AR-2基因沉默：解鎖食管癌EC109細胞增殖與侵襲轉移奧秘一、引言1.1研究背景與意義食管癌作為消化系統常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類健康。據統計，我國是食管癌高發區，每年新增病例眾多，且大部分患者確診時已處于晚期。盡管手術、放療和化療等治療手段在不斷進步，但食管癌患者的5年總體生存率仍低于20%，預后情況不容樂觀。食管癌細胞的增殖、轉移是影響患者療效和預后的關鍵因素，深入探究其分子機制對于尋找新的治療策略至關重要。在眾多相關研究中，基因層面的探索成為熱點，其中AR-2基因逐漸進入研究者的視野。AR-2基因可能在食管癌的發生、發展過程中扮演重要角色，對其進行深入研究，尤其是關于AR-2基因沉默對食管癌細胞的影響，有望揭示食管癌發病的新機制。從臨床應用角度來看，目前食管癌的治療面臨諸多困境，如耐藥性、高復發率等。若能明確AR-2基因沉默對食管癌細胞增殖及侵襲轉移的影響，或許可以為食管癌的治療提供新的靶點和思路。這不僅有助于開發更有效的靶向治療藥物，提高治療的精準性和有效性，還可能改善患者的生存質量，延長患者的生存期，具有重要的臨床價值和社會意義。1.2國內外研究現狀在國外，對于AR-2基因的研究主要集中在其與神經肌肉疾病的關聯上。如脊髓延髓肌萎縮癥（SBMA），又稱X-連鎖脊髓延髓肌萎縮癥或肯尼迪氏癥，研究發現染色體Xq11-12上的雄激素受體（AR）基因的1號外顯子中編碼谷氨酰胺（PolyQ）的CAG三聯體重復的不穩定擴增會引發該疾病。LimWF等人通過RNA測序，在SBMA患者干細胞分化形成的運動神經元中，發現了特殊的轉錄本AR2，且系統性注射AAV-AR45可改善SBMA小鼠的病理特征及行為學表現，且無明顯細胞毒性。但在腫瘤領域，尤其是食管癌方面，國外針對AR-2基因的研究較為匱乏。國內對于食管癌的研究相對廣泛，涵蓋了發病機制、診斷及治療等多個方面。在發病機制上，研究發現腫瘤干細胞、病毒和細菌感染、表觀遺傳、基因突變以及不良生活方式等都與食管癌的發生發展相關。在細胞實驗方面，對食管癌細胞系如EC-1和EC-109的研究較多。其中，EC-109細胞系因其染色體核型相對穩定等特點，常被用于食管癌相關的分子機制研究。有研究通過阻斷Hedgehog信號通路來觀察其對人食管癌EC109細胞轉移的影響，發現該信號通路對EC109細胞具有重要的促進作用和刺激細胞轉移的作用，阻斷該通路可能是治療EC109細胞轉移的新途徑；還有研究探究了葉黃素對食管癌Ec-109細胞的體外作用，發現葉黃素在一定濃度范圍內可抑制Ec-109細胞的增殖、導致明顯凋亡，并使細胞周期阻滯在G0/G1期。然而，目前國內關于AR-2基因在食管癌中的研究尚處于起步階段，對于AR-2基因沉默如何影響食管癌EC109細胞的增殖及侵襲轉移，尚未有系統且深入的研究報道。綜上所述，當前國內外對于AR-2基因在食管癌領域的研究存在明顯的不足與空白。雖然對食管癌的整體研究取得了一定成果，但AR-2基因與食管癌之間的關系尚未被充分挖掘，尤其是AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞生物學行為的影響，亟待進一步探索，這也為本研究提供了明確的方向和重要的研究價值。1.3研究目的與內容本研究旨在深入探究AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞增殖及侵襲轉移的影響，并初步探討其潛在的作用機制。具體研究內容如下：構建AR-2基因沉默的食管癌EC109細胞模型：運用RNA干擾技術，設計并合成針對AR-2基因的小干擾RNA（siRNA），通過脂質體轉染法將其導入食管癌EC109細胞中，篩選出穩定轉染的細胞株，利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測AR-2基因在mRNA和蛋白質水平的表達，驗證基因沉默效果，確保構建出可靠的AR-2基因沉默細胞模型，為后續實驗奠定基礎。檢測AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞增殖的影響：采用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法，在不同時間點（如24h、48h、72h）檢測對照組和AR-2基因沉默組EC109細胞的增殖活性，繪制細胞生長曲線，直觀呈現細胞增殖情況；通過5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實驗，觀察細胞DNA合成情況，進一步明確AR-2基因沉默對細胞增殖的影響；利用平板克隆形成實驗，統計克隆形成數目，評估細胞的長期增殖能力，全面分析AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞增殖能力的作用。檢測AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞侵襲轉移的影響：運用Transwell小室實驗，在上室接種對照組和AR-2基因沉默組EC109細胞，下室加入趨化因子，培養一定時間后，固定并染色遷移到下室的細胞，計數細胞數目，評估細胞的遷移能力；在Transwell小室中鋪基質膠，進行侵襲實驗，同樣計數穿過基質膠的細胞數目，判斷細胞的侵襲能力；采用劃痕愈合實驗，在細胞單層上制造劃痕，觀察并測量不同時間點劃痕愈合情況，從動態角度分析AR-2基因沉默對細胞遷移能力的影響，綜合評估AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞侵襲轉移能力的作用。探討AR-2基因沉默影響食管癌EC109細胞增殖及侵襲轉移的潛在機制：利用RT-qPCR和Westernblot技術，檢測與細胞增殖、侵襲轉移相關的信號通路關鍵分子（如PI3K/AKT、MAPK等信號通路中的蛋白）的mRNA和蛋白質表達水平，分析AR-2基因沉默后這些信號通路的激活或抑制情況；通過免疫熒光染色技術，觀察相關蛋白在細胞內的定位和表達變化，進一步探究其作用機制；若有必要，使用信號通路抑制劑或激活劑處理細胞，驗證信號通路在AR-2基因沉默影響細胞增殖及侵襲轉移過程中的作用，深入揭示AR-2基因沉默影響食管癌EC109細胞生物學行為的潛在分子機制。1.4研究方法與技術路線RNA干擾技術：根據AR-2基因的mRNA序列，運用生物信息學軟件，如NCBI的BLAST工具，設計3-5條特異性的小干擾RNA（siRNA）序列。為確保序列的有效性和特異性，將設計好的siRNA序列與人類基因組數據庫進行比對，排除與其他基因有高度同源性的序列。隨后，通過化學合成的方法獲得這些siRNA，并使用無內毒素的核酸純化試劑盒進行純化，以保證其質量和純度。利用脂質體轉染試劑，按照產品說明書的操作步驟，將siRNA轉染至食管癌EC109細胞中。轉染時，設置陰性對照組（轉染非特異性siRNA）和空白對照組（未轉染任何siRNA），以準確評估AR-2基因沉默的效果。轉染后48-72小時，收集細胞，用于后續的基因和蛋白表達檢測。細胞實驗：采用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法檢測細胞增殖活性。將對照組和AR-2基因沉默組的EC109細胞以相同密度接種于96孔板中，每組設置5-6個復孔。在培養的不同時間點（24h、48h、72h），向每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續孵育1-4小時。然后，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），以OD值表示細胞增殖活性，繪制細胞生長曲線。通過5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實驗進一步驗證細胞增殖情況。將細胞接種于24孔板中，待細胞貼壁后，按照EdU試劑盒的操作說明，加入EdU工作液孵育2-4小時。隨后，進行細胞固定、通透和染色等步驟，最后在熒光顯微鏡下觀察并計數EdU陽性細胞（即正在進行DNA合成的細胞），計算EdU陽性細胞率，以此反映細胞的增殖能力。利用平板克隆形成實驗評估細胞的長期增殖能力。將細胞以低密度（如200-500個/孔）接種于6孔板中，每組設置3-4個復孔。培養10-14天后，用PBS輕輕洗滌細胞，然后用甲醇固定15-20分鐘，再用結晶紫染色10-15分鐘。最后，用清水沖洗掉多余的染料，晾干后在顯微鏡下觀察并計數克隆形成數目（克隆定義為含有50個以上細胞的細胞團），計算克隆形成率。運用Transwell小室實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。遷移實驗時，在上室加入無血清培養基重懸的對照組和AR-2基因沉默組EC109細胞，下室加入含有10%胎牛血清的培養基作為趨化因子。培養24-48小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將小室進行固定、染色，在顯微鏡下隨機選取5-10個視野，計數遷移到下室的細胞數目，以此評估細胞的遷移能力。侵襲實驗時，在Transwell小室的上室預先鋪上一層基質膠，待基質膠凝固后，按照遷移實驗的方法接種細胞并進行后續操作，計數穿過基質膠的細胞數目，判斷細胞的侵襲能力。采用劃痕愈合實驗動態觀察細胞遷移能力。將細胞接種于6孔板中，待細胞長滿單層后，用200μl移液器槍頭在細胞單層上垂直劃一道均勻的劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞，去除劃下的細胞，然后加入含1%胎牛血清的培養基繼續培養。在劃痕后的0h、24h、48h等時間點，在顯微鏡下觀察并拍照記錄劃痕愈合情況，使用圖像分析軟件測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率，以評估細胞的遷移能力。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）：使用TRIzol試劑提取對照組和AR-2基因沉默組EC109細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒的操作步驟，將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，根據AR-2基因及內參基因（如GAPDH）的序列設計特異性引物，使用SYBRGreen熒光染料法進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系和反應條件按照熒光定量PCR試劑盒的說明書進行設置。擴增結束后，通過分析Ct值（循環閾值），采用2^(-ΔΔCt)法計算AR-2基因在mRNA水平的相對表達量，以評估基因沉默效果以及檢測相關信號通路關鍵分子的mRNA表達變化。蛋白質免疫印跡法（Westernblot）：收集對照組和AR-2基因沉默組EC109細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，然后加入一抗（針對AR-2蛋白及相關信號通路關鍵蛋白的抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學發光底物顯色，在化學發光成像系統下曝光、拍照，通過分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，評估AR-2蛋白及相關信號通路關鍵蛋白的表達變化。免疫熒光染色技術：將對照組和AR-2基因沉默組EC109細胞接種于預先放置有蓋玻片的24孔板中，待細胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定細胞15-20分鐘，然后用0.1%TritonX-100通透細胞10-15分鐘。用5%BSA封閉細胞1-2小時，加入一抗（針對相關蛋白的抗體），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，然后加入熒光標記的二抗，室溫避光孵育1-2小時。再次用PBS洗滌細胞3次，每次5分鐘，用DAPI染核5-10分鐘，最后用抗熒光淬滅封片劑封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析相關蛋白在細胞內的定位和表達變化情況。技術路線圖如下：@startumlstart:獲取食管癌EC109細胞;:設計并合成AR-2基因的siRNA;:脂質體轉染siRNA至EC109細胞;if(篩選穩定轉染細胞株)then(是):RT-qPCR和Westernblot檢測AR-2基因沉默效果;if(基因沉默成功)then(是):進行細胞增殖實驗（CCK-8法、EdU摻入實驗、平板克隆形成實驗）;:進行細胞侵襲轉移實驗（Transwell小室實驗、劃痕愈合實驗）;:RT-qPCR和Westernblot檢測相關信號通路關鍵分子表達;:免疫熒光染色觀察相關蛋白定位和表達變化;if(必要時)then(是):使用信號通路抑制劑或激活劑處理細胞;:重復上述實驗驗證信號通路作用;endif:分析實驗結果，撰寫論文;else(否):重新設計siRNA或優化轉染條件;:返回脂質體轉染siRNA至EC109細胞;endifelse(否):重新篩選穩定轉染細胞株;:返回篩選穩定轉染細胞株;endifstop@enduml二、相關理論基礎2.1食管癌概述食管癌是一種原發于食管的惡性腫瘤，以鱗狀上皮癌較為多見。其發病機制復雜，涉及多個基因和信號通路的異常改變。在我國，食管癌的發病率和死亡率均處于較高水平，嚴重威脅著人們的生命健康。從流行病學特征來看，食管癌的發病具有明顯的地區分布差異。在我國，太行山脈沿線地區，如河南、河北、山西等地，是食管癌的高發區域，其發病率顯著高于其他地區。同時，男性的發病率普遍高于女性，男女比例約為1.3-2.7:1。發病年齡多集中在40歲以上，隨著年齡的增長，發病率呈逐漸上升趨勢，其中60-64歲年齡組的發病率最高。食管癌的發病與多種因素密切相關，吸煙和重度飲酒是食管鱗癌的重要致病因素，長期食用過熱、過硬、腌制等刺激性食物，以及缺乏某些維生素和微量元素，也可能增加食管癌的發病風險。早期食管癌癥狀通常不明顯，患者可能僅在吞咽粗硬食物時偶有不適，如胸骨后出現燒灼樣、針刺樣或牽拉摩擦樣疼痛，食物通過時感覺緩慢，并有停滯感或異物感，這些癥狀可能會通過吞咽水后緩解消失，容易被患者忽視。中晚期食管癌的典型癥狀為進行性吞咽困難，患者先是難以咽下固體食物，隨后半流質食物也逐漸難以吞咽，最后甚至連液體也無法咽下。此外，患者還可能伴有消瘦、乏力、貧血等全身癥狀，以及聲音嘶啞、嗆咳等因腫瘤侵犯周圍組織和器官而引起的癥狀。目前，食管癌的診斷方法主要包括食管鋇餐造影、胃鏡檢查、病理活檢、CT掃描、MRI檢查和PET-CT檢查等。食管鋇餐造影可觀察食管的形態、輪廓、蠕動情況以及有無充盈缺損、龕影等異常表現，對于早期食管癌的診斷有一定幫助，但對于微小病變的檢測敏感度相對較低；胃鏡檢查能直接觀察食管黏膜的病變情況，并可在直視下取組織進行病理活檢，病理活檢是診斷食管癌的金標準，通過對活檢組織進行病理學分析，可明確腫瘤的類型、分化程度等信息，為后續治療提供重要依據；CT掃描和MRI檢查有助于了解腫瘤的大小、位置、侵犯范圍以及與周圍組織器官的關系，對于判斷腫瘤的分期和制定治療方案具有重要價值；PET-CT檢查則可用于檢測全身是否存在轉移病灶，提高對腫瘤轉移的診斷準確性。食管癌的治療手段主要有手術治療、放射治療、化學治療、靶向治療和免疫治療。手術治療是早期食管癌的首選治療方法，通過切除腫瘤組織，有望達到根治的目的，對于腫瘤局限于食管黏膜層或黏膜下層，無淋巴結轉移的患者，手術切除后的5年生存率相對較高。放射治療利用高能射線殺死腫瘤細胞，可分為外照射和內照射兩種方式，對于不能手術或拒絕手術的患者，放療是一種重要的治療選擇；對于局部晚期食管癌患者，同步放化療可提高治療效果，延長患者生存期?；瘜W治療使用化學藥物抑制腫瘤細胞的增殖和生長，常用的化療藥物有順鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇等，化療可作為手術前后的輔助治療，也可用于晚期食管癌的姑息治療，以緩解癥狀、延長生存期。靶向治療針對腫瘤細胞表面的特定分子靶點，使用靶向藥物阻斷腫瘤細胞的生長和轉移信號通路，具有特異性強、副作用相對較小的優點，如針對人表皮生長因子受體2（HER-2）過表達的食管癌患者，可使用曲妥珠單抗等靶向藥物進行治療。免疫治療通過激活患者自身的免疫系統來攻擊腫瘤細胞，如程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑和程序性死亡配體1（PD-L1）抑制劑等，已在部分食管癌患者中顯示出較好的療效，為食管癌的治療帶來了新的希望。在實際治療中，醫生會根據患者的病情、身體狀況等因素，綜合運用多種治療手段，制定個性化的治療方案，以提高治療效果和患者的生存質量。2.2AR-2基因相關理論AR-2基因是雄激素受體（AR）基因的一種特殊轉錄本。AR基因位于染色體Xq11-12上，其編碼的雄激素受體屬于核受體超家族成員，在細胞的生理功能調節中發揮著重要作用。AR基因具有復雜的結構，包含多個外顯子和內含子，通過不同的轉錄和剪接方式，可以產生多種轉錄本，AR-2便是其中之一。在正常細胞中，AR-2基因可能參與細胞生長、分化和代謝等生理過程的調節。在雄激素響應的組織中，如前列腺、精囊等，AR-2基因表達相對較高，可能與這些組織的正常發育和功能維持密切相關。在前列腺細胞中，AR-2可能通過與雄激素結合，調控一系列基因的表達，從而影響細胞的增殖、分化和凋亡，維持前列腺組織的正常生理功能。然而，在腫瘤細胞中，AR-2基因的作用機制可能發生改變。已有研究表明，某些腫瘤的發生發展與AR-2基因的異常表達或功能失調有關。在前列腺癌中，AR-2基因的表達水平和活性變化可能影響癌細胞的增殖和侵襲能力。當AR-2基因異常激活時，可能通過與其他信號通路相互作用，促進癌細胞的生長和轉移。AR-2可能激活PI3K/AKT信號通路，增強癌細胞的存活和增殖能力；也可能調節上皮-間質轉化（EMT）相關蛋白的表達，促進癌細胞的侵襲和轉移。對于食管癌而言，雖然目前關于AR-2基因的研究較少，但從腫瘤發生發展的共性機制推測，AR-2基因可能在食管癌的發生發展過程中扮演重要角色。食管癌的發生涉及多個基因和信號通路的異常改變，AR-2基因可能通過影響食管癌細胞的增殖、侵襲轉移等生物學行為，參與食管癌的發病過程。它可能通過調節細胞周期相關蛋白的表達，影響食管癌細胞的增殖速度；也可能通過調控細胞外基質降解酶的活性，影響癌細胞的侵襲能力。因此，深入研究AR-2基因在食管癌中的作用機制，對于揭示食管癌的發病機制、尋找新的治療靶點具有重要意義。2.3基因沉默技術基因沉默是指生物體中特定基因由于種種原因不表達或者表達量極低的現象，它在生物的生長發育、疾病發生以及應對外界環境變化等過程中發揮著重要的調控作用。根據作用機制和發生水平的不同，基因沉默主要分為轉錄水平的基因沉默（TGS）和轉錄后水平的基因沉默（PTGS）。轉錄水平的基因沉默主要是由于DNA甲基化、染色質結構改變等原因，使得基因無法正常轉錄形成mRNA，這種沉默可以通過有性世代傳遞，表現為減數分裂的可遺傳性；轉錄后水平的基因沉默則是在mRNA轉錄形成之后，通過核酸序列特異性的降解機制，使得mRNA無法正常翻譯為蛋白質，從而實現對基因表達的調控。在眾多基因沉默技術中，RNA干擾（RNAi）技術是目前研究和應用最為廣泛的一種。RNAi是一種在動植物中廣泛存在的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發的、同源mRNA特異性沉默的過程，其作用機制主要包括以下幾個階段：在起始階段，細胞內由RNA病毒入侵、轉座子轉錄、基因組中反向重復序列轉錄等所產生的dsRNA分子，會被一種雙鏈RNA酶Ⅲ型內切酶（也叫Dicer酶或Dicer核酸酶同源物）剪切成21-23nt的小干擾RNA（siRNA），這些siRNA的3'端帶有2個堿基突出的黏性末端，5'為磷酸基團，這種特殊結構對于siRNA行使其功能非常關鍵，且剪切位點一般在U處，具有特異性；進入效應階段，RNAi特異性的核酸外切酶、核酸內切酶、解旋酶、輔助識別同源序列蛋白和其他一些蛋白會與siRNA結合，形成RNA誘導沉默復合體（RISC），RISC識別靶mRNA，其中的反義鏈與靶mRNA互補結合，正義鏈則被置換出來，繼而，RISC復合物中的RNase（可能是Dicer）在靶mRNA與siRNA結合區域的中間將其切斷；在級聯放大階段，在RNA依賴性RNA聚合酶的作用下，以mRNA為模板，siRNA為引物，擴增產生足夠數量的dsRNA作為底物提供給Dicer酶，產生更多的siRNA，從而使效應階段反復發生，一個完整的mRNA被降解成多個21-23nt的小片段，導致相應的基因表達沉默。整個過程中的多個步驟都需要ATP，如RISC復合體的形成、siRNA與靶mRNA的配對、靶mRNA的切割，另外，在dsRNA復制過程中，兩條鏈的分離可能也需要一個依賴ATP的RNA解旋酶。RNAi技術具有諸多顯著特點和優勢。首先是高特異性，它是轉錄后水平的基因沉默機制，有高度的序列特異性，19nt的dsRNA幾乎可以完全抑制基因的表達，而其中只要有1nt突變，它對基因的抑制作用就會消失，這種高度的序列特異性能夠使dsRNA非常特異地誘導與之序列同源的mRNA降解，避免降解與目的mRNA同家族的其他mRNA，從而實現對目的基因的精確沉默。其次是高效性，RNAi存在級聯放大效應，由于Dicer酶切產生的siRNA與同源mRNA的結合并降解后者，會產生新的siRNA，新產生的siRNA可再次與Dicer酶形成RISC復合體，介導新一輪的同源mRNA降解的多次利用，如此循環，使相對很少量的dsRNA分子（數量遠遠少于內源mRNA的數量）就能產生強烈的RNAi效應，每個細胞僅需幾分子siRNA就可產生RNAi效應，并且能達到缺失突變體表型的程度，相比普通的siRNA，具有短發卡結構的雙鏈RNA產生的RNAi效應更強。此外，RNAi技術還具有操作相對簡單、投入少、周期短等優點，這些優勢使得它成為分子生物學研究中強有力的工具。在腫瘤研究領域，RNAi技術展現出了廣闊的應用前景和獨特的優勢。它可以用于抑制腫瘤抗凋亡基因，許多腫瘤細胞之所以能夠逃避機體的免疫監視和治療攻擊，是因為其抗凋亡基因過度表達，通過RNAi技術特異性地沉默這些抗凋亡基因，能夠促進腫瘤細胞凋亡，從而達到治療腫瘤的目的；RNAi技術還能沉默癌基因，原癌基因的激活是腫瘤發生的重要原因之一，利用RNAi技術降低癌基因的表達水平，有望阻斷腫瘤細胞的異常增殖信號通路，抑制腫瘤的生長；在調控細胞周期方面，腫瘤細胞的一個顯著特征是細胞周期紊亂，RNAi可以通過靶向調控細胞周期相關基因，使腫瘤細胞的細胞周期恢復正常，抑制其無限增殖；腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管的形成，RNAi技術能夠通過抗血管生成，沉默血管內皮生長因子等相關基因，抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養供應，從而抑制腫瘤的生長和轉移；此外，RNAi技術還可以增強腫瘤細胞對放化療的敏感性，通過沉默某些耐藥相關基因，克服腫瘤細胞的耐藥性，提高放化療的治療效果；同時，它也是研究腫瘤相關基因功能的重要手段，通過對特定基因進行沉默，觀察腫瘤細胞生物學行為的變化，有助于深入了解腫瘤的發生發展機制，為腫瘤的治療提供新的靶點和策略。與其他基因沉默方法相比，RNAi技術具有獨特的優勢?；瘜W沉默是通過特定的化學抑制劑或藥物作用于細胞，干擾基因的表達或轉錄過程來實現基因沉默，常用的化學沉默藥物包括DNA甲基化抑制劑、組蛋白去乙?；敢种苿┑?，這類方法雖然可以通過口服或注射給藥，直接作用于患者體液或組織，但對于作用機制和藥物劑量要求較高，且可能存在較大的副作用?；蚯贸夹g通過同源重組或CRISPR-Cas9等手段，將目標基因進行部分或完全敲除，該技術具有較高的特異性和可操作性，但需要設計特異性的核酸酶，技術難度較大，成本較高，且存在一定的細胞毒性風險，同時基因敲除是永久的、不可逆轉的改變基因，而RNAi技術可以實現暫時性的、可逆轉的基因沉默，更便于研究基因在不同階段的功能。綜上所述，RNAi技術憑借其高特異性、高效性、操作相對簡便等優勢，在腫瘤研究中具有重要的應用價值，為本研究探究AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞的影響提供了有力的技術支持。三、實驗設計與方法3.1實驗材料細胞系：人食管癌EC109細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，該細胞具有上皮細胞樣形態，在RPMI-1640培養基中能夠良好生長，常用于食管癌相關的細胞實驗研究，為探究AR-2基因沉默對食管癌生物學行為的影響提供了穩定的細胞模型。主要試劑：RPMI-1640培養基（GIBCO公司，貨號31800022），含有多種細胞生長所需的營養成分，如氨基酸、維生素、糖類等，為EC109細胞的生長和增殖提供適宜的環境；優質胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司），富含多種生長因子和營養物質，能有效促進細胞的生長和存活，在本實驗中用于補充培養基的營養成分，維持細胞的正常生理功能；0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液（北京索萊寶科技有限公司），胰蛋白酶能夠特異性地切割蛋白質中的肽鍵，EDTA則可以螯合細胞外的鈣離子和鎂離子，破壞細胞間的連接，二者協同作用，可使貼壁生長的EC109細胞從培養瓶壁上脫離下來，便于進行細胞傳代和實驗操作；細胞計數試劑盒-8（CCK-8，日本同仁化學研究所），其主要成分WST-8在活細胞線粒體中的脫氫酶作用下，可被還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物，生成的甲瓚物數量與活細胞數量成正比，通過檢測450nm處的吸光度值，能夠準確地反映細胞的增殖活性；5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）細胞增殖檢測試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司），EdU能夠在細胞DNA合成期摻入到新合成的DNA中，通過熒光標記的疊氮化物與EdU發生點擊化學反應，在熒光顯微鏡下可以直觀地觀察并計數正在進行DNA合成的細胞，從而準確地評估細胞的增殖能力；Transwell小室（Corning公司，孔徑8.0μm），由上室和下室組成，上室用于接種細胞，下室加入趨化因子，細胞可通過小室的微孔從上層遷移到下層，通過計數遷移到下室的細胞數目，能夠評估細胞的遷移能力，在小室上室預先鋪上基質膠后，可用于檢測細胞的侵襲能力；Matrigel基質膠（BD公司），主要成分包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、巢蛋白和硫酸肝素蛋白多糖等，模擬了體內細胞外基質的成分和結構，在細胞侵襲實驗中，鋪有Matrigel基質膠的Transwell小室能夠更真實地反映細胞在體內穿透基底膜的能力；TRIzol試劑（Invitrogen公司），是一種新型總RNA抽提試劑，能快速裂解細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶，保證RNA的完整性，可有效提取細胞中的總RNA，用于后續的RT-qPCR實驗；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司），包含逆轉錄酶、引物、dNTP等成分，能夠以提取的總RNA為模板，通過逆轉錄反應合成cDNA，為后續的PCR擴增提供模板；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（Roche公司），利用SYBRGreen染料能與雙鏈DNA特異性結合的特性，在PCR擴增過程中，隨著雙鏈DNA的合成，SYBRGreen染料不斷嵌入雙鏈DNA中，其熒光信號強度與擴增的DNA量成正比，通過實時監測熒光信號的變化，能夠準確地定量目的基因的表達水平；兔抗人AR-2多克隆抗體（Proteintech公司），具有高特異性和親和力，能夠特異性地識別并結合人AR-2蛋白，在Westernblot和免疫熒光染色實驗中，用于檢測AR-2蛋白的表達水平和細胞內定位；羊抗兔IgG-HRP二抗（武漢博士德生物工程有限公司），與兔抗人AR-2多克隆抗體特異性結合，其攜帶的辣根過氧化物酶（HRP）在化學發光底物的作用下，能夠催化底物發光，通過檢測發光強度，能夠間接反映一抗與抗原結合的情況，從而實現對目的蛋白的定量檢測；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術有限公司），基于BCA與二價銅離子在堿性條件下形成紫色絡合物的原理，通過與標準蛋白曲線對比，能夠準確地測定細胞裂解液中蛋白質的濃度，為后續的Westernblot實驗提供準確的蛋白上樣量參考；DAPI染液（Sigma公司），能夠與雙鏈DNA的小溝結合，在紫外線激發下發出藍色熒光，常用于細胞核染色，在免疫熒光染色實驗中，可用于標記細胞核，以便更清晰地觀察相關蛋白在細胞內的定位。儀器設備：二氧化碳培養箱（ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制箱內的溫度、濕度和二氧化碳濃度，為細胞培養提供穩定的環境，其中溫度控制在37℃，濕度保持在70%-80%，二氧化碳濃度為5%，滿足EC109細胞的生長需求；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），通過高效空氣過濾器過濾空氣，提供一個無菌的操作環境，有效防止微生物污染，確保實驗操作的準確性和可靠性；倒置顯微鏡（Olympus公司），可用于觀察細胞的形態、生長狀態和貼壁情況，在細胞傳代、轉染等實驗操作中，能夠實時監測細胞的變化；酶標儀（Bio-Rad公司），能夠精確測量96孔板中各孔的吸光度值，在CCK-8實驗中，通過檢測450nm波長處的吸光度，定量分析細胞的增殖活性；高速冷凍離心機（Eppendorf公司），最高轉速可達15000rpm，能夠在低溫條件下對細胞裂解液、核酸等樣品進行快速離心分離，如在提取RNA和蛋白質的實驗中，可用于沉淀細胞碎片和雜質，獲取純凈的樣品；實時熒光定量PCR儀（ABI公司），具有高靈敏度和準確性，能夠實時監測PCR擴增過程中熒光信號的變化，精確地定量目的基因的表達水平；電泳儀（Bio-Rad公司），提供穩定的電場，使DNA或蛋白質在凝膠中根據其大小和電荷差異進行分離，是Westernblot和RT-qPCR實驗中不可或缺的設備；化學發光成像系統（Tanon公司），能夠檢測化學發光信號，在Westernblot實驗中，通過檢測辣根過氧化物酶催化底物產生的化學發光，對目的蛋白進行成像和定量分析；熒光顯微鏡（Nikon公司），配備有不同波長的激發光源和熒光濾光片，能夠觀察細胞內熒光標記的物質，在EdU摻入實驗和免疫熒光染色實驗中，用于觀察和拍照，分析細胞的增殖情況和相關蛋白的定位。3.2實驗方法3.2.1細胞培養將人食管癌EC109細胞從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，不斷搖晃使其在1-2分鐘內快速解凍。將解凍后的細胞懸液轉移至含有5mL完全培養基（90%RPMI-1640培養基+10%優質胎牛血清）的15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用5mL完全培養基重懸細胞沉淀，吹打均勻后轉移至T25培養瓶中，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。在細胞培養過程中，每天使用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀態，包括細胞的形態、密度、貼壁情況等。當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養。傳代時，先用PBS潤洗細胞1-2次，以去除殘留的培養基和雜質，然后加入2mL0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養瓶置于37℃培養箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察，當細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲培養瓶使細胞完全脫落，加入5mL完全培養基終止消化。用移液器將細胞懸液輕輕吹打均勻，轉移至15mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量的完全培養基重懸細胞，按照1:2-1:5的比例將細胞接種到新的培養瓶中，補充適量的完全培養基，繼續在37℃、5%CO?的培養箱中培養。3.2.2AR-2基因沉默載體的構建與轉染根據GenBank中AR-2基因的mRNA序列（登錄號：NM_XXXXXX），運用RNAi設計軟件（如siDirect2.0等），設計3條針對AR-2基因的短發夾RNA（shRNA）序列，同時設計一條非特異性的陰性對照shRNA序列。將設計好的shRNA序列交由生物公司合成，合成后的shRNA序列兩端分別帶有BamHI和HindIII酶切位點。用限制性內切酶BamHI和HindIII對pGPU6/GFP/Neo載體進行雙酶切，37℃酶切反應3-4小時，酶切結束后，通過瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物，使用膠回收試劑盒回收線性化的載體片段。將合成的shRNA序列與線性化的pGPU6/GFP/Neo載體進行連接反應，連接體系中包含10×T4DNA連接酶緩沖液、T4DNA連接酶、線性化載體片段和shRNA序列，16℃連接過夜。連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，將轉化后的感受態細胞均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養基平板上，37℃培養箱中倒置培養12-16小時。挑取平板上長出的單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃、200rpm振蕩培養12-16小時。使用質粒小提試劑盒提取質粒，通過雙酶切鑒定和測序驗證重組質粒的正確性，將構建成功的重組質粒命名為pGPU6/GFP/Neo-shAR-2。將處于對數生長期的食管癌EC109細胞接種于6孔板中，每孔接種2×10?個細胞，加入2mL完全培養基，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養24小時，使細胞貼壁。按照脂質體轉染試劑說明書的操作步驟進行轉染，在無菌EP管中分別加入2μg的pGPU6/GFP/Neo-shAR-2重組質粒（實驗組）或pGPU6/GFP/Neo陰性對照質粒（對照組）和100μL無血清的RPMI-1640培養基，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘；另取一支無菌EP管，加入5μL脂質體轉染試劑和100μL無血清的RPMI-1640培養基，輕輕混勻，室溫靜置5分鐘。將上述兩支EP管中的液體混合，輕輕混勻，室溫靜置20分鐘，形成DNA-脂質體復合物。將6孔板中的培養基吸出，用PBS輕輕潤洗細胞1-2次，每孔加入800μL無血清的RPMI-1640培養基，然后將DNA-脂質體復合物逐滴加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養4-6小時。4-6小時后，吸出培養基，每孔加入2mL完全培養基，繼續培養48-72小時。轉染48-72小時后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，評估轉染效率。隨后，向培養基中加入終濃度為800μg/mL的G418篩選抗生素，進行穩定轉染細胞株的篩選。每2-3天更換一次含有G418的篩選培養基，持續篩選2-3周，直至未轉染的細胞全部死亡，存活下來的細胞即為穩定轉染的細胞克隆。挑取單克隆細胞，接種到24孔板中進行擴大培養，培養至細胞密度達到80%-90%時，將細胞轉移至6孔板中繼續培養，待細胞長滿后，轉移至T25培養瓶中培養，獲得穩定轉染的食管癌EC109細胞株，分別命名為EC109-shAR-2（實驗組穩定轉染細胞株）和EC109-NC（對照組穩定轉染細胞株）。3.2.3檢測指標與方法AR-2基因沉默效果檢測：采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測AR-2基因在mRNA和蛋白質水平的表達。使用TRIzol試劑提取EC109-shAR-2、EC109-NC和未轉染的EC109細胞（空白對照組）的總RNA，按照逆轉錄試劑盒的操作步驟，將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，根據AR-2基因及內參基因GAPDH的序列設計特異性引物，引物序列如下：AR-2上游引物5'-XXXXX-3'，下游引物5'-XXXXX-3'；GAPDH上游引物5'-XXXXX-3'，下游引物5'-XXXXX-3'。使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進行擴增，反應體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μM）、0.5μL下游引物（10μM）、2μLcDNA模板和7μLddH?O。反應條件為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環，每個循環包括95℃變性5秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒。擴增結束后，通過分析Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計算AR-2基因在mRNA水平的相對表達量，以評估基因沉默效果。收集上述三組細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。取適量變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，然后加入兔抗人AR-2多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入羊抗兔IgG-HRP二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學發光底物顯色，在化學發光成像系統下曝光、拍照，通過分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，評估AR-2蛋白的表達變化。細胞增殖能力檢測：采用細胞計數試劑盒-8（CCK-8）法檢測細胞增殖活性。將EC109-shAR-2、EC109-NC和空白對照組的EC109細胞以每孔3000個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔，加入100μL完全培養基，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。在培養的0h、24h、48h、72h時間點，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續孵育2小時。然后，使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），以OD值表示細胞增殖活性，繪制細胞生長曲線。通過5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實驗進一步驗證細胞增殖情況。將細胞接種于24孔板中，待細胞貼壁后，按照EdU試劑盒的操作說明，加入EdU工作液（終濃度為10μM）孵育2小時。隨后，用4%多聚甲醛固定細胞15分鐘，0.5%TritonX-100通透細胞10分鐘，然后加入1×Apollo染色反應液，室溫避光孵育30分鐘。用1×Hoechst33342染色液染核10分鐘，最后在熒光顯微鏡下觀察并計數EdU陽性細胞（即正在進行DNA合成的細胞），計算EdU陽性細胞率，以此反映細胞的增殖能力。利用平板克隆形成實驗評估細胞的長期增殖能力。將細胞以每孔200個細胞的密度接種于6孔板中，每組設置3個復孔，加入2mL完全培養基，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養10-14天。期間每3-4天更換一次培養基，待克隆形成后，用PBS輕輕洗滌細胞，然后用甲醇固定15分鐘，再用結晶紫染色15分鐘。最后，用清水沖洗掉多余的染料，晾干后在顯微鏡下觀察并計數克隆形成數目（克隆定義為含有50個以上細胞的細胞團），計算克隆形成率。細胞侵襲轉移能力檢測：運用Transwell小室實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。遷移實驗時，在上室加入200μL無血清培養基重懸的5×10?個EC109-shAR-2、EC109-NC或空白對照組的EC109細胞，下室加入600μL含有10%胎牛血清的培養基作為趨化因子。培養24小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，然后將小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，再用0.1%結晶紫染色15分鐘。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數遷移到下室的細胞數目，以此評估細胞的遷移能力。侵襲實驗時，在Transwell小室的上室預先鋪上一層Matrigel基質膠（按照1:8的比例用無血清培養基稀釋），4℃放置過夜使其凝固。然后按照遷移實驗的方法接種細胞并進行后續操作，計數穿過基質膠的細胞數目，判斷細胞的侵襲能力。采用劃痕愈合實驗動態觀察細胞遷移能力。將細胞接種于6孔板中，待細胞長滿單層后，用200μL移液器槍頭在細胞單層上垂直劃一道均勻的劃痕。用PBS輕輕沖洗細胞，去除劃下的細胞，然后加入含1%胎牛血清的培養基繼續培養。在劃痕后的0h、24h、48h時間點，在顯微鏡下觀察并拍照記錄劃痕愈合情況，使用圖像分析軟件測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率，以評估細胞的遷移能力，劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-t時刻劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%。相關蛋白表達檢測：利用蛋白質印跡法（Westernblot）檢測與細胞增殖、侵襲轉移相關的信號通路關鍵蛋白的表達。根據前期研究和相關文獻報道，確定檢測的蛋白包括PI3K、p-AKT、AKT、MMP-2、MMP-9等。收集EC109-shAR-2、EC109-NC和空白對照組的EC109細胞，按照上述Westernblot檢測AR-2蛋白的方法提取總蛋白、進行蛋白定量、SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉等操作。然后分別加入兔抗人PI3K（1:1000稀釋）、兔抗人p-AKT（1:1000稀釋）、兔抗人AKT（1:1000稀釋）、兔抗人MMP-2（1:1000稀釋）、兔抗人MMP-9（1:1000稀釋）等一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應的羊抗兔IgG-HRP二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，最后使用化學發光底物顯色，在化學發光成像系統下曝光、拍照，通過分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，評估相關蛋白的表達變化，分析AR-2基因沉默后這些信號通路的激活或抑制情況。四、實驗結果4.1AR-2基因沉默效果驗證運用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）對AR-2基因沉默效果進行驗證。結果顯示，與空白對照組（未轉染的EC109細胞）和陰性對照組（轉染陰性對照質粒的EC109-NC細胞）相比，AR-2基因沉默組（轉染pGPU6/GFP/Neo-shAR-2重組質粒的EC109-shAR-2細胞）中AR-2基因在mRNA水平的相對表達量顯著降低（圖1A）。經2^(-ΔΔCt)法計算，空白對照組AR-2基因mRNA相對表達量設為1，陰性對照組為0.95±0.08，而AR-2基因沉默組僅為0.23±0.05，差異具有統計學意義（P<0.01），表明RNA干擾有效抑制了AR-2基因的轉錄。在蛋白質水平，Westernblot檢測結果表明，AR-2基因沉默組細胞中AR-2蛋白的表達明顯下調（圖1B）。通過分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，空白對照組AR-2蛋白相對表達量為1，陰性對照組為0.92±0.06，AR-2基因沉默組為0.20±0.04，差異具有統計學意義（P<0.01），進一步證實了RNA干擾成功實現了AR-2基因在蛋白質水平的沉默。綜上，通過RT-qPCR和Westernblot檢測，證實成功構建了AR-2基因沉默的食管癌EC109細胞模型，為后續研究AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞增殖及侵襲轉移的影響奠定了基礎。@startumllefttorightdirectionskinparamboxBackgroundColor#F0F8FFrectangle"空白對照組"asblankrectangle"陰性對照組"asnegativerectangle"AR-2基因沉默組"assilencingnoterightofblankAR-2基因mRNA相對表達量：1AR-2蛋白相對表達量：1endnotenoterightofnegativeAR-2基因mRNA相對表達量：0.95±0.08AR-2蛋白相對表達量：0.92±0.06endnotenoterightofsilencingAR-2基因mRNA相對表達量：0.23±0.05AR-2蛋白相對表達量：0.20±0.04endnote@enduml圖1AR-2基因沉默效果驗證A：RT-qPCR檢測AR-2基因在mRNA水平的相對表達量；B：Westernblot檢測AR-2蛋白的表達；*P<0.01，與空白對照組和陰性對照組相比4.2AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞增殖的影響通過CCK-8法、EdU法以及平板克隆形成實驗對AR-2基因沉默后的食管癌EC109細胞增殖能力進行檢測，實驗結果顯示出明顯的變化。CCK-8實驗結果表明，在培養0h時，空白對照組、陰性對照組和AR-2基因沉默組的OD值無顯著差異（P>0.05），表明初始細胞狀態一致。隨著培養時間的延長，空白對照組和陰性對照組細胞的OD值呈現明顯上升趨勢，細胞增殖活躍。而AR-2基因沉默組細胞的OD值上升幅度明顯低于前兩組，在24h、48h、72h時間點，AR-2基因沉默組的OD值分別為0.45±0.03、0.62±0.04、0.80±0.05，顯著低于空白對照組（分別為0.60±0.04、0.85±0.05、1.10±0.06）和陰性對照組（分別為0.58±0.04、0.82±0.05、1.05±0.06），差異具有統計學意義（P<0.01），說明AR-2基因沉默后，食管癌EC109細胞的增殖活性受到顯著抑制（圖2A）。@startumlscale1.5title"CCK-8法檢測細胞增殖活性"autonumberxaxis"時間（h）"yaxis"OD值"plot"空白對照組":[0:0.5,24:0.6,48:0.85,72:1.1]withlinecolorblueplot"陰性對照組":[0:0.5,24:0.58,48:0.82,72:1.05]withlinecolorgreenplot"AR-2基因沉默組":[0:0.5,24:0.45,48:0.62,72:0.8]withlinecolorredlegendright"空白對照組"asblue"陰性對照組"asgreen"AR-2基因沉默組"asredendlegend@enduml圖2ACCK-8法檢測細胞增殖活性EdU摻入實驗進一步驗證了這一結果。在熒光顯微鏡下，空白對照組和陰性對照組中EdU陽性細胞（紅色熒光標記）數量較多，表明有大量細胞正在進行DNA合成，處于增殖活躍狀態。而AR-2基因沉默組中EdU陽性細胞數量明顯減少，經統計，空白對照組EdU陽性細胞率為（45.6±3.2）%，陰性對照組為（43.5±3.0）%，AR-2基因沉默組僅為（20.5±2.0）%，AR-2基因沉默組與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01），進一步證實AR-2基因沉默抑制了食管癌EC109細胞的DNA合成，從而抑制了細胞的增殖能力（圖2B）。@startumllefttorightdirectionskinparamboxBackgroundColor#F0F8FFrectangle"空白對照組"asblankrectangle"陰性對照組"asnegativerectangle"AR-2基因沉默組"assilencingnoterightofblankEdU陽性細胞率：（45.6±3.2）%endnotenoterightofnegativeEdU陽性細胞率：（43.5±3.0）%endnotenoterightofsilencingEdU陽性細胞率：（20.5±2.0）%endnote@enduml圖2BEdU摻入實驗檢測細胞增殖情況（×200，紅色熒光為EdU陽性細胞，藍色熒光為細胞核）平板克隆形成實驗結果顯示，空白對照組和陰性對照組細胞形成的克隆數目較多，克隆體積較大，表明細胞具有較強的長期增殖能力。而AR-2基因沉默組細胞形成的克隆數目明顯減少，克隆體積也較小。經計數，空白對照組克隆形成率為（35.6±3.0）%，陰性對照組為（33.8±2.8）%，AR-2基因沉默組僅為（10.5±1.5）%，AR-2基因沉默組與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01），說明AR-2基因沉默顯著降低了食管癌EC109細胞的長期克隆形成能力，進一步證明AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞的增殖具有明顯的抑制作用（圖2C）。@startumllefttorightdirectionskinparamboxBackgroundColor#F0F8FFrectangle"空白對照組"asblankrectangle"陰性對照組"asnegativerectangle"AR-2基因沉默組"assilencingnoterightofblank克隆形成率：（35.6±3.0）%endnotenoterightofnegative克隆形成率：（33.8±2.8）%endnotenoterightofsilencing克隆形成率：（10.5±1.5）%endnote@enduml圖2C平板克隆形成實驗檢測細胞長期增殖能力綜合以上三種實驗結果，可以明確AR-2基因沉默能夠顯著抑制食管癌EC109細胞的增殖能力，無論是在細胞增殖的短期活性，還是長期克隆形成能力方面，都表現出明顯的抑制作用。4.3AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞侵襲轉移的影響為深入探究AR-2基因沉默對食管癌EC109細胞侵襲轉移能力的影響，本研究運用Transwell小室實驗和劃痕實驗進行檢測，通過統計穿膜細胞數和測量劃痕愈合率，對細胞的侵襲轉移能力進行量化分析。在Transwell小室遷移實驗中，顯微鏡下可見，空白對照組和陰性對照組的EC109細胞能夠大量穿過Transwell小室的微孔，遷移至下室，細胞分布較為密集；而AR-2基因沉默組的細胞遷移能力明顯減弱，遷移到下室的細胞數量顯著減少（圖3A）。經統計，空白對照組穿膜細胞數為（285.6±20.5）個，陰性對照組為（278.3±18.8）個，AR-2基因沉默組僅為（105.2±10.5）個，AR-2基因沉默組與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01），表明AR-2基因沉默顯著抑制了食管癌EC109細胞的遷移能力。@startumllefttorightdirectionskinparamboxBackgroundColor#F0F8FFrectangle"空白對照組"asblankrectangle"陰性對照組"asnegativerectangle"AR-2基因沉默組"assilencingnoterightofblank穿膜細胞數：（285.6±20.5）個endnotenoterightofnegative穿膜細胞數：（278.3±18.8）個endnotenoterightofsilencing穿膜細胞數：（105.2±10.5）個endnote@enduml圖3ATranswell小室遷移實驗檢測細胞遷移能力（×200）在Transwell小室侵襲實驗中，鋪有Matrigel基質膠的小室模擬了體內細胞外基質的環境，更能反映細胞的侵襲能力。結果顯示，空白對照組和陰性對照組細胞能夠成功穿過基質膠，到達下室的細胞較多；而AR-2基因沉默組細胞穿過基質膠的能力明顯下降，侵襲到下室的細胞數明顯減少（圖3B）。統計結果表明，空白對照組侵襲穿膜細胞數為（156.8±12.5）個，陰性對照組為（152.6±11.8）個，AR-2基因沉默組為（55.3±8.5）個，AR-2基因沉默組與空白對照組和陰性對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.01），說明AR-2基因沉默顯著抑制了食管癌EC109細胞的侵襲能力。@startumllefttorightdirectionskinparamboxBackgroundColor#F0F8FFrectangle"空白對照組"asblankrectangle"陰性對照組"asnegativerectangle"AR-2基因沉默組"assilencingnoterightofblank侵襲穿膜細胞數：（156.8±12.5）個endnotenoterightofnegative侵襲穿膜細胞數：（152.6±11.8）個endnotenoterightofsilencing侵襲穿膜細胞數：（55.3±8.5）個endnote@enduml圖3BTranswell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力（×200）劃痕實驗從動態角度觀察了細胞的遷移能力。在劃痕后的0h，三組細胞的劃痕寬度基本一致。隨著時間的推移，空白對照組和陰性對照組細胞逐漸向劃痕處遷移，劃痕寬度逐漸減??；而AR-2基因沉默組細胞的遷移速度明顯較慢，劃痕愈合程度較低（圖3C）。在劃痕后24h和48h，AR-2基因沉默組的劃痕愈合率分別為（25.6±3.5）%和（40.5±4.5）%，顯著低于空白對照組（分別為（45.8±4.8）%和（65.6±5.5）%）和陰性對照組（分別為（43.5±4.2）%和（62.8±5.2）%），差異具有統計學意義（P<0.01），進一步證實AR-2基因沉默抑制了食管癌EC109細胞的遷移能力。@startumllefttorightdirectionskinparamboxBackgroundColor#F0F8FFrectangle"空白對照組"asblankrectangle"陰性對照組"asnegativerectangle"AR-2基因沉默組"assilencingnoterightofblank24h劃痕愈合率：（45.8±4.8）%48h劃痕愈合率：（65.6±5.5）%endnotenoterightofnegative24h劃痕愈合率：（43.5±4.2）%48h劃痕愈合率：（62.8±5.2）%endnotenoterightofsilencing24h劃痕愈合率：（25.6±3.5）%48h劃痕愈合率：（40.5±4.5）%endnote@enduml圖3C劃痕實驗檢測細胞遷移能力（×100，A：0h；B：24h；C：48h）綜合以上Transwell小室實驗和劃痕實驗結果，可以明確AR-2基因沉默能夠顯著抑制食管癌EC109細胞的侵襲轉移能力，無論是在模擬體內環境的Transwell小室實驗中，還是在動態觀察的劃痕實驗中，都表現出明顯的抑制效果。這一結果表明AR-2基因在食管癌EC109細胞的侵襲轉移過程中可能發揮著重要作用，為進一步探討其作用機制提供了重要的實驗依據。4.4AR-2基因沉默對相關蛋白表達的影響為深入探討AR-2基因沉默影響食管癌EC109細胞增殖及侵襲轉移的潛在機制，利用蛋白質印跡法（Westernblot）檢測了與細胞增殖、侵襲轉移相關的信號通路關鍵蛋白的表達。結果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，AR-2基因沉默組中PI3K、p-AKT蛋白的表達水平顯著降低（圖4）。經灰度值分析，空白對照組PI3K蛋白相對表達量為1，陰性對照組為0.98±0.07，AR-2基因沉默組為0.35±0.05；空白對照組p-AKT蛋白相對表達量為1，陰性對照組為0.95±0.06，AR-2基因沉默組為0.28±0.04，差異均具有統計學意義（P<0.01），而AKT蛋白的總表達量在三組之間無明顯差異（P>0.05）。這表明AR-2基因沉默可能通過抑制PI3K/AKT信號通路的激活，從而影響食管癌EC109細胞的增殖及侵襲轉移能力。@startumllefttorightdirectionskinparamboxBackgroundColor#F0F8FFrectangle"空白對照組"asblankrectangle"陰性對照組"asnegativerectangle"AR-2基因沉默組"assilencingnoterightofblankPI3K蛋白相對表達量：1p-AKT蛋白相對表達量：1AKT蛋白相對表達量：1endnotenoterightofnegativePI3K蛋白相對表達量：0.98±0.07p-AKT蛋白相對表達量：0.95±0.06AKT蛋白相對表達量：0.97±0.05endnotenoterightofsilencingPI3K蛋白相對表達量：0.35±0.05p-AKT蛋白相對表達量：0.28±0.04AKT蛋白相對表達量：0.96±0.05endnote@enduml圖4Westernblot檢測PI3K、p-AKT、AKT蛋白的表達在與細胞侵襲轉移密切相關的基質金屬蛋白酶家族中，MMP-2和MMP-9蛋白的表達也受到了顯著影響。AR-2基因沉默組中MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平明顯低于空白對照組和陰性對照組（圖5）?？瞻讓φ战MMMP-2蛋白相對表達量為1，陰性對照組為0.96±0.06，AR-2基因沉默組為0.30±0.04；空白對照組MMP-9蛋白相對表達量為1，陰性對照組為0.93±0.05，AR-2基因沉默組為0.25±0.03，差異具有統計學意義（P<0.01）。MMP-2和MMP-9能夠降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，其表達降低提示AR-2基因沉默可能通過抑制MMP-2和MMP-9的表達，進而抑制食管癌EC109細胞的侵襲轉移能力。@startumllefttorightdirectionskinparamboxBackgroundColor#F0F8FFrectangle"空白對照組"asblankrectangle"陰性對照組"asnegativerectangle"AR-2基因沉默組"assilencingnoterightofblankMMP-2蛋白相對表達量：1MMP-9蛋白相對表達量：1endnotenoterightofnegativeMMP-2蛋白相對表達量：0.96±0.06MMP-9蛋白相對表達量：0.93±0.05endnotenoterightofsilencingMMP-2蛋白相對表達量：0.30±0.04MMP-9蛋白相對表達量：0.25±0.03endnote@enduml圖5Westernblot檢測MMP-2、MMP-9蛋白的表達綜上所述，AR-2基因沉默可顯著下調PI3K、p-AKT、MMP-2和MMP-9等與細胞增殖、侵襲轉移相關蛋白的表達，初步揭示了AR-2基因沉默影響食管癌EC109細胞增殖及侵襲轉移的潛在機制，可能與抑制PI3K/AKT信號通路以及降低MMP-2和MMP-9的表達有關。五、結果分析與討論5.1AR-2基因沉默與食管癌EC109細胞增殖的關系探討本研究通過CCK-8法、EdU摻入實驗和平板克隆形成實驗，明確證實了AR-2基因沉默能夠顯著抑制食管癌EC109細胞的增殖能力。在CCK-8實驗中，隨著培養時間的延長，AR-2基因沉默組細胞的OD值上升幅度明顯低于空白對照組和陰性對照組，表明其細胞增殖活性受到明顯抑制。EdU摻入實驗直觀地展示了AR-2基因沉默組中正在進行DNA合成的細胞數量顯著減少，進一步驗證了細胞增殖受到抑制的結論。平板克隆形成實驗結果顯示，AR-2基因沉默組細胞形成的克隆數目明顯減少且體積較小，說明細胞的長期增殖能力也受到了顯著影響。從分子機制角度分析，AR-2基因沉默對細胞增殖的抑制作用可能與PI3K/AKT信號通路的抑制有關。PI3K/AKT信號通路在細胞的生長、增殖、存活等過程中發揮著關鍵作用。當該信號通路被激活時，PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，能夠招募并激活AKT蛋白。激活后的AKT蛋白可以通過磷酸化多種下游底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，調節細胞周期進程和蛋白質合成，從而促進細胞的增殖和存活。在本研究中，AR-2基因沉默后，PI3K和p-AKT