第58講基因工程的基本工具和基本操作程序高中總復習·生物課程標準1.

闡明DNA重組技術的實現需要利用限制性內切核酸酶、DNA連接酶和

載體三種基本工具。2.

闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲取、基

因表達載體的構建、將目的基因導入受體細胞和目的基因的檢測與鑒

定等步驟。3.

DNA的粗提取與鑒定實驗。4.

利用聚合酶鏈式反應（PCR）擴增DNA片段并完成電泳鑒定，或運用軟

件進行虛擬PCR實驗。1.破考點·抓必備2.研真題·扣教材3.驗收效·提能力目錄Contents01破考點·抓必備梳理歸納，鞏固基本知識考點一基因工程的基本工具1.

基因工程的概念cc提醒基因工程的理論基礎2.

基因工程的基本工具（1）限制性內切核酸酶（簡稱限制酶）cccc提醒

①將一個基因從DNA分子上切割下來需要切兩處，同時產生四個黏性

末端或平末端。②原核生物的限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在

該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。（2）DNA連接酶【教材拾遺】

（選擇性必修3

P72旁欄思考）DNA連接酶和DNA聚合酶不

是一回事。原因是①DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶

是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上。②DNA聚合酶起作用時

需要以一條DNA鏈為模板，而DNA連接酶不需要模板。（3）基因進入受體細胞的載體ccccc

1.

（選擇性必修3

P71正文）切割質粒的限制性內切核酸酶均能特異性地

識別6個核苷酸序列。

（

×

）提示：不同種類限制酶識別序列不同。×2.

（選擇性必修3

P71正文）限制酶在識別序列中心軸線兩側將DNA分子

的兩條鏈分別切開形成的是黏性末端，在識別序列中心軸線處切開形成的

是平末端。

（

√

）√3.

（選擇性必修3

P71正文）E.

coli

DNA連接酶既可連接平末端，又可連

接黏性末端。

（

√

）4.

（選擇性必修3

P71～72正文）基因工程中用到的工具酶有限制酶、

DNA連接酶、載體。

（

×

）提示：限制性內切核酸酶、DNA連接酶和質粒是基因工程中常用的三種工

具，前兩者屬于工具酶，質粒屬于載體。5.

（選擇性必修3

P72正文）質粒上標記基因的存在，是便于重組DNA分

子的篩選。

（

√

）√×√

1.

（2024·江西上饒期末）基因工程是在DNA分子水平上進行的操作，需要有專門的工具。下列關于基因工程所需基本工具的敘述，錯誤的是（

）A.

用不同的限制酶分別切割含目的基因的DNA和質粒可能產生相同的末端B.T4

DNA連接酶可以催化磷酸二酯鍵形成進而連接黏性末端或平末端C.

作為載體的質粒上通常有抗生素合成基因作為標記基因，以便于重組

DNA的篩選D.

原核細胞內的限制酶可切割入侵的DNA分子，通常不切割細菌自身的

DNA分子√解析：

不同限制酶識別的堿基序列一般不同，但切割后所產生的黏

性末端可能是一樣的，像這種能切割不同的DNA片段但產生相同黏性

末端的一類限制酶稱為同尾酶，A正確；T4

DNA連接酶既可以連接雙

鏈DNA片段互補的黏性末端，也可以連接雙鏈DNA片段的平末端，催

化磷酸二酯鍵形成，B正確；作為載體的質粒上通常有抗生素抗性基因

作為標記基因，以便于重組DNA的篩選，不是抗生素合成基因，C錯

誤；原核生物內的限制酶可切割入侵的DNA分子而保護自身，一般不

切割自身的DNA分子，D正確。2.

（2025·山東濟南高三期末）下列關于生物學中常見的幾種酶的敘述，

正確的是（

）A.DNA連接酶將目的基因的黏性末端與載體的黏性末端之間的堿基黏合B.

用限制性內切核酸酶從質粒上切下一個目的基因需消耗4個水分子C.

利用PCR儀擴增DNA分子時常用一種耐高溫的DNA連接酶D.

在解離根尖分生區細胞時加入纖維素酶有利于提高解離的效果√解析：

黏性末端與黏性末端之間的互補配對的堿基自動形成氫鍵，

DNA連接酶催化形成磷酸二酯鍵，A錯誤；切下一個目的基因需要打開2個

切口，水解4個磷酸二酯鍵，故需消耗4個水分子，B正確；利用PCR儀擴

增DNA分子時常用耐高溫的DNA聚合酶，C錯誤；對根尖分生區細胞進行

解離時用解離液處理，不需要纖維素酶，D錯誤。題后歸納與DNA有關的幾種酶的比較3.

限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，以下說法正確的是（

）A.

限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割煙草花葉病毒的核酸B.DNA連接酶能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵C.

E.

coli

DNA連接酶只能連接黏性末端，不能連接平末端D.

限制酶主要從原核生物中分離純化而來，所以也能剪切自身的DNA解析：

限制酶只能切割DNA分子，煙草花葉病毒的核酸是RNA，不能

切割，A正確；DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，B錯誤；E.

coli

DNA

連接酶能連接黏性末端，也能連接平末端，C錯誤；限制酶主要從原核生

物中分離純化而來，但是因為原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列

或識別序列已經被修飾，所以不能剪切自身的DNA，D錯誤。√考點二基因工程的基本操作程序1.

目的基因的篩選與獲取（1）篩選合適的目的基因①目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得

預期表達產物等的基因。主要是指

的基因。②篩選目的基因的方法編碼蛋白質

cc（2）利用PCR獲取和擴增目的基因

提醒

①在PCR過程中實際加入的原料為dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、

dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。②引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，作

為新子鏈的合成起點，只能結合在母鏈的3'端，使DNA聚合酶能夠從引物

的3'端開始連接脫氧核苷酸。③復性溫度過高，則引物難以與模板鏈結合；溫度過低則易使兩條母鏈配

對結合，均無法獲得PCR產物。④真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應緩沖液

中一般要添加Mg2＋。2.

基因表達載體的構建（核心）

提醒啟動子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的區別3.

將目的基因導入受體細胞ccccccc提醒

①農桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入：第一次拼接是將目的基因

拼接到Ti質粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工操作）是指插入目的基因

的T-DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上；兩次導入：第一次導入是將含

目的基因的Ti質粒導入農桿菌，第二次導入（非人工操作）是指含目的基

因的T-DNA導入受體細胞。②導入的目的基因，可能存在于細胞質中，也可能整合到染色體DNA上。

存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進入雜草或其他作物

中，造成“基因污染”。4.

目的基因的檢測與鑒定cccccc

1.

（選擇性必修3

P77正文）目的基因一定是編碼蛋白質的基因。

（

×

）提示：目的基因主要是指編碼蛋白質的基因，也可以是一些具有調控作用

的因子。2.

（選擇性必修3

P77相關信息）利用PCR擴增目的基因時，要用2種不同

但能夠互補配對的引物。

（

×

）提示：PCR擴增目的基因時，2種不同的引物不能互補配對。××3.

（選擇性必修3

P79旁欄思考）PCR技術擴增目的基因時不必知道基因的

全部序列，該技術既可以擴增DNA又可以擴增mRNA。

（

×

）4.

（選擇性必修3

P80正文）基因表達載體中的啟動子和終止子決定著翻

譯的開始與結束。

（

×

）提示：啟動子和終止子決定著轉錄的開始與結束。××5.

（選擇性必修3

P80旁欄思考）生物的所有DNA通過注射或花粉管通道

法轉入植物細胞中，就可獲得具有理想性狀的轉基因植物。

（

×

）6.

（選擇性必修3

P81資料卡）Ti質粒上的T-DNA可攜帶目的基因進入宿主

細胞，并可將目的基因整合到該細胞的染色體DNA中。

（

√

）7.

（選擇性必修3

P83練習與應用）應用PCR技術，可以檢測轉基因抗凍番

茄植株中目的基因是否存在及其是否表達。

（

×

）×√×

1.

（2024·重慶期末）利用PCR技術可以獲取如圖中的目的基因。下列敘

述正確的是（

）

A.

用圖中引物②和引物⑤至少要經過3次循環才能獲得目的基因B.

用圖中引物③和引物④至少要經過2次循環才能獲得目的基因C.

合成新鏈是從引物的5'開始延伸D.

用圖中引物①和引物⑤經過2次循環可獲得4種雙鏈DNA分子√解析：

用圖中引物②和引物⑤經過1次循環能獲得含母鏈和引物②、母

鏈和引物⑤的兩種雙鏈DNA，經過2次循環能獲得一條鏈為目的基因的堿

基序列的雙鏈DNA，經過3次循環能獲得兩條鏈均為目的基因的DNA片

段，A正確；用圖中引物③和引物④循環不能獲得目的基因，因為合成的

新鏈是從引物的3'開始延伸，用引物③和引物④延伸不包含目的基因的堿

基序列，B錯誤；合成新鏈是從引物的3'開始延伸，C錯誤；用圖中引物①

和引物⑤經過2次循環可獲得3種雙鏈DNA分子，D錯誤。題后歸納PCR擴增過程中的循環圖示與規律循環次數123nDNA分子數2482n含引物A（或B）的

DNA分子數1372n－1同時含引物A、B的

DNA分子數0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗的引物數量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－

22n＋1－22.

（2024·福建廈門期末）研究人員擬利用如圖所示的目的基因片段和質

粒構建基因表達載體。下列相關敘述錯誤的是（

）名稱識別序列及切割位點名稱識別序列及切割位點SmaⅠCCC↓GGGGGG↑CCCEcoRⅠG↓AATTCCTTAA↑GAvrⅡC↓CTAGGGGATC↑CXbalⅠT↓CTAGAAGATC↑TA.

應選用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基因，SmaⅠ和AvrⅡ切割質粒B.

應選用T4

DNA連接酶連接目的基因與質粒C.

重組表達載體能被XbalⅠ識別并切割D.

目的基因以β鏈為模板鏈進行轉錄√解析：

據表可知，AvrⅡ和XbalⅠ切割后可產生相同的黏性末端，由圖可

知，為了保證目的基因能正向接入載體，應選用SmaⅠ和XbalⅠ切割目的基

因，SmaⅠ和AvrⅡ切割質粒，A正確；圖中用SmaⅠ切割后產生平末端，用

AvrⅡ和XbalⅠ切割后產生黏性末端，所以應用T4

DNA連接酶目的基因與質

粒，B正確；重組表達載體序列不能被AvrⅡ、XbalⅠ識別，不能被二者切

割，C錯誤；轉錄的方向為5'→3'端，據圖可知，目的基因以β鏈為模板鏈

進行轉錄，D正確。題后歸納限制酶的選擇（1）不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。（2）保留標記基因、啟動子、終止子、復制原點原則：質粒作為載體必

須具備標記基因，所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中不選

擇SmaⅠ。若載體上有兩個及以上的標記基因，則可合理對其中一些標記基

因進行酶切破壞，從而達到比一個標記基因更高的篩選成功率，防止只有

一個標記基因時出現的“假陽性”（即未成功導入目的基因的載體也能正

常表達標記基因，造成無效篩選）。（3）善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多

種酶切位點時，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位

點的兩種不同的限制酶，對目的基因所在序列和載體進行剪切，即“雙酶

切法”。其優點和作用是：①防止目的基因環化；②避免目的基因與載體

反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載

體啟動子的方向（或描述為“RNA聚合酶的移動方向”）必須是相同的，

否則目的基因導入后無法正常表達。如圖甲、乙也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩

種限制酶。（4）巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產生相同黏性末端的限

制酶。當不適合選擇某種限制酶時，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏

性末端。3.

（2025·廣東廣州一模）為使玉米獲得抗除草劑性狀，科研人員進行了相關操作（如圖所示）。含有內含子的報告基因不能在原核生物中正確表達，其正確表達產物能催化無色物質K呈現藍色。轉化過程中愈傷組織表面常殘留農桿菌，會導致未轉化的愈傷組織可能在含除草劑的培養基中生長。下列敘述錯誤的是（

）A.T-DNA可將基因G轉移并整合到愈傷組織細胞的染色體DNA上B.

利用物質K和抗生素進行篩選1，可獲得農桿菌的藍色菌落C.

利用物質K和除草劑進行篩選2，更易于獲得抗除草劑的轉基因植株D.

愈傷組織重新分化為芽、根等器官的過程中，需要添加植物激素√解析：

將目的基因（基因G）插入Ti質粒的T-DNA上，通過農桿菌的轉

化作用，可以把目的基因（基因G）整合到愈傷組織細胞的染色體DNA

上，A正確；含有內含子的報告基因不能在原核生物中正確表達，農桿菌

屬于原核生物，無法正確表達出產物，也就無法催化無色物質K呈現藍

色，B錯誤；含有內含子的報告基因的產物在愈傷組織細胞中能催化無色

物質K呈現藍色，而愈傷組織表面殘留的農桿菌，會導致未轉化的愈傷組

織可能在含除草劑的培養基中生長，因此利用物質K和除草劑進行篩選2，

更易于獲得抗除草劑的轉基因植株，C正確；植物組織培養過程需要添加

植物激素誘導愈傷組織重新分化為芽、根等器官，D正確。歸納總結如何篩選出含有目的基因的受體細胞（1）原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果目

的基因插入某種抗生素抗性基因內部，則會導致該抗生素抗性基因失活。

如圖，目的基因插入了四環素抗性基因內部，則四環素抗性基因失活。（2）被轉化的細菌有三種：含目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含

質粒的細菌。（3）篩選方法：將細菌先放在含氨芐青霉素的培養基上培養，能生長的

是含重組質粒的細菌和含質粒的細菌，如圖中1、2、3、4、5菌落，再利

用滅菌的絨布影印到含有四環素的培養基上，如圖能生長的菌落為2、3、

4，則在含四環素培養基上不生長的即含有目的基因的菌落，如圖中1、5

菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養基上挑取1、5菌落進行培養。考點三DNA的粗提取與鑒定和DNA片段的擴增與電泳鑒定1.

DNA的粗提取與鑒定（1）實驗原理cc（2）實驗步驟c提醒

①加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷

裂，導致DNA分子不能形成絲狀沉淀。②本實驗不能用哺乳動物成熟的紅細胞作為實驗材料，原因是哺乳動物成

熟的紅細胞無細胞核（無DNA）。可選用雞血細胞作為材料。③DNA的粗提取實驗中過濾不能用濾紙代替紗布，因為DNA會被吸附到濾

紙上而大量損失，影響最終提取的DNA量。2.

DNA片段的擴增與電泳鑒定（1）實驗基礎cccc（2）PCR實驗操作步驟（3）DNA的電泳鑒定c

1.

（選擇性必修3

P74正文）DNA在2

mol/L的NaCl溶液中溶解度大。

（

√

）2.

（選擇性必修3

P74正文）可用濾紙過濾洋蔥研磨液以除去其中的雜

質。

（

×

）3.

（選擇性必修3

P84正文）在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子

的大小相關。

（

×

）提示：在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠濃度、DNA分子的大小和構象

等有關。√××4.

（選擇性必修3

P85正文）進行DNA片段的擴增及電泳鑒定實驗所需的

緩沖液和酶應分裝成小份，并在20

℃儲存。

（

×

）提示：緩沖液和酶應在－20

℃條件下儲存。5.

（選擇性必修3

P85正文）為了節約資源，移液器上的槍頭在實驗過程

中不必更換。

（

×

）提示：移液器上的槍頭在實驗過程中必須更換，避免試劑的污染。××

1.

（2023·廣東高考11題）“DNA粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂

解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是（

）A.

裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質B.

分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質等C.

沉淀：可反復多次以提高DNA的純度D.

鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現藍色√解析：

裂解的目的是使細胞破裂，釋放出DNA等物質，A正確；DNA

不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精，利用這一原理，可以初步分離DNA

與蛋白質等，DNA分離過程中混合物中的多糖、蛋白質等可被去除，B正

確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度

去除雜質，可反復多次以提高DNA的純度，C正確；進行DNA鑒定時可以

使用二苯胺試劑，但要進行沸水浴加熱后才能觀察到顏色變化，D錯誤。2.

（2025·山東日照高三模擬）某生物興趣小組利用蘋果進行“DNA的粗

提取與鑒定”的實驗，下列操作正確的是（

）A.

蘋果組織研磨前經冷凍處理可以提高DNA的提取量B.

研磨液離心，保留沉淀物并加入酒精去除蛋白質等雜質C.

將預冷酒精溶液加入上清液，攪拌后可析出純凈的DNAD.

將絲狀物溶于NaCl溶液，加入二苯胺試劑振蕩后呈藍色√解析：

由于冷凍后的細胞易破碎，所以將蘋果組織研磨前經液氮冷

凍處理，可以提高DNA的提取量，A正確。提取DNA時，研磨液離

心，過濾并取濾液。由于DNA不溶于酒精溶液，但是細胞中的某些蛋

白質則溶于酒精，在濾液中加入酒精去除蛋白質等雜質，B錯誤。

DNA不溶于酒精，因此可用體積分數為95％的冷酒精析出DNA，靜置

2～3分鐘，可見絲狀物即為DNA的粗提取物，C錯誤。鑒定DNA時，

應將絲狀物溶解在2

mol/L的NaCl溶液中，加入二苯胺試劑并進行沸水

浴，冷卻后才可出現藍色，D錯誤。3.

（2025·江蘇淮安期中）關于“DNA片段的擴增及電泳鑒定”實驗，下

列相關敘述錯誤的是（

）A.

凝膠中的DNA分子通過染色，可以在紫外燈下被檢測出來B.

微量離心管、蒸餾水和移液器在使用前均需進行高壓蒸汽滅菌處理C.DNA向著與其所帶電荷相反的電極移動，遷移速率與凝膠濃度、DNA

的大小和構象有關D.PCR所用的緩沖液從冰箱拿出之后，應放在冰塊上緩慢融化，目的是不

破壞穩定性較差的成分解析：

PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水在使用前都必須

進行高壓蒸汽滅菌處理，移液器不需要進行高壓蒸汽滅菌處理，B錯誤。√02研真題·扣教材探究分析，培養核心技能1.

（2024·湖南高考5題）某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發現DNA

完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是

（

）A.

限制酶失活，更換新的限制酶B.

酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等C.

質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，更換正常質粒DNAD.

酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶√解析：

限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應更換新的限制酶，

A正確；酶切條件不合適通常會使切割效果下降，調整反應條件如溫度和

pH等，調整酶的用量沒有作用，B錯誤；質粒DNA突變會導致限制酶識別

位點缺失，進而造成限制酶無法對質粒DNA進行切割，此時應更換為正常

質粒DNA，C正確；質粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導致對DNA甲

基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制

酶，D正確。2.

（2024·安徽高考14題）下列關于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，

錯誤的是（

）A.

實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低B.

利用DNA和蛋白質在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNAC.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物D.

將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應，可檢測溶液中是否含有蛋白

質雜質√解析：

研磨液有利于DNA的溶解，換為蒸餾水，DNA提取的效率會降

低，A正確；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精，可

初步分離DNA，B正確；DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl濃度的變化

而改變，因此可用不同濃度的NaCl溶液對DNA進行粗提取，C正確；在沸

水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色，二苯胺試劑用于鑒定DNA，

D錯誤。溯源教材（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質溶于酒精。

（見選擇性必修3

P74

正文）（2）DNA在不同濃度NaC1溶液中溶解度不同，它能溶于2

mol/L的NaCl溶

液。

（見選擇性必修3

P74正文）（3）在一定溫度下，DNA與二苯胺試劑會呈現藍色。

（見選擇性必修3

P74正文）3.

（2024·黑吉遼高考7題）關于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物的實

驗，下列敘述正確的是（

）A.

瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小B.

凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置C.

在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快D.

瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來√解析：

應根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶

液，一般配制質量體積比為0.8％～1.2％的瓊脂糖溶液，A正確；凝膠載

樣緩沖液中指示劑的作用是指示電泳的進度，而不是指示DNA分子的具體

位置，B錯誤；在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的

大小和構象等有關，在同一電場作用下，DNA片段（帶負電）越長，DNA

向正極遷移的速率越慢，C錯誤；凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波

長為300

nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。4.

（2024·江西高考12題）γ-氨基丁酸在醫藥等領域有重要的應用價值。利用L-谷氨酸脫羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脫羧是高效生產γ-氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB）導入生產菌株E.coli

A，構建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產γ-氨基丁酸的菌株E.coli

B。下列敘述正確的是（

）A.

上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadBB.E.coli

B發酵生產γ-氨基丁酸時，L-谷氨酸鈉的作用是供能C.E.coli

A和E.coli

B都能高效降解γ-氨基丁酸D.

可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構建重組質粒√解析：

不能直接從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，只能分離得

到含有目的基因gadB序列的染色體DNA，如題圖所示，若要獲取目的基

因，需要進行PCR，A錯誤；由題意知L-谷氨酸鈉是合成γ-氨基丁酸的底

物，用L-谷氨酸脫羧酶（GadB）催化L-谷氨酸（或L-谷氨酸鹽）脫羧（谷

氨酸→氨基丁酸＋CO2）生產γ-氨基丁酸，該過程L-谷氨酸鈉的作用是底物

而不是供能，B錯誤；菌株E.coli

A中沒有L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB），不能表達產生L-谷氨酸脫羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E.

coli

B中導下L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB），L-谷氨酸脫羧酶基因（gadB）

表達產生L-谷氨酸脫羧酶（gadB），能高效降解L-谷氨酸鈉生成γ-氨基丁

酸，而不是高效降解γ-氨基丁酸，C錯誤；圖中質粒下方括號內備注含多克

隆位點，表明質粒上含有多種限制酶的識別序列，除了Nco

Ⅰ和Kpn

Ⅰ外還

有其他的限制酶可選，D正確。5.

（2024·全國甲卷38題）某同學采用基因工程技術在大腸桿菌中表達蛋

白E。回答下列問題。（1）該同學利用PCR擴增目的基因。PCR的每次循環包括變性、復性、延

伸3個階段，其中DNA雙鏈打開成為單鏈的階段是

，引物與模板

DNA鏈堿基之間的化學鍵是

?。解析：PCR的每次循環包括變性、復性、延伸3個階段，其中DNA雙鏈打開為單鏈的階段是變性，引物與模板DNA鏈堿基之間的化學鍵是氫鍵。變性氫鍵（2）質粒載體上有限制酶a、b、c的酶切位點，限制酶的切割位點如圖所

示。構建重組質粒時，與用酶a單酶切相比，用酶a和酶b雙酶切的優點體現

在

?

（答出2點即可）；使用酶c單酶切構建重組質粒時宜選用的連接酶是

??。用酶a和酶b雙酶切可防止載體和目的基因自身環化以及目的基因的反

向連接，保證目的基因和載體正確連接，從而提高重組率T4

DNA連接酶

解析：用酶a和酶b雙酶切可防止載體和目的基因自身環化以及目的基因的反向連接，保證目的基因和載體正確連接，從而提高重組率。使用酶c單酶切只能形成平末端，T4

DNA連接酶可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。（3）將重組質粒轉入大腸桿菌前，通常先將受體細胞處理成感受態，感

受態細胞的特點是

。若要驗證轉化的大腸

桿菌中含有重組質粒，簡要的實驗思路和預期結果是

?

?

?

?。能吸收周圍環境中DNA分子將轉化的大腸桿菌

的基因組DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等

作標記，以此作為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示雜交帶，就

表明轉化的大腸桿菌中含有重組質粒（合理即可）解析：感受態細胞的特點是能吸收周圍環境中DNA分子。欲驗證轉化的大腸桿菌中含有重組質粒，可將轉化的大腸桿菌的基因組DNA提取出來，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作標記，以此為探針，使探針與基因組DNA雜交，如果顯示雜交帶，就表明轉化的大腸桿菌中含有重組質粒。（4）蛋白E基因中的一段DNA編碼序列（與模板鏈互補）是

GGGCCCAAGCTGAGATGA，編碼從GGG開始，部分密碼子見表。若第

一個核苷酸G缺失，則突變后相應肽鏈的序列是

??。氨基酸賴氨酸精氨酸絲氨酸脯氨酸亮氨酸甘氨酸終止密碼子AAGAGAAGCCCACCCCUGGGC

GGGUGA甘氨酸—脯氨酸—絲氨酸

解析：依據DNA分子模板鏈和編碼鏈的堿基配對情況、轉錄過程的堿基配對情況，可推出轉錄形成的mRNA上的堿基序列和編碼鏈相近，只存在T和U的差別，即正常mRNA堿基序列為GGGCCCAAGCUGAGAUGA，編碼序列缺失第一個核苷酸G后，產生的異常mRNA堿基序列為GGCCCAAGCUGAGAUGA，對應的密碼子依次是GGC（甘氨酸）、CCA（脯氨酸）、AGC（絲氨酸）、UGA（終止密碼子），即突變后相應肽鏈的序列是甘氨酸—脯氨酸—絲氨酸。6.

（2024·新課標卷35題）某研究小組將纖維素酶基因（N）插入某種細菌

（B1）的基因組中，構建高效降解纖維素的菌株（B2）。該小組在含有N

基因的質粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經限制酶切割獲得含N基

因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯

技術將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點（Ⅰ～Ⅳ）、引物

（P1～P4）的結合位置、片段甲替換區如圖所示，→表示引物5'→3'方

向。回答下列問題。（1）限制酶切割的化學鍵是

。為保證N基因能在菌株B2中

表達，在構建片段甲時，應將M1與M2片段分別插入質粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ

酶切位點之間，原因是

?。解析：

限制酶能夠識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。在構建片段甲時，將M1與M2片段分別插入質粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點之間，可保證片段甲含有啟動子和終止子，且不破壞N基因，從而使N基因能在菌株B2中表達。磷酸二酯鍵不破壞N基因，且能保證N基因正常表達

（2）CRISPR/Cas9技術可以切割細菌B1基因組中與向導RNA結合的

DNA。向導RNA與B1基因組DNA互補配對可以形成的堿基對有G—C

和

?。解析：

向導RNA為核糖核苷酸序列，含有堿基A、U、C、G；B1基因組DNA為脫氧核苷酸序列，含有堿基A、T、C、G。故向導RNA與B1基因組DNA互補配對可形成的堿基對有G—C和C—G、A—T、U—A。C—G、U—A、A—T（3）用引物P1和P2進行PCR可驗證片段甲插入了細菌B1基因組，所用的

模板是

；若用該模板與引物P3和P4進行PCR，實驗結

果是

?。解析：

由題中信息“利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術將片段甲插入

B1的基因組，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2進行PCR驗證片段甲插入

了細菌B1基因組所用的模板為N基因的兩條鏈。結合題圖分析可知，P4是

以細菌B1基因組DNA為模板設計的引物，故N基因的兩條鏈為模板，以P3

和P4為引物進行PCR，不能擴增出目的條帶。N基因的兩條鏈無擴增產物（4）與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細菌處理秸稈的優點

是

（答出2點即可）。解析：

焚燒秸稈會污染環境，利用高效降解纖維素的細菌處理秸稈

可實現廢物利用，減少環境污染。實現廢物利用，減少環境污染

（1）通過基因工程技術引入外源基因可改變中國水仙花色。

（2024·福

建高考）

（

√

）（2）使用不同的限制酶也能產生相同的黏性末端。

（2024·貴州高考）

（

√

）（3）PCR技術中的DNA延伸過程無需引物參與即可完成半保留復制。

（2022·遼寧高考）

（

×

）提示：DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA鏈，只能催化單個的脫氧核苷酸

添加到已有的核酸片段的3'端，故延伸過程需要引物參與。√√×（4）粗提取DNA時的過濾液沉淀過程在4

℃冰箱中進行是為了防止DNA

降解。

（2022·山東高考）

（

√

）（5）動、植物細胞DNA的提取必須在無菌條件下進行。

（2022·湖北高

考）

（

×

）提示：動、植物細胞的DNA提取不需要在無菌條件下進行。√×03驗收效·提能力跟蹤訓練，檢驗學習效果一、選擇題1.

（2025·江蘇南通統考）如圖所示三個DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamH

Ⅰ和Sau3AⅠ三種限制酶的識別序列與切割位點。下列有關敘述錯誤的是

（

）A.

三種限制酶切割產生的末端的長度大小相同B.

這三種限制酶切割后形成的都是黏性末端C.

BamH

Ⅰ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端不能彼此連接D.

圖中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，會增加兩個游離的磷酸基團12345678910√解析：

根據題圖并結合三種限制酶的切割位點可知，這三種限制酶切

割后形成的都是黏性末端，且長度大小相同，A、B正確；用BamH

Ⅰ和

Sau3AⅠ切割DNA片段會形成相同的黏性末端，故BamH

Ⅰ和Sau3AⅠ切割

DNA片段形成的末端能按照堿基互補配對彼此連接，C錯誤；圖中的DNA

片段被EcoRⅠ切割后，會斷裂兩個磷酸二酯鍵，從而增加兩個游離的磷酸

基團，D正確。123456789102.

（2025·吉林四平高三聯考）科學家利用PCR技術擴增人乳頭瘤病毒

HPV-16L1基因，構建了含HPV-16L1基因的表達載體pBI-L1，經根瘤農桿

菌介導轉化，獲得了轉基因煙草植株。該技術利用轉基因煙草作為生物反

應器，生產出了純度較高的HPV-16L1蛋白。下列說法錯誤的是（

）A.

利用PCR擴增HPV-16L1基因的前提是已知該基因的一段堿基序列B.

構建表達載體pBI-L1時可使用兩種不同限制酶以確保正確連接C.

必須選用煙草的受精卵作為受體細胞才能保證每個細胞中含有目的基因D.

可以用抗原—抗體雜交法檢測再生植株是否表達出HPV-16L1蛋白√12345678910解析：

利用PCR擴增HPV-16L1基因的前提是已知該基因的一段堿基序

列，根據該序列制作引物，A正確；用兩種不同限制酶，可保證目的基因

和載體定向連接，且不發生自身環化，B正確；除選用煙草的受精卵作為

受體細胞外，也可選用煙草的根尖分生區細胞作為受體細胞，然后通過植

物組織培養使每個細胞中均含有目的基因，C錯誤；分子水平對目的基因

進行檢測，可根據抗原—抗體雜交技術檢測相應蛋白質，D正確。123456789103.

（2025·山東聊城一模）下列關于DNA的提取和DNA片段的擴增及電泳

鑒定的敘述，正確的是（

）A.

利用DNA和蛋白質在冷酒精中溶解性的差異可將DNA進一步純化分離B.

在提取白色絲狀物時雙向攪拌比單向攪拌更有利于獲得結構完整的

DNAC.PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、蒸餾水和移液器等在使用前都必

須進行高壓蒸汽滅菌處理D.PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定，電泳時電泳緩沖液不能沒

過凝膠√12345678910解析：

DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質溶于酒精，可利

用這個特性將DNA與蛋白質分離，A正確；在提取白色絲狀物時用玻璃棒

輕輕單向攪拌更有利于獲得結構完整的DNA，B錯誤；PCR實驗中使用的

微量離心管、槍頭、蒸餾水在使用前都必須進行高壓蒸汽滅菌處理，移液

器不需要進行高壓蒸汽滅菌處理，C錯誤；通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定

PCR的產物時，電泳緩沖液沒過凝膠1

mm為宜，D錯誤。123456789104.

（2025·遼寧沈陽模擬）農桿菌轉化法是植物轉基因技術中常用的轉化

方法之一。下列與該方法相關的敘述，錯誤的是（

）A.

土壤農桿菌是重組質粒的受體細胞B.T-DNA是擬核DNA上的一段序列C.

農桿菌能侵染雙子葉植物和裸子植物D.

新鮮葉圓片與農桿菌在適宜條件下共培養，部分細胞會被轉化√12345678910解析：

將目的基因與載體相連形成重組質粒后，要導入土壤農桿菌

內，再讓農桿菌去侵染植物細胞，A正確；T-DNA是位于Ti質粒中的一段

序列，不位于擬核，B錯誤；農桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸

子植物，對大多數單子葉植物沒有侵染能力，C正確；農桿菌轉化法的轉

化效率不是100％，因此適宜條件下，新鮮葉圓片與農桿菌共培養后，部

分細胞會被轉化，D正確。123456789105.

（2025·廣東深圳光明區高三檢測）如圖為某種質粒的簡圖，小箭頭所

指分別為限制性內切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點，P為轉錄的啟動

部位。已知目的基因的兩端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位點，受體細胞為無

任何抗藥性的原核細胞。下列有關敘述正確的是（

）A.

將含有目的基因的DNA與質粒分別用EcoRⅠ酶

切，在DNA連接酶作用下，生成的由兩個DNA片

段連接形成的產物有兩種B.DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏性末端連

接起來，形成一個重組質粒時形成兩個磷酸二酯鍵C.

為了防止目的基因反向連接和質粒自身環化，酶切

時可選用的酶是EcoRⅠ和BamH

ⅠD.

受體細胞能在含青霉素的培養基中生長，表明目

的基因已成功導入該細胞√12345678910解析：

根據題意可知，目的基因的兩端有EcoR

Ⅰ、BamH

Ⅰ的酶切位

點，將含有目的基因的DNA用EcoR

Ⅰ酶切，會得到目的基因片段；根據質

粒的簡圖可知，將質粒用EcoR

Ⅰ酶切，會得到與質粒周長等長的鏈狀

DNA，因此將含有目的基因的DNA與質粒分別用EcoR

Ⅰ酶切，在DNA連

接酶作用下，可生成目的基因—目的基因片段、目的基因—質粒片段、質

粒—質粒片段三種產物，A錯誤。DNA連接酶的作用是將酶切后得到的黏

性末端連接起來形成一個重組質粒，該過程形成四個磷酸二酯鍵，B錯誤。EcoR

Ⅰ和BamH

Ⅰ的識別序列不同，獲取目的基因和切割質粒時，同時選

用EcoR

Ⅰ和BamH

Ⅰ切割，目的基因兩端形成的末端不同，切割后的質粒

兩端形成的末端也不同，再用DNA連接酶連接，可以防止目的基因反向連

接和質粒自身環化，C正確。導入普通質粒的受體細胞和導入重組質粒的

受體細胞都能在含青霉素的培養基中生長，因此能在含青霉素的培養基中

生長的受體細胞不一定含有目的基因，D錯誤。123456789106.

（2025·廣東梅州聯考）PCR引物的3'端為結合模板DNA的關鍵，5'端無

嚴格限制，可用于添加限制酶切點等序列，dNTP（四種脫氧核苷三磷酸）

是DNA合成的原料。下列相關說法錯誤的是（

）A.

圖示環節所需的溫度比上一個環節的低B.dNTP作為擴增的原料會依次連接到3'端C.

Taq

DNA聚合酶催化磷酸二酯鍵的形成D.

經過1個循環后，獲得的子代DNA的雙鏈中脫氧核苷酸數量相同√12345678910解析：

題圖中環節為引物與模板堿基互補配對，表示的是復性環節，

復性的上一環節為變性，復性的溫度（50

℃左右）比變性的溫度（90

℃

以上）低，A正確；在PCR擴增中，子鏈延伸的方向是從5'端到3'端，所以

dNTP作為擴增的原料會依次連接到3'端，B正確；Taq

DNA聚合酶能催化

磷酸二酯鍵的形成，C正確；由于兩個引物均不在該片段的端點，因此一

個循環后，得到的兩個DNA片段中脫氧核苷酸的數量不一定相同，一般

PCR第三輪才可以擴增出雙鏈脫氧核苷酸數量相同的子代DNA，D錯誤。123456789107.

（2025·廣東肇慶調研）在基因工程操作中，科研人員利用識別兩種不

同序列的限制酶（R1和R2）處理基因載體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢

測，結果如圖所示。以下相關敘述中，錯誤的是（

）A.

該載體最可能為環形DNA分子B.

兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點C.

限制酶R1與R2的切割位點最短相距200

bpD.

限制酶作用位點會導致氫鍵和肽鍵斷裂√12345678910解析：

單用限制酶R1或R2切割均只得到一段序列（兩種限制酶切割產

生的DNA片段等長），可知載體可能是環狀DNA分子，當用兩種限制酶R1

和R2同時切割載體時，產生兩種長度的DNA片段，則這兩種限制酶在載體

上各有一個酶切位點，兩種限制酶同時切割可得到200

bp和600

bp的DNA

分子片段，可知限制酶R1和R2的酶切位點最短相距200

bp，A、B、C正

確；限制酶是切割DNA的工具，能夠特異性識別雙鏈DNA分子的某種特定

核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵

斷裂，D錯誤。123456789108.

（2025·湖南衡陽月考）戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，ORF2基因編碼的結構蛋白（pORF2）位于病毒表面，構成病毒的衣殼。我國科研人員利用基因工程技術，在大腸桿菌中表達pORF2，制備戊型肝炎疫苗，過程如圖。下列關于該疫苗的敘述錯誤的是（

）A.

過程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是A、U、G、CB.

重組基因表達載體上的啟動子需來源于大腸桿菌C.

過程⑤需要用Ca2＋處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環境中

DNA分子的生理狀態D.

過程⑥大量制備pORF2蛋白前應做相應的檢測與鑒定√12345678910解析：

戊型肝炎病毒是一種RNA病毒，過程①是以病毒RNA為模板合成DNA，獲取目的基因的過程，需要的酶是逆轉錄酶，原料是四種脫氧核苷酸，A錯誤；啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段，其作用是供RNA聚合酶的識別結合以驅動目的基因的轉錄，啟動子具有物種或組織特異性，構建在大腸桿菌細胞內特異表達pORF2的載體時，需要選擇大腸桿菌細胞的啟動子，而不能選擇其他物種的啟動子，B正確；將目的基因導入微生物細胞的方法是Ca2＋處理法，需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀