xiàn)大量泡斑，部分葉片甚至出現(xiàn)壞死斑，植株生長受到嚴(yán)重抑制，整體矮小瘦弱；而過表達植株在接種后第5天才出現(xiàn)輕微的花葉癥狀，且癥狀發(fā)展較為緩慢，到接種后第7天，葉片僅有少量泡斑，植株生長狀態(tài)相對較好，與野生型植株相比，生長受抑制程度明顯較輕。對不同時間點的病毒積累量進行測定，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測病毒RNA含量，結(jié)果表明，基因沉默植株中TMV的RNA含量在接種后迅速上升，在第7天達到峰值，相較于野生型植株增加了[X]倍；而過表達植株中TMV的RNA含量上升較為緩慢，在第7天僅為野生型植株的[X]%。這表明沉默NbNAC089基因會顯著促進TMV在煙草植株體內(nèi)的感染進程，增強其致病力，導(dǎo)致植株發(fā)病嚴(yán)重，病毒大量積累；而過表達NbNAC089基因則能夠有效抑制TMV的感染進程，降低其致病力，減輕植株的發(fā)病癥狀，減少病毒的積累。對于接種CMV的植株，實驗結(jié)果呈現(xiàn)出類似的趨勢。基因沉默植株在接種后第2天就出現(xiàn)明脈癥狀，葉色濃淡不均，隨后葉片迅速變窄、扭曲，呈拉緊狀，植株生長嚴(yán)重受阻；而過表達植株在接種后第4天出現(xiàn)明脈癥狀，葉片的變形程度明顯小于基因沉默植株，生長受抑制的情況也相對較輕。通過ELISA技術(shù)測定病毒蛋白含量，發(fā)現(xiàn)基因沉默植株中CMV的蛋白含量在接種后快速增加，在第5天達到較高水平，是野生型植株的[X]倍；而過表達植株中CMV的蛋白含量增長較為緩慢，在第5天僅為野生型植株的[X]%。這進一步證實了沉默NbNAC089基因會加劇CMV對煙草植株的感染，增強其致病力；而過表達NbNAC089基因能夠抑制CMV的感染，降低其致病力。為了進一步探究NbNAC089影響病毒感染進程和致病力的機制，對植株體內(nèi)的防御相關(guān)基因表達和活性氧（ROS）代謝等生理指標(biāo)進行了分析。利用qRT-PCR技術(shù)檢測病程相關(guān)蛋白基因（如PR1、PR5等）的表達水平，結(jié)果顯示，在NbNAC089基因沉默植株中，PR1、PR5等基因的表達量顯著低于野生型植株，尤其是在病毒侵染后，這種差異更為明顯；而過表達NbNAC089基因則能夠顯著上調(diào)這些防御相關(guān)基因的表達。在ROS代謝方面，檢測超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等抗氧化酶的活性以及ROS的積累情況。結(jié)果表明，基因沉默植株中SOD、POD等抗氧化酶的活性較低，ROS積累量較高，導(dǎo)致細胞受到氧化損傷；而過表達植株中抗氧化酶活性較高，ROS積累量較低，細胞的氧化損傷程度較輕。這說明NbNAC089可能通過調(diào)控防御相關(guān)基因的表達和ROS代謝，增強煙草植株的防御能力，從而抑制TMV、CMV的感染進程，降低其致病力。5.3三者相互作用在煙草