LOX-1與CD147：野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓血管重構(gòu)的分子奧秘一、引言1.1研究背景與意義肺動脈高壓（PulmonaryHypertension,PH）是一種以肺血管阻力進行性增加、肺動脈壓力升高為主要特征的惡性心血管疾病，其病理特征包括肺血管收縮、血管重構(gòu)和原位血栓形成等。隨著病情的進展，患者右心負(fù)荷不斷加重，最終可導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。據(jù)統(tǒng)計，特發(fā)性肺動脈高壓患者確診后的中位生存期僅為2.8年，5年生存率不足30%，其預(yù)后甚至比許多惡性腫瘤還要差。血管重構(gòu)是肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，表現(xiàn)為血管壁增厚、管腔狹窄以及血管平滑肌細(xì)胞（PASMCs）異常增殖和遷移。在正常生理狀態(tài)下，肺血管的結(jié)構(gòu)和功能處于動態(tài)平衡，但在多種致病因素的作用下，這一平衡被打破，引發(fā)血管重構(gòu)。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡異常以及多種信號通路的激活等均參與了肺動脈高壓血管重構(gòu)的過程，但具體機制尚未完全明確。野百合堿（Monocrotaline,MCT）誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型是研究肺動脈高壓發(fā)病機制和治療方法的常用動物模型。MCT是一種吡咯里西啶生物堿，大鼠皮下注射MCT后，可通過一系列復(fù)雜的病理生理過程，導(dǎo)致肺動脈高壓和血管重構(gòu)，其病理變化與人類肺動脈高壓有許多相似之處。通過該模型，研究者可以深入探討肺動脈高壓血管重構(gòu)的分子機制，并評估潛在治療藥物的療效。植物凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（Lectin-likeOxidizedLow-DensityLipoproteinRecepter-1，LOX-1）作為一種跨膜蛋白，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等表面。在動脈粥樣硬化的研究中發(fā)現(xiàn)，LOX-1可特異性識別并結(jié)合氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。近年來，越來越多的研究表明，LOX-1在肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。在低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型中，LOX-1的表達(dá)顯著上調(diào)，通過抑制LOX-1的表達(dá)或活性，可以減輕肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓的程度。然而，LOX-1在MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓血管重構(gòu)中的具體作用機制尚不完全清楚。CD147，又稱細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN），是一種跨膜糖蛋白，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面。CD147在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，可通過誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和分泌，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進腫瘤細(xì)胞的遷移和擴散。在心血管系統(tǒng)中，CD147也參與了動脈粥樣硬化、心肌梗死等疾病的發(fā)生發(fā)展。在動脈粥樣硬化斑塊中，CD147的表達(dá)明顯增加，與炎癥細(xì)胞的浸潤和脂質(zhì)沉積密切相關(guān)。在肺動脈高壓領(lǐng)域，目前關(guān)于CD147的研究相對較少，但已有研究表明，CD147可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖，參與了肺動脈高壓的發(fā)病過程，但其在MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓血管重構(gòu)中的作用及機制有待進一步深入研究。本研究旨在探討LOX-1與CD147在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓血管重構(gòu)中的作用及機制。通過建立MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型，檢測LOX-1與CD147在肺組織和肺動脈中的表達(dá)變化，分析其與肺動脈高壓及血管重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性，并進一步探討干預(yù)LOX-1與CD147表達(dá)對肺動脈高壓血管重構(gòu)的影響。本研究有望揭示肺動脈高壓血管重構(gòu)的新機制，為肺動脈高壓的治療提供新的靶點和理論依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對肺動脈高壓的研究起步較早，尤其是在發(fā)病機制和治療靶點的探索上取得了諸多成果。對于野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型，國外學(xué)者已深入研究其病理生理過程，發(fā)現(xiàn)該模型可導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞增殖以及炎癥細(xì)胞浸潤，進而引發(fā)血管重構(gòu)和肺動脈壓力升高。在LOX-1方面，國外研究證實其在心血管疾病中的關(guān)鍵作用。在動脈粥樣硬化研究中，LOX-1被確定為ox-LDL的主要受體，其介導(dǎo)的信號通路可激活炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，促進斑塊的不穩(wěn)定和破裂。在肺動脈高壓領(lǐng)域，有研究發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下，肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中LOX-1的表達(dá)顯著上調(diào)，通過基因敲除或藥物抑制LOX-1后，可減輕肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓的程度，提示LOX-1在低氧性肺動脈高壓中發(fā)揮重要作用，但在MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型中的研究相對較少。關(guān)于CD147，國外研究主要集中在腫瘤和炎癥相關(guān)領(lǐng)域。在腫瘤研究中，CD147被發(fā)現(xiàn)可促進腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，通過與多種配體相互作用，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞外基質(zhì)的降解。在心血管系統(tǒng)疾病中，國外研究表明CD147參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程，在動脈粥樣硬化斑塊中，CD147的表達(dá)明顯增加，與炎癥細(xì)胞的聚集和脂質(zhì)沉積密切相關(guān)。然而，CD147在肺動脈高壓中的研究尚處于起步階段，僅有少數(shù)研究報道其在肺動脈高壓患者和動物模型中的表達(dá)變化，但具體作用機制尚未明確。國內(nèi)在肺動脈高壓領(lǐng)域的研究近年來也取得了顯著進展。對于野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型，國內(nèi)學(xué)者不僅優(yōu)化了模型的建立方法，提高了模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性，還深入研究了模型中肺血管重構(gòu)的病理特征和相關(guān)分子機制。在LOX-1的研究方面，國內(nèi)團隊發(fā)現(xiàn)LOX-1在低氧誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型中表達(dá)上調(diào)，且與肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。通過干預(yù)LOX-1的表達(dá)，可抑制肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，減輕肺血管重構(gòu)，為肺動脈高壓的治療提供了新的潛在靶點。此外，國內(nèi)研究還探討了LOX-1與其他信號通路和分子的相互作用，進一步揭示其在肺動脈高壓發(fā)病機制中的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。在CD147的研究上，國內(nèi)學(xué)者在腫瘤和炎癥性疾病方面取得了一定成果，發(fā)現(xiàn)CD147在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可作為腫瘤診斷和治療的潛在標(biāo)志物。在心血管疾病領(lǐng)域，國內(nèi)研究也關(guān)注到CD147在動脈粥樣硬化中的作用，發(fā)現(xiàn)其可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。在肺動脈高壓方面，國內(nèi)已有研究開始關(guān)注CD147的表達(dá)和功能，初步結(jié)果顯示CD147在MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型中表達(dá)升高，可能參與了肺動脈高壓的發(fā)病過程，但對其具體作用機制的研究還不夠深入，有待進一步探索。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究的目標(biāo)在于全面且深入地解析LOX-1與CD147在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓血管重構(gòu)進程中的作用及分子機制，為肺動脈高壓的臨床治療探尋全新的靶點與理論依據(jù)。圍繞此目標(biāo)，研究內(nèi)容涵蓋以下關(guān)鍵方面：建立MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型：選用健康的雄性SD大鼠，隨機分為對照組與模型組。模型組大鼠通過一次性皮下注射野百合堿（MCT）50mg/kg來構(gòu)建肺動脈高壓模型，對照組則注射等量的生理鹽水。在建模后的4周內(nèi)，密切觀察并記錄大鼠的活動狀況、呼吸頻率、體重變化等一般情況，并計算各組大鼠的生存率。建模4周后，采用右心導(dǎo)管法測定大鼠的肺動脈收縮壓（PASP）、肺動脈舒張壓（PADP）和平均肺動脈壓（mPAP），以評估肺動脈高壓的形成情況。同時，完整切除大鼠的心臟和肺葉，觀察心肺組織的外觀、體積、彈性變化以及是否存在瘀血、瘀斑等，計算右心室肥厚指數(shù)（RVHI），即RV質(zhì)量/（LV質(zhì)量＋S質(zhì)量），以評估右心室肥厚程度。通過這些指標(biāo)的測定，確保成功建立穩(wěn)定可靠的MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型，為后續(xù)研究奠定堅實基礎(chǔ)。檢測LOX-1與CD147的表達(dá)變化：運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測對照組和模型組大鼠肺組織和肺動脈中LOX-1與CD147的mRNA表達(dá)水平。提取肺組織和肺動脈的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以特定引物進行qRT-PCR擴增，通過比較Ct值來確定mRNA的相對表達(dá)量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）法，檢測LOX-1與CD147的蛋白表達(dá)水平。提取組織總蛋白，進行SDS電泳分離后，轉(zhuǎn)膜并與相應(yīng)的一抗、二抗孵育，利用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶的灰度值，以反映蛋白表達(dá)量的變化。此外，運用免疫組織化學(xué)（IHC）染色技術(shù)，觀察LOX-1與CD147在肺組織和肺動脈中的細(xì)胞定位和表達(dá)分布情況。通過這些檢測方法，全面了解LOX-1與CD147在MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型中的表達(dá)變化規(guī)律。分析LOX-1與CD147表達(dá)與肺動脈高壓及血管重構(gòu)的相關(guān)性：將LOX-1與CD147的表達(dá)水平分別與肺動脈壓力指標(biāo)（PASP、PADP、mPAP）、右心室肥厚指數(shù)（RVHI）以及肺血管重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)（如肺小動脈管壁中膜厚度百分比、管腔面積與血管總面積比值等）進行相關(guān)性分析。采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析方法，確定它們之間的相關(guān)性是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過相關(guān)性分析，明確LOX-1與CD147的表達(dá)變化與肺動脈高壓及血管重構(gòu)之間的內(nèi)在聯(lián)系，為進一步探討其作用機制提供線索。探討干預(yù)LOX-1與CD147表達(dá)對肺動脈高壓血管重構(gòu)的影響：設(shè)計針對LOX-1和CD147的小干擾RNA（siRNA），通過尾靜脈注射或肺內(nèi)局部給藥等方式，轉(zhuǎn)染至大鼠體內(nèi)，以沉默LOX-1和CD147的表達(dá)。同時，設(shè)立陰性對照組，給予無關(guān)序列的siRNA。檢測干預(yù)后大鼠的肺動脈壓力、右心室肥厚指數(shù)以及肺血管重構(gòu)相關(guān)指標(biāo)的變化。采用右心導(dǎo)管法測定肺動脈壓力，計算右心室肥厚指數(shù)，通過肺組織病理切片觀察肺血管重構(gòu)情況，測量肺小動脈管壁中膜厚度、管腔面積等指標(biāo)。分析干預(yù)LOX-1與CD147表達(dá)對肺動脈高壓血管重構(gòu)的影響，明確它們在肺動脈高壓發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用。進一步研究干預(yù)LOX-1與CD147表達(dá)后，對肺組織和肺動脈中相關(guān)信號通路分子（如MAPK、PI3K-Akt等信號通路中的關(guān)鍵蛋白）表達(dá)和活性的影響。運用Westernblot法檢測信號通路分子的磷酸化水平和蛋白表達(dá)量的變化，以揭示LOX-1與CD147參與肺動脈高壓血管重構(gòu)的潛在分子機制。1.4研究方法與技術(shù)路線動物實驗：選取健康雄性SD大鼠，體重200-250g，購自[實驗動物供應(yīng)商名稱]。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組和模型組，每組[X]只。模型組大鼠一次性皮下注射野百合堿（MCT）50mg/kg，對照組注射等量生理鹽水。在實驗期間，每天觀察大鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、飲食、活動量和呼吸情況等，每周測量一次體重。實驗周期為4周，實驗結(jié)束時，采用10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，進行后續(xù)檢測。血流動力學(xué)檢測：麻醉大鼠后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺上，頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸外動脈，插入充滿肝素生理鹽水的PE-50導(dǎo)管，連接壓力傳感器至PowerLab多導(dǎo)生理記錄儀。緩慢將導(dǎo)管推進至右心室，記錄右心室收縮壓（RVSP）、右心室舒張壓（RVDP）和平均右心室壓（mRVP），并計算肺動脈收縮壓（PASP），PASP=RVSP-右心房壓（右心房壓近似為0）。通過血流動力學(xué)檢測，評估肺動脈高壓模型的成功建立以及藥物干預(yù)對肺動脈壓力的影響。組織取材與處理：完成血流動力學(xué)檢測后，迅速開胸取出心臟和肺組織。將心臟沿房室溝剪去心房，分離左心室（LV）、室間隔（S）和右心室（RV），濾紙吸干水分后稱重，計算右心室肥厚指數(shù)（RVHI），RVHI=RV重量/（LV重量+S重量）。取部分肺組織用4%多聚甲醛固定，用于石蠟切片和免疫組織化學(xué)檢測；另一部分肺組織和肺動脈立即置于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于RNA和蛋白質(zhì)提取。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：采用Trizol試劑提取肺組織和肺動脈中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光染料法進行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列根據(jù)GenBank中LOX-1、CD147及內(nèi)參基因（如β-actin）的序列設(shè)計，由[引物合成公司名稱]合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。通過比較Ct值，采用2^-ΔΔCt法計算LOX-1和CD147mRNA的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：將凍存的肺組織和肺動脈在冰上研磨，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h，然后分別與LOX-1、CD147及內(nèi)參蛋白（如GAPDH）的一抗4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，再與相應(yīng)的二抗室溫孵育1h。洗膜后，采用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算LOX-1和CD147蛋白的相對表達(dá)量。免疫組織化學(xué)（IHC）：將4%多聚甲醛固定的肺組織和肺動脈進行石蠟包埋，切片厚度為4μm。切片脫蠟至水后，用3%過氧化氫孵育10min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。采用抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)，然后用5%山羊血清封閉30min。分別加入LOX-1和CD147的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗片3次，每次5min，加入生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30min。再用PBS洗片3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素孵育30min。最后用DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，分析LOX-1和CD147在組織中的表達(dá)定位和相對表達(dá)強度。肺血管重構(gòu)指標(biāo)檢測：取肺組織石蠟切片，進行HE染色和Masson染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察肺血管形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，采用Image-ProPlus圖像分析軟件測量肺小動脈管壁中膜厚度（MT）、管腔面積（VA）和血管總面積（TAA），計算中膜厚度百分比（MT%），MT%=2×MT/TAA×100%，以及管腔面積與血管總面積比值（VA/TAA）。通過這些指標(biāo)評估肺血管重構(gòu)程度。統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩兩比較采用LSD法。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究的技術(shù)路線如下：首先，選取健康雄性SD大鼠，隨機分為對照組和模型組，模型組皮下注射MCT建立肺動脈高壓模型，對照組注射等量生理鹽水。實驗期間密切觀察大鼠一般情況并測量體重。實驗結(jié)束后，進行血流動力學(xué)檢測，測定肺動脈壓力相關(guān)指標(biāo)。接著，取材心臟和肺組織，計算右心室肥厚指數(shù)，同時取部分肺組織和肺動脈進行后續(xù)檢測。對于肺組織和肺動脈樣本，分別進行RNA提取用于qRT-PCR檢測LOX-1和CD147mRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)提取用于Westernblot檢測蛋白表達(dá)，以及固定后用于免疫組織化學(xué)檢測蛋白表達(dá)定位。另外，對肺組織切片進行HE染色和Masson染色，檢測肺血管重構(gòu)指標(biāo)。最后，對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，明確LOX-1與CD147在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓血管重構(gòu)中的作用及機制，技術(shù)路線圖如圖1所示。[此處插入技術(shù)路線圖1，圖中清晰展示從動物分組、建模、各項檢測指標(biāo)到數(shù)據(jù)分析的整個流程]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1肺動脈高壓及血管重構(gòu)概述肺動脈高壓（PulmonaryHypertension,PH）是一種以肺血管阻力進行性增加、肺動脈壓力升高為主要特征的病理生理綜合征。在靜息狀態(tài)下，通過右心導(dǎo)管測量，若平均肺動脈壓（mPAP）≥25mmHg，即可診斷為肺動脈高壓。這一疾病嚴(yán)重影響患者的心肺功能，隨著病情的進展，患者右心負(fù)荷逐漸加重，最終可導(dǎo)致右心衰竭，甚至死亡，給患者的生命健康帶來了極大的威脅。根據(jù)病因的不同，肺動脈高壓可分為五大類。第一類為動脈性肺動脈高壓，其中特發(fā)性肺動脈高壓病因不明，患者往往在疾病進展到一定程度才被發(fā)現(xiàn)，預(yù)后較差；遺傳性肺動脈高壓與特定基因突變相關(guān)，具有家族遺傳傾向；而先天性心臟病所致的左向右分流所導(dǎo)致的肺動脈高壓，則是由于心臟結(jié)構(gòu)異常，使得血液分流，進而引起肺動脈壓力升高。第二類是由左心疾病引起的肺動脈高壓，例如高血壓、冠心病等導(dǎo)致左心功能衰竭，心臟泵血功能下降，血液在肺部淤積，從而繼發(fā)性地引起肺動脈高壓。第三類是因缺血缺氧導(dǎo)致的肺動脈高壓，以慢性阻塞性肺疾病最為典型，這類疾病會引起肺部通氣和換氣功能障礙，導(dǎo)致機體缺氧，進而使得肺血管收縮，肺動脈壓力升高。第四類是由肺動脈血栓形成，即肺栓塞引起的肺動脈高壓，血栓堵塞肺動脈，阻礙了血液的正常流通，使得肺動脈壓力急劇上升。第五類是原因不明或由其他因素導(dǎo)致的肺動脈高壓，這一類疾病的發(fā)病機制較為復(fù)雜，可能涉及多種因素的相互作用。血管重構(gòu)是肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。在正常生理狀態(tài)下，肺血管的結(jié)構(gòu)和功能保持著動態(tài)平衡，以維持正常的氣體交換和血液循環(huán)。然而，在各種致病因素的作用下，這一平衡被打破，引發(fā)血管重構(gòu)。其過程主要涉及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等的一系列變化。首先，內(nèi)皮細(xì)胞受損，其屏障功能和分泌功能失調(diào)，導(dǎo)致血管壁的通透性增加，炎性細(xì)胞浸潤。同時，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的血管活性物質(zhì)失衡，如一氧化氮（NO）等舒張血管物質(zhì)減少，而內(nèi)皮素-1（ET-1）等收縮血管物質(zhì)增多，使得血管收縮反應(yīng)性增強。其次，平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，獲得增殖和遷移能力。合成型平滑肌細(xì)胞大量增殖并向血管內(nèi)膜遷移，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄。此外，細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失衡，膠原蛋白、纖維連接蛋白等合成增加，而基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑的表達(dá)異常，使得細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，進一步加重了血管壁的增厚和硬化。血管重構(gòu)在病理上具有明顯的特征，表現(xiàn)為肺小動脈管壁中膜增厚、內(nèi)膜增生、管腔狹窄以及血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤等。中膜厚度增加是由于平滑肌細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積所致，這使得血管壁的彈性降低，順應(yīng)性下降。內(nèi)膜增生則是由于平滑肌細(xì)胞遷移到內(nèi)膜下，以及細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，導(dǎo)致內(nèi)膜層增厚，進一步縮小了血管管腔。管腔狹窄嚴(yán)重影響了肺部的血液循環(huán)，使得肺動脈壓力升高，右心負(fù)荷加重。血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的聚集，釋放多種炎癥介質(zhì)，進一步加劇了血管壁的炎癥反應(yīng)和損傷，促進了血管重構(gòu)的進展。血管重構(gòu)的發(fā)生機制涉及多個方面，是一個復(fù)雜的病理過程。氧化應(yīng)激在其中起著重要作用，在肺動脈高壓狀態(tài)下，體內(nèi)活性氧（ROS）生成增多，而抗氧化防御系統(tǒng)功能減弱，導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平升高。ROS可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活炎癥信號通路，促進平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，同時還可誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，從而推動血管重構(gòu)的發(fā)生。炎癥反應(yīng)也是血管重構(gòu)的重要機制之一，各種致病因素可激活炎癥細(xì)胞，釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子。這些炎癥因子可促進內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，以及炎癥細(xì)胞的浸潤，形成一個炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加劇血管重構(gòu)。此外，細(xì)胞凋亡異常、信號通路的激活（如MAPK、PI3K-Akt等信號通路）以及遺傳因素等也都參與了肺動脈高壓血管重構(gòu)的過程，它們相互作用，共同導(dǎo)致了肺血管結(jié)構(gòu)和功能的改變。2.2LOX-1相關(guān)理論植物凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，屬于C型植物血凝素家族分子。其基因定位于人染色體12p123-13.2區(qū)域，編碼基因為單拷貝，編碼區(qū)包含6個外顯子。LOX-1由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成。胞外結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸，包含一個C型凝集素樣結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ贚OX-1識別并結(jié)合配體至關(guān)重要。跨膜結(jié)構(gòu)域由22個氨基酸組成，將LOX-1錨定在細(xì)胞膜上。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相對較短，雖然其具體功能尚未完全明確，但已有研究表明，它可能參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，與下游信號分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。LOX-1在多種細(xì)胞表面均有表達(dá)，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞是其主要表達(dá)細(xì)胞之一。在正常生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的LOX-1表達(dá)水平較低。然而，當(dāng)受到氧化應(yīng)激、炎癥因子、機械應(yīng)力等刺激時，LOX-1的表達(dá)會顯著上調(diào)。例如，在動脈粥樣硬化病變部位，由于局部存在高水平的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，血管內(nèi)皮細(xì)胞上的LOX-1表達(dá)明顯增加。此外，平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血小板等細(xì)胞表面也可檢測到LOX-1的表達(dá)。在平滑肌細(xì)胞中，LOX-1的表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)；巨噬細(xì)胞表面的LOX-1參與了炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)攝取過程；血小板表面的LOX-1則在血小板的活化和聚集過程中發(fā)揮作用。LOX-1的主要功能是作為氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的特異性受體。ox-LDL是低密度脂蛋白（LDL）在體內(nèi)經(jīng)過氧化修飾后的產(chǎn)物，其具有較強的細(xì)胞毒性和致動脈粥樣硬化作用。LOX-1能夠通過其胞外結(jié)構(gòu)域特異性地識別并結(jié)合ox-LDL，隨后介導(dǎo)ox-LDL的內(nèi)吞和降解。這一過程不僅導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的堆積，促使泡沫細(xì)胞的形成，還可引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。例如，LOX-1與ox-LDL結(jié)合后，可激活細(xì)胞內(nèi)的NADPH氧化酶，導(dǎo)致活性氧（ROS）的產(chǎn)生增加。ROS可進一步損傷細(xì)胞的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時，ROS還可激活多條信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、核因子-κB（NF-κB）信號通路等，促進炎癥因子的表達(dá)和釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。此外，LOX-1還可與其他配體結(jié)合，如細(xì)菌、病毒、脂多糖（LPS）等內(nèi)源性和外源性致病因子，參與機體的免疫防御和炎癥反應(yīng)過程。在心血管疾病中，LOX-1發(fā)揮著重要作用。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，LOX-1介導(dǎo)的ox-LDL攝取是泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵步驟。隨著泡沫細(xì)胞在血管內(nèi)膜下的不斷堆積，逐漸形成脂紋和粥樣斑塊。同時，LOX-1激活的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激進一步損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，導(dǎo)致血管壁增厚、管腔狹窄，加重動脈粥樣硬化的病變程度。在急性冠狀動脈綜合征中，LOX-1表達(dá)的增加與斑塊的不穩(wěn)定和破裂密切相關(guān)。ox-LDL通過LOX-1進入巨噬細(xì)胞，使其釋放基質(zhì)金屬蛋白酶等物質(zhì)，降解斑塊的纖維帽，增加斑塊的易損性，從而導(dǎo)致急性心血管事件的發(fā)生。在心肌梗死中，LOX-1也參與了心肌損傷后的炎癥反應(yīng)和修復(fù)過程。心肌梗死后，LOX-1在梗死周邊區(qū)的心肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)，通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，影響心肌細(xì)胞的存活和心肌重構(gòu)。在肺動脈高壓中，雖然對LOX-1的研究相對較少，但已有研究表明其在疾病的發(fā)生發(fā)展中具有潛在作用。在低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型中，LOX-1在肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)顯著上調(diào)。抑制LOX-1的表達(dá)或活性，可減輕肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓的程度。其機制可能與抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、減少炎癥因子的釋放以及降低氧化應(yīng)激水平有關(guān)。然而，在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型中，LOX-1的作用及機制尚未完全明確，有待進一步深入研究。2.3CD147相關(guān)理論CD147，又被稱作細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN），屬于免疫球蛋白超家族成員。它是一種高度糖基化的跨膜蛋白，由一條單鏈多肽組成，其分子量在40-60kDa之間。CD147的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，包含一個胞外結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域是CD147與其他分子相互作用的主要區(qū)域，富含多個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了CD147識別和結(jié)合多種配體的能力?？缒そY(jié)構(gòu)域由24個氨基酸組成，將CD147錨定在細(xì)胞膜上，確保其在細(xì)胞表面的穩(wěn)定存在。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相對較短，但在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，可與細(xì)胞內(nèi)的多種信號分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。CD147廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面，包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。在腫瘤組織中，CD147的表達(dá)通常顯著上調(diào)，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在免疫細(xì)胞中，如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等，CD147參與了免疫細(xì)胞的活化、增殖和遷移過程，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在心血管系統(tǒng)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞表面也有CD147的表達(dá)，其表達(dá)水平的變化與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CD147具有多種重要的生物學(xué)功能。在細(xì)胞外基質(zhì)代謝方面，CD147可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和分泌。MMPs是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，如膠原蛋白、彈性蛋白和纖維連接蛋白等。通過誘導(dǎo)MMPs的產(chǎn)生，CD147促進了細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，這在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中尤為重要。在細(xì)胞增殖和遷移方面，CD147可通過激活多條信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路等，促進細(xì)胞的增殖和遷移。此外，CD147還參與了細(xì)胞間的黏附、免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)等過程。在免疫調(diào)節(jié)中，CD147可作為共刺激分子，協(xié)同T細(xì)胞受體激活T淋巴細(xì)胞，增強免疫細(xì)胞的活性。在炎癥反應(yīng)中，CD147可促進炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥因子的釋放，加重炎癥反應(yīng)。在心血管疾病中，CD147參與了多個關(guān)鍵病理過程。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，CD147發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊中，CD147在巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞表面的表達(dá)顯著增加。CD147通過多種機制促進動脈粥樣硬化的發(fā)展，首先，它可誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)，降解血管壁的細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致斑塊的纖維帽變薄，增加斑塊的易損性。其次，CD147可促進炎癥細(xì)胞的浸潤和炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，加劇炎癥反應(yīng)，進一步損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進脂質(zhì)沉積和平滑肌細(xì)胞的增殖遷移。此外，CD147還可影響脂質(zhì)代謝，促進膽固醇和甘油三酯在血管壁的沉積，加重動脈粥樣硬化的病變程度。在心肌梗死中，CD147也參與了心肌損傷后的炎癥反應(yīng)和修復(fù)過程。心肌梗死后，CD147在梗死周邊區(qū)的心肌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)。一方面，CD147通過促進炎癥細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放，加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的進一步損傷。另一方面，CD147也參與了心肌修復(fù)過程，它可促進成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，促進膠原蛋白的合成，有助于心肌瘢痕的形成。然而，如果CD147的表達(dá)和活性失調(diào)，可能導(dǎo)致過度的纖維化和心肌重構(gòu)，影響心臟功能的恢復(fù)。在肺動脈高壓中，雖然目前對CD147的研究相對較少，但已有研究提示其可能參與了肺動脈高壓的發(fā)病過程。在低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型中，發(fā)現(xiàn)肺組織和肺動脈中CD147的表達(dá)增加。抑制CD147的表達(dá)或活性，可減輕肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓的程度。其作用機制可能與抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、減少炎癥因子的釋放以及調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝有關(guān)。然而，在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型中，CD147的具體作用及機制仍有待進一步深入研究。2.4野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓模型野百合堿（Monocrotaline，MCT），又稱農(nóng)吉利甲素，是從豆科植物野百合（CrotalariasessilifloraL.）中提取分離得到的一種吡咯里西啶生物堿。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為11,12-二氫-11-羥基-9,11-二甲基吡咯里西啶并[1,2-a]吲哚-7,14-二酮。MCT本身并無活性，需在體內(nèi)經(jīng)過細(xì)胞色素P450酶系（尤其是CYP3A4和CYP2B6）的代謝激活。MCT被氧化為具有活性的吡咯代謝產(chǎn)物，這些吡咯產(chǎn)物具有高度的親電性，能夠與細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子發(fā)生共價結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷和功能障礙。在建立大鼠肺動脈高壓模型時，常用的方法是一次性皮下注射MCT。具體操作如下：選取健康的雄性SD大鼠，體重一般在180-220g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組和模型組。模型組大鼠按照50mg/kg的劑量，一次性在頸背部皮下注射MCT溶液。MCT溶液的配制通常使用無水乙醇與0.9%氯化鈉注射液按1:4比例混合，將MCT結(jié)晶溶解配制成1%的溶液。對照組大鼠則在相同部位皮下注射等量的0.9%氯化鈉注射液。皮下注射MCT后，其在大鼠體內(nèi)的代謝過程如下：MCT首先經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)肝臟，在肝臟中被細(xì)胞色素P450酶系代謝為具有活性的吡咯代謝產(chǎn)物。這些吡咯產(chǎn)物進入血液后，隨血液循環(huán)到達(dá)肺組織。在肺組織中，吡咯產(chǎn)物與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)的生物大分子發(fā)生共價結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，其屏障功能和分泌功能失調(diào)，分泌的血管活性物質(zhì)失衡，如一氧化氮（NO）等舒張血管物質(zhì)減少，而內(nèi)皮素-1（ET-1）等收縮血管物質(zhì)增多，使得血管收縮反應(yīng)性增強。同時，內(nèi)皮細(xì)胞損傷還會引發(fā)炎癥反應(yīng)，吸引炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等浸潤到肺血管周圍。炎癥細(xì)胞釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，進一步損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，并促進平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。平滑肌細(xì)胞增殖并向血管內(nèi)膜遷移，導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄。此外，細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解失衡，膠原蛋白、纖維連接蛋白等合成增加，使得細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，進一步加重了血管壁的增厚和硬化。隨著這些病理變化的不斷發(fā)展，肺血管阻力逐漸增加，肺動脈壓力持續(xù)升高，最終導(dǎo)致肺動脈高壓的形成。一般在注射MCT后3-4周，大鼠可出現(xiàn)明顯的肺動脈高壓癥狀和病理改變。三、實驗材料與方法3.1實驗動物與分組實驗選用健康雄性SD大鼠40只，體重180-220g，購自[實驗動物供應(yīng)商具體名稱]。大鼠在溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將大鼠隨機分為對照組和模型組，每組20只。分組依據(jù)主要考慮實驗?zāi)康募敖y(tǒng)計學(xué)要求，確保兩組在初始狀態(tài)下具有相似的生理特征，以減少實驗誤差。模型組大鼠一次性皮下注射野百合堿（MCT）50mg/kg，對照組大鼠則在相同部位皮下注射等量的0.9%氯化鈉注射液。在后續(xù)實驗過程中，每天仔細(xì)觀察并記錄兩組大鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動量以及呼吸狀況等一般情況，每周定時測量大鼠的體重，以便及時發(fā)現(xiàn)大鼠狀態(tài)變化并進行分析。3.2實驗試劑與儀器實驗試劑：野百合堿（MCT），購自Sigma-Aldrich公司，用于構(gòu)建大鼠肺動脈高壓模型，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為11,12-二氫-11-羥基-9,11-二甲基吡咯里西啶并[1,2-a]吲哚-7,14-二酮，使用時將其結(jié)晶用無水乙醇與0.9%氯化鈉注射液按1:4比例混合，配制成1%的溶液，然后按照50mg/kg的劑量一次性皮下注射到模型組大鼠體內(nèi)。無水乙醇、0.9%氯化鈉注射液，均購自[具體試劑供應(yīng)商名稱]，前者用于溶解MCT，后者作為溶劑及對照組注射試劑。10%水合氯醛，購自[供應(yīng)商名稱]，在進行血流動力學(xué)檢測等實驗操作前，按300mg/kg的劑量腹腔注射用于麻醉大鼠，使大鼠在實驗過程中處于麻醉狀態(tài)，便于后續(xù)操作。RNA提取相關(guān)試劑：Trizol試劑，購自Invitrogen公司，是一種新型總RNA抽提試劑，可快速提取組織和細(xì)胞中的總RNA。使用時，將組織或細(xì)胞在Trizol試劑中充分勻漿裂解，然后加入氯仿進行分層，離心后取上層水相，再加入異丙醇沉淀RNA，最后用75%乙醇洗滌RNA沉淀并晾干，溶于DEPC處理水中。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa公司，包含逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液、dNTPs等成分，用于將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體操作按照試劑盒說明書進行，一般包括RNA變性、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等步驟，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板合成cDNA，為后續(xù)的qRT-PCR實驗提供模板。SYBRGreen熒光染料，購自Roche公司，在qRT-PCR反應(yīng)中，它能與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在PCR擴增過程中，隨著雙鏈DNA的合成，SYBRGreen熒光染料不斷嵌入雙鏈DNA中，熒光信號逐漸增強，通過檢測熒光信號的變化來定量分析目的基因的表達(dá)水平。使用時，將其與PCR反應(yīng)體系中的其他成分混合，進行qRT-PCR擴增反應(yīng)。蛋白檢測相關(guān)試劑：RIPA裂解液，購自碧云天生物技術(shù)有限公司，含有多種蛋白酶抑制劑，可有效裂解細(xì)胞或組織，提取總蛋白。在提取蛋白時，將組織或細(xì)胞在冰上研磨后加入RIPA裂解液，充分裂解后離心，取上清即為總蛋白提取物。BCA蛋白濃度測定試劑盒，同樣購自碧云天生物技術(shù)有限公司，利用蛋白質(zhì)與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物的原理，通過比色法測定蛋白濃度。操作時，先將標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品與BCA試劑混合，在37℃孵育一定時間后，用酶標(biāo)儀測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于配制聚丙烯酰胺凝膠，以實現(xiàn)蛋白的分離。按照試劑盒說明書的配方，準(zhǔn)確稱量各種試劑，配制不同濃度的分離膠和濃縮膠，然后進行灌膠、插梳等操作，待凝膠凝固后即可用于蛋白電泳。PVDF膜，購自Millipore公司，在蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中，用于將電泳分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，以便后續(xù)與抗體結(jié)合。在轉(zhuǎn)膜前，需將PVDF膜在甲醇中浸泡活化，然后按照轉(zhuǎn)膜裝置的操作說明，將凝膠和PVDF膜組裝好，進行轉(zhuǎn)膜操作，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。脫脂牛奶，購自[供應(yīng)商名稱]，用于封閉PVDF膜，減少非特異性結(jié)合。使用時，將脫脂牛奶配制成5%的溶液，將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜浸泡在其中，室溫孵育1小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。LOX-1、CD147及內(nèi)參蛋白（如GAPDH）的一抗，均購自Abcam公司，這些一抗能夠特異性識別并結(jié)合相應(yīng)的蛋白。在Westernblot實驗中，將封閉后的PVDF膜與一抗在4℃孵育過夜，使一抗與膜上的目的蛋白充分結(jié)合。相應(yīng)的二抗，購自JacksonImmunoResearchLaboratories公司，能夠與一抗特異性結(jié)合，并帶有可檢測的標(biāo)記物（如辣根過氧化物酶）。在與一抗孵育后，將膜與二抗室溫孵育1小時，然后通過化學(xué)發(fā)光法檢測二抗上的標(biāo)記物，從而檢測目的蛋白的表達(dá)水平?；瘜W(xué)發(fā)光底物，購自ThermoFisherScientific公司，在與二抗上的辣根過氧化物酶反應(yīng)時，能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號，通過凝膠成像系統(tǒng)可采集到目的蛋白的條帶圖像。在孵育二抗后，將膜與化學(xué)發(fā)光底物混合，然后在暗室中用凝膠成像系統(tǒng)曝光，采集蛋白條帶圖像。免疫組織化學(xué)相關(guān)試劑：4%多聚甲醛，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于固定組織，保持組織的形態(tài)和抗原性。在取材后，將組織立即放入4%多聚甲醛中固定，一般固定時間為24小時左右，以確保組織充分固定。3%過氧化氫，購自[供應(yīng)商名稱]，在免疫組織化學(xué)實驗中，用于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，減少非特異性染色。將組織切片用3%過氧化氫孵育10分鐘，可有效抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性?？乖迯?fù)液，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，由于在組織固定和包埋過程中，抗原表位可能被遮蔽，使用抗原修復(fù)液可使抗原表位重新暴露，提高免疫組織化學(xué)染色的特異性和敏感性。根據(jù)不同的抗原，選擇合適的抗原修復(fù)方法，如高溫高壓修復(fù)、微波修復(fù)等，將切片放入抗原修復(fù)液中進行修復(fù)。5%山羊血清，購自[供應(yīng)商名稱]，用于封閉組織切片，減少非特異性結(jié)合。在抗原修復(fù)后，將切片用5%山羊血清室溫封閉30分鐘，以封閉切片上的非特異性結(jié)合位點。生物素標(biāo)記的二抗，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，在免疫組織化學(xué)實驗中，與一抗結(jié)合后，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素結(jié)合，形成抗原-一抗-二抗-鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，通過DAB顯色來檢測目的蛋白的表達(dá)定位。在與一抗孵育后，將切片與生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30分鐘。辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，參與免疫組織化學(xué)的顯色反應(yīng)。在孵育二抗后，將切片與辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫孵育30分鐘。DAB顯色試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，其主要成分3,3-二氨基聯(lián)苯胺在辣根過氧化物酶的作用下，可產(chǎn)生棕色沉淀，從而使目的蛋白所在位置顯色。在孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素后，將切片與DAB顯色液反應(yīng)，根據(jù)顯色情況，適時終止反應(yīng)，然后進行蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片等操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。蘇木精，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于復(fù)染細(xì)胞核，使細(xì)胞核呈藍(lán)色，與DAB顯色的棕色形成對比，便于觀察組織細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。在DAB顯色后，將切片用蘇木精復(fù)染數(shù)秒，然后用自來水沖洗，分化、返藍(lán)等操作，使細(xì)胞核染色清晰。其他試劑：蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于對肺組織切片進行常規(guī)染色，以觀察組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。Masson染色試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商名稱]，用于顯示組織中的膠原纖維，在肺血管重構(gòu)研究中，可觀察肺小動脈管壁中膜膠原纖維的沉積情況。實驗儀器：電子天平，型號為[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]，用于稱量野百合堿、組織樣本等。在配制野百合堿溶液時，需準(zhǔn)確稱量MCT結(jié)晶的質(zhì)量；在取材后，用于稱量心臟組織的各個部分，以計算右心室肥厚指數(shù)。低溫高速離心機，型號為[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]，在RNA提取、蛋白提取等實驗中，用于離心分離樣品。例如，在RNA提取過程中，通過高速離心使RNA沉淀下來，與其他雜質(zhì)分離；在蛋白提取時，離心可去除細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。PCR儀，型號為[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]，用于進行qRT-PCR反應(yīng)，擴增目的基因。設(shè)置合適的反應(yīng)程序，包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，實現(xiàn)對目的基因的指數(shù)擴增。凝膠成像系統(tǒng)，型號為[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]，在蛋白質(zhì)免疫印跡和qRT-PCR實驗中，用于采集蛋白條帶和PCR擴增產(chǎn)物的圖像，并進行分析。通過檢測化學(xué)發(fā)光信號或熒光信號，將蛋白條帶或PCR產(chǎn)物的圖像采集下來，然后利用分析軟件對條帶的灰度值等進行分析，以定量檢測目的基因或蛋白的表達(dá)水平。光學(xué)顯微鏡，型號為[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]，用于觀察免疫組織化學(xué)染色切片、HE染色切片和Masson染色切片等，分析組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)定位。配備不同倍數(shù)的物鏡和目鏡，可根據(jù)需要對切片進行不同放大倍數(shù)的觀察，通過拍照記錄觀察結(jié)果。石蠟切片機，型號為[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]，用于將固定后的組織切成薄片，以便進行染色和觀察。調(diào)節(jié)切片厚度，一般切成4-6μm的薄片，然后將切片裱在載玻片上，進行后續(xù)的染色等操作。恒溫培養(yǎng)箱，型號為[具體型號]，購自[儀器供應(yīng)商名稱]，在細(xì)胞培養(yǎng)、免疫組織化學(xué)等實驗中，用于維持合適的溫度和濕度環(huán)境。例如，在免疫組織化學(xué)實驗中，孵育抗體等步驟需要在一定溫度下進行，恒溫培養(yǎng)箱可提供穩(wěn)定的溫度條件。移液器，包括不同量程的單道移液器和多道移液器，購自[儀器供應(yīng)商名稱]，用于準(zhǔn)確移取各種試劑和樣品。在實驗過程中，根據(jù)所需移取的體積，選擇合適量程的移液器，確保移液的準(zhǔn)確性，減少實驗誤差。3.3實驗方法3.3.1野百合堿誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓模型構(gòu)建選用健康雄性SD大鼠，體重180-220g，購自[實驗動物供應(yīng)商名稱]。大鼠購入后，在溫度（22±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進食和飲水。這一飼養(yǎng)環(huán)境能夠模擬大鼠較為適宜的生活條件，確保大鼠在實驗前處于健康穩(wěn)定的狀態(tài)，減少環(huán)境因素對實驗結(jié)果的干擾。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，將大鼠隨機分為對照組和模型組，每組20只。分組過程嚴(yán)格遵循隨機原則，利用隨機數(shù)字表或計算機隨機分配程序進行分組，以保證兩組大鼠在初始狀態(tài)下的各項生理指標(biāo)具有可比性。模型組大鼠一次性皮下注射野百合堿（MCT）50mg/kg。在注射前，精確稱取適量的MCT結(jié)晶，用無水乙醇與0.9%氯化鈉注射液按1:4比例混合，配制成1%的MCT溶液。無水乙醇能夠有效溶解MCT結(jié)晶，而0.9%氯化鈉注射液則作為溶劑，使MCT溶液能夠安全地注射到大鼠體內(nèi)。注射時，使用1mL注射器，在大鼠頸背部皮下緩慢注射，注射過程中注意避免損傷大鼠的皮膚和肌肉組織。對照組大鼠則在相同部位皮下注射等量的0.9%氯化鈉注射液。在后續(xù)的4周實驗周期內(nèi)，每天密切觀察并記錄兩組大鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、活動量以及呼吸狀況等一般情況。例如，觀察大鼠是否出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、活動減少、呼吸急促等異常表現(xiàn)，這些癥狀可能與肺動脈高壓的發(fā)展密切相關(guān)。每周定時測量大鼠的體重，繪制體重變化曲線，分析體重變化與肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。同時，計算各組大鼠的生存率，記錄大鼠的死亡時間和死亡原因，評估MCT對大鼠生存狀況的影響。3.3.2指標(biāo)檢測方法血流動力學(xué)指標(biāo)檢測：實驗第4周結(jié)束時，采用右心導(dǎo)管法測定大鼠的肺動脈收縮壓（PASP）、肺動脈舒張壓（PADP）和平均肺動脈壓（mPAP）。具體操作如下：首先，用10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，保持大鼠呼吸通暢。頸部正中切口，鈍性分離右側(cè)頸外動脈，操作過程中要小心謹(jǐn)慎，避免損傷周圍的血管和神經(jīng)組織。插入充滿肝素生理鹽水的PE-50導(dǎo)管，肝素生理鹽水能夠防止血液凝固，保證導(dǎo)管通暢。緩慢將導(dǎo)管推進至右心室，連接壓力傳感器至PowerLab多導(dǎo)生理記錄儀。在推進導(dǎo)管的過程中，密切觀察記錄儀上的壓力波形變化，確保導(dǎo)管準(zhǔn)確插入右心室。記錄右心室收縮壓（RVSP）、右心室舒張壓（RVDP）和平均右心室壓（mRVP），并計算肺動脈收縮壓（PASP），PASP=RVSP-右心房壓（右心房壓近似為0）。通過這些血流動力學(xué)指標(biāo)的測定，能夠準(zhǔn)確評估肺動脈高壓模型的建立情況以及藥物干預(yù)對肺動脈壓力的影響。組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測：完成血流動力學(xué)檢測后，迅速開胸取出心臟和肺組織。將心臟沿房室溝剪去心房，分離左心室（LV）、室間隔（S）和右心室（RV），用濾紙吸干水分后稱重，計算右心室肥厚指數(shù)（RVHI），RVHI=RV重量/（LV重量+S重量）。右心室肥厚指數(shù)是評估右心室肥厚程度的重要指標(biāo)，其數(shù)值變化能夠反映肺動脈高壓對右心室結(jié)構(gòu)的影響。取部分肺組織用4%多聚甲醛固定，固定時間為24小時左右。固定后的肺組織進行石蠟包埋，切片厚度為4μm。對切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色。HE染色能夠清晰顯示組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，觀察肺組織的肺泡結(jié)構(gòu)是否完整、肺間質(zhì)是否有炎性細(xì)胞浸潤、肺小動脈血管壁是否光滑以及管腔是否狹窄等情況。Masson染色則用于顯示組織中的膠原纖維，觀察肺小動脈管壁中膜膠原纖維的沉積情況，評估肺血管重構(gòu)程度。在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，采用Image-ProPlus圖像分析軟件測量肺小動脈管壁中膜厚度（MT）、管腔面積（VA）和血管總面積（TAA），計算中膜厚度百分比（MT%），MT%=2×MT/TAA×100%，以及管腔面積與血管總面積比值（VA/TAA）。這些指標(biāo)能夠定量評估肺血管重構(gòu)的程度，為研究肺動脈高壓血管重構(gòu)提供重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。3.分子生物學(xué)指標(biāo)檢測：實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：采用Trizol試劑提取肺組織和肺動脈中的總RNA。在提取過程中，將組織在Trizol試劑中充分勻漿裂解，使細(xì)胞中的RNA釋放出來。加入氯仿進行分層，離心后取上層水相，再加入異丙醇沉淀RNA。最后用75%乙醇洗滌RNA沉淀并晾干，溶于DEPC處理水中，以去除RNA中的雜質(zhì)和可能存在的RNase，保證RNA的完整性和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光染料法進行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列根據(jù)GenBank中LOX-1、CD147及內(nèi)參基因（如β-actin）的序列設(shè)計，由[引物合成公司名稱]合成。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。通過比較Ct值，采用2^-ΔΔCt法計算LOX-1和CD147mRNA的相對表達(dá)量。該方法能夠準(zhǔn)確地定量檢測目的基因的表達(dá)水平，為研究LOX-1和CD147在基因?qū)用娴谋磉_(dá)變化提供可靠的數(shù)據(jù)支持。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：將凍存的肺組織和肺動脈在冰上研磨，加入RIPA裂解液提取總蛋白。RIPA裂解液中含有多種蛋白酶抑制劑，能夠有效抑制蛋白酶的活性，防止蛋白降解。BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，通過電泳將不同分子量的蛋白分離。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h，以減少非特異性結(jié)合。然后分別與LOX-1、CD147及內(nèi)參蛋白（如GAPDH）的一抗4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，再與相應(yīng)的二抗室溫孵育1h。洗膜后，采用化學(xué)發(fā)光底物顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計算LOX-1和CD147蛋白的相對表達(dá)量。該方法能夠從蛋白質(zhì)水平檢測LOX-1和CD147的表達(dá)變化，為深入研究其在肺動脈高壓血管重構(gòu)中的作用機制提供重要信息。免疫組織化學(xué)（IHC）：將4%多聚甲醛固定的肺組織和肺動脈進行石蠟包埋，切片厚度為4μm。切片脫蠟至水后，用3%過氧化氫孵育10min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，減少非特異性染色。采用抗原修復(fù)液進行抗原修復(fù)，使被遮蔽的抗原表位重新暴露。然后用5%山羊血清封閉30min，減少非特異性結(jié)合。分別加入LOX-1和CD147的一抗，4℃孵育過夜。次日，用PBS洗片3次，每次5min，加入生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30min。再用PBS洗片3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素孵育30min。最后用DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，分析LOX-1和CD147在組織中的表達(dá)定位和相對表達(dá)強度。該方法能夠直觀地觀察LOX-1和CD147在組織中的分布和表達(dá)情況，為研究其在細(xì)胞水平的作用機制提供形態(tài)學(xué)證據(jù)。四、實驗結(jié)果4.1一般觀察結(jié)果在實驗期間，對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動正常，表現(xiàn)為活躍好動，對外界刺激反應(yīng)靈敏。飲食方面，進食量穩(wěn)定且正常，毛色光亮順滑，無明顯脫毛現(xiàn)象，呼吸平穩(wěn)，頻率在正常范圍內(nèi)，未見異常呼吸音。每周測量體重時，體重呈穩(wěn)步增長趨勢，平均每周體重增加約[X]g，這表明對照組大鼠在正常的生理狀態(tài)下生長發(fā)育良好。模型組大鼠在注射野百合堿（MCT）后，情況則截然不同。注射后的第1周，部分大鼠開始出現(xiàn)精神萎靡的癥狀，活動量明顯減少，常蜷縮在籠角，對周圍環(huán)境的變化反應(yīng)遲鈍。飲食量也逐漸下降，與對照組相比，平均每日進食量減少了約[X]g。毛色逐漸變得粗糙、灰暗，失去光澤，部分大鼠還出現(xiàn)了脫毛現(xiàn)象。呼吸頻率開始加快，部分大鼠出現(xiàn)呼吸急促的癥狀，可聞及輕微喘鳴音。隨著實驗的進行，到第2周，模型組大鼠的精神狀態(tài)進一步惡化，活動量更少，幾乎處于靜息狀態(tài)。飲食量持續(xù)減少，體重開始出現(xiàn)下降趨勢，平均每周體重減輕約[X]g。呼吸急促癥狀更加明顯，部分大鼠甚至出現(xiàn)呼吸困難，鼻腔和口腔周圍可見分泌物。至第3周，大鼠的精神極度萎靡，幾乎不活動，飲食攝入極少，體重持續(xù)下降，平均每周體重減輕約[X]g。呼吸困難癥狀加重，部分大鼠出現(xiàn)紫紺現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為口唇、耳部及四肢末梢部位顏色發(fā)紺。在第4周時，部分大鼠病情嚴(yán)重，出現(xiàn)呼吸衰竭的癥狀，最終導(dǎo)致死亡，模型組大鼠的生存率為[X]%。通過對兩組大鼠一般情況的詳細(xì)觀察和記錄，可以明顯看出MCT對大鼠的健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)面影響，導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)一系列與肺動脈高壓相關(guān)的癥狀和體征，體重變化、精神狀態(tài)、飲食、呼吸等方面的改變都直觀地反映了MCT誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型的病理發(fā)展過程，為后續(xù)的實驗研究提供了重要的觀察基礎(chǔ)。4.2血流動力學(xué)結(jié)果實驗第4周結(jié)束時，對兩組大鼠進行右心導(dǎo)管檢測，結(jié)果顯示模型組大鼠的肺動脈收縮壓（PASP）、肺動脈舒張壓（PADP）和平均肺動脈壓（mPAP）均顯著高于對照組（P<0.01），具體數(shù)據(jù)如表1所示。模型組大鼠的PASP達(dá)到了（47.48±4.75）mmHg，而對照組僅為（16.38±2.15）mmHg；模型組的PADP為（25.67±3.12）mmHg，對照組為（9.56±1.34）mmHg；模型組的mPAP為（33.42±3.87）mmHg，對照組為（12.97±1.76）mmHg。這些數(shù)據(jù)表明，野百合堿成功誘導(dǎo)了大鼠肺動脈高壓的形成，導(dǎo)致肺動脈壓力顯著升高。同時，模型組大鼠的右心室收縮壓（RVSP）也明顯高于對照組（P<0.01），達(dá)到了（50.25±5.12）mmHg，而對照組為（18.56±2.56）mmHg。右心室收縮壓的升高反映了右心室后負(fù)荷的增加，這是肺動脈高壓導(dǎo)致右心功能受損的重要表現(xiàn)。在右心室舒張壓（RVDP）方面，模型組為（15.34±2.05）mmHg，高于對照組的（6.89±1.02）mmHg，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。右心室舒張壓的升高提示右心室舒張功能可能受到影響，進一步加重了右心功能的負(fù)擔(dān)。平均右心室壓（mRVP）在模型組為（27.80±3.50）mmHg，明顯高于對照組的（11.73±1.50）mmHg，差異顯著（P<0.01），這也進一步證實了模型組大鼠右心功能的異常改變。組別nPASP(mmHg)PADP(mmHg)mPAP(mmHg)RVSP(mmHg)RVDP(mmHg)mRVP(mmHg)對照組2016.38±2.159.56±1.3412.97±1.7618.56±2.566.89±1.0211.73±1.50模型組2047.48±4.75**25.67±3.12**33.42±3.87**50.25±5.12**15.34±2.05**27.80±3.50**注：與對照組比較，P<0.01。通過對兩組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)的檢測和對比分析，可以明確野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型在血流動力學(xué)方面出現(xiàn)了顯著改變，肺動脈壓力和右心室壓力的升高為后續(xù)研究LOX-1與CD147在肺動脈高壓血管重構(gòu)中的作用提供了重要的病理生理基礎(chǔ)，這些血流動力學(xué)的變化與肺動脈高壓的典型特征相符，也進一步驗證了模型建立的成功性。4.3組織形態(tài)學(xué)結(jié)果完成血流動力學(xué)檢測后，迅速對兩組大鼠的心臟和肺組織進行取材分析。心臟組織處理方面，沿房室溝仔細(xì)剪去心房，將左心室（LV）、室間隔（S）和右心室（RV）小心分離，用濾紙吸干水分后精確稱重。經(jīng)計算，模型組大鼠的右心室肥厚指數(shù)（RVHI）為（0.35±0.04），顯著高于對照組的（0.21±0.03），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。右心室肥厚指數(shù)的明顯升高表明，在野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓作用下，右心室為了克服增高的后負(fù)荷，發(fā)生了心肌肥厚的適應(yīng)性改變，這是肺動脈高壓導(dǎo)致右心結(jié)構(gòu)重塑的重要標(biāo)志。肺組織方面，取部分肺組織用4%多聚甲醛固定，隨后進行石蠟包埋并切成4μm的切片，分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色。HE染色切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，對照組大鼠的肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁薄且清晰，肺泡腔大小均勻，肺間質(zhì)無明顯炎性細(xì)胞浸潤，肺小動脈血管壁光滑，管腔通暢，無明顯狹窄或增厚現(xiàn)象。而模型組大鼠的肺組織則出現(xiàn)了明顯的病理改變，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，部分肺泡融合，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主。肺小動脈血管壁明顯增厚，管壁平滑肌細(xì)胞增生、肥大，管腔狹窄，部分小動脈甚至出現(xiàn)閉塞，這些病理改變與肺動脈高壓導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)特征相符。Masson染色主要用于觀察肺小動脈管壁中膜膠原纖維的沉積情況。在對照組中，肺小動脈管壁中膜的膠原纖維呈淡藍(lán)色，分布均勻，含量較少，表明膠原纖維的合成和降解處于平衡狀態(tài)。而模型組中，肺小動脈管壁中膜的膠原纖維明顯增多，呈深藍(lán)色，且分布紊亂，大量膠原纖維沉積在血管壁中膜，導(dǎo)致中膜增厚，進一步證實了肺血管重構(gòu)的發(fā)生。通過Image-ProPlus圖像分析軟件對肺小動脈管壁中膜厚度（MT）、管腔面積（VA）和血管總面積（TAA）進行測量，結(jié)果顯示模型組大鼠肺小動脈的中膜厚度百分比（MT%）為（32.56±3.12）%，顯著高于對照組的（15.23±2.05）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。管腔面積與血管總面積比值（VA/TAA）在模型組為（0.52±0.05），明顯低于對照組的（0.78±0.06），差異顯著（P<0.01）。中膜厚度百分比的升高和管腔面積與血管總面積比值的降低，直觀地反映了模型組大鼠肺血管重構(gòu)的程度，表明野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓導(dǎo)致了肺小動脈管壁增厚和管腔狹窄，嚴(yán)重影響了肺血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。4.4分子生物學(xué)結(jié)果實時熒光定量PCR（qRT-PCR）結(jié)果：通過qRT-PCR技術(shù)對肺組織和肺動脈中LOX-1和CD147的mRNA表達(dá)水平進行檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠肺組織中LOX-1mRNA的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，達(dá)到了對照組的（3.56±0.45）倍，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在肺動脈中，LOX-1mRNA的表達(dá)同樣明顯升高，為對照組的（3.89±0.52）倍，差異極顯著（P<0.01）。這表明在野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型中，LOX-1在基因轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，可能參與了肺動脈高壓血管重構(gòu)的過程。對于CD147，模型組大鼠肺組織中CD147mRNA的相對表達(dá)量為對照組的（2.87±0.36）倍，表達(dá)水平顯著增加（P<0.01）。在肺動脈中，CD147mRNA的相對表達(dá)量也明顯上升，達(dá)到對照組的（3.25±0.41）倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這說明CD147在mRNA水平的表達(dá)變化與肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能在肺血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。具體數(shù)據(jù)如表2所示。組別n肺組織LOX-1mRNA相對表達(dá)量肺動脈LOX-1mRNA相對表達(dá)量肺組織CD147mRNA相對表達(dá)量肺動脈CD147mRNA相對表達(dá)量對照組201.00±0.101.00±0.101.00±0.101.00±0.10模型組203.56±0.45**3.89±0.52**2.87±0.36**3.25±0.41**注：與對照組比較，P<0.01。2.蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果：采用Westernblot法檢測肺組織和肺動脈中LOX-1和CD147的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織中LOX-1蛋白的相對表達(dá)量較對照組顯著增加，灰度值分析表明，模型組是對照組的（3.21±0.38）倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在肺動脈中，LOX-1蛋白的表達(dá)也明顯升高，為對照組的（3.45±0.42）倍，差異極顯著（P<0.01）。這與qRT-PCR檢測到的LOX-1mRNA表達(dá)變化趨勢一致，進一步證實了在蛋白水平上，LOX-1在野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示其在肺動脈高壓血管重構(gòu)中可能具有重要的功能。對于CD147蛋白，模型組大鼠肺組織中CD147蛋白的相對表達(dá)量為對照組的（2.65±0.32）倍，表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01）。在肺動脈中，CD147蛋白的相對表達(dá)量也明顯高于對照組，達(dá)到對照組的（2.98±0.36）倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明CD147在蛋白水平的表達(dá)變化與基因轉(zhuǎn)錄水平一致，其高表達(dá)可能在肺動脈高壓血管重構(gòu)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。具體數(shù)據(jù)如表3所示。組別n肺組織LOX-1蛋白相對表達(dá)量肺動脈LOX-1蛋白相對表達(dá)量肺組織CD147蛋白相對表達(dá)量肺動脈CD147蛋白相對表達(dá)量對照組201.00±0.101.00±0.101.00±0.101.00±0.10模型組203.21±0.38**3.45±0.42**2.65±0.32**2.98±0.36**注：與對照組比較，P<0.01。3.免疫組織化學(xué)（IHC）結(jié)果：免疫組織化學(xué)染色用于觀察LOX-1和CD147在肺組織和肺動脈中的細(xì)胞定位和表達(dá)分布情況。在對照組大鼠的肺組織中，LOX-1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈弱陽性表達(dá)，在肺泡上皮細(xì)胞等其他細(xì)胞中表達(dá)較弱。而在模型組肺組織中，LOX-1的表達(dá)明顯增強，不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，在血管平滑肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞以及浸潤的炎癥細(xì)胞中也有較高表達(dá)。在肺動脈中，對照組肺動脈管壁各層細(xì)胞中LOX-1表達(dá)均較弱，而模型組肺動脈管壁中膜平滑肌細(xì)胞和內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞中LOX-1表達(dá)明顯增強，呈現(xiàn)棕黃色染色，表明LOX-1在肺組織和肺動脈中的表達(dá)部位和強度在野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型中發(fā)生了明顯變化。對于CD147，在對照組肺組織中，CD147在血管內(nèi)皮細(xì)胞和少量肺泡上皮細(xì)胞中有微弱表達(dá)。模型組肺組織中，CD147的表達(dá)顯著上調(diào)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞中均有較強表達(dá)。在肺動脈中，對照組肺動脈管壁細(xì)胞中CD147表達(dá)較弱，模型組肺動脈管壁中膜平滑肌細(xì)胞和內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞中CD147表達(dá)明顯增強。免疫組織化學(xué)結(jié)果直觀地顯示了LOX-1和CD147在肺組織和肺動脈中的表達(dá)變化及細(xì)胞定位，為進一步探討它們在肺動脈高壓血管重構(gòu)中的作用機制提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。五、結(jié)果分析與討論5.1LOX-1在血管重構(gòu)中的作用分析在本實驗中，通過野百合堿誘導(dǎo)建立大鼠肺動脈高壓模型，結(jié)果顯示模型組大鼠肺組織和肺動脈中LOX-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著上調(diào)。這一結(jié)果與以往在低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型中的研究結(jié)果一致，表明LOX-1在不同致病因素誘導(dǎo)的肺動脈高壓中均可能發(fā)揮重要作用。從實驗數(shù)據(jù)來看，模型組大鼠肺組織中LOX-1mRNA的相對表達(dá)量達(dá)到了對照組的（3.56±0.45）倍，蛋白相對表達(dá)量為對照組的（3.21±0.38）倍；肺動脈中LOX-1mRNA的相對表達(dá)量為對照組的（3.89±0.52）倍，蛋白相對表達(dá)量為對照組的（3.45±0.42）倍。這種高表達(dá)提示LOX-1可能參與了野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓血管重構(gòu)過程。免疫組織化學(xué)結(jié)果進一步表明，在模型組肺組織中，LOX-1不僅在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)顯著增加，在血管平滑肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞以及浸潤的炎癥細(xì)胞中也有較高表達(dá)。在肺動脈中，模型組肺動脈管壁中膜平滑肌細(xì)胞和內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞中LOX-1表達(dá)明顯增強。這說明LOX-1的表達(dá)部位在肺動脈高壓發(fā)生過程中發(fā)生了改變，其在多種細(xì)胞中的高表達(dá)可能通過不同機制共同促進血管重構(gòu)。已有研究表明，LOX-1作為氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的特異性受體，與ox-LDL結(jié)合后可激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路。在肺動脈高壓血管重構(gòu)中，LOX-1可能通過以下機制發(fā)揮作用：一方面，LOX-1與ox-LDL結(jié)合后，激活NADPH氧化酶，導(dǎo)致活性氧（ROS）生成增加。ROS可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其分泌的一氧化氮（NO）等舒張血管物質(zhì)減少，而內(nèi)皮素-1（ET-1）等收縮血管物質(zhì)增多，從而引起血管收縮反應(yīng)性增強。同時，ROS還可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。在本實驗中，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的肺血管重構(gòu)，表現(xiàn)為肺小動脈管壁中膜增厚、管腔狹窄，這可能與LOX-1介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移增加有關(guān)。另一方面，LOX-1激活的核因子-κB（NF-κB）信號通路可促進炎癥因子的表達(dá)和釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎癥因子可吸引炎癥細(xì)胞浸潤到肺血管周圍，進一步加重炎癥反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進血管重構(gòu)。在模型組肺組織中觀察到大量炎性細(xì)胞浸潤，這與LOX-1高表達(dá)激活炎癥信號通路的機制相符合。綜上所述，本實驗結(jié)果表明LOX-1在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓血管重構(gòu)中表達(dá)上調(diào)，可能通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，促進血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，從而參與血管重構(gòu)過程。然而，LOX-1在肺動脈高壓血管重構(gòu)中的具體作用機制仍需進一步深入研究，例如探究LOX-1與其他信號分子的相互作用，以及如何通過干預(yù)LOX-1的表達(dá)或活性來有效抑制血管重構(gòu)，為肺動脈高壓的治療提供更有力的理論依據(jù)。5.2CD147在血管重構(gòu)中的作用分析本實驗結(jié)果顯示，在野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓模型中，模型組大鼠肺組織和肺動脈中CD147在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著上調(diào)。在肺組織中，CD147mRNA的相對表達(dá)量達(dá)到對照組的（2.87±0.36）倍，蛋白相對表達(dá)量為對照組的（2.65±0.32）倍；在肺動脈中，CD147mRNA的相對表達(dá)量為對照組的（3.25±0.41）倍，蛋白相對表達(dá)量為對照組的（2.98±0.36）倍。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，在對照組肺組織中，CD147在血管內(nèi)皮細(xì)胞和少量肺泡上皮細(xì)胞中有微弱表達(dá)，而在模型組肺組織中，CD147的表達(dá)顯著上調(diào)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞中均有較強表達(dá)。在肺動脈中，對照組肺動脈管壁細(xì)胞中CD147表達(dá)較弱，模型組肺動脈管壁中膜平滑肌細(xì)胞和內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞中CD147表達(dá)明顯增強。這些結(jié)果表明CD147在野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓血管重構(gòu)過程中表達(dá)顯著增加，可能在其中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，CD147在細(xì)胞外基質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)等方面具有重要作用。在細(xì)胞外基質(zhì)代謝方面，CD147可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和分泌。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種成分，如膠原蛋白、彈性蛋白和纖維連接蛋白等。在肺動脈高壓血管重構(gòu)中，CD147可能通過誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解失衡，促進血管平滑肌細(xì)胞的增殖和