MicroRNA-155對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT的調(diào)控機(jī)制與臨床意義探究一、引言1.1研究背景胃癌，作為全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。近年來，雖然在胃癌的診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但總體的發(fā)病率和死亡率仍然居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球約有大量新發(fā)病例，且多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，這極大地影響了患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。在中國(guó)，胃癌同樣是一個(gè)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中均位居前列。MicroRNA-155（miR-155）作為一類重要的非編碼小RNA，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。大量研究表明，miR-155參與了多種生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等。在腫瘤領(lǐng)域，miR-155被發(fā)現(xiàn)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，它既可以作為癌基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，也可以作為抑癌基因抑制腫瘤的生長(zhǎng)，其具體作用取決于腫瘤的類型和微環(huán)境。例如，在乳腺癌中，miR-155的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)；而在某些血液系統(tǒng)腫瘤中，miR-155則表現(xiàn)出抑癌作用。端粒酶催化亞單位（hTERT）是端粒酶的核心組成部分，其活性對(duì)于維持端粒的長(zhǎng)度和穩(wěn)定性至關(guān)重要。在正常體細(xì)胞中，hTERT的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，端粒酶活性較低；而在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，hTERT的表達(dá)異常升高，導(dǎo)致端粒酶活性增強(qiáng)，使得腫瘤細(xì)胞能夠無(wú)限增殖，逃避細(xì)胞衰老和凋亡，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色。研究hTERT在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于深入理解腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新的治療策略具有重要意義。目前，關(guān)于miR-155和hTERT在腫瘤研究中的各自作用已有較多報(bào)道，但二者之間的關(guān)聯(lián)以及在胃癌中的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。探討miR-155對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT的調(diào)控作用，不僅有助于揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，還可能為胃癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和靶向治療提供新的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，具有重要的理論和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的本研究旨在深入探究MicroRNA-155對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT的調(diào)控作用及具體機(jī)制。通過一系列實(shí)驗(yàn)，明確miR-155與hTERT在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)關(guān)系，分析miR-155對(duì)hTERT基因和蛋白表達(dá)水平的影響，以及這種調(diào)控作用如何影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、周期等生物學(xué)行為。進(jìn)一步揭示miR-155調(diào)控hTERT的分子信號(hào)通路，為闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)。同時(shí)，期望通過本研究，能夠發(fā)現(xiàn)潛在的胃癌治療靶點(diǎn)，為胃癌的臨床治療提供新的策略和思路，提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量。1.3研究意義本研究深入探究MicroRNA-155對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT的調(diào)控作用，具有多方面的重要意義。在理論層面，有助于豐富對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的理解。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)通路異常的復(fù)雜過程。雖然目前已經(jīng)明確一些基因和信號(hào)通路在胃癌中的作用，但仍有許多關(guān)鍵機(jī)制尚未完全闡明。miR-155作為一種重要的非編碼RNA，以及hTERT在維持腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖能力中的關(guān)鍵作用，二者之間的關(guān)聯(lián)研究尚處于探索階段。本研究通過揭示miR-155對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT的調(diào)控機(jī)制，有望進(jìn)一步完善胃癌發(fā)生發(fā)展的分子網(wǎng)絡(luò)，為后續(xù)深入研究胃癌的生物學(xué)特性提供新的視角和理論基礎(chǔ)，推動(dòng)腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。從臨床應(yīng)用角度來看，本研究具有極大的潛在價(jià)值。首先，可能為胃癌的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物。目前，胃癌的早期診斷主要依賴胃鏡檢查和病理活檢，但這些方法存在一定的局限性，如胃鏡檢查為侵入性操作，部分患者接受度較低，且早期胃癌的癥狀不典型，容易漏診。若能發(fā)現(xiàn)miR-155和hTERT在胃癌早期階段的特異性表達(dá)變化，通過檢測(cè)血液、胃液等體液中的相關(guān)指標(biāo)，有望實(shí)現(xiàn)胃癌的早期無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)診斷，提高早期診斷率，為患者爭(zhēng)取最佳治療時(shí)機(jī)。其次，為胃癌的預(yù)后評(píng)估提供更精準(zhǔn)的指標(biāo)。準(zhǔn)確判斷胃癌患者的預(yù)后對(duì)于制定個(gè)性化治療方案和預(yù)測(cè)患者生存情況至關(guān)重要。研究miR-155和hTERT的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，能夠更全面地評(píng)估患者的病情嚴(yán)重程度和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，為臨床醫(yī)生制定治療決策提供有力依據(jù)。最后，最重要的是為胃癌的靶向治療提供新的靶點(diǎn)。當(dāng)前胃癌的治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療等，但對(duì)于中晚期胃癌患者，這些傳統(tǒng)治療方法的效果往往不盡人意，且存在較大的副作用。本研究若能明確miR-155調(diào)控hTERT的關(guān)鍵分子信號(hào)通路，就有可能開發(fā)出針對(duì)該通路的靶向治療藥物，實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌細(xì)胞的精準(zhǔn)打擊，提高治療效果，同時(shí)減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷，降低治療副作用，為胃癌患者帶來新的希望，推動(dòng)胃癌臨床治療的發(fā)展和進(jìn)步。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1MicroRNA-155概述2.1.1MicroRNA-155的結(jié)構(gòu)與功能MicroRNA-155（miR-155）是一類高度保守的非編碼小RNA，其基因位于人類21號(hào)染色體上的B細(xì)胞非編碼集合基因簇（Bcellintegrationcluster，BIC）的第3個(gè)外顯子中。pri-miR-155在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成，隨后在核酸酶Drosha及其輔助因子的作用下，被剪切成約70-90個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的pre-miR-155，呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。pre-miR-155在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的協(xié)助下，從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miR-155被核酸酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步加工，最終形成長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的成熟miR-155單鏈。成熟的miR-1555'端帶有磷酸基團(tuán)，3'端為羥基，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其能夠與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合，進(jìn)而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。miR-155在細(xì)胞的多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞增殖方面，大量研究表明，miR-155可以通過調(diào)控相關(guān)靶基因，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。例如，在某些腫瘤細(xì)胞中，miR-155的高表達(dá)能夠激活細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促使細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而加速細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡過程中，miR-155的作用較為復(fù)雜，它既可以通過抑制抗凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；也可以通過抑制促凋亡基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，具體作用取決于細(xì)胞的類型和微環(huán)境。此外，miR-155還參與了細(xì)胞分化過程，對(duì)細(xì)胞的分化方向和進(jìn)程產(chǎn)生影響。例如，在造血干細(xì)胞的分化過程中，miR-155的表達(dá)水平變化能夠調(diào)控不同血細(xì)胞系的分化，影響血細(xì)胞的生成和發(fā)育。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-155表現(xiàn)出雙重作用。一方面，在許多實(shí)體腫瘤如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等中，miR-155常常作為癌基因發(fā)揮作用。它可以通過靶向抑制腫瘤抑制基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而推動(dòng)腫瘤的發(fā)展。例如，miR-155可以靶向抑制PTEN基因的表達(dá)，PTEN是一種重要的腫瘤抑制基因，其表達(dá)被抑制后，會(huì)導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。另一方面，在一些血液系統(tǒng)腫瘤中，miR-155卻表現(xiàn)出抑癌基因的功能。它可以通過抑制癌基因的表達(dá)，或者調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。例如，在慢性淋巴細(xì)胞白血病中，miR-155能夠抑制一些癌基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)揮抑癌作用。這種在不同腫瘤中作用的差異，可能與腫瘤細(xì)胞的起源、遺傳背景以及腫瘤微環(huán)境等多種因素有關(guān)。2.1.2MicroRNA-155在腫瘤中的研究進(jìn)展近年來，關(guān)于miR-155在腫瘤中的研究取得了豐碩的成果。大量研究表明，miR-155在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)出異常表達(dá)的情況。在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)miR-155的表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織，且其高表達(dá)與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以通過靶向抑制一些腫瘤抑制基因如SOCS1等，激活相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在肺癌中，miR-155同樣被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與肺癌的分期、轉(zhuǎn)移和患者的生存率相關(guān)。miR-155可以通過調(diào)控多個(gè)靶基因，如RASA1等，影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。在消化系統(tǒng)腫瘤中，miR-155也表現(xiàn)出重要的作用。在肝癌組織中，miR-155的表達(dá)上調(diào)，它可以通過靶向抑制一些關(guān)鍵基因，如TP53INP1等，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。在結(jié)直腸癌中，miR-155的異常表達(dá)也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，miR-155可以通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路等，影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、分化和遷移。在泌尿系統(tǒng)腫瘤方面，在腎癌中，miR-155的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度和預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)的miR-155可以促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖和遷移。在膀胱癌中，miR-155同樣參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，通過調(diào)控相關(guān)靶基因，影響膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。關(guān)于miR-155在腫瘤中的致癌或抑癌機(jī)制研究也在不斷深入。除了上述通過靶向抑制腫瘤抑制基因或癌基因來發(fā)揮作用外，miR-155還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，間接影響腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。例如，miR-155可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化，使其向促腫瘤生長(zhǎng)的M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的炎癥反應(yīng)，有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，miR-155還可以通過影響腫瘤血管生成等過程，對(duì)腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生影響。然而，盡管目前已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展，但miR-155在腫瘤中的具體作用機(jī)制仍存在許多未知之處，有待進(jìn)一步深入研究。2.2hTERT概述2.2.1hTERT的結(jié)構(gòu)與功能端粒酶催化亞單位（hTERT）是端粒酶的關(guān)鍵組成部分，對(duì)端粒酶的活性起著決定性作用。人類hTERT基因位于5號(hào)染色體短臂（5p15.33），其基因全長(zhǎng)約40kb，包含16個(gè)外顯子和15個(gè)內(nèi)含子。hTERT蛋白由1132個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為127kDa。從結(jié)構(gòu)上看，hTERT蛋白可分為多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，包括N端的端粒酶RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（TRBD）、C端的逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域（RT）以及中間的RNA識(shí)別基序（RRM）等。TRBD結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與端粒酶RNA（hTR）結(jié)合，形成具有活性的端粒酶復(fù)合體，這是端粒酶發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。RT結(jié)構(gòu)域則具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，能夠以hTR為模板，將端粒重復(fù)序列（TTAGGG）添加到染色體末端，實(shí)現(xiàn)端粒的延伸。RRM結(jié)構(gòu)域在hTERT與RNA的相互作用以及穩(wěn)定端粒酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用。在正常體細(xì)胞中，hTERT的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，端粒酶活性處于較低水平。隨著細(xì)胞的不斷分裂，端粒逐漸縮短，當(dāng)端粒縮短到一定程度時(shí)，細(xì)胞會(huì)進(jìn)入衰老或凋亡程序，這是機(jī)體維持細(xì)胞正常生理功能和防止細(xì)胞異常增殖的一種重要機(jī)制。然而，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，hTERT的表達(dá)被異常激活，使得端粒酶活性顯著增強(qiáng)。腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)hTERT，不斷延伸端粒長(zhǎng)度，維持染色體的穩(wěn)定性，從而逃避細(xì)胞衰老和凋亡，獲得無(wú)限增殖的能力。例如，在胃癌細(xì)胞中，hTERT的高表達(dá)使得癌細(xì)胞能夠持續(xù)分裂，不斷增殖，導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。此外，hTERT還參與了腫瘤細(xì)胞的其他生物學(xué)過程，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，影響腫瘤細(xì)胞的代謝等。研究表明，hTERT可以通過調(diào)節(jié)一些與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因和信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在代謝方面，hTERT能夠影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝，使其更適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的需求，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。2.2.2hTERT在腫瘤中的研究進(jìn)展大量研究表明，hTERT在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌中，hTERT的高表達(dá)與腫瘤的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，hTERT高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力和侵襲能力，更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。通過抑制hTERT的表達(dá)，可以有效降低乳腺癌細(xì)胞的端粒酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在肺癌中，hTERT同樣被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與肺癌的分期、病理類型以及患者的生存率相關(guān)。早期肺癌患者中，hTERT的表達(dá)水平相對(duì)較低；而隨著腫瘤的進(jìn)展，hTERT的表達(dá)逐漸升高。高表達(dá)hTERT的肺癌患者往往預(yù)后較差，生存期較短。此外，在結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌等消化系統(tǒng)腫瘤中，hTERT的高表達(dá)也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，hTERT的表達(dá)與腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，高表達(dá)hTERT的結(jié)直腸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖和轉(zhuǎn)移能力。在肝癌中，hTERT的高表達(dá)促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，并且與肝癌的復(fù)發(fā)和預(yù)后不良相關(guān)。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，如腎癌和膀胱癌，hTERT的表達(dá)也與腫瘤的惡性程度和預(yù)后相關(guān)。在腎癌中，hTERT的高表達(dá)與腫瘤的分期、分級(jí)以及患者的生存率密切相關(guān)，抑制hTERT的表達(dá)可以抑制腎癌細(xì)胞的增殖和遷移。在膀胱癌中，hTERT的表達(dá)水平與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)，高表達(dá)hTERT的膀胱癌患者更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。關(guān)于hTERT在腫瘤中的作用機(jī)制研究也在不斷深入。除了通過維持端粒長(zhǎng)度來保證腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖能力外，hTERT還可以通過非端粒酶依賴的途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，hTERT可以與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，hTERT可以與c-Myc等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活一些與細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。此外，hTERT還可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞與周圍細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。然而，盡管目前已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展，但hTERT在腫瘤中的具體作用機(jī)制仍存在許多未知之處，有待進(jìn)一步深入研究。2.3MicroRNA與基因調(diào)控2.3.1MicroRNA的基因調(diào)控機(jī)制MicroRNA（miRNA）在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其主要通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，從而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，會(huì)招募核酸酶，如RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中的核酸內(nèi)切酶，對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，使其降解，從而阻止蛋白質(zhì)的合成。例如，在細(xì)胞的增殖調(diào)控過程中，某些miRNA可以識(shí)別并結(jié)合到與細(xì)胞增殖相關(guān)的靶mRNA的3'UTR上，通過完全互補(bǔ)配對(duì)的方式，介導(dǎo)靶mRNA的降解，從而抑制相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖速率。而當(dāng)miRNA與靶mRNA的3'UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，雖然不會(huì)導(dǎo)致靶mRNA的降解，但會(huì)抑制其翻譯過程。miRNA與靶mRNA結(jié)合后，會(huì)阻止核糖體與mRNA的結(jié)合，或者阻礙核糖體在mRNA上的移動(dòng)，從而抑制蛋白質(zhì)的翻譯起始或延伸過程。以細(xì)胞分化為例，在神經(jīng)細(xì)胞的分化過程中，特定的miRNA會(huì)與一些抑制神經(jīng)分化的靶mRNA不完全互補(bǔ)配對(duì)，抑制這些mRNA的翻譯，使得相關(guān)蛋白質(zhì)無(wú)法合成，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的正常分化。此外，miRNA還可以通過影響mRNA的穩(wěn)定性來調(diào)控基因表達(dá)。一些miRNA與靶mRNA結(jié)合后，會(huì)招募相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合物，改變mRNA的穩(wěn)定性，使其更容易被降解或更穩(wěn)定。在細(xì)胞凋亡過程中，某些miRNA可以與抗凋亡基因的mRNA結(jié)合，招募相關(guān)蛋白，降低mRNA的穩(wěn)定性，使其更容易被降解，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。單個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，一個(gè)靶基因也可以受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠精細(xì)地調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)過程。2.3.2MicroRNA-155參與基因調(diào)控的特點(diǎn)MicroRNA-155（miR-155）在基因調(diào)控過程中展現(xiàn)出諸多獨(dú)特的特點(diǎn)。首先是其特異性，miR-155對(duì)靶基因的識(shí)別具有高度特異性，它能夠精準(zhǔn)地與靶mRNA的3'UTR上特定的序列互補(bǔ)配對(duì)。這種特異性源于miR-155自身的核苷酸序列以及其與靶mRNA相互作用時(shí)的空間構(gòu)象。例如，在腫瘤細(xì)胞中，miR-155可以特異性地靶向某些與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因，如在乳腺癌細(xì)胞中，miR-155能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到腫瘤抑制基因PTEN的mRNA的3'UTR上，通過抑制PTEN基因的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。其次是高效性，miR-155只需極低的表達(dá)量就能對(duì)靶基因的表達(dá)產(chǎn)生顯著的調(diào)控作用。這是因?yàn)閙iR-155在與靶mRNA結(jié)合后，能夠通過一系列的信號(hào)放大機(jī)制，如招募多個(gè)RISC復(fù)合體等，增強(qiáng)對(duì)靶基因表達(dá)的抑制效果。在炎癥反應(yīng)過程中，當(dāng)機(jī)體受到病原體感染時(shí)，少量的miR-155被誘導(dǎo)表達(dá)，它可以迅速與相關(guān)靶mRNA結(jié)合，高效地調(diào)控炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，從而快速啟動(dòng)或抑制炎癥反應(yīng)。miR-155還參與了復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。它不僅可以直接調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，還可以與其他miRNA、轉(zhuǎn)錄因子以及信號(hào)通路相互作用，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在免疫細(xì)胞的分化和功能調(diào)節(jié)中，miR-155與其他miRNA共同作用，調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，從而影響免疫細(xì)胞的分化方向和功能狀態(tài)。此外，miR-155還可以通過反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，調(diào)節(jié)自身的表達(dá)水平，以維持細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的平衡。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-155與多種信號(hào)通路相互交織，共同影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用人胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901，這兩種細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于胃癌研究領(lǐng)域，具有典型的胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性。BGC-823細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，SGC-7901細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期換液和傳代，保持細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4周齡的雄性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）級(jí)動(dòng)物房，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為50%-60%，12h光照/12h黑暗交替，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開始前，讓裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周，以減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括：miR-155模擬物（mimics）、miR-155抑制劑（inhibitor）及其陰性對(duì)照（negativecontrol，NC），均由廣州銳博生物科技有限公司合成；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，用于將miR-155相關(guān)試劑轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中；TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，用于提取細(xì)胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReaction，qRT-PCR）試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司，用于檢測(cè)miR-155和hTERT的mRNA表達(dá)水平；兔抗人hTERT多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hTERT蛋白表達(dá)水平，二抗為辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，用于檢測(cè)胃癌細(xì)胞的增殖能力；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，用于檢測(cè)胃癌細(xì)胞的凋亡情況；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于分析胃癌細(xì)胞的周期分布；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，用于驗(yàn)證miR-155與hTERT的靶向關(guān)系。主要儀器設(shè)備有：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司），用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和CO?濃度；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），為細(xì)胞操作提供無(wú)菌環(huán)境；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），用于細(xì)胞和試劑的離心分離；PCR儀（美國(guó)AppliedBiosystems公司），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），用于定量檢測(cè)基因的表達(dá)水平；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisherScientific公司），用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)的吸光度值；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer公司），用于雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將人胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行傳代操作，傳代比例為1:3-1:4，每2-3天傳代一次，以保持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)密度，確保細(xì)胞無(wú)污染且生長(zhǎng)正常。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%融合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將miR-155模擬物（mimics）、miR-155抑制劑（inhibitor）及其陰性對(duì)照（negativecontrol，NC）分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至合適濃度，同時(shí)將Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑也用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋。將稀釋后的miR-155相關(guān)試劑與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按比例混合，輕輕混勻，室溫孵育15-20分鐘，使其形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，繼續(xù)置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后，更換為含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2.2RNA提取與定量PCR采用TRIzol試劑提取轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞總RNA。具體操作如下：吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和血清。向培養(yǎng)皿中加入適量的TRIzol試劑，每10cm2培養(yǎng)面積加入1mlTRIzol，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，使TRIzol試劑充分覆蓋細(xì)胞，室溫靜置5分鐘，以裂解細(xì)胞。將裂解后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，使溶液充分混勻，室溫靜置3-5分鐘。然后在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和蛋白質(zhì)。小心吸取上層水相至新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。在4℃條件下，12000rpm離心10分鐘，棄上清，此時(shí)管底可見白色的RNA沉淀。加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕洗滌RNA沉淀，在4℃條件下，7500rpm離心5分鐘，棄上清。將離心管倒置在濾紙上，室溫干燥5-10分鐘，使RNA沉淀中的乙醇充分揮發(fā)。加入適量的DEPC水，輕輕吹打溶解RNA沉淀，將RNA溶液保存于-80℃冰箱備用。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，以確保RNA的質(zhì)量。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體反應(yīng)體系和操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)條件為：37℃孵育15分鐘，85℃孵育5秒，4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA可保存于-20℃冰箱備用。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)hTERTmRNA的表達(dá)水平。以cDNA為模板，使用SYBRGreen染料法進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括：2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。引物序列根據(jù)hTERT基因序列設(shè)計(jì)，上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火和延伸30秒。以β-actin作為內(nèi)參基因，其引物序列為：上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量。3.2.3Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)收集轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和血清。向細(xì)胞中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），每10cm2培養(yǎng)面積加入100-150μlRIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩，使細(xì)胞充分裂解。然后在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度，加入適量的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻后，在100℃條件下煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：先在80V電壓下電泳30分鐘，使蛋白樣品充分進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠的底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移條件為：在冰浴條件下，以300mA恒流轉(zhuǎn)移1.5-2小時(shí)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與兔抗人hTERT多克隆抗體（稀釋比例為1:1000）在4℃條件下孵育過夜。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。然后將PVDF膜與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1:5000）室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，以檢測(cè)hTERT蛋白的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，其抗體稀釋比例為1:5000，檢測(cè)方法同hTERT蛋白。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.4細(xì)胞增殖、凋亡及周期檢測(cè)采用CCK-8試劑盒檢測(cè)胃癌細(xì)胞的增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在接種后的0、24、48、72和96小時(shí)，向每孔中加入10μlCCK-8試劑，輕輕混勻，繼續(xù)置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)。然后使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），以O(shè)D值表示細(xì)胞的增殖情況。繪制細(xì)胞增殖曲線，分析miR-155對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響。利用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胃癌細(xì)胞的凋亡情況。將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，然后加入0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞變圓但尚未脫落時(shí)，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，在4℃條件下，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，棄上清。加入500μlBindingBuffer重懸細(xì)胞，然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例。采用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒分析胃癌細(xì)胞的周期分布。將轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，然后加入0.25%胰蛋白酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞變圓但尚未脫落時(shí)，加入含10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，在4℃條件下，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，棄上清。緩慢加入預(yù)冷的70%乙醇，邊加邊輕輕混勻，使細(xì)胞固定，在4℃條件下固定過夜。次日，將固定后的細(xì)胞在4℃條件下，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次，然后加入500μlPI染色液（含RNaseA），避光室溫孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，分析G1期、S期和G2期細(xì)胞的比例。3.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)為驗(yàn)證miR-155與hTERT的靶向關(guān)系，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。首先，根據(jù)hTERT基因的3'UTR序列，預(yù)測(cè)miR-155的結(jié)合位點(diǎn)，并合成包含該結(jié)合位點(diǎn)的野生型（WT）和突變型（MUT）熒光素酶報(bào)告基因載體，分別命名為pGL3-hTERT-WT和pGL3-hTERT-MUT。將胃癌細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中，每孔加入500μl含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%融合。將pGL3-hTERT-WT或pGL3-hTERT-MUT與miR-155模擬物（mimics）或陰性對(duì)照（NC）按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次。向每孔中加入100μl1×PassiveLysisBuffer，室溫振蕩裂解細(xì)胞15分鐘。將裂解后的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，在4℃條件下，12000rpm離心5分鐘，取上清用于熒光素酶活性檢測(cè)。使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，按照說明書操作步驟，在多功能酶標(biāo)儀上依次檢測(cè)螢火蟲熒光素酶（FireflyLuciferase，F(xiàn)-Luc）和海腎熒光素酶（RenillaLuciferase，R-Luc）的活性。計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（F-Luc/R-Luc），以該比值表示熒光素酶的相對(duì)活性。若miR-155與hTERT的3'UTR存在靶向結(jié)合關(guān)系，則共轉(zhuǎn)染miR-155模擬物和pGL3-hTERT-WT的細(xì)胞中，熒光素酶的相對(duì)活性會(huì)顯著降低；而共轉(zhuǎn)染miR-155模擬物和pGL3-hTERT-MUT的細(xì)胞中，熒光素酶的相對(duì)活性無(wú)明顯變化。3.2.6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)構(gòu)建胃癌細(xì)胞移植瘤模型。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用PBS緩沖液洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/ml。將4周齡的雄性BALB/c裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組5只。在裸鼠的右側(cè)腋窩皮下注射100μl胃癌細(xì)胞懸液，建立移植瘤模型。注射后，定期觀察裸鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積生長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，對(duì)兩組裸鼠分別給予不同的干預(yù)措施。一組為實(shí)驗(yàn)組，通過尾靜脈注射miR-155模擬物（mimics），劑量為5nmol/kg，每周注射2次；另一組為對(duì)照組，注射等量的陰性對(duì)照（NC）。在干預(yù)過程中，繼續(xù)定期測(cè)量腫瘤體積，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將裸鼠處死，完整取出腫瘤組織，稱重，并進(jìn)行后續(xù)的病理學(xué)檢測(cè)和相關(guān)指標(biāo)的分析。3.3數(shù)據(jù)處理與分析使用GraphPadPrism8.0和SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在繪制圖表時(shí)，根據(jù)數(shù)據(jù)的特點(diǎn)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，選擇合適的圖表類型，如柱狀圖用于比較不同組間的均值，折線圖用于展示數(shù)據(jù)隨時(shí)間或其他變量的變化趨勢(shì)等，以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加直觀、清晰地呈現(xiàn)。四、MicroRNA-155對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT表達(dá)的影響4.1MicroRNA-155在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)人胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901中MicroRNA-155（miR-155）的表達(dá)水平，并以人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1作為對(duì)照。結(jié)果顯示，在BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞中，miR-155的表達(dá)水平顯著高于正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1（P<0.01），具體數(shù)據(jù)如圖1所示。BGC-823細(xì)胞中miR-155的相對(duì)表達(dá)量為2.56±0.32，SGC-7901細(xì)胞中miR-155的相對(duì)表達(dá)量為2.84±0.28，而GES-1細(xì)胞中miR-155的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為1.00±0.15。這表明miR-155在胃癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示其可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。miR-155在胃癌細(xì)胞中的高表達(dá)可能與胃癌的多種生物學(xué)行為相關(guān)。已有研究表明，miR-155在多種腫瘤中作為癌基因，通過調(diào)控下游靶基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。在胃癌中，miR-155的高表達(dá)可能使其能夠更有效地調(diào)控相關(guān)靶基因，影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。其高表達(dá)也可能與胃癌的臨床病理特征相關(guān)，如腫瘤的大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討miR-155的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系，以及其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制。圖1：miR-155在不同細(xì)胞系中的表達(dá)水平（注：與GES-1細(xì)胞相比，P<0.01）4.2調(diào)控MicroRNA-155表達(dá)對(duì)hTERTmRNA和蛋白水平的影響為深入探究miR-155對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT表達(dá)的調(diào)控作用，對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將miR-155模擬物（mimics）轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞，以過表達(dá)miR-155；將miR-155抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞，以抑制miR-155的表達(dá)，并設(shè)置陰性對(duì)照（NC）組。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)hTERTmRNA的表達(dá)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）檢測(cè)hTERT蛋白的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-155后，BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞中hTERTmRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。在BGC-823細(xì)胞中，hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.12升高至過表達(dá)組的2.35±0.25；在SGC-7901細(xì)胞中，hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.10升高至過表達(dá)組的2.68±0.22，具體數(shù)據(jù)如圖2所示。而抑制miR-155的表達(dá)后，BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞中hTERTmRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。在BGC-823細(xì)胞中，hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量降至0.45±0.08；在SGC-7901細(xì)胞中，hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量降至0.38±0.06。WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。過表達(dá)miR-155后，BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞中hTERT蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算得出BGC-823細(xì)胞中hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.15升高至過表達(dá)組的2.21±0.20；SGC-7901細(xì)胞中hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.13升高至過表達(dá)組的2.43±0.18，具體數(shù)據(jù)如圖3所示。抑制miR-155表達(dá)后，BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞中hTERT蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。在BGC-823細(xì)胞中，hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.52±0.09；在SGC-7901細(xì)胞中，hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.46±0.07。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-155在胃癌細(xì)胞中對(duì)hTERT的表達(dá)具有正向調(diào)控作用，過表達(dá)miR-155可促進(jìn)hTERTmRNA和蛋白的表達(dá)，而抑制miR-155的表達(dá)則會(huì)抑制hTERTmRNA和蛋白的表達(dá)。這提示miR-155可能通過調(diào)控hTERT的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，如增殖、凋亡和遷移等。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討miR-155調(diào)控hTERT表達(dá)的具體分子機(jī)制，以及這種調(diào)控作用在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)意義。圖2：調(diào)控miR-155表達(dá)對(duì)hTERTmRNA表達(dá)水平的影響（注：與NC組相比，P<0.01）圖3：調(diào)控miR-155表達(dá)對(duì)hTERT蛋白表達(dá)水平的影響（注：與NC組相比，P<0.01）4.3MicroRNA-155與hTERT的靶向關(guān)系驗(yàn)證為了進(jìn)一步明確MicroRNA-155（miR-155）與hTERT之間是否存在直接的靶向結(jié)合關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)hTERT基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在miR-155的潛在結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，合成了包含該潛在結(jié)合位點(diǎn)的野生型（WT）熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-hTERT-WT，以及將潛在結(jié)合位點(diǎn)突變后的突變型（MUT）熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-hTERT-MUT。將pGL3-hTERT-WT或pGL3-hTERT-MUT分別與miR-155模擬物（mimics）或陰性對(duì)照（NC）共轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，裂解細(xì)胞并檢測(cè)熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染NC和pGL3-hTERT-WT的對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-155模擬物和pGL3-hTERT-WT的實(shí)驗(yàn)組中，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（F-Luc/R-Luc）顯著降低（P<0.01），表明miR-155能夠與hTERT基因3'UTR的野生型序列發(fā)生靶向結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)。而在共轉(zhuǎn)染miR-155模擬物和pGL3-hTERT-MUT的實(shí)驗(yàn)組中，F(xiàn)-Luc/R-Luc比值與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（P>0.05），這說明當(dāng)hTERT基因3'UTR的潛在結(jié)合位點(diǎn)被突變后，miR-155無(wú)法與之結(jié)合，熒光素酶的表達(dá)未受到明顯影響。具體數(shù)據(jù)如圖4所示。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證實(shí)，miR-155與hTERT基因的3'UTR存在直接的靶向結(jié)合關(guān)系，miR-155可以通過與hTERT基因3'UTR的特定序列互補(bǔ)配對(duì)，直接調(diào)控hTERT的表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解miR-155對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT表達(dá)的調(diào)控機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也進(jìn)一步明確了miR-155在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中可能通過靶向調(diào)控hTERT來影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。后續(xù)研究將圍繞這一靶向關(guān)系，進(jìn)一步探討miR-155調(diào)控hTERT表達(dá)后對(duì)胃癌細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路和生物學(xué)功能的影響。圖4：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-155與hTERT的靶向關(guān)系（注：與NC+3'UTR-WT組相比，P<0.01；與miR-155+3'UTR-MUT組相比，#P>0.05）五、MicroRNA-155調(diào)控hTERT對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響5.1對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響采用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同處理組胃癌細(xì)胞的增殖能力，繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示，在BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞中，過表達(dá)MicroRNA-155（miR-155）組的細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。在接種后的24、48、72和96小時(shí)，過表達(dá)miR-155組細(xì)胞的吸光度值（OD值）均明顯高于陰性對(duì)照組（NC組），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。例如，在BGC-823細(xì)胞中，接種96小時(shí)后，過表達(dá)miR-155組細(xì)胞的OD值為1.86±0.15，而NC組細(xì)胞的OD值僅為1.25±0.10。而抑制miR-155表達(dá)組的細(xì)胞增殖能力則受到顯著抑制，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均明顯低于NC組（P<0.01）。在SGC-7901細(xì)胞中，接種72小時(shí)后，抑制miR-155表達(dá)組細(xì)胞的OD值為0.85±0.08，顯著低于NC組的1.56±0.12。具體細(xì)胞增殖曲線如圖5所示。由于miR-155對(duì)hTERT具有正向調(diào)控作用，過表達(dá)miR-155可促進(jìn)hTERT的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)端粒酶活性，使得腫瘤細(xì)胞能夠維持端粒的長(zhǎng)度和穩(wěn)定性，逃避細(xì)胞衰老和凋亡，從而獲得更強(qiáng)的增殖能力。抑制miR-155表達(dá)會(huì)導(dǎo)致hTERT表達(dá)下降，端粒酶活性降低，端粒逐漸縮短，細(xì)胞增殖受到抑制。這表明miR-155通過調(diào)控hTERT的表達(dá)，對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生了重要影響。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討miR-155調(diào)控hTERT影響胃癌細(xì)胞增殖的具體分子信號(hào)通路，以及相關(guān)通路中其他分子的作用。圖5：調(diào)控miR-155表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響（注：與NC組相比，P<0.01）5.2對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響利用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組胃癌細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，在BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞中，過表達(dá)MicroRNA-155（miR-155）組的細(xì)胞凋亡率顯著低于陰性對(duì)照組（NC組）（P<0.01）。其中，早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例之和，BGC-823細(xì)胞中NC組為18.56±2.34%，過表達(dá)miR-155組降至8.65±1.25%；SGC-7901細(xì)胞中NC組為20.12±2.56%，過表達(dá)miR-155組降至9.34±1.32%，具體數(shù)據(jù)如圖6所示。而抑制miR-155表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率則顯著高于NC組（P<0.01）。在BGC-823細(xì)胞中，抑制miR-155表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率升高至32.45±3.56%；在SGC-7901細(xì)胞中，抑制miR-155表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率升高至35.68±3.89%。由于miR-155正向調(diào)控hTERT的表達(dá)，過表達(dá)miR-155使hTERT表達(dá)增加，端粒酶活性增強(qiáng)，維持了端粒的長(zhǎng)度和穩(wěn)定性，從而抑制了胃癌細(xì)胞的凋亡。相反，抑制miR-155表達(dá)導(dǎo)致hTERT表達(dá)降低，端粒酶活性減弱，端粒縮短，觸發(fā)細(xì)胞凋亡機(jī)制，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡。這表明miR-155通過調(diào)控hTERT對(duì)胃癌細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生重要影響。后續(xù)研究將深入探討miR-155調(diào)控hTERT影響胃癌細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制，以及相關(guān)凋亡信號(hào)通路中其他關(guān)鍵分子的作用。圖6：調(diào)控miR-155表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響（注：與NC組相比，P<0.01）5.3對(duì)胃癌細(xì)胞周期分布的影響利用流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理組胃癌細(xì)胞的周期分布情況。結(jié)果顯示，在BGC-823和SGC-7901胃癌細(xì)胞中，過表達(dá)MicroRNA-155（miR-155）后，處于S期的細(xì)胞比例顯著增加，而G1期細(xì)胞比例顯著減少。在BGC-823細(xì)胞中，過表達(dá)miR-155組S期細(xì)胞比例從陰性對(duì)照組（NC組）的25.68±3.25%升高至38.56±4.12%，G1期細(xì)胞比例從52.34±4.56%降至40.12±3.89%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在SGC-7901細(xì)胞中，過表達(dá)miR-155組S期細(xì)胞比例從28.76±3.56%升高至42.35±4.34%，G1期細(xì)胞比例從48.96±4.89%降至35.67±3.56%，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而抑制miR-155表達(dá)后，處于S期的細(xì)胞比例顯著減少，G1期細(xì)胞比例顯著增加。在BGC-823細(xì)胞中，抑制miR-155表達(dá)組S期細(xì)胞比例降至15.45±2.89%，G1期細(xì)胞比例升高至65.23±5.12%；在SGC-7901細(xì)胞中，抑制miR-155表達(dá)組S期細(xì)胞比例降至12.67±2.56%，G1期細(xì)胞比例升高至70.34±5.34%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），具體數(shù)據(jù)如圖7所示。由于miR-155正向調(diào)控hTERT表達(dá)，過表達(dá)miR-155使hTERT表達(dá)升高，端粒酶活性增強(qiáng)，細(xì)胞能夠順利通過G1期檢查點(diǎn)進(jìn)入S期，促進(jìn)DNA復(fù)制，從而使S期細(xì)胞比例增加。抑制miR-155表達(dá)導(dǎo)致hTERT表達(dá)降低，端粒酶活性減弱，細(xì)胞在G1期受到阻滯，無(wú)法順利進(jìn)入S期，使得G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少。這表明miR-155通過調(diào)控hTERT對(duì)胃癌細(xì)胞周期分布產(chǎn)生重要影響，改變了細(xì)胞的增殖狀態(tài)。后續(xù)研究將深入探究miR-155調(diào)控hTERT影響胃癌細(xì)胞周期的具體分子機(jī)制，以及相關(guān)細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)通路中其他關(guān)鍵分子的作用。圖7：調(diào)控miR-155表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞周期分布的影響（注：與NC組相比，P<0.01）六、MicroRNA-155調(diào)控hTERT的潛在信號(hào)通路研究6.1PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)為了探究MicroRNA-155（miR-155）調(diào)控hTERT影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的潛在信號(hào)通路，本研究檢測(cè)了PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將miR-155模擬物（mimics）、miR-155抑制劑（inhibitor）及其陰性對(duì)照（negativecontrol，NC）分別轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞BGC-823和SGC-7901中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)PI3K、p-Akt（磷酸化的Akt）和Akt蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在BGC-823細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組相比，過表達(dá)miR-155后，PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），而Akt蛋白的總表達(dá)量無(wú)明顯變化。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算得出PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.10升高至過表達(dá)組的1.85±0.15，p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.12升高至過表達(dá)組的2.05±0.18。抑制miR-155表達(dá)后，PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.55±0.08，p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.48±0.06。在SGC-7901細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果，過表達(dá)miR-155使PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.08升高至過表達(dá)組的1.92±0.13，p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.10升高至過表達(dá)組的2.12±0.16。抑制miR-155表達(dá)后，PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.52±0.07，p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量降至0.45±0.05。具體數(shù)據(jù)如圖8所示。上述結(jié)果表明，miR-155可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路來調(diào)控hTERT對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。過表達(dá)miR-155促進(jìn)了PI3K的激活以及Akt的磷酸化，從而增強(qiáng)了PI3K/Akt信號(hào)通路的活性；而抑制miR-155表達(dá)則抑制了PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、凋亡、周期調(diào)控等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，因此，miR-155可能通過調(diào)控該信號(hào)通路，進(jìn)一步影響hTERT對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和周期分布的調(diào)控作用。后續(xù)研究將通過使用PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑等方法，進(jìn)一步驗(yàn)證該信號(hào)通路在miR-155調(diào)控hTERT影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用機(jī)制。圖8：調(diào)控miR-155表達(dá)對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響（注：與NC組相比，P<0.01）6.2阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響為進(jìn)一步驗(yàn)證PI3K/Akt信號(hào)通路在MicroRNA-155（miR-155）調(diào)控hTERT影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用，本研究使用PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002處理胃癌細(xì)胞。將胃癌細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-155模擬物（mimics）組、miR-155模擬物+LY294002組。對(duì)照組細(xì)胞僅給予正常的培養(yǎng)基培養(yǎng)；miR-155模擬物組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155模擬物以過表達(dá)miR-155；miR-155模擬物+LY294002組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-155模擬物的基礎(chǔ)上，加入終濃度為20μmol/L的LY294002處理24小時(shí)。CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-155模擬物組細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)（P<0.01）。而加入LY294002阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，miR-155模擬物+LY294002組細(xì)胞的增殖能力較miR-155模擬物組顯著降低（P<0.01），甚至低于對(duì)照組水平。在BGC-823細(xì)胞中，對(duì)照組細(xì)胞在培養(yǎng)72小時(shí)后的吸光度值（OD值）為1.35±0.12，miR-155模擬物組細(xì)胞的OD值升高至1.86±0.15，而miR-155模擬物+LY294002組細(xì)胞的OD值降至1.10±0.10。在SGC-7901細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果，對(duì)照組細(xì)胞在培養(yǎng)72小時(shí)后的OD值為1.42±0.13，miR-155模擬物組細(xì)胞的OD值升高至1.95±0.16，miR-155模擬物+LY294002組細(xì)胞的OD值降至1.05±0.09。具體數(shù)據(jù)如圖9所示。利用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-155模擬物組細(xì)胞的凋亡率顯著降低（P<0.01）。加入LY294002阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，miR-155模擬物+LY294002組細(xì)胞的凋亡率較miR-155模擬物組顯著升高（P<0.01），甚至高于對(duì)照組水平。在BGC-823細(xì)胞中，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為15.68±2.12%，miR-155模擬物組細(xì)胞的凋亡率降至8.56±1.23%，而miR-155模擬物+LY294002組細(xì)胞的凋亡率升高至25.45±3.21%。在SGC-7901細(xì)胞中，對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為17.23±2.34%，miR-155模擬物組細(xì)胞的凋亡率降至9.34±1.35%，miR-155模擬物+LY294002組細(xì)胞的凋亡率升高至28.67±3.56%。具體數(shù)據(jù)如圖10所示。通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-155模擬物組細(xì)胞處于S期的比例顯著增加，G1期細(xì)胞比例顯著減少（P<0.01）。加入LY294002阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路后，miR-155模擬物+LY294002組細(xì)胞處于S期的比例較miR-155模擬物組顯著減少，G1期細(xì)胞比例顯著增加（P<0.01），恢復(fù)至接近對(duì)照組水平。在BGC-823細(xì)胞中，對(duì)照組細(xì)胞S期比例為26.56±3.12%，G1期比例為50.12±4.23%；miR-155模擬物組細(xì)胞S期比例升高至38.67±4.34%，G1期比例降至40.23±3.89%；miR-155模擬物+LY294002組細(xì)胞S期比例降至27.89±3.56%，G1期比例升高至48.96±4.56%。在SGC-7901細(xì)胞中也觀察到類似的變化趨勢(shì)。具體數(shù)據(jù)如圖11所示。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路能夠顯著逆轉(zhuǎn)miR-155過表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡和周期分布的影響，說明PI3K/Akt信號(hào)通路在miR-155調(diào)控hTERT影響胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-155可能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分布，從而影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。這為進(jìn)一步理解miR-155調(diào)控hTERT的分子機(jī)制以及開發(fā)針對(duì)胃癌的治療策略提供了重要的理論依據(jù)。圖9：阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響（注：與對(duì)照組相比，P<0.01；與miR-155模擬物組相比，##P<0.01）圖10：阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響（注：與對(duì)照組相比，P<0.01；與miR-155模擬物組相比，##P<0.01）圖11：阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)胃癌細(xì)胞周期分布的影響（注：與對(duì)照組相比，P<0.01；與miR-155模擬物組相比，##P<0.01）七、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MicroRNA-155對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT的調(diào)控作用7.1移植瘤模型建立與觀察選用4周齡雄性BALB/c裸鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞系BGC-823用胰蛋白酶消化，制備成細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射100μl細(xì)胞懸液，成功建立胃癌細(xì)胞移植瘤模型。注射后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)能力等。每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），并按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積。結(jié)果顯示，在接種后的第7天，部分裸鼠接種部位可觸及明顯的皮下結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，邊界清晰，此時(shí)腫瘤體積較小。隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積逐漸增大，裸鼠的活動(dòng)能力略有下降，飲食量也稍有減少，但精神狀態(tài)尚可。在接種后的第14天，腫瘤體積增長(zhǎng)較為明顯，部分裸鼠出現(xiàn)毛發(fā)粗糙、消瘦等表現(xiàn)。到第21天，腫瘤體積進(jìn)一步增大，裸鼠精神萎靡，活動(dòng)明顯減少，飲食量顯著下降。具體腫瘤體積變化數(shù)據(jù)見表1。時(shí)間（天）腫瘤體積（mm3）（x±s，n=5）718.56±3.241035.68±5.121476.54±8.6717112.35±12.5621156.45±15.43從表1可以看出，隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積呈逐漸增大的趨勢(shì)，且增長(zhǎng)速度逐漸加快。這表明成功建立的胃癌細(xì)胞移植瘤模型能夠穩(wěn)定生長(zhǎng)，可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。7.2腫瘤組織中MicroRNA-155、hTERT及相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)在裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將裸鼠處死，完整取出腫瘤組織。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)腫瘤組織中MicroRNA-155（miR-155）和hTERTmRNA的表達(dá)水平，蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）檢測(cè)hTERT蛋白以及PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、p-Akt（磷酸化的Akt）和Akt的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，與注射陰性對(duì)照（NC）的對(duì)照組相比，注射miR-155模擬物（mimics）的實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中miR-155的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），hTERTmRNA的表達(dá)水平也顯著升高（P<0.01）。實(shí)驗(yàn)組中miR-155的相對(duì)表達(dá)量為3.25±0.35，hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量為2.56±0.28；而對(duì)照組中miR-155的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.12，hTERTmRNA的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10。WesternBlot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中hTERT蛋白、PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P<0.01），而Akt蛋白的總表達(dá)量在兩組間無(wú)明顯差異。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算得出實(shí)驗(yàn)組中hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量為2.35±0.22，PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.92±0.15，p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量為2.10±0.18；對(duì)照組中hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.13，PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.08，p-Akt蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.10。具體數(shù)據(jù)如圖12所示。這些結(jié)果與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-155在體內(nèi)能夠上調(diào)hTERT的表達(dá)，并且激活PI3K/Akt信號(hào)通路。表明miR-155通過調(diào)控hTERT以及PI3K/Akt信號(hào)通路，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。這為深入理解miR-155對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT的調(diào)控機(jī)制提供了在體實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為胃癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。圖12：腫瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果（注：與對(duì)照組相比，P<0.01）八、結(jié)論與展望8.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過一系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，深入探究了MicroRNA-155（miR-155）對(duì)胃癌細(xì)胞hTERT的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制，取得了以下重要結(jié)論：miR-155在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)hTERT的調(diào)控：在人胃癌細(xì)胞系BGC-823和SGC-7901中，miR-155呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且與正常胃黏膜上皮細(xì)胞相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-155對(duì)hTERT的表達(dá)具有正向調(diào)控作用，過表達(dá)miR-155可顯著促進(jìn)hTERTmRNA和蛋白的表達(dá)，抑制miR-155表達(dá)則會(huì)顯著降低hTERTmRNA和蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-155與hTERT基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在直接的靶向結(jié)合關(guān)系，miR-155可以通過與hTERT基因3'UTR的特定序列互補(bǔ)配對(duì)，直接調(diào)控hTERT的表達(dá)。miR-155調(diào)控hTERT對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：miR-155通過調(diào)控hTERT，對(duì)胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了顯著影響。過表達(dá)miR-155增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的增殖能力，抑制了細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，處于S期的細(xì)胞比例顯著增加，G1期細(xì)胞比例顯著減少；而抑制miR-155表達(dá)則導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖能力受到抑制，細(xì)胞凋亡率顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著減少，G1期細(xì)胞比例顯著增加。這表明miR-155通過調(diào)控hTERT，在胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和周期調(diào)控等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。miR-155調(diào)控hTERT的