03第三步：將目的基因導入受體細胞三第三步：將目的基因導入受體細胞受體細胞類型植物細胞動物細胞微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法我國科學家獨創常用顯微注射法Ca2+處理法三第三步：將目的基因導入受體細胞植物細胞花粉管通道法方法一：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中含目的基因的DNA溶液（我國科學家獨創）（我國科學家獨創）三第三步：將目的基因導入受體細胞植物細胞花粉管通道法方法二：在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。三第三步：將目的基因導入受體細胞植物細胞花粉管通道法農桿菌轉化法轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。實質是基因重組。農桿菌農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。三第三步：將目的基因導入受體細胞植物細胞花粉管通道法農桿菌轉化法轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。實質是基因重組。農桿菌農桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數單子葉植物沒有侵染能力。Ti質粒T-DNA（可轉移的DNA）三第三步：將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法農桿菌Ti質粒T-DNA（可轉移的DNA）目的基因構建表達載體含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌含重組Ti質粒的農桿菌三第三步：將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法農桿菌Ti質粒T-DNA（可轉移的DNA）目的基因構建表達載體含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌含重組Ti質粒的農桿菌導入植物細胞將目的基因插入染色體DNA中三第三步：將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法農桿菌Ti質粒T-DNA（可轉移的DNA）目的基因構建表達載體含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌含重組Ti質粒的農桿菌導入植物細胞將目的基因插入染色體DNA中表現出新性狀的植株三第三步：將目的基因導入受體細胞農桿菌轉化法農桿菌Ti質粒T-DNA（可轉移的DNA）目的基因構建表達載體含目的基因的重組Ti質粒轉入農桿菌含重組Ti質粒的農桿菌導入植物細胞將目的基因插入染色體DNA中第一次拼接第二次拼接第一次導入第二次導入該過程涉及兩次拼接和兩次導入，你能總結嗎？兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞染色體的DNA上。兩次導入：第一次導入是將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌；第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導入受體細胞（非人工操作）。

三第三步：將目的基因導入受體細胞根據受體植物的不同，所用的具體轉化方法有所區別。方法一：可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農桿菌共培養，然后篩選轉化細胞，并再生成植株；方法二：將花序直接浸沒在含有農桿菌的溶液中一段時間，然后培養植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等。隨著轉化方法的突破，用農桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。受體細胞為受精卵受體細胞為體細胞（利用植物細胞的全能性）目的基因Ti質粒表達載體農桿菌植物細胞植物細胞染色體DNA新性狀植株構建轉入導入插入表達農桿菌轉化法小結三第三步：將目的基因導入受體細胞三第三步：將目的基因導入受體細胞受體細胞類型植物細胞動物細胞微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法我國科學家獨創常用顯微注射法Ca2+處理法三第三步：將目的基因導入受體細胞受體細胞類型植物細胞動物細胞微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法我國科學家獨創常用顯微注射法Ca2+處理法三第三步：將目的基因導入受體細胞動物細胞顯微注射法將目的基因導入動物受精卵最常用的一種方法是利用顯微注射將目的基因注入動物的受精卵中，這個受精卵將發育成為具有新性狀的動物。三第三步：將目的基因導入受體細胞動物細胞顯微注射法將目的基因導入動物受精卵最常用的一種方法是利用顯微注射將目的基因注入動物的受精卵中，這個受精卵將發育成為具有新性狀的動物。受精卵注射器固定吸管顯微注射儀構建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養胚胎移植獲得具有新性狀的動物①體積大，易操作。②全能性高，易培養成完整個體。三第三步：將目的基因導入受體細胞受體細胞類型植物細胞動物細胞微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法我國科學家獨創常用顯微注射法Ca2+處理法三第三步：將目的基因導入受體細胞受體細胞類型植物細胞動物細胞微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法我國科學家獨創常用顯微注射法Ca2+處理法三第三步：將目的基因導入受體細胞微生物細胞Ca2+處理法在基因工程操作中，常用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌應用最為廣泛。研究人員一般先用Ca2+處理大腸桿菌細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態，然后再將重組的基因表達載體導入其中。Ca2+感受態細胞吸收三第三步：將目的基因導入受體細胞種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法；花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞DNA中→表達目的基因表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態細胞→表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸收DNA分子04第四步：目的基因的檢測與鑒定四第四步：目的基因的檢測與鑒定①檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質（一）分子水平檢測（二）個體生物學水平鑒定方法：抗蟲或抗病接種實驗

PCR等技術——“抗原—抗體雜交技術”之前我們使用過標記基因檢測目的基因是否插入，還記得嗎？(4)β-半乳糖苷酶可分解無色的X-gal并產生藍色的產物，使菌落呈現藍色，否則菌落為白色。將大腸桿菌與基因表達載體混合培養一段時間后，將大腸桿菌接種到添加_____________________的培養基上培養，待長出菌落后，應挑選___________的菌落作為工程菌生產人胰島素。氨芐青霉素和X-gal白色四第四步：目的基因的檢測與鑒定目的基因插入位點(4)β-半乳糖苷酶可分解無色的X-gal并產生藍色的產物，使菌落呈現藍色，否則菌落為白色。將大腸桿菌與基因表達載體混合培養一段時間后，將大腸桿菌接種到添加_____________________的培養基上培養，待長出菌落后，應挑選___________的菌落作為工程菌生產人胰島素。氨芐青霉素和X-gal白色四第四步：目的基因的檢測與鑒定目的基因插入位點導入重組質粒導入原質粒導入目的基因未導入成功在加入氨芐青霉素和X-gal的培養基中白色活菌藍色活菌死亡死亡白色四第四步：目的基因的檢測與鑒定①檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質（一）分子水平檢測（二）個體生物學水平鑒定方法：抗蟲或抗病接種實驗

PCR等技術——“抗原—抗體雜交技術”PCR和核酸分子雜交技術可更加精準地鑒定受體細胞中是否轉入了目的基因！四第四步：目的基因的檢測與鑒定①檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質（一）分子水平檢測（二）個體生物學水平鑒定方法：抗蟲或抗病接種實驗

PCR等技術——“抗原—抗體雜交技術”PCR和核酸分子雜交技術可更加精準地鑒定受體細胞中是否轉入了目的基因！方法1：PCR擴增轉基因生物提取DNA根據目的基因的序列設計PCR引物PCR操作是否擴增出目的基因電泳DNA測序技術你知道PCR會擴增出哪些不同的片段嗎？什么是電泳？目的基因在整個DNA片段的中央位置復制3次后只含目的基因片段目的基因在整個DNA片段的中央位置復制3次后只含目的基因片段目的基因在整個DNA片段的中央位置復制3次后這兩個DNA分子量相同嗎？種類1種類2種類3種類4種類5目的基因不在整個DNA片段的中央位置復制3次后只含目的基因片段目的基因不在整個DNA片段的中央位置復制3次后種類1種類2種類3種類4種類5怎么知道里面有該DNA片段？電泳！電泳：在電場的作用下，DNA、RNA、蛋白質等這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。正極負極電場力電泳：在電場的作用下，DNA、RNA、蛋白質等這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。正極負極電場力電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。正極負極電場力電泳常用緩沖液pH8.0～8.3DNA分子在此pH條件下帶負電荷若此時電場里沒有任何障礙物，所有DNA片段會以同樣的速度向正極移動，怎么讓它們移動速度不相同呢？電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。正極負極電場力電泳常用緩沖液pH8.0～8.3DNA分子在此pH條件下帶負電荷若此時電場里沒有任何障礙物，所有DNA片段會以同樣的速度向正極移動，怎么讓它們移動速度不相同呢？瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠是以瓊脂糖為支持介質制備的凝膠。瓊脂糖的熔點在62?65°C之間，融化后在37°C下可維持液態數小時，30°C時凝固成膠。電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。正極負極電場力電泳常用緩沖液pH8.0～8.3DNA分子在此pH條件下帶負電荷若此時電場里沒有任何障礙物，所有DNA片段會以同樣的速度向正極移動，怎么讓它們移動速度不相同呢？瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠是以瓊脂糖為支持介質制備的凝膠。瓊脂糖的熔點在62?65°C之間，融化后在37°C下可維持液態數小時，30°C時凝固成膠。電泳：正極負極電場力瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠是以瓊脂糖為支持介質制備的凝膠。瓊脂糖的熔點在62?65°C之間，融化后在37°C下可維持液態數小時，30°C時凝固成膠。加樣孔（加入待測DNA樣本）電泳：正極負極電場力瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠是以瓊脂糖為支持介質制備的凝膠。瓊脂糖的熔點在62?65°C之間，融化后在37°C下可維持液態數小時，30°C時凝固成膠。片段短，遷移速率快片段長，遷移速率慢在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關凝膠的濃度越大，遷移速率越慢DNA分子越大，遷移速率越慢DNA分子構像有環狀、鏈狀等怎么知道這些DNA片段的大小呢？四第四步：目的基因的檢測與鑒定①檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質（一）分子水平檢測（二）個體生物學水平鑒定方法：抗蟲或抗病接種實驗

PCR等技術——“抗原—抗體雜交技術”方法1：PCR擴增轉基因生物提取DNA根據目的基因的序列設計PCR引物PCR操作是否擴增出目的基因電泳DNA測序技術M：marker；1-陽性質粒；2：原始品系；3-9轉Bt品系；轉Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果四第四步：目的基因的檢測與鑒定①檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質（一）分子水平檢測（二）個體生物學水平鑒定方法：抗蟲或抗病接種實驗

PCR等技術——“抗原—抗體雜交技術”方法2：DNA分子雜交技術提取DNA樣本基因組DNA酶切DNA片段電泳目標片段（事先不知道）轉膜硝酸纖維素膜四第四步：目的基因的檢測與鑒定基因探針是一段帶有檢測標記，且順序已知的，與目的基因互補的核酸序列(DNA或RNA)。基因探針通過分子雜交與目的基因結合，產生雜交信號，能從浩瀚的基因組中把目的基因顯示出來。硝酸纖維素膜含目的基因的DNA片段基因探針四第四步：目的基因的檢測與鑒定基因探針是一段帶有檢測標記，且順序已知的，與目的基因互補的核酸序列(DNA或RNA)。基因探針通過分子雜交與目的基因結合，產生雜交信號，能從浩瀚的基因組中把目的基因顯示出來。硝酸纖維素膜含目的基因的DNA片段洗去未結合的探針四第四步：目的基因的檢測與鑒定基因探針是一段帶有檢測標記，且順序已知的，與目的基因互補的核酸序列(DNA或RNA)。基因探針通過分子雜交與目的基因結合，產生雜交信號，能從浩瀚的基因組中把目的基因顯示出來。硝酸纖維素膜含目的基因的DNA片段洗去未結合的探針顯影裝置出現雜交帶四第四步：目的基因的檢測與鑒定①檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因（一）分子水平檢測方法2：DNA分子雜交技術提取DNA樣本基因組DNA酶切DNA片段電泳目標片段（事先不知道）轉膜硝酸纖維素膜待整理：熒光標記的探針四第四步：目的基因的檢測與鑒定②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA（一）分子水平檢測轉基因生物PCR操作是否擴增出目的基因逆轉錄cDNA提取RNAmRNA作為模板方法1：PCR擴增四第四步：目的基因的檢測與鑒定②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA（一）分子水平檢測轉基因生物PCR操作是否擴增出目的基因逆轉錄cDNA提取RNAmRNA作為模板方法1：PCR擴增RNA分子雜交(NorthernBlot)流程圖提取RNA轉基因生物標記的基因探針方法2：分子雜交技術四第四步：目的基因的檢測與鑒定③檢測目的基因是否翻譯出相應蛋白質（一）分子水平檢測如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白方法：

抗原—抗體雜交過程：提取轉基因植物的蛋白質+相應抗體→是否出現雜交帶以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）抗原與抗體的特異性結合原理：四第四步：目的基因的檢測與鑒定③檢測目的基因是否翻譯出相應蛋白質（一）分子水平檢測如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白方法：

抗原—抗體雜交過程：提取轉基因植物的蛋白質+相應抗體→是否出現雜交帶以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）蘇云金芽孢桿菌提取Bt抗蟲蛋白注射小鼠體內抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交轉基因生物放射性檢測

（雜交帶）抗原與抗體的特異性結合原理：四第四步：目的基因的檢測與鑒定（二）個體生物學水平鑒定目的基因是否表現出相應的性狀采摘抗蟲棉葉片飼喂棉鈴蟲觀察棉鈴蟲存活情況轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）感染（抗病接種實驗）未出現病斑鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長功能、活性正常提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較四第四步：目的基因的檢測與鑒定（二）個體生物學水平鑒定1.目的基因的篩選和獲取-前提利用PCR獲取和擴增人工合成2.構建基因表達載體-核心目的基因、啟動子、終止子、標記基因3.將目的基因導入受體細胞-關鍵農桿菌轉化法(植物)、顯微注射法(動物)、

感受態細胞轉化法(微生物);4.目的基因的檢測與鑒定-保證分子檢測：是否插入、轉錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等。小結05DNA片段的擴增及電泳鑒定五DNA片段的擴增及電泳鑒定（一）實驗原理（1）PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合，PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理：（2）PCR擴增DNA片段還利用了DNA半保留復制的原理。一次PCR一般要經歷30次循環。五DNA片段的擴增及電泳鑒定（一）實驗原理2.DNA片段電泳鑒定的原理：（1）DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。（2）PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。（3）凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。五DNA片段的擴增及電泳鑒定（二）目的要求1．了解PCR和電泳鑒定的基本原理。2．嘗試進行PCR的基本操作并用電泳鑒定PCR的產物。（三）材料用具PCR的材料用具和步驟五DNA片段的擴增及電泳鑒定PCR儀（自動控溫，實現DNA的擴增）微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）調節旋鈕推動桿卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿一次性吸液槍頭微量移液器五DNA片段的擴增及電泳鑒定(4)一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）(5)電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）(6)4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水。(7)電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等。PCR儀（自動控溫，實現DNA的擴增）微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）離心機（使反應液集中在管的底部）五DNA片段的擴增及電泳鑒定（四）PCR步驟1、移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。五DNA片段的擴增及電泳鑒定PCR步驟1、移液：用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分。2、離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）。五DNA片段的擴增及電泳鑒定PCR步驟2、離心：待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）。3、反應：參照下表的參數，設置好PCR儀的循環程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。預變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結合。電泳的材料用具和步驟電泳儀電泳槽梳子五DNA片段的擴增及電泳鑒定（五）電泳步驟1、配制瓊脂糖溶液根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。五DNA片段的擴增及電泳鑒定（五）電泳步驟2、制備凝膠（1）將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。（3）將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。（2）待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。(電泳緩沖液用來維持PH值，使DNA帶負電荷)(梳子孔為加樣孔，加樣孔側連電極負極)五DNA片段的擴增及電泳鑒定（五）電泳步驟2、制備凝膠（1）將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。（3）將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。（2）待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。五DNA片段的擴增及電泳鑒定將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。（五）電泳步驟3、加樣接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。4、電泳：五DNA片段的擴增及電泳鑒定將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物。（五）電泳步驟3、加樣接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。4、電泳：五DNA片段的擴增及電泳鑒定取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。（五）電泳步驟5、觀察記錄配制瓊脂糖溶液根據待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻制備凝膠將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜加樣將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物電泳接通電源，根據電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相五DNA片段的擴增及電泳鑒定觀看一個更清晰的視頻，復習過程五DNA片段的擴增及電泳鑒定（六）注意事項1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材