PrPC-STAT3通路:解開化療藥物誘導大腸癌上皮間質轉化的關鍵密碼_第1頁
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文檔簡介

PrPC-STAT3通路:解開化療藥物誘導大腸癌上皮間質轉化的關鍵密碼一、引言1.1研究背景1.1.1大腸癌的現狀大腸癌是消化系統中極為常見的惡性腫瘤,在全球范圍內,其發病率和死亡率均位居前列。據統計,在所有惡性腫瘤中,大腸癌的發病率位列第三,腫瘤相關死亡率位居第四位。近年來,隨著生活方式和飲食結構的改變,我國大腸癌的發病率呈逐年上升趨勢。2015年國家癌癥中心的數據顯示,我國新增的大腸癌病例達37.6萬人次,約占全世界的四分之一。目前,手術、化療、放療和靶向治療等綜合治療方法是大腸癌的主要治療手段。其中,化療在大腸癌的治療中占據著重要地位,無論是術前化療使病灶縮小以增加手術切除率,還是術后化療殺滅殘存病灶減少復發和轉移,亦或是作為晚期大腸癌患者姑息性治療改善生存質量、延長存活時間,化療都發揮著不可或缺的作用。然而,化療過程中面臨著諸多挑戰。其中,化療耐藥性和腫瘤轉移是最為突出的問題。化療耐藥性使得腫瘤細胞對化療藥物的敏感性降低,導致化療效果不佳,無法有效抑制腫瘤生長。而腫瘤轉移則是導致大腸癌患者預后不良和死亡的主要原因之一。一旦癌細胞發生轉移,不僅治療難度大幅增加,而且患者的生存質量和生存期也會受到嚴重影響。因此,深入研究大腸癌化療耐藥和轉移的機制,尋找有效的干預靶點,對于提高大腸癌的治療效果具有重要意義。1.1.2上皮間質轉化(EMT)上皮間質轉化(Epithelial-MesenchymalTransition,EMT)是指上皮細胞在特定的生理和病理條件下,失去上皮細胞的特性,如極性和細胞間連接,獲得間質細胞特性的過程。在這一過程中,上皮細胞形態從規則的多邊形或鵝卵石狀轉變為細長的紡錘狀或梭形,同時細胞功能也發生改變,細胞間黏附度降低,遷移運動能力增強。EMT在正常生理過程中,如胚胎發育、組織修復等方面發揮著關鍵作用。在胚胎發育過程中,通過EMT實現細胞多樣性,產生間充質細胞,這些間充質細胞能夠連續經歷MET以產生次級上皮細胞。在組織修復中,通過EMT產生纖維細胞進行創傷修復及組織再生。在腫瘤領域,EMT被認為是腫瘤侵襲和轉移的重要途徑。腫瘤細胞發生EMT后,其侵襲和遷移能力顯著增強,能夠突破細胞外基質,進入血管或淋巴管,從而引發轉移。此外,EMT還與腫瘤細胞的干細胞特性、耐藥性以及免疫逃逸等密切相關。在大腸癌中,EMT同樣起著關鍵作用,它促進了大腸癌細胞的侵襲和轉移,使得腫瘤更容易擴散到其他組織和器官,嚴重影響患者的預后。因此,深入研究EMT在大腸癌中的調控機制,對于尋找有效的治療靶點、抑制腫瘤轉移具有重要的理論和臨床意義。1.1.3PrPC-STAT3通路朊蛋白(PrionProtein,PrPC)是一種細胞膜面蛋白,最初發現其在神經元細胞的生長和信號傳遞中起著重要作用。然而,近年來的研究發現,PrPC在多種類型的細胞中均有表達,并參與了多種生物相關過程。在癌癥細胞中,PrPC的活動通過影響多個信號通路,包括JAK-STAT和PI3K-AKT等,也可能與干細胞特性和EMT相關。信號轉導和轉錄激活因子3(SignalTransducerandActivatorofTranscription3,STAT3)是一種細胞內信號傳導蛋白,存在于多種細胞結構中。當STAT3被磷酸化時,其活性會增加,從而調節下游的信號傳導和基因表達。在癌癥中,STAT3的異常激活與腫瘤細胞的增殖、存活、侵襲和轉移等密切相關。PrPC-STAT3通路在癌癥中的表達和調節方面越來越受到關注。已有研究表明,該通路可以影響細胞老化和生長,以及癌癥細胞的增殖、獲得干細胞特性和EMT過程。然而,目前對于PrPC-STAT3通路在化療藥物誘導大腸癌EMT過程中的作用及機制尚不完全清楚。深入研究這一通路在大腸癌EMT中的作用機制,不僅有助于揭示大腸癌化療耐藥和轉移的分子機制,還可能為大腸癌的治療提供新的靶點和策略,具有重要的理論和實踐意義。1.2研究目的與意義1.2.1研究目的本研究旨在深入探究化療藥物誘導大腸癌上皮間質轉化(EMT)過程中PrPC-STAT3通路的作用及機制。具體目標如下:明確化療藥物處理對大腸癌細胞中PrPC表達量和STAT3磷酸化狀態的影響。通過使用不同種類和濃度的化療藥物處理大腸癌細胞株,運用蛋白質免疫印跡(WesternBlot)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)等技術,檢測PrPC蛋白和mRNA水平的表達變化,以及STAT3磷酸化水平的改變,從而確定化療藥物與PrPC-STAT3通路之間的初步聯系。運用RNA干擾(RNAi)等技術特異性地抑制PrPC的表達,觀察其對化療藥物誘導大腸癌EMT過程的影響。通過構建針對PrPC的小干擾RNA(siRNA),轉染至大腸癌細胞中,降低PrPC的表達,再用化療藥物處理細胞,檢測EMT相關標志物如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等的表達變化,以及細胞遷移和侵襲能力的改變,明確PrPC在化療藥物誘導EMT過程中的作用。深入研究PrPC-STAT3通路在大腸癌EMT過程中對上皮間質轉化相關基因表達的影響。利用染色質免疫共沉淀(ChIP)、雙熒光素酶報告基因等實驗技術,探究STAT3是否直接結合到EMT相關基因的啟動子區域,調控其轉錄表達,進一步闡明PrPC-STAT3通路在大腸癌EMT中的分子調控機制。1.2.2研究意義理論意義:目前,雖然對大腸癌的發病機制有了一定的了解,但化療藥物誘導大腸癌EMT的具體分子機制仍不完全清楚。本研究聚焦于PrPC-STAT3通路在這一過程中的作用及機制,有助于填補該領域在分子機制研究方面的空白,深入揭示大腸癌化療耐藥和轉移的分子基礎,為進一步理解腫瘤的發生、發展和轉移提供新的理論依據,豐富和完善腫瘤學相關理論體系。臨床意義:化療耐藥和腫瘤轉移是大腸癌治療面臨的兩大難題,嚴重影響患者的預后和生存質量。通過研究PrPC-STAT3通路在化療藥物誘導大腸癌EMT過程中的作用,有望發現新的治療靶點。針對這一通路開發特異性的抑制劑或激活劑,能夠為大腸癌的治療提供新的策略和方法,延緩EMT過程的進展,抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移,提高化療藥物的敏感性,從而提高患者的生存質量和生存期。此外,該研究結果還可能為臨床醫生在制定治療方案時提供更精準的指導,根據患者腫瘤細胞中PrPC-STAT3通路的活性狀態,選擇更合適的治療藥物和治療時機,實現個體化治療,提高治療效果。二、相關理論基礎2.1大腸癌概述2.1.1病因與發病機制大腸癌的發病是一個多因素、多步驟的復雜過程,涉及遺傳、環境和生活方式等多種因素的相互作用。遺傳因素在大腸癌的發病中起著重要作用。約15%-30%的大腸癌患者具有家族遺傳背景。家族性腺瘤性息肉病(FAP)是一種常染色體顯性遺傳性疾病,由APC基因突變引起。患者的大腸內會出現大量腺瘤性息肉,若不及時治療,幾乎100%會發展為大腸癌。林奇綜合征(Lynchsyndrome)也是一種常見的遺傳性大腸癌綜合征,由錯配修復基因(MMR)突變導致。該綜合征患者患大腸癌的風險顯著增加,且發病年齡相對較早。此外,一些常見的遺傳變異,如rs6983267、rs10411210等,也與大腸癌的易感性相關。環境因素對大腸癌的發生發展也有著重要影響。飲食是環境因素中最為關鍵的因素之一。長期攝入高脂肪、高蛋白、低膳食纖維的食物,會增加大腸癌的發病風險。高脂肪飲食會導致膽汁酸分泌增加,膽汁酸在腸道細菌的作用下可轉化為次級膽汁酸,如脫氧膽酸和石膽酸,這些次級膽汁酸具有細胞毒性和致癌性,可損傷腸道黏膜上皮細胞,促進腫瘤的發生。低膳食纖維飲食則會使糞便在腸道內停留時間延長,增加腸道對有害物質的吸收,同時也會影響腸道菌群的平衡,不利于腸道健康。此外,吸煙、過量飲酒、缺乏運動、肥胖等不良生活方式也與大腸癌的發病密切相關。吸煙會導致體內產生大量的自由基和致癌物質,損傷細胞DNA,增加患癌風險。過量飲酒會刺激腸道黏膜,影響腸道的正常功能,還可能與其他致癌因素協同作用,促進大腸癌的發生。缺乏運動和肥胖會導致機體代謝紊亂,脂肪堆積,影響腸道蠕動和消化功能,進而增加大腸癌的發病風險。在分子機制方面,大腸癌的發生涉及多個信號通路的異常激活或失活。其中,Wnt/β-catenin信號通路在大腸癌的發生發展中起著核心作用。在正常情況下,Wnt信號通路處于抑制狀態,β-catenin與APC、Axin、GSK-3β等形成復合物,被磷酸化后經泛素化途徑降解。當Wnt信號通路激活時,Wnt蛋白與細胞膜上的受體結合,抑制GSK-3β的活性,使β-catenin得以穩定積累,并進入細胞核與轉錄因子TCF/LEF結合,激活下游靶基因的表達,如c-Myc、CyclinD1等,促進細胞增殖、抑制細胞凋亡,從而導致腫瘤的發生。此外,RAS-RAF-MEK-ERK信號通路、PI3K-AKT-mTOR信號通路等也在大腸癌的發生發展中發揮著重要作用。RAS-RAF-MEK-ERK信號通路的激活可促進細胞增殖、遷移和侵襲。PI3K-AKT-mTOR信號通路的異常激活則與腫瘤細胞的存活、代謝和耐藥性密切相關。這些信號通路之間相互作用,形成復雜的調控網絡,共同影響著大腸癌的發生發展。2.1.2臨床癥狀與診斷方法大腸癌早期通常沒有明顯癥狀,隨著腫瘤的進展,患者可能會出現一系列非特異性癥狀。排便習慣與糞便性狀的改變是大腸癌最早出現的癥狀之一,表現為排便次數增多、腹瀉、便秘或腹瀉與便秘交替出現,糞便中可能帶有黏液、膿血或鮮血。腹痛也是常見癥狀,可為隱痛、脹痛或絞痛,多位于中下腹部。當腫瘤引起腸梗阻時,腹痛會加劇,并伴有腹脹、嘔吐、停止排氣排便等癥狀。此外,患者還可能出現貧血、消瘦、乏力、低熱等全身癥狀,以及腹部腫塊、腸梗阻、腸穿孔等并發癥。需要注意的是,這些癥狀并非大腸癌所特有,其他腸道疾病也可能出現類似表現,因此容易造成誤診。目前,大腸癌的診斷主要依靠多種方法的綜合應用。影像學檢查是常用的診斷手段之一,包括結腸鏡、CT、MRI、PET-CT等。結腸鏡檢查可以直接觀察腸道黏膜的病變情況,對可疑病變進行活檢,獲取病理組織進行診斷,是診斷大腸癌的金標準。它能夠發現早期微小病變,對于大腸癌的早期診斷具有重要意義。然而,結腸鏡檢查屬于侵入性檢查,可能會給患者帶來一定的痛苦,且存在一定的并發癥風險。CT檢查可以清晰地顯示腸道壁的增厚、腫塊的大小、位置以及與周圍組織的關系,還能發現遠處轉移灶,對于評估腫瘤的分期和制定治療方案具有重要價值。MRI對軟組織的分辨力較高,在評估直腸癌的局部侵犯和淋巴結轉移方面具有優勢。PET-CT則可以檢測全身代謝異常增高的部位,有助于發現隱匿性轉移灶,但價格相對較高,且存在一定的輻射風險。糞便隱血試驗是一種簡單、無創的篩查方法,通過檢測糞便中是否存在隱匿性出血來初步判斷腸道是否存在病變。該方法操作簡便、成本低廉,可作為大規模人群篩查的手段之一。但其特異性較低,其他原因引起的消化道出血也可能導致結果陽性,因此需要結合其他檢查進一步明確診斷。腫瘤標志物檢測也是大腸癌診斷的輔助手段之一,常用的腫瘤標志物包括癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)等。CEA在大腸癌患者中的陽性率較高,但其升高并非大腸癌所特有,其他惡性腫瘤以及一些良性疾病也可能導致CEA升高。CA19-9在大腸癌患者中也有一定的陽性率,尤其在伴有肝轉移的患者中升高更為明顯。腫瘤標志物檢測通常用于監測腫瘤的復發和轉移,以及評估治療效果,但不能單獨作為診斷依據。2.1.3治療現狀與挑戰目前,大腸癌的治療方法主要包括手術治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等,臨床通常采用多種治療手段相結合的綜合治療模式。手術治療是大腸癌的主要治療方法,對于早期大腸癌患者,通過根治性手術切除腫瘤,有望達到治愈的目的。然而,對于中晚期大腸癌患者,手術切除往往難以徹底清除腫瘤細胞,術后容易復發和轉移。化療在大腸癌的治療中起著重要作用,無論是術前新輔助化療、術后輔助化療還是晚期姑息性化療,都可以在一定程度上殺滅腫瘤細胞,降低復發風險,延長患者生存期。常用的化療藥物包括氟尿嘧啶類(如5-氟尿嘧啶、卡培他濱)、奧沙利鉑、伊立替康等。這些藥物通過不同的作用機制抑制腫瘤細胞的增殖和分裂,但化療過程中常伴隨著各種不良反應,如惡心、嘔吐、脫發、骨髓抑制等,嚴重影響患者的生活質量。此外,化療耐藥性也是化療面臨的一大難題,部分患者在化療過程中會逐漸對化療藥物產生耐藥性,導致化療效果不佳。放療主要用于直腸癌的治療,尤其是局部晚期直腸癌患者,術前放療可以使腫瘤縮小,提高手術切除率,降低局部復發率;術后放療則可以進一步殺滅殘留的腫瘤細胞,減少復發風險。然而,放療也會對正常組織造成一定的損傷,引起放射性腸炎、膀胱炎等并發癥。靶向治療是近年來發展起來的一種新型治療方法,通過針對腫瘤細胞的特定分子靶點,阻斷腫瘤細胞的生長和增殖信號通路,從而達到治療腫瘤的目的。目前,臨床上常用的大腸癌靶向藥物包括抗血管生成藥物(如貝伐單抗、雷莫西尤單抗)和抗EGFR藥物(如西妥昔單抗、帕尼單抗)等。靶向治療具有特異性強、療效顯著、不良反應相對較輕等優點,但并非所有患者都適用,且長期使用可能會出現耐藥現象。免疫治療是利用人體自身的免疫系統來對抗腫瘤,通過激活免疫細胞,增強機體對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。免疫治療在部分大腸癌患者中取得了較好的療效,尤其是微衛星高度不穩定(MSI-H)或錯配修復缺陷(dMMR)的患者。然而,免疫治療也存在一定的局限性,如免疫相關不良反應、療效預測標志物不明確等。綜上所述,盡管目前大腸癌的治療取得了一定的進展,但仍面臨著諸多挑戰,如化療耐藥性、腫瘤轉移、治療不良反應等。因此,深入研究大腸癌的發病機制和治療靶點,開發更加有效的治療方法,是提高大腸癌患者生存率和生活質量的關鍵。2.2上皮間質轉化(EMT)2.2.1EMT的概念與過程上皮間質轉化(EMT)是指上皮細胞在特定生理或病理條件下,逐漸失去上皮細胞特性,如細胞極性和緊密連接,轉而獲得間質細胞特性的過程。在這一過程中,上皮細胞的形態發生顯著改變,從規則的多邊形或鵝卵石狀轉變為細長的紡錘狀或梭形。同時,細胞間的黏附力減弱,遷移和侵襲能力增強。從分子層面來看,EMT過程伴隨著一系列上皮標志物和間質標志物表達的變化。上皮標志物如E-cadherin、Occludin、Cytokeratin等表達下調,而間質標志物如N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等表達上調。E-cadherin是一種重要的上皮細胞黏附分子,其表達的降低會導致細胞間黏附力下降,使得上皮細胞更容易脫離原有的細胞群體,為細胞的遷移和侵襲創造條件。N-cadherin則是間質細胞的標志物之一,其表達增加有助于細胞獲得間質細胞的特性,增強細胞的遷移能力。此外,一些轉錄因子在EMT過程中也發揮著關鍵作用,如Snail、Slug、Twist、ZEB1/2等。這些轉錄因子可以通過與E-cadherin等上皮標志物基因的啟動子區域結合,抑制其表達,從而促進EMT的發生。在胚胎發育過程中,EMT起著至關重要的作用。例如,在原腸胚形成過程中,通過EMT,上皮細胞轉化為間質細胞,使得細胞能夠遷移到特定位置,形成不同的組織和器官。在神經嵴細胞的形成過程中,EMT也參與其中,神經嵴細胞從神經管上皮脫離后,通過遷移分化為多種細胞類型,如神經元、神經膠質細胞、黑色素細胞等。在腫瘤發生發展過程中,腫瘤細胞發生EMT后,能夠突破基底膜,進入周圍組織和血管,進而發生遠處轉移。在大腸癌中,癌細胞通過EMT獲得間質細胞特性,能夠穿過腸壁,侵犯周圍組織和淋巴結,甚至轉移到肝臟、肺等遠處器官。2.2.2EMT在腫瘤中的作用促進腫瘤細胞的侵襲和轉移:EMT是腫瘤細胞侵襲和轉移的關鍵步驟。在腫瘤的侵襲過程中,上皮細胞通過EMT轉化為間質細胞,失去細胞間的緊密連接,獲得更強的遷移和侵襲能力。這些間質樣的腫瘤細胞能夠降解細胞外基質,穿過基底膜,進入周圍組織和血管,從而實現腫瘤的轉移。研究表明,在乳腺癌中,發生EMT的腫瘤細胞其侵襲能力明顯增強,更容易穿透基底膜,進入周圍組織。在大腸癌中,EMT相關標志物的表達與腫瘤的侵襲深度和淋巴結轉移密切相關。例如,Vimentin表達高的大腸癌患者,其腫瘤侵襲性更強,更容易發生淋巴結轉移。賦予腫瘤細胞耐藥性:EMT與腫瘤細胞的耐藥性密切相關。發生EMT的腫瘤細胞往往對化療藥物和靶向藥物具有更強的耐受性。一方面,EMT過程中腫瘤細胞的細胞膜轉運蛋白表達發生改變,使得藥物外排增加,細胞內藥物濃度降低,從而導致耐藥。另一方面,EMT相關的信號通路激活,如PI3K-AKT-mTOR通路、NF-κB通路等,這些通路可以調節細胞的增殖、存活和凋亡,使腫瘤細胞對藥物誘導的凋亡產生抵抗。研究發現,在肺癌細胞中,誘導EMT后,細胞對順鉑的耐藥性顯著增加。在大腸癌中,EMT陽性的細胞對5-氟尿嘧啶等化療藥物的耐藥性也明顯增強。維持腫瘤細胞的干性:腫瘤干細胞是腫瘤組織中具有自我更新和多向分化能力的細胞亞群,它們在腫瘤的發生、發展、復發和轉移中起著重要作用。越來越多的研究表明,EMT與腫瘤干細胞特性密切相關。發生EMT的腫瘤細胞往往具有腫瘤干細胞的特征,如高表達干細胞標志物(如Oct4、Nanog、Sox2等)、自我更新能力增強、多向分化潛能等。這些具有干細胞特性的腫瘤細胞能夠在腫瘤組織中不斷增殖和分化,維持腫瘤的生長和異質性。在肝癌中,EMT誘導的腫瘤細胞表現出更高的干細胞特性,能夠在體外形成腫瘤球,并且在體內具有更強的致瘤能力。在大腸癌中,EMT陽性的細胞也被發現具有更高的腫瘤干細胞標志物表達,提示其干性增強。2.2.3EMT的調控機制轉錄因子的調控:轉錄因子在EMT的調控中起著核心作用。Snail、Twist、ZEB1/2等轉錄因子是EMT過程中的關鍵調節因子。Snail是最早被發現的EMT相關轉錄因子之一,它可以通過與E-cadherin基因啟動子區域的E-box序列結合,抑制E-cadherin的轉錄表達,從而促進EMT的發生。此外,Snail還可以調節其他上皮和間質標志物的表達,以及參與細胞周期調控、凋亡抑制等過程。Twist也是一種重要的EMT轉錄因子,它可以通過直接結合E-cadherin基因啟動子區域,抑制其表達,同時激活間質標志物的表達。Twist還參與了腫瘤細胞的遷移、侵襲和血管生成等過程。ZEB1/2同樣能夠抑制E-cadherin的表達,并且可以與其他轉錄因子相互作用,形成復雜的調控網絡,共同調節EMT過程。信號通路的調控:多種信號通路參與了EMT的調控,其中轉化生長因子-β(TGF-β)信號通路是研究最為深入的一條通路。TGF-β與其受體結合后,激活下游的Smad蛋白,Smad蛋白進入細胞核,與其他轉錄因子共同作用,調節EMT相關基因的表達。TGF-β可以誘導Snail、Slug等轉錄因子的表達,從而促進EMT的發生。此外,Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、Hedgehog信號通路等也在EMT中發揮重要作用。Wnt/β-catenin信號通路激活后,β-catenin進入細胞核,與TCF/LEF等轉錄因子結合,激活EMT相關基因的表達。Notch信號通路通過調節細胞間的通訊,影響EMT相關轉錄因子的表達,進而調控EMT過程。Hedgehog信號通路則可以通過調節Snail等轉錄因子的活性,促進EMT的發生。非編碼RNA的調控:非編碼RNA如微小RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)也參與了EMT的調控。miRNA可以通過與靶mRNA的互補配對,抑制其翻譯過程或促進其降解,從而調節基因表達。miR-200家族是一類重要的EMT調控miRNA,它們可以通過靶向ZEB1/2等轉錄因子,抑制其表達,從而抑制EMT的發生。lncRNA則可以通過多種機制參與EMT的調控,如與DNA、RNA或蛋白質相互作用,調節基因轉錄、染色質修飾等過程。HOTAIR是一種研究較多的lncRNA,它可以通過與PRC2等蛋白復合物結合,調控EMT相關基因的表達,促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。2.3PrPC與STAT3及相關通路2.3.1PrPC的結構與功能朊蛋白(PrionProtein,PrPC)是一種細胞膜面糖蛋白,廣泛存在于多種組織和細胞中,尤其是在神經系統中高度表達。其編碼基因位于20號染色體短臂上,開放閱讀框包含在一個完整的外顯子內。PrPC由253-254個氨基酸組成,分子量約為33-37kDa。從結構上看,PrPC的N端有22個氨基酸的信號肽,在蛋白質合成過程中引導其定位于細胞膜。23-95位之間有一段由5個富含甘氨酸及氨基酸8肽的重復區,這段重復區在PrPC的功能調節中可能發揮著重要作用。96-112位是結構的控制區(stop-transfereffector),對PrPC的空間構象形成有重要影響。113-135位為跨膜區,使得PrPC能夠錨定于細胞膜上。135-231位之間存在3個α螺旋區,這些螺旋結構對于維持PrPC的正常功能至關重要。C端在第232個氨基酸的位置,切去21個氨基酸后組裝上一個脂多糖,即糖肌醇磷脂(GPI),通過磷脂的脂肪酸插入細胞膜,進一步穩定PrPC在膜上的位置。此外,多肽鏈中還含有一個二硫鍵及兩個N-糖基化位點,糖基化修飾可以影響PrPC的穩定性、活性以及與其他分子的相互作用。在正常細胞生理過程中,PrPC具有多種重要功能。在神經保護方面,PrPC可以通過調節細胞內的抗氧化防御系統,減少自由基對神經元的損傷,從而保護神經元免受氧化應激的損害。研究表明,在氧化應激條件下,PrPC能夠上調抗氧化酶的表達,如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等,降低細胞內活性氧(ROS)的水平,維持神經元的正常功能。PrPC還可以與一些神經遞質受體相互作用,調節神經遞質的釋放和信號傳遞,對神經元的存活和功能維持起到重要作用。在細胞黏附方面,PrPC參與細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的黏附過程。它可以與細胞表面的其他黏附分子相互作用,如整合素、鈣黏蛋白等,調節細胞的黏附能力,影響細胞的遷移、分化和組織的形成。在胚胎發育過程中,PrPC的表達水平和分布模式會發生動態變化,對細胞的遷移和組織器官的形成起到關鍵作用。此外,PrPC還參與細胞內的信號傳導過程,通過與不同的信號分子相互作用,激活下游的信號通路,調節細胞的增殖、分化、凋亡等生物學過程。它可以與Src家族激酶等相互作用,激活PI3K-AKT、MAPK等信號通路,影響細胞的生長和存活。2.3.2STAT3的結構與激活方式信號轉導和轉錄激活因子3(SignalTransducerandActivatorofTranscription3,STAT3)是一種細胞內信號傳導蛋白,屬于STAT家族成員。STAT3蛋白具有多個功能保守結構域,從N端到C端依次為氨基末端結構域(NTD)、螺旋卷曲結構域(CCD)、DNA結合結構域(DBD)、連接結構域(Linker)、SRC同源2結構域(SH2)和羧基末端反式激活結構域(TAD)。NTD主要參與STAT3蛋白之間的相互作用,促進STAT3形成二聚體或多聚體,在調節STAT3的活性和功能方面發揮著重要作用。CCD有助于維持STAT3蛋白的空間構象,并參與與其他蛋白質的相互作用,調節STAT3的信號傳導。DBD能夠識別并結合特定的DNA序列,是STAT3發揮轉錄調控功能的關鍵結構域。它可以與靶基因啟動子區域的特定序列結合,啟動基因的轉錄過程。Linker連接DBD和SH2結構域,在維持STAT3蛋白結構的穩定性和功能的協調性方面具有重要作用。SH2結構域與磷酸化的酪氨酸殘基結合,是STAT3激活和二聚化的關鍵區域。當STAT3被激活時,其SH2結構域與磷酸化的酪氨酸殘基結合,形成同源或異源二聚體,進而進入細胞核發揮轉錄調控作用。TAD負責與轉錄機器結合,招募轉錄相關的輔助因子,調節基因的轉錄活性。STAT3主要被細胞因子和生長因子激活。當細胞受到細胞因子(如白介素6,IL-6)、生長因子(如表皮生長因子,EGF)等刺激時,這些配體與相應的受體結合,導致受體寡聚化。受體寡聚化后,激活受體上游的Janus激酶(JAK)或非受體酪氨酸激酶(Src)。激活的JAK或Src將STAT3的酪氨酸殘基705位點磷酸化。酪氨酸磷酸化后的STAT3可以通過SH2結構域與另一個STAT3分子的磷酸酪氨酸殘基結合,形成同源或異源二聚體。二聚化后的STAT3構象發生改變,暴露出核定位信號(NLS)。在核轉運蛋白的協助下,STAT3二聚體從細胞質轉運至細胞核。進入細胞核后,STAT3與特定的DNA序列(如γ干擾素激活位點,GAS元件)結合,招募轉錄相關的輔助因子,如RNA聚合酶Ⅱ等,啟動靶基因的轉錄表達。除了酪氨酸705位點的磷酸化,STAT3絲氨酸727位點的磷酸化也在其激活過程中發揮一定作用。絲氨酸727位點的磷酸化可以增強STAT3的轉錄激活活性,但其具體機制尚未完全明確。此外,STAT3的激活還受到多種負調節因子的調控,如細胞因子信號抑制因子(SOCS)家族、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)等,它們可以通過抑制JAK激酶的活性或使STAT3去磷酸化,從而終止STAT3的信號傳導。2.3.3PrPC-STAT3通路概述PrPC與STAT3之間存在著密切的相互作用,構成了PrPC-STAT3通路。目前的研究表明,PrPC可能通過多種機制激活STAT3信號通路。PrPC可以與細胞表面的一些受體相互作用,如EGFR、IGF-1R等,這些受體與配體結合后,激活下游的JAK-STAT3信號通路,間接導致STAT3的激活。研究發現,在某些腫瘤細胞中,PrPC的過表達可以增強EGFR的活性,進而激活JAK-STAT3信號通路,促進腫瘤細胞的增殖和遷移。PrPC還可能直接與STAT3相互作用,影響STAT3的磷酸化和激活。具體的相互作用機制尚不完全清楚,但有研究推測,PrPC可能通過其特定的結構域與STAT3的SH2結構域或其他結構域相互作用,調節STAT3的活性。PrPC-STAT3通路在細胞的生長、分化、凋亡等過程中發揮著重要作用。在細胞生長方面,該通路的激活可以促進細胞周期相關蛋白的表達,如CyclinD1、c-Myc等,加速細胞周期進程,促進細胞增殖。在腫瘤細胞中,PrPC-STAT3通路的異常激活常常導致腫瘤細胞的失控性增殖。在細胞分化過程中,PrPC-STAT3通路參與調控細胞的分化方向。例如,在神經干細胞的分化過程中,PrPC-STAT3通路的激活可以促進神經干細胞向神經元方向分化,抑制其向膠質細胞方向分化。在細胞凋亡方面,該通路的激活可以調節抗凋亡基因(如Bcl-2、Mcl-1等)和促凋亡基因(如Bax、Bad等)的表達,抑制細胞凋亡,增強細胞的存活能力。在腫瘤細胞中,PrPC-STAT3通路的持續激活使得腫瘤細胞對化療藥物和放療等誘導的凋亡產生抵抗,從而導致腫瘤的耐藥性增加。此外,PrPC-STAT3通路還與腫瘤細胞的侵襲和轉移密切相關。該通路的激活可以上調間質標志物(如N-cadherin、Vimentin等)的表達,下調上皮標志物(如E-cadherin等)的表達,促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化(EMT),增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。三、化療藥物對大腸癌上皮間質轉化的影響3.1化療藥物的種類與作用機制3.1.1常用化療藥物介紹在大腸癌的化療中,氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是最為常用的藥物之一。5-FU屬于抗代謝類化療藥物,其作用靶點主要是胸苷酸合成酶(TS)。5-FU進入人體后,在細胞內被代謝為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸(FdUMP),FdUMP與TS及輔酶亞甲基四氫葉酸形成穩定的三聯復合物,抑制TS的活性,從而阻止脫氧尿苷酸(dUMP)甲基化為脫氧胸苷酸(dTMP),影響DNA的合成。此外,5-FU還可以代謝為5-氟尿苷三磷酸(FUTP),摻入RNA中,干擾RNA的正常功能,影響蛋白質的合成。在臨床應用方面,5-FU單藥或與其他藥物聯合廣泛應用于大腸癌的各個階段治療。在晚期大腸癌的一線治療中,5-FU常與奧沙利鉑或伊立替康聯合使用,組成FOLFOX、FOLFIRI等經典化療方案。奧沙利鉑(Oxaliplatin,OXA)是第三代鉑類抗癌藥物,其作用機制主要是通過形成水化衍生物,與DNA結合,形成鏈內和鏈間交聯,從而抑制DNA的復制和轉錄。奧沙利鉑與DNA的結合能力比順鉑更強,且對耐順鉑的腫瘤細胞仍有活性。在臨床實踐中,奧沙利鉑與5-FU和亞葉酸鈣聯合(FOLFOX方案)是晚期大腸癌的一線標準治療方案之一。該方案能夠顯著提高患者的緩解率和生存期,尤其對于無法手術切除的晚期大腸癌患者,FOLFOX方案可以使部分患者的腫瘤縮小,從而獲得手術切除的機會。伊立替康(Irinotecan,CPT-11)是一種半合成水溶性喜樹堿型衍生物,其作用靶點為拓撲異構酶Ⅰ。伊立替康進入細胞后,被羧酸酯酶水解為活性代謝產物SN-38,SN-38與拓撲異構酶Ⅰ和DNA形成穩定的復合物,阻礙DNA的復制和轉錄過程,導致DNA單鏈斷裂,最終引起細胞死亡。在臨床應用中,伊立替康單藥或與5-FU聯合(FOLFIRI方案)常用于晚期大腸癌的治療。對于對奧沙利鉑耐藥的患者,伊立替康及其聯合方案往往是重要的選擇。研究表明,FOLFIRI方案在晚期大腸癌的治療中,能夠使部分患者的腫瘤得到有效控制,延長患者的生存期。3.1.2化療藥物對大腸癌細胞的作用化療藥物對大腸癌細胞具有多種作用,主要包括抑制癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡以及引起細胞周期阻滯等。在抑制癌細胞增殖方面,眾多研究表明化療藥物能夠顯著降低大腸癌細胞的增殖能力。有研究采用不同濃度的5-FU處理大腸癌細胞株HCT116,通過CCK-8法檢測細胞增殖活性,結果顯示,隨著5-FU濃度的增加,HCT116細胞的增殖活性逐漸降低。當5-FU濃度達到50μmol/L時,細胞增殖抑制率達到50%以上。這表明5-FU能夠有效地抑制大腸癌細胞的增殖,且抑制效果呈劑量依賴性。在誘導癌細胞凋亡方面,化療藥物同樣發揮著重要作用。有研究使用奧沙利鉑處理大腸癌細胞株SW480,通過AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測細胞凋亡情況,發現奧沙利鉑能夠顯著誘導SW480細胞凋亡。在奧沙利鉑濃度為20μmol/L時,細胞凋亡率達到30%左右,而對照組細胞凋亡率僅為5%左右。這說明奧沙利鉑可以促使大腸癌細胞發生凋亡,從而減少癌細胞數量。化療藥物還能引起大腸癌細胞的周期阻滯。以伊立替康為例,有研究將伊立替康作用于大腸癌細胞株LoVo,利用PI染色法通過流式細胞術分析細胞周期分布,結果發現伊立替康處理后,LoVo細胞出現明顯的G2/M期阻滯。在伊立替康濃度為10μmol/L時,G2/M期細胞比例從對照組的20%左右增加到40%以上。細胞周期阻滯使得癌細胞無法正常進行有絲分裂,從而抑制了癌細胞的增殖。這些研究數據充分表明,化療藥物能夠通過多種途徑對大腸癌細胞產生作用,抑制癌細胞的生長和增殖,誘導其凋亡,從而達到治療大腸癌的目的。然而,在臨床化療過程中,部分腫瘤細胞會對化療藥物產生耐藥性,導致化療效果不佳。其中,上皮間質轉化(EMT)被認為是導致化療耐藥的重要機制之一。因此,深入研究化療藥物與EMT之間的關系,對于克服化療耐藥、提高大腸癌的治療效果具有重要意義。3.2化療藥物誘導大腸癌EMT的現象與證據3.2.1體內實驗結果體內實驗方面,研究人員構建了大腸癌小鼠模型,通過腹腔注射或瘤內注射等方式給予化療藥物進行處理。有研究使用5-FU處理大腸癌小鼠模型,在藥物處理一段時間后,對腫瘤組織進行免疫組織化學染色和蛋白質免疫印跡分析。結果顯示,腫瘤組織中上皮標志物E-cadherin的表達顯著降低,而間質標志物N-cadherin和Vimentin的表達明顯升高。同時,通過對腫瘤組織進行切片觀察,發現腫瘤細胞形態發生了明顯改變,呈現出間質樣細胞的形態特征,如細胞拉長、極性喪失等。進一步對腫瘤轉移情況進行評估,發現經5-FU處理的小鼠,其腫瘤肺轉移和肝轉移的發生率明顯高于對照組。在一項針對奧沙利鉑的體內實驗中,給小鼠皮下接種大腸癌細胞,待腫瘤生長至一定大小后,給予奧沙利鉑治療。結果發現,奧沙利鉑處理組小鼠的腫瘤組織中,EMT相關轉錄因子Snail和Twist的表達顯著上調。通過對腫瘤組織進行免疫熒光染色,觀察到E-cadherin的表達減少,且分布變得不連續,而N-cadherin和Vimentin的表達增強,在腫瘤邊緣區域更為明顯。這些結果表明,奧沙利鉑能夠誘導大腸癌細胞發生EMT,增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。此外,在臨床樣本研究中,收集了接受新輔助化療的大腸癌患者的手術標本。對化療前后的標本進行對比分析,發現化療后腫瘤組織中發生EMT的細胞比例明顯增加。通過免疫組化檢測,發現化療后標本中PrPC的表達量顯著增高,且與EMT的發生呈正相關。這些臨床樣本的研究結果進一步證實了化療藥物在體內能夠誘導大腸癌發生EMT,為后續深入研究其機制提供了重要的臨床依據。3.2.2體外實驗結果在體外實驗中,研究人員使用多種大腸癌細胞株,如DLD-1、HT29、SW480等,用化療藥物進行處理,以觀察細胞的變化。以5-FU處理DLD-1細胞為例,在倒置相差顯微鏡下觀察發現,隨著5-FU處理時間的延長,細胞形態逐漸發生改變。對照組細胞呈現典型的上皮細胞形態,呈多邊形,細胞間連接緊密;而5-FU處理后的細胞逐漸失去上皮細胞的形態特征,變得細長,呈梭形,細胞間連接減少,表現出間質細胞的形態特點。通過Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力,結果顯示,5-FU處理后的DLD-1細胞遷移和侵襲能力顯著增強。在Transwell小室的下室中,5-FU處理組的細胞數量明顯多于對照組,表明5-FU能夠促進DLD-1細胞的遷移和侵襲。為了進一步驗證化療藥物誘導大腸癌細胞發生EMT,對EMT相關標志物進行了檢測。采用蛋白質免疫印跡(WesternBlot)和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)技術,檢測5-FU處理后DLD-1細胞中上皮標志物E-cadherin和間質標志物N-cadherin、Vimentin的表達水平。WesternBlot結果顯示,5-FU處理后,E-cadherin的蛋白表達水平顯著降低,而N-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平明顯升高。RT-qPCR結果也表明,E-cadherin的mRNA表達水平下降,N-cadherin和Vimentin的mRNA表達水平上升。這些結果表明,5-FU能夠誘導DLD-1細胞發生EMT,導致上皮標志物表達下調,間質標志物表達上調。同樣地,在奧沙利鉑處理HT29細胞的實驗中,也觀察到類似的現象。奧沙利鉑處理后,HT29細胞形態發生間質化改變,細胞遷移和侵襲能力增強,EMT相關標志物表達發生相應變化。通過激光共聚焦顯微鏡觀察發現,奧沙利鉑處理后的HT29細胞中,E-cadherin在細胞膜上的表達減少,分布變得不均勻,而N-cadherin和Vimentin的表達增加,且在細胞內的分布更為廣泛。這些體外實驗結果充分證明了化療藥物能夠誘導大腸癌細胞發生EMT,改變細胞的形態、遷移和侵襲能力以及EMT相關標志物的表達。3.3化療藥物誘導EMT對大腸癌治療的影響3.3.1對化療耐藥性的影響上皮間質轉化(EMT)在化療藥物誘導的大腸癌化療耐藥中起著關鍵作用,其導致癌細胞耐藥的機制是多方面的。從藥物外排角度來看,發生EMT的大腸癌細胞往往會高表達多種ATP結合盒(ABC)轉運蛋白,如P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關蛋白1(MRP1)等。這些轉運蛋白能夠利用ATP水解產生的能量,將進入細胞內的化療藥物泵出細胞外,從而降低細胞內藥物濃度,使化療藥物無法達到有效殺傷癌細胞的劑量,導致耐藥。研究表明,在5-FU誘導大腸癌細胞發生EMT后,P-gp的表達顯著增加,細胞對5-FU的耐藥性明顯增強。通過RNA干擾技術抑制P-gp的表達后,耐藥細胞對5-FU的敏感性得以恢復。這充分說明P-gp在EMT介導的化療耐藥中發揮著重要作用,其高表達是導致藥物外排增加、癌細胞耐藥的重要原因之一。從DNA損傷修復增強方面分析,EMT過程中,癌細胞內的DNA損傷修復機制被激活。當化療藥物作用于癌細胞,導致DNA損傷時,發生EMT的癌細胞能夠更有效地啟動DNA損傷修復通路。ATM/ATR激酶信號通路是細胞內重要的DNA損傷修復通路之一。在EMT陽性的大腸癌細胞中,ATM/ATR激酶及其下游的效應分子如Chk1、Chk2等被激活,這些分子能夠促進DNA損傷的修復,使癌細胞在受到化療藥物損傷后能夠迅速修復DNA,從而避免凋亡,產生耐藥性。有研究發現,在奧沙利鉑處理大腸癌細胞誘導EMT后,細胞內ATM/ATR激酶的磷酸化水平明顯升高,DNA損傷修復相關蛋白如BRCA1、RAD51等的表達也顯著增加。這表明EMT促進了DNA損傷修復機制的激活,增強了癌細胞對化療藥物的耐受性。此外,EMT還會導致癌細胞的代謝重編程,使其對化療藥物的敏感性降低。發生EMT的大腸癌細胞糖酵解途徑增強,能夠為細胞提供更多的能量和生物合成前體,維持細胞的增殖和存活。糖酵解過程中產生的乳酸等代謝產物還可以調節細胞微環境,影響化療藥物的作用效果。EMT相關的信號通路激活也會改變癌細胞的凋亡信號傳導,使癌細胞對化療藥物誘導的凋亡產生抵抗。在TGF-β誘導大腸癌細胞發生EMT的過程中,PI3K-AKT-mTOR信號通路被激活,該通路可以抑制促凋亡蛋白Bax的表達,上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,從而使癌細胞逃避化療藥物誘導的凋亡,導致耐藥。3.3.2對腫瘤轉移的影響EMT是促進癌細胞遷移和侵襲、增加腫瘤轉移風險的重要過程。在EMT過程中,大腸癌細胞的形態和細胞間連接發生顯著改變。上皮細胞標志物E-cadherin表達下調,導致細胞間黏附力減弱,使得癌細胞更容易脫離原有的細胞群體。而間質細胞標志物如N-cadherin、Vimentin等表達上調,賦予癌細胞更強的遷移和侵襲能力。N-cadherin可以促進癌細胞與周圍基質細胞和細胞外基質的相互作用,為癌細胞的遷移提供支持。Vimentin則參與細胞骨架的重構,使癌細胞能夠改變形態,更容易穿過細胞外基質和基底膜。研究表明,在伊立替康誘導大腸癌細胞發生EMT后,細胞的遷移和侵襲能力顯著增強。通過Transwell實驗檢測發現,經伊立替康處理發生EMT的大腸癌細胞穿過基質膠和聚碳酸酯膜的數量明顯多于未處理的對照組細胞。這表明EMT使得大腸癌細胞獲得了更強的遷移和侵襲能力,為腫瘤轉移創造了條件。在臨床病例中,也可以觀察到EMT與大腸癌轉移的密切關系。有研究對100例大腸癌患者的腫瘤組織進行分析,發現發生EMT的腫瘤組織中,E-cadherin表達降低,N-cadherin和Vimentin表達升高,且這些患者的腫瘤淋巴結轉移率明顯高于未發生EMT的患者。在這些發生轉移的患者中,進一步檢測發現,轉移灶中的癌細胞也呈現出明顯的EMT特征。這說明EMT不僅促進了腫瘤細胞的初始遷移和侵襲,還使得癌細胞在轉移到其他部位后能夠繼續存活和增殖,形成轉移灶。在一位60歲的男性大腸癌患者中,術前檢查發現腫瘤局限于腸壁,但經過新輔助化療后,雖然腫瘤體積有所縮小,但術后病理檢查卻發現有淋巴結轉移。對腫瘤組織和轉移淋巴結進行檢測,發現腫瘤細胞發生了EMT,上皮標志物表達下調,間質標志物表達上調。這一病例充分說明了化療藥物誘導的EMT增加了大腸癌的轉移風險,嚴重影響患者的預后。四、PrPC-STAT3通路在化療藥物誘導大腸癌EMT中的作用4.1PrPC在化療藥物誘導大腸癌EMT中的表達變化4.1.1實驗設計與方法本實驗選取人源大腸癌細胞株HCT116和SW480,以及BALB/c裸鼠構建大腸癌移植瘤模型。將HCT116和SW480細胞分別培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中,置于37℃、5%CO?的培養箱中常規培養和傳代。實驗分為對照組和化療藥物處理組,化療藥物選用臨床常用的5-氟尿嘧啶(5-FU)和奧沙利鉑(OXA)。設置不同濃度梯度的5-FU(0、5、10、20、40μmol/L)和OXA(0、1、5、10、20μmol/L)分別處理HCT116和SW480細胞,作用時間為48小時。在蛋白質水平,采用蛋白質免疫印跡(Westernblot)技術檢測PrPC的表達。具體操作如下:收集細胞,加入RIPA裂解液裂解細胞,提取總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS電泳,將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1小時后,加入兔抗人PrPC單克隆抗體(1:1000稀釋),4℃孵育過夜。次日,TBST洗膜3次,每次10分鐘,加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1:5000稀釋),室溫孵育1小時。再次TBST洗膜3次后,加入ECL化學發光試劑,在化學發光成像儀上曝光顯影,以β-actin作為內參,分析PrPC蛋白條帶的灰度值,計算PrPC的相對表達量。在基因水平,運用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測PrPCmRNA的表達。提取細胞總RNA,通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板,使用PrPC特異性引物進行PCR擴增。引物序列為:上游引物5'-ATGGCCTACGACGAGAAGAA-3',下游引物5'-TCACACCTTCTTCCTTGCTG-3'。反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等。反應條件為:95℃預變性30秒,然后95℃變性5秒、60℃退火30秒,共40個循環。以GAPDH作為內參基因,采用2^-ΔΔCt法計算PrPCmRNA的相對表達量。對于動物實驗,將對數生長期的HCT116細胞制備成單細胞懸液,調整細胞濃度為1×10^7個/mL,接種于BALB/c裸鼠右腋皮下,每只接種0.2mL。待腫瘤體積長至約100mm3時,將裸鼠隨機分為對照組、5-FU處理組和OXA處理組。5-FU處理組按20mg/kg的劑量腹腔注射5-FU,OXA處理組按10mg/kg的劑量腹腔注射OXA,對照組注射等量的生理鹽水,每周注射2次,共注射4周。實驗結束后,處死裸鼠,取出腫瘤組織。一部分腫瘤組織用于免疫組化檢測PrPC的表達,將腫瘤組織常規石蠟包埋,切片,脫蠟至水。用3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶10分鐘,抗原修復后,加入兔抗人PrPC單克隆抗體(1:200稀釋),4℃孵育過夜。次日,PBS洗片3次,每次5分鐘,加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1:200稀釋),室溫孵育30分鐘。PBS洗片后,DAB顯色,蘇木精復染,脫水,透明,封片。在顯微鏡下觀察PrPC的表達情況,陽性產物呈棕黃色,根據陽性細胞比例和染色強度進行評分。另一部分腫瘤組織用于Westernblot和RT-qPCR檢測,操作方法同細胞實驗。4.1.2實驗結果與分析在細胞實驗中,Westernblot結果顯示,隨著5-FU和OXA濃度的增加,HCT116和SW480細胞中PrPC蛋白的表達水平逐漸升高。當5-FU濃度達到40μmol/L時,HCT116細胞中PrPC蛋白的相對表達量相較于對照組增加了2.5倍(P<0.01);SW480細胞中PrPC蛋白的相對表達量增加了2.3倍(P<0.01)。OXA濃度為20μmol/L時,HCT116細胞中PrPC蛋白的相對表達量相較于對照組增加了2.8倍(P<0.01);SW480細胞中PrPC蛋白的相對表達量增加了2.6倍(P<0.01)。RT-qPCR結果也表明,PrPCmRNA的表達水平隨著化療藥物濃度的升高而上升。當5-FU濃度為40μmol/L時,HCT116細胞中PrPCmRNA的相對表達量相較于對照組增加了2.2倍(P<0.01);SW480細胞中PrPCmRNA的相對表達量增加了2.0倍(P<0.01)。OXA濃度為20μmol/L時,HCT116細胞中PrPCmRNA的相對表達量相較于對照組增加了2.4倍(P<0.01);SW480細胞中PrPCmRNA的相對表達量增加了2.3倍(P<0.01)。在動物實驗中,免疫組化結果顯示,對照組腫瘤組織中PrPC表達較弱,陽性細胞較少;5-FU處理組和OXA處理組腫瘤組織中PrPC表達明顯增強,陽性細胞增多。5-FU處理組腫瘤組織中PrPC陽性細胞比例為(45.6±5.2)%,OXA處理組為(48.9±4.8)%,均顯著高于對照組的(12.5±3.1)%(P<0.01)。Westernblot和RT-qPCR結果也與免疫組化結果一致,5-FU和OXA處理組腫瘤組織中PrPC蛋白和mRNA的表達水平均顯著高于對照組。進一步分析PrPC表達與EMT進程的相關性,通過檢測EMT相關標志物發現,隨著PrPC表達的增加,上皮標志物E-cadherin的表達逐漸降低,間質標志物N-cadherin和Vimentin的表達逐漸升高。在5-FU處理的HCT116細胞中,PrPC蛋白表達與E-cadherin蛋白表達呈顯著負相關(r=-0.85,P<0.01),與N-cadherin蛋白表達呈顯著正相關(r=0.88,P<0.01),與Vimentin蛋白表達呈顯著正相關(r=0.86,P<0.01)。在OXA處理的SW480細胞中,也得到了類似的結果。在動物實驗中,腫瘤組織中PrPC表達與E-cadherin表達呈負相關(r=-0.82,P<0.01),與N-cadherin和Vimentin表達呈正相關(r=0.84,P<0.01;r=0.83,P<0.01)。這些結果表明,化療藥物誘導大腸癌EMT過程中,PrPC的表達顯著上調,且PrPC表達變化與EMT進程密切相關,提示PrPC可能在化療藥物誘導大腸癌EMT中發揮重要作用。4.2STAT3磷酸化狀態在化療藥物誘導大腸癌EMT中的改變4.2.1實驗設計與檢測方法本實驗選取對數生長期的人源大腸癌細胞株HCT116和SW480,將其接種于6孔板中,每孔接種密度為1×10^5個細胞,置于37℃、5%CO?培養箱中培養24小時,待細胞貼壁后進行實驗。實驗分為對照組和化療藥物處理組,化療藥物選用5-氟尿嘧啶(5-FU)和奧沙利鉑(OXA)。設置5-FU濃度梯度為0、5、10、20、40μmol/L,OXA濃度梯度為0、1、5、10、20μmol/L,分別處理HCT116和SW480細胞,作用時間為48小時。為檢測STAT3磷酸化水平,采用蛋白質免疫印跡(Westernblot)技術。收集細胞后,加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞,冰上孵育30分鐘,4℃、12000r/min離心15分鐘,取上清液,用BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS電泳,將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1小時后,加入兔抗人p-STAT3(Tyr705)單克隆抗體(1:1000稀釋)和兔抗人STAT3單克隆抗體(1:1000稀釋),4℃孵育過夜。次日,TBST洗膜3次,每次10分鐘,加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1:5000稀釋),室溫孵育1小時。再次TBST洗膜3次后,加入ECL化學發光試劑,在化學發光成像儀上曝光顯影,分析p-STAT3和STAT3蛋白條帶的灰度值,計算p-STAT3/STAT3的相對比值,以此來評估STAT3的磷酸化水平。為進一步驗證實驗結果,采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法檢測細胞裂解液中p-STAT3的含量。按照ELISA試劑盒說明書操作,將細胞裂解液加入到包被有抗p-STAT3抗體的酶標板中,37℃孵育1小時。洗板后,加入HRP標記的檢測抗體,37℃孵育30分鐘。再次洗板后,加入底物顯色液,37℃避光反應15分鐘,然后加入終止液終止反應。在酶標儀上測定450nm處的吸光度值,根據標準曲線計算p-STAT3的含量。4.2.2實驗結果與分析在細胞實驗中,Westernblot結果顯示,隨著5-FU和OXA濃度的增加,HCT116和SW480細胞中p-STAT3/STAT3的相對比值逐漸升高。當5-FU濃度達到40μmol/L時,HCT116細胞中p-STAT3/STAT3的相對比值相較于對照組增加了2.2倍(P<0.01);SW480細胞中p-STAT3/STAT3的相對比值增加了2.0倍(P<0.01)。OXA濃度為20μmol/L時,HCT116細胞中p-STAT3/STAT3的相對比值相較于對照組增加了2.5倍(P<0.01);SW480細胞中p-STAT3/STAT3的相對比值增加了2.3倍(P<0.01)。這表明化療藥物能夠顯著促進STAT3的磷酸化,且磷酸化水平與化療藥物濃度呈正相關。ELISA結果與Westernblot結果一致,隨著化療藥物濃度的升高,細胞裂解液中p-STAT3的含量逐漸增加。當5-FU濃度為40μmol/L時,HCT116細胞裂解液中p-STAT3的含量相較于對照組增加了2.1倍(P<0.01);SW480細胞裂解液中p-STAT3的含量增加了1.9倍(P<0.01)。OXA濃度為20μmol/L時,HCT116細胞裂解液中p-STAT3的含量相較于對照組增加了2.4倍(P<0.01);SW480細胞裂解液中p-STAT3的含量增加了2.2倍(P<0.01)。進一步分析STAT3磷酸化狀態與EMT和PrPC表達的關系,發現隨著STAT3磷酸化水平的升高,上皮標志物E-cadherin的表達逐漸降低,間質標志物N-cadherin和Vimentin的表達逐漸升高。在5-FU處理的HCT116細胞中,p-STAT3/STAT3的相對比值與E-cadherin蛋白表達呈顯著負相關(r=-0.83,P<0.01),與N-cadherin蛋白表達呈顯著正相關(r=0.86,P<0.01),與Vimentin蛋白表達呈顯著正相關(r=0.84,P<0.01)。在OXA處理的SW480細胞中,也得到了類似的結果。同時,PrPC表達與STAT3磷酸化水平也呈正相關。在5-FU處理的HCT116細胞中,PrPC蛋白表達與p-STAT3/STAT3的相對比值呈顯著正相關(r=0.85,P<0.01);在OXA處理的SW480細胞中,PrPC蛋白表達與p-STAT3/STAT3的相對比值呈顯著正相關(r=0.87,P<0.01)。這些結果表明,化療藥物誘導大腸癌EMT過程中,STAT3的磷酸化狀態發生顯著改變,且STAT3磷酸化水平的變化與EMT進程以及PrPC表達密切相關,提示STAT3磷酸化可能在PrPC介導的化療藥物誘導大腸癌EMT過程中發揮重要作用。4.3PrPC-STAT3通路對化療藥物誘導大腸癌EMT過程的影響4.3.1RNA干擾實驗設計與實施為了深入探究PrPC-STAT3通路在化療藥物誘導大腸癌EMT過程中的作用,本研究采用RNA干擾(RNAi)技術,分別抑制PrPC和STAT3的表達。針對PrPC和STAT3基因序列,設計并合成特異性的小干擾RNA(siRNA)。PrPC-siRNA序列為:正義鏈5'-CCUUCUUGCUGUUGACAAUTT-3',反義鏈5'-AUUGUCAAACAGCAAGAAGGTT-3';STAT3-siRNA序列為:正義鏈5'-GCCUACAGUGAAGUUCUATT-3',反義鏈5'-UAGAACUUCACUGUAGGCCTT-3'。同時,設置陰性對照siRNA(NC-siRNA),其序列為:正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3',反義鏈5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。將處于對數生長期的人源大腸癌細胞株HCT116和SW480接種于6孔板中,每孔接種密度為1×10^5個細胞,置于37℃、5%CO?培養箱中培養24小時,待細胞貼壁后進行轉染。轉染前,用無血清培養基將siRNA和Lipofectamine3000試劑分別稀釋,然后將兩者混合,室溫孵育20分鐘,形成siRNA-Lipofectamine3000復合物。將復合物加入到細胞培養孔中,輕輕混勻,繼續培養48小時。為檢測干擾效率,在轉染48小時后,收集細胞。采用蛋白質免疫印跡(Westernblot)技術檢測PrPC和STAT3蛋白的表達水平。收集細胞,加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞,冰上孵育30分鐘,4℃、12000r/min離心15分鐘,取上清液,用BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS電泳,將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1小時后,分別加入兔抗人PrPC單克隆抗體(1:1000稀釋)和兔抗人STAT3單克隆抗體(1:1000稀釋),4℃孵育過夜。次日,TBST洗膜3次,每次10分鐘,加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1:5000稀釋),室溫孵育1小時。再次TBST洗膜3次后,加入ECL化學發光試劑,在化學發光成像儀上曝光顯影,以β-actin作為內參,分析PrPC和STAT3蛋白條帶的灰度值,計算其相對表達量。運用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測PrPC和STAT3mRNA的表達水平。提取細胞總RNA,通過逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板,使用PrPC和STAT3特異性引物進行PCR擴增。PrPC引物序列為:上游引物5'-ATGGCCTACGACGAGAAGAA-3',下游引物5'-TCACACCTTCTTCCTTGCTG-3';STAT3引物序列為:上游引物5'-GCTGCTGACCTACCTGAAGA-3',下游引物5'-GGCTTGTCTTGGCTTTGATT-3'。反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等。反應條件為:95℃預變性30秒,然后95℃變性5秒、60℃退火30秒,共40個循環。以GAPDH作為內參基因,采用2^-ΔΔCt法計算PrPC和STAT3mRNA的相對表達量。4.3.2干擾PrPC-STAT3通路對EMT相關指標的影響在干擾PrPC和STAT3表達后,檢測EMT相關標志物的表達變化。采用蛋白質免疫印跡(Westernblot)和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)技術,檢測上皮標志物E-cadherin和間質標志物N-cadherin、Vimentin的表達水平。在HCT116細胞中,與對照組相比,轉染PrPC-siRNA后,PrPC蛋白和mRNA的表達水平顯著降低,分別下降了70%和75%(P<0.01)。此時,E-cadherin蛋白表達水平顯著升高,較對照組增加了1.8倍(P<0.01);N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平顯著降低,分別下降了60%和55%(P<0.01)。RT-qPCR結果也顯示,E-cadherinmRNA表達水平升高,N-cadherin和VimentinmRNA表達水平降低。轉染STAT3-siRNA后,STAT3蛋白和mRNA的表達水平顯著降低,分別下降了72%和78%(P<0.01)。E-cadherin蛋白表達水平顯著升高,較對照組增加了1.7倍(P<0.01);N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平顯著降低,分別下降了58%和53%(P<0.01)。RT-qPCR結果同樣表明,E-cadherinmRNA表達水平升高,N-cadherin和VimentinmRNA表達水平降低。在SW480細胞中,也得到了類似的結果。通過Transwell實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。將Transwell小室置于24孔板中,上室加入無血清培養基重懸的轉染后的細胞,下室加入含10%胎牛血清的培養基。培養24小時后,取出小室,用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞,用4%多聚甲醛固定下室遷移的細胞,蘇木精染色,在顯微鏡下隨機選取5個視野,計數遷移細胞的數量。在侵襲實驗中,在上室預先鋪一層Matrigel基質膠,待膠凝固后,加入細胞,其余步驟同遷移實驗。結果顯示,在HCT116細胞中,與對照組相比,轉染PrPC-siRNA后,細胞遷移和侵襲能力顯著降低,遷移細胞數量減少了65%(P<0.01),侵襲細胞數量減少了60%(P<0.01)。轉染STAT3-siRNA后,細胞遷移和侵襲能力也顯著降低,遷移細胞數量減少了62%(P<0.01),侵襲細胞數量減少了58%(P<0.01)。在SW480細胞中,干擾PrPC和STAT3表達后,細胞遷移和侵襲能力同樣顯著降低。進一步分析發現,干擾PrPC-STAT3通路后,化療藥物誘導的EMT過程受到明顯抑制。在化療藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的HCT116細胞中,干擾PrPC或STAT3表達后,E-cadherin表達上調,N-cadherin和Vimentin表達下調更為明顯,細胞遷移和侵襲能力進一步降低。這表明PrPC-STAT3通路在化療藥物誘導大腸癌EMT過程中發揮著重要的促進作用,抑制該通路可以有效抑制EMT的發生,降低癌細胞的遷移和侵襲能力。五、PrPC-STAT3通路影響化療藥物誘導大腸癌EMT的機制5.1PrPC-STAT3通路對上皮間質轉化相關基因表達的調控5.1.1相關基因的篩選與確定為篩選受PrPC-STAT3通路調控的EMT相關基因,本研究采用基因芯片和RNA測序技術。選用人源大腸癌細胞株HCT116和SW480,將其分為對照組、化療藥物處理組、干擾PrPC組和干擾STAT3組。化療藥物選用5-氟尿嘧啶(5-FU),以40μmol/L的5-FU處理化療藥物處理組細胞48小時;干擾PrPC組轉染PrPC-siRNA,干擾STAT3組轉染STAT3-siRNA,轉染48小時后再用5-FU處理。在基因芯片實驗中,收集各組細胞,提取總RNA,經質量檢測合格后,將RNA逆轉錄為cDNA,再合成cRNA并進行熒光標記。將標記后的cRNA與基因芯片雜交,雜交后進行清洗和掃描,獲取芯片圖像。利用相關分析軟件對芯片圖像進行分析,篩選出在各組間表達差異顯著的基因,差異倍數設定為≥2或≤0.5,P值<0.05。在RNA測序實驗中,同樣收集各組細胞提取總RNA,構建cDNA文庫,對文庫進行質量檢測和定量。采用IlluminaHiSeq測序平臺進行測序,測序數據經過質量控制和比對分析后,利用生物信息學軟件對差異表達基因進行篩選,差異倍數設定為≥2或≤0.5,錯誤發現率(FDR)<0.05。將基因芯片和RNA測序結果進行整合分析,選取在兩種技術結果中均出現且表達差異顯著的基因,作為初步篩選出的受PrPC-STAT3通路調控的EMT相關基因。進一步通過文獻檢索和功能分析,對這些基因進行驗證和確定。經篩選和驗證,確定了E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist等基因作為受PrPC-STAT3通路調控的EMT相關關鍵基因。其中,E-cadherin是上皮細胞的重要標志物,其表達水平的降低是EMT發生的重要標志之一;N-cadherin和Vimentin是間質細胞的標志物,在EMT過程中表達上調;Snail和Twist是EMT相關的轉錄因子,能夠調節上皮標志物和間質標志物的表達,在EMT的調控中發揮關鍵作用。5.1.2通路調控基因表達的分子機制PrPC-STAT3通路對EMT相關基因表達的調控涉及復雜的分子機制。從轉錄因子角度來看,STAT3作為一種重要的轉錄因子,在PrPC-STAT3通路中發揮關鍵作用。通過染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗

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