三重化學修飾血紅蛋白氧載體：制備、結構與攜放氧活性研究一、引言1.1研究背景與意義血液在人體生理活動中扮演著無可替代的關鍵角色，承擔著氧氣輸送、營養物質運輸、代謝廢物清除以及維持內環境穩定等諸多重要功能。然而，臨床醫療領域對血液的需求常常面臨嚴峻挑戰，血源短缺、血型匹配困難、血液儲存時間有限以及輸血相關感染風險等問題，嚴重制約了輸血治療的廣泛應用和效果提升。在此背景下，開發安全、有效的血液代用品成為醫學和生物材料領域的研究熱點與迫切需求。血紅蛋白氧載體（Hemoglobin-basedoxygencarriers，HBOCs）作為一類極具潛力的血液代用品，以血紅蛋白為核心原料，通過一系列化學修飾或封裝技術，使其具備運載氧氣的能力，成為紅細胞替代物研究的重點方向。血紅蛋白（Hemoglobin，Hb）是紅細胞的主要組成成分，依靠分子中心血紅素中的鐵原子實現機體氧氣運輸功能。其獨特的攜氧特性以及良好的生物相容性與安全性，使其成為人工攜載氧的理想仿生生物載體。但游離血紅蛋白存在著諸多缺陷，如四級結構不穩定，易解聚為αβ二聚體，迅速從循環系統中清除，導致腎毒性；對氧的親和力過高，在組織中釋放氧困難；且容易被氧化為高鐵血紅蛋白，失去攜氧能力等。因此，對血紅蛋白進行化學修飾以改善其性能，成為制備高效血紅蛋白氧載體的關鍵。目前，對血紅蛋白的化學修飾方法眾多，包括交聯、聚合、偶聯等。但單一的化學修飾往往只能改善血紅蛋白的部分性能，難以全面滿足臨床應用對血紅蛋白氧載體的要求。本研究提出的三重化學修飾策略，旨在綜合利用多種修飾方法的優勢，從多個維度對血紅蛋白進行改性。通過精心設計和調控修飾過程，有望實現血紅蛋白氧載體在穩定性、攜氧能力、釋氧性能以及生物相容性等多方面性能的協同提升。這種創新的修飾策略不僅能夠拓展血紅蛋白氧載體的應用范圍，提高其在臨床治療中的有效性和安全性，還為血液代用品的研發提供了新的思路和方法，對推動該領域的發展具有重要的理論意義和實際應用價值。1.2血紅蛋白概述1.2.1血紅蛋白的結構血紅蛋白是一種在高等生物體內負責運載氧的特殊蛋白質，其結構呈現出復雜而精妙的組織形式。從整體架構來看，血紅蛋白是由四個亞基組成的四聚體，在人體內，這四個亞基包含了兩個α-亞基和兩個β-亞基，它們通過非共價相互作用緊密結合，共同構建起穩定的四級結構。每個亞基自身又具備獨特的組成。它由一條多肽鏈和一個血紅素輔基構成。多肽鏈在生理環境中會進行特定的折疊與盤繞，最終形成球狀結構，這種球狀結構將血紅素輔基緊緊包裹其中，為血紅素發揮功能提供了穩定的微環境。多肽鏈的氨基酸序列和空間構象決定了其與血紅素輔基的適配性以及亞基之間的相互作用模式，對血紅蛋白整體功能的實現至關重要。血紅素輔基是血紅蛋白實現氧氣運輸功能的核心結構。它屬于含鐵的卟啉化合物，中心位置的亞鐵離子（Fe2?）起著關鍵作用。亞鐵離子與卟啉環上的四個氮原子形成配位鍵，構成了血紅素的基本框架，使得亞鐵離子能夠穩定地處于卟啉環的中心。此外，在珠蛋白肽鏈中第8位的組氨酸殘基，其咪唑側鏈上的氮原子從卟啉分子平面的上方與亞鐵離子配位結合，進一步增強了亞鐵離子與珠蛋白的連接穩定性。當血紅蛋白未與氧結合時，有一個水分子從卟啉環下方與亞鐵離子配位；而當血紅蛋白運載氧時，氧分子會取代水分子的位置，與亞鐵離子結合，從而實現氧氣的可逆結合與釋放。這種獨特的結構使得血紅蛋白能夠高效地在肺部攝取氧氣，并在組織中釋放氧氣，滿足機體的氧需求。1.2.2血紅蛋白的生理功能血紅蛋白在人體生理過程中承擔著兩項關鍵的生理功能，即氧氣運輸和二氧化碳排出，這兩項功能對于維持人體正常的新陳代謝和生理活動起著決定性作用。在氧氣運輸過程中，當血液流經肺部時，肺部富含氧氣的環境使得血紅蛋白與氧氣發生結合反應。由于血紅素輔基中心的亞鐵離子對氧氣具有較高的親和力，氧氣分子能夠迅速與亞鐵離子結合，形成氧合血紅蛋白。這一過程使得血紅蛋白的空間構象發生變化，增強了其對氧氣的結合能力，從而高效地將氧氣從肺部攝取到血液中。隨著血液循環，氧合血紅蛋白被運輸到全身各個組織和器官。在組織中，由于組織細胞代謝消耗氧氣，導致局部氧氣濃度降低，二氧化碳濃度升高，pH值下降，這些因素共同作用促使氧合血紅蛋白發生解離，釋放出氧氣。釋放的氧氣能夠擴散進入組織細胞，參與細胞內的有氧呼吸過程，為細胞提供能量，維持細胞的正常生理功能。血紅蛋白在二氧化碳排出過程中也發揮著重要作用。組織細胞在代謝過程中產生大量的二氧化碳，這些二氧化碳一部分直接溶解在血漿中，另一部分則通過擴散進入紅細胞。進入紅細胞的二氧化碳在碳酸酐酶的催化作用下與水反應生成碳酸，碳酸進一步解離為氫離子（H?）和碳酸氫根離子（HCO??）。其中，氫離子會與血紅蛋白結合，而碳酸氫根離子則通過紅細胞膜上的陰離子交換蛋白與血漿中的氯離子進行交換，進入血漿。當血液流經肺部時，肺部的低二氧化碳分壓環境促使這一過程逆向進行。紅細胞內的碳酸氫根離子與氫離子結合生成碳酸，碳酸在碳酸酐酶的作用下分解為二氧化碳和水，二氧化碳通過擴散排出體外。同時，血紅蛋白釋放出結合的氫離子，恢復其原來的結構和功能，為下一次運輸氧氣和二氧化碳做好準備。1.2.3游離血紅蛋白的缺陷游離血紅蛋白，即未被包裹在紅細胞內的血紅蛋白，雖然具備運載氧氣的能力，但在實際應用和生理環境中暴露出諸多嚴重缺陷，限制了其作為血液代用品的可行性和有效性。游離血紅蛋白的四級結構穩定性較差。在缺乏紅細胞內環境的保護和支撐下，游離血紅蛋白的αβ二聚體之間的相互作用減弱，容易解聚為αβ二聚體。這種解聚現象使得血紅蛋白的分子結構發生改變，其表面性質也隨之變化，導致其迅速被單核吞噬細胞系統識別并清除，從循環系統中快速消失。這不僅大大縮短了血紅蛋白在體內的循環時間，無法持續有效地為組織提供氧氣，而且被清除的血紅蛋白代謝產物還可能對腎臟等器官造成負擔，引發腎毒性，嚴重時甚至導致腎功能損傷。游離血紅蛋白對氧的親和力過高。正常情況下，紅細胞內的血紅蛋白通過與2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）等物質相互作用，調節其對氧的親和力，從而實現高效的氧氣運輸和釋放。然而，游離血紅蛋白脫離了紅細胞內的微環境，失去了與2,3-DPG的相互作用，導致其對氧的親和力顯著升高。這使得游離血紅蛋白在組織中難以釋放氧氣，無法滿足組織細胞對氧氣的需求，降低了其作為氧載體的有效性。游離血紅蛋白還容易被氧化為高鐵血紅蛋白。在生理環境中，血紅蛋白中心的亞鐵離子（Fe2?）處于相對不穩定的狀態，容易受到體內氧化物質的攻擊而被氧化為高鐵離子（Fe3?），形成高鐵血紅蛋白。高鐵血紅蛋白無法與氧氣結合，失去了運載氧氣的能力，進一步降低了血液的攜氧能力。而且，高鐵血紅蛋白的積累還可能引發一系列不良反應，如導致血管收縮、影響微循環等，對機體造成損害。1.3化學修飾血紅蛋白的方法為克服游離血紅蛋白的缺陷，使其能夠滿足作為血液代用品的要求，科研人員發展了多種化學修飾方法。這些方法旨在改善血紅蛋白的穩定性、調節其氧親和力以及增強其生物相容性，以下是幾種常見的化學修飾方法：分子內交聯：分子內交聯是通過在血紅蛋白分子內部引入共價鍵，連接不同亞基或同一亞基上的不同位點，從而穩定血紅蛋白的四級結構。常用的交聯劑有雙功能試劑，如戊二醛、雙(3,5-二溴水楊基)富馬酸酯（DBBF）等。以戊二醛為例，其具有兩個醛基，能夠與血紅蛋白分子中不同亞基上的賴氨酸殘基的ε-氨基發生反應，形成Schiff堿，進而通過還原反應轉化為穩定的C-N鍵。這種交聯方式有效阻止了血紅蛋白亞基的解聚，延長了其在循環系統中的半衰期。同時，由于交聯改變了血紅蛋白的空間構象，還可能對其氧親和力產生影響，使其更有利于在組織中釋放氧氣。分子內交聯技術在一些早期的血紅蛋白氧載體研究中得到廣泛應用，為提高血紅蛋白的穩定性奠定了基礎。分子間聚合：分子間聚合是使多個血紅蛋白分子相互連接形成聚合物，增大血紅蛋白的分子量，降低其從循環系統中清除的速度。常見的聚合方法包括使用多聚體交聯劑，如戊二醛、右旋糖酐二醛等。以戊二醛介導的聚合反應為例，戊二醛的兩個醛基可以分別與不同血紅蛋白分子上的賴氨酸殘基反應，從而將多個血紅蛋白分子連接在一起，形成大分子聚合物。這種聚合物在體內的循環時間明顯長于單體血紅蛋白，能夠更持久地為組織提供氧氣。而且，通過控制聚合程度，可以調節聚合物的分子量和性能，以滿足不同的應用需求。分子間聚合技術使得血紅蛋白氧載體的循環穩定性得到顯著提升，推動了血紅蛋白氧載體向更實用化的方向發展。高聚物修飾：高聚物修飾是將水溶性高聚物通過化學反應連接到血紅蛋白分子表面，利用高聚物的特性來改善血紅蛋白的性能。常用的高聚物有聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVA）等。PEG修飾是研究較為廣泛的一種高聚物修飾方法，PEG具有良好的親水性、生物相容性和低免疫原性。通過活化PEG的端基，使其與血紅蛋白分子表面的氨基酸殘基發生反應，將PEG鏈連接到血紅蛋白上。PEG修飾后的血紅蛋白不僅可以增加分子的空間位阻，防止亞基解聚，還能降低血紅蛋白的免疫原性，減少機體對其的免疫反應。同時，PEG的存在還可以調節血紅蛋白的氧親和力，使其更接近天然紅細胞的氧釋放特性。高聚物修飾為血紅蛋白氧載體的性能優化提供了新的途徑，顯著提高了血紅蛋白氧載體的生物相容性和安全性。1.4聚乙二醇修飾相關理論1.4.1聚乙二醇的理化性質聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PEG）是一種由環氧乙烷與水或乙二醇逐步加成聚合而得到的線性聚合物，其化學通式為HO(CH?CH?O)?H。聚乙二醇的結構特點賦予了它一系列獨特的理化性質。從溶解性來看，聚乙二醇具有良好的水溶性，這是由于其分子鏈中含有大量的醚鍵（-O-）和末端羥基（-OH），這些極性基團能夠與水分子形成氫鍵，從而使聚乙二醇能夠在水中迅速溶解。而且，聚乙二醇的溶解性隨分子量的變化而有所不同。低分子量的聚乙二醇（通常指分子量小于1000的PEG）在水中的溶解度極高，甚至可以與水以任意比例互溶；隨著分子量的增加，聚乙二醇在水中的溶解度逐漸降低，但在一定范圍內仍能保持較好的溶解性。除了水之外，聚乙二醇還能溶解于許多極性有機溶劑，如乙醇、丙酮、氯仿等，這使得它在不同的化學環境中都具有良好的適應性。聚乙二醇具有較高的化學穩定性。其分子鏈中的碳-氧鍵（C-O）和碳-碳鍵（C-C）較為穩定，不易被常見的化學試劑所破壞。在一般的酸堿條件下，聚乙二醇能夠保持結構的完整性，不會發生明顯的分解或化學反應。而且，聚乙二醇對熱也具有一定的穩定性，在一定溫度范圍內，其物理和化學性質不會發生顯著變化。通常情況下，聚乙二醇可以在80-100℃的溫度下穩定存在，甚至在更高溫度下短時間處理也不會導致其結構的嚴重破壞。這種化學穩定性使得聚乙二醇在各種修飾反應以及后續的應用過程中，能夠可靠地發揮其作用，保證修飾產物的性能穩定。聚乙二醇還具有低免疫原性和生物相容性。低免疫原性意味著聚乙二醇在進入生物體后，不易被免疫系統識別為外來異物，從而引發免疫反應。這一特性使得聚乙二醇修飾的生物分子在體內能夠避免被免疫系統攻擊和清除，延長其在體內的循環時間。生物相容性則體現為聚乙二醇能夠與生物體內的各種組織、細胞和生物分子和諧共處，不會對生物體的正常生理功能產生明顯的干擾或損害。無論是在細胞培養實驗中，還是在動物體內實驗中，聚乙二醇修飾的材料都表現出良好的生物相容性，不會引起細胞毒性、炎癥反應或其他不良反應。這使得聚乙二醇成為生物醫學領域中一種極為理想的修飾材料，被廣泛應用于藥物載體、生物傳感器、組織工程等多個方面。1.4.2聚乙二醇修飾的優勢聚乙二醇修飾在改善生物分子性能方面具有諸多顯著優勢，這些優勢使得聚乙二醇修飾技術在生物醫學和生物技術領域得到了廣泛的應用和深入的研究。聚乙二醇修飾能夠顯著延長生物分子的半衰期。當生物分子被聚乙二醇修飾后，其分子量增大，分子體積也相應增加，這使得它們更難被腎臟等器官過濾和清除。聚乙二醇的親水性使得修飾后的生物分子在溶液中形成水化層，增加了分子的溶解性和穩定性，進一步減少了其被體內代謝酶降解的可能性。以蛋白質藥物為例，未修飾的蛋白質藥物在體內的半衰期往往較短，需要頻繁給藥才能維持有效的治療濃度，這不僅給患者帶來不便，還可能導致藥物的副作用增加。而經過聚乙二醇修飾后，蛋白質藥物的半衰期可以延長數倍甚至數十倍，大大減少了給藥次數，提高了藥物的療效和患者的依從性。聚乙二醇修飾能夠降低生物分子的免疫原性。如前所述，聚乙二醇具有低免疫原性，當它與生物分子結合后，可以掩蓋生物分子表面的抗原決定簇，減少免疫系統對其的識別和攻擊。這對于那些容易引起免疫反應的生物分子，如異體蛋白、多肽藥物等，具有重要意義。通過聚乙二醇修飾，可以有效地降低這些生物分子在體內引發免疫反應的風險，提高其安全性和耐受性。在輸血治療中，游離血紅蛋白由于其免疫原性較高，可能會引發受血者的免疫反應，而經過聚乙二醇修飾后的血紅蛋白氧載體，其免疫原性顯著降低，降低了輸血不良反應的發生概率。聚乙二醇修飾還可以改善生物分子的溶解性和穩定性。對于一些疏水性較強的生物分子，如某些蛋白質、多肽和藥物，聚乙二醇的親水性可以增加它們在水溶液中的溶解度，使其更容易在體內運輸和發揮作用。聚乙二醇的修飾還可以通過空間位阻效應，阻止生物分子之間的聚集和沉淀，提高其在溶液中的穩定性。在儲存和運輸過程中，聚乙二醇修飾的生物分子能夠更好地保持其活性和結構完整性，減少了因環境因素導致的降解和失活現象。1.4.3聚乙二醇修飾的基團在血紅蛋白的聚乙二醇修飾過程中，有多種聚乙二醇修飾基團可供選擇，這些基團能夠與血紅蛋白分子表面的特定氨基酸殘基發生反應，實現聚乙二醇與血紅蛋白的共價連接。最常見的聚乙二醇修飾基團之一是琥珀酰亞胺碳酸酯（NHS-PEG）。NHS-PEG的琥珀酰亞胺酯基具有較高的反應活性，能夠與血紅蛋白分子中賴氨酸殘基的ε-氨基發生親核取代反應。在反應過程中，NHS酯基中的N-琥珀酰亞胺離去，形成穩定的酰胺鍵，將聚乙二醇連接到血紅蛋白上。這種反應通常在溫和的條件下進行，pH值一般控制在7.0-8.5之間，反應溫度在4-25℃。NHS-PEG修飾具有反應效率高、選擇性好的特點，能夠在不影響血紅蛋白活性中心的前提下，實現對血紅蛋白分子表面的修飾。醛基化聚乙二醇（CHO-PEG）也是一種常用的修飾基團。CHO-PEG的醛基可以與血紅蛋白分子中賴氨酸殘基的ε-氨基發生Schiff堿反應，形成不穩定的亞胺鍵。為了使反應更加穩定，通常需要加入還原劑，如氰基硼氫化鈉（NaCNBH?），將亞胺鍵還原為穩定的仲胺鍵。該反應需要在弱酸性條件下進行，pH值一般為5.0-6.0，以促進醛基與氨基的反應。CHO-PEG修飾可以引入多個醛基，實現對血紅蛋白分子的多點修飾，從而更有效地改善血紅蛋白的性能。巰基化聚乙二醇（SH-PEG）則適用于與血紅蛋白分子中半胱氨酸殘基的巰基（-SH）發生反應。兩者之間的反應通常通過二硫鍵交換反應或形成硫醚鍵來實現。在二硫鍵交換反應中，SH-PEG中的巰基與血紅蛋白中半胱氨酸的二硫鍵發生交換，形成新的二硫鍵連接；而在形成硫醚鍵的反應中，通常需要加入一些活化劑，如馬來酰亞胺等，使SH-PEG的巰基與活化后的馬來酰亞胺基團反應，進而與血紅蛋白中的半胱氨酸巰基形成穩定的硫醚鍵。這種修飾方式具有較高的特異性，能夠準確地將聚乙二醇連接到血紅蛋白分子中半胱氨酸的位置，避免對其他氨基酸殘基的影響。1.5修飾后血紅蛋白的分離純化方法修飾后的血紅蛋白往往與未反應的原料、副產物以及其他雜質混合在一起，為了獲得高純度的修飾血紅蛋白氧載體，需要采用有效的分離純化方法。以下介紹幾種常用的分離純化方法及其原理與應用。離子交換層析：離子交換層析是利用不同物質在離子交換劑上的親和力差異進行分離的技術。其原理基于離子交換劑表面的可解離基團與溶液中帶相反電荷的離子之間的靜電相互作用。離子交換劑通常分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。陽離子交換劑含有酸性基團，如磺酸基（-SO?H）、羧基（-COOH）等，能與溶液中的陽離子發生交換反應；陰離子交換劑含有堿性基團，如季銨基（-NR??）、氨基（-NH?）等，能與溶液中的陰離子發生交換反應。在修飾血紅蛋白的分離純化中，由于修飾后的血紅蛋白表面電荷分布可能發生改變，與未修飾血紅蛋白或雜質在離子交換劑上的親和力不同。通過選擇合適的離子交換劑和緩沖液，調節pH值和離子強度，使修飾血紅蛋白與雜質依次被洗脫下來，從而實現分離。例如，對于帶正電荷的修飾血紅蛋白，可以選用陰離子交換劑，在低離子強度的緩沖液中，修飾血紅蛋白與交換劑結合，然后逐漸增加緩沖液的離子強度，使修飾血紅蛋白從交換劑上洗脫下來。離子交換層析具有分離效率高、處理量大、可連續操作等優點，廣泛應用于血紅蛋白及其修飾產物的分離純化。凝膠過濾層析：凝膠過濾層析又稱分子篩層析，其原理是利用凝膠顆粒的多孔網狀結構，根據分子大小不同進行分離。凝膠顆粒是由具有三維空間網狀結構的高分子材料制成，如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等。當樣品溶液通過凝膠柱時，小分子物質能夠進入凝膠顆粒內部的孔隙，而大分子物質則被排阻在凝膠顆粒外部，只能沿著凝膠顆粒之間的空隙流動。因此，大分子物質先流出凝膠柱，小分子物質后流出凝膠柱，從而實現不同分子大小物質的分離。在修飾血紅蛋白的分離中，未反應的小分子修飾劑、副產物等小分子物質與修飾后的血紅蛋白分子大小差異明顯，通過凝膠過濾層析可以有效去除小分子雜質，獲得純凈的修飾血紅蛋白。凝膠過濾層析具有操作簡單、條件溫和、不影響蛋白質活性等優點，常用于蛋白質的脫鹽、分離純化以及分子量測定等。反相高效液相層析：反相高效液相層析（RP-HPLC）是基于溶質在固定相和流動相之間的分配系數差異進行分離的技術。其固定相通常為非極性的烷基鍵合硅膠，如C??、C?等，流動相為極性較強的溶劑，如水、甲醇、乙腈等。在反相色譜中，樣品中的非極性成分與固定相的親和力較強，而極性成分與流動相的親和力較強。當樣品進入色譜柱后，在流動相的帶動下，不同成分在固定相和流動相之間不斷進行分配，由于分配系數的差異，各成分在色譜柱中的保留時間不同，從而實現分離。對于修飾血紅蛋白，其修飾程度和修飾位點的不同可能導致分子的疏水性發生變化，通過調整流動相的組成和比例，可以使修飾血紅蛋白與雜質在反相色譜柱上得到有效分離。反相高效液相層析具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優點，常用于對純度要求較高的修飾血紅蛋白的分析和純化。1.6修飾血紅蛋白的常用表征方法對修飾后的血紅蛋白進行全面、準確的表征是評估其性能和質量的關鍵環節，有助于深入了解修飾過程對血紅蛋白結構和功能的影響。以下介紹幾種在修飾血紅蛋白研究中常用的表征方法。1.6.1拉曼光譜拉曼光譜是一種基于拉曼散射效應的光譜分析技術，在檢測血紅蛋白結構變化方面具有獨特的原理和廣泛的應用。當一束頻率為ν?的單色光照射到樣品上時，大部分光子與樣品分子發生彈性碰撞，其頻率和方向均不改變，這種散射稱為瑞利散射；而一小部分光子與樣品分子發生非彈性碰撞，光子的頻率發生改變，這種散射即為拉曼散射。拉曼散射光的頻率與入射光頻率之差稱為拉曼位移，拉曼位移只與分子的振動和轉動能級有關，不同的化學鍵或基團具有特定的拉曼位移，因此拉曼光譜可以提供分子結構的指紋信息。在血紅蛋白研究中，拉曼光譜能夠對血紅蛋白分子中的血紅素基團、多肽鏈以及它們之間的相互作用進行深入分析。血紅素中的卟啉環具有豐富的振動模式，其拉曼光譜特征峰能夠反映卟啉環的結構和電子狀態。例如，卟啉環的ν??振動模式對應的拉曼峰在1585-1610cm?1附近，該峰的位置和強度變化可以用于監測血紅素與氧氣的結合狀態。當血紅蛋白與氧氣結合形成氧合血紅蛋白時，卟啉環的電子云分布發生改變，導致該拉曼峰的位置和強度發生明顯變化，從而為研究血紅蛋白的氧合過程提供了直接的證據。多肽鏈中的酰胺鍵也是拉曼光譜分析的重要對象。酰胺I帶（1630-1690cm?1）主要由C=O伸縮振動貢獻，其拉曼光譜特征可以反映多肽鏈的二級結構信息。通過分析酰胺I帶的拉曼峰，可以了解修飾過程對血紅蛋白二級結構的影響，判斷α-螺旋、β-折疊等結構的相對含量變化。而且，拉曼光譜還可以用于研究血紅蛋白分子中氨基酸殘基的環境變化，如某些氨基酸殘基與修飾劑之間的相互作用，以及這些相互作用對血紅蛋白結構和功能的影響。由于拉曼光譜具有無損、快速、靈敏等優點，能夠在不破壞樣品的前提下提供豐富的結構信息，因此在修飾血紅蛋白的結構表征中發揮著重要作用，為深入理解血紅蛋白的修飾機制和性能優化提供了有力的技術支持。1.6.2高效液相色譜高效液相色譜（High-PerformanceLiquidChromatography，HPLC）是一種廣泛應用于化學分析和生物分離領域的技術，在分析血紅蛋白修飾產物的純度和組成方面具有重要的原理和應用價值。其基本原理是利用樣品中各組分在固定相和流動相之間的分配系數差異，實現對不同組分的分離。在HPLC系統中，流動相是一種具有一定極性的溶劑，如甲醇、乙腈、水等，它在高壓泵的作用下以恒定的流速通過裝有固定相的色譜柱。固定相則是填充在色譜柱內的具有特定化學性質的固體顆粒，如硅膠、聚合物等，其表面通常鍵合有各種功能基團，如烷基、氨基、氰基等。當樣品注入到流動相中后，各組分在流動相的帶動下進入色譜柱。由于不同組分與固定相和流動相之間的相互作用不同，它們在色譜柱中的遷移速度也不同。分配系數較大的組分與固定相的親和力較強，在色譜柱中停留的時間較長，遷移速度較慢；而分配系數較小的組分與流動相的親和力較強，在色譜柱中停留的時間較短，遷移速度較快。經過一段時間的分離，不同組分依次從色譜柱中流出，進入檢測器進行檢測。檢測器根據各組分的物理或化學性質，如紫外吸收、熒光發射、電化學活性等，將其轉化為電信號或光信號，從而實現對各組分的定性和定量分析。在血紅蛋白修飾產物的分析中，HPLC可以準確地分離和檢測修飾后的血紅蛋白、未反應的血紅蛋白以及各種雜質和副產物。通過選擇合適的色譜柱和流動相條件，可以使修飾血紅蛋白與其他成分在色譜圖上得到良好的分離，根據色譜峰的保留時間和峰面積，可以確定各組分的種類和含量，從而評估修飾產物的純度和組成。采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析聚乙二醇修飾的血紅蛋白時，利用C??色譜柱和甲醇-水-三氟乙酸流動相體系，可以將修飾后的血紅蛋白與未修飾的血紅蛋白、游離的聚乙二醇以及其他雜質有效分離。通過對色譜峰的積分和分析，可以準確計算修飾血紅蛋白的純度以及修飾程度，為修飾血紅蛋白的質量控制和性能評價提供了重要的數據支持。1.6.3圓二色光譜圓二色光譜（CircularDichroismSpectroscopy，CD）是一種基于光學活性物質對左旋圓偏振光和右旋圓偏振光吸收差異的光譜技術，在研究血紅蛋白二級結構變化方面具有獨特的原理和廣泛的應用。當一束平面偏振光通過光學活性物質時，由于物質分子對左旋圓偏振光和右旋圓偏振光的吸收系數不同，會導致出射光的偏振面發生旋轉，這種現象稱為圓二色性。圓二色光譜測量的是物質對左旋圓偏振光和右旋圓偏振光吸收系數之差（Δε）隨波長的變化，其光譜曲線包含了豐富的分子結構信息。在蛋白質研究中，圓二色光譜主要用于分析蛋白質的二級結構。蛋白質的二級結構主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲等，不同的二級結構具有特征性的圓二色光譜。α-螺旋結構在208nm和222nm處有兩個負的特征吸收峰，這是由于α-螺旋中肽鍵的n→π*和π→π*躍遷引起的；β-折疊結構在216nm左右有一個負的特征吸收峰，而在195nm處有一個正的特征吸收峰；無規卷曲結構在198nm左右有一個負的特征吸收峰。通過測量蛋白質在不同波長下的圓二色信號，并與已知二級結構的蛋白質標準譜圖進行對比，可以計算出蛋白質中各種二級結構的相對含量。對于修飾后的血紅蛋白，圓二色光譜可以靈敏地檢測修飾過程對其二級結構的影響。當血紅蛋白與修飾劑發生反應時，修飾基團可能會改變血紅蛋白分子的局部構象，進而影響其二級結構。通過比較修飾前后血紅蛋白的圓二色光譜，可以直觀地觀察到二級結構的變化情況。若修飾導致α-螺旋含量減少，208nm和222nm處的負吸收峰強度會相應降低；若β-折疊含量增加，216nm處的負吸收峰強度會增強。圓二色光譜還可以用于研究血紅蛋白在不同環境條件下的結構穩定性，如溫度、pH值、離子強度等因素對其二級結構的影響。由于圓二色光譜具有快速、靈敏、對樣品無損傷等優點，能夠在溶液狀態下對蛋白質的二級結構進行實時監測，因此成為研究修飾血紅蛋白結構變化的重要手段之一。1.6.4血氧分析儀血氧分析儀是一種專門用于測定血紅蛋白氧飽和度和氧分壓的儀器，其原理基于光吸收和電化學技術，在血紅蛋白氧載體的性能評估中具有重要的應用價值。在光吸收原理方面，血紅蛋白對不同波長的光具有特定的吸收特性。氧合血紅蛋白（HbO?）和還原血紅蛋白（Hb）在可見光譜范圍內的吸收光譜存在明顯差異。HbO?在660nm處有較低的吸收峰，而在940nm處有較高的吸收峰；Hb則相反，在660nm處有較高的吸收峰，在940nm處有較低的吸收峰。血氧分析儀通過發射特定波長的光（通常為660nm和940nm）照射含有血紅蛋白的樣品，然后檢測透過樣品的光強度。根據Lambert-Beer定律，光吸收與物質濃度成正比，通過比較不同波長下光的吸收程度，可以計算出血紅蛋白的氧飽和度。在電化學原理方面，血氧分析儀通常采用Clark型氧電極。Clark型氧電極由一個陰極和一個陽極組成，電極表面覆蓋一層透氣膜。當含有氧氣的樣品與電極接觸時，氧氣透過透氣膜擴散到陰極表面，在陰極上發生還原反應，產生電流。電流的大小與樣品中的氧分壓成正比。通過測量電流強度，并結合已知的氧分壓與電流的校準曲線，就可以確定樣品中的氧分壓。在修飾血紅蛋白的研究中，血氧分析儀可以直接測定修飾血紅蛋白的氧結合和釋放能力。通過測量不同氧分壓下修飾血紅蛋白的氧飽和度，可以繪制出氧解離曲線，從而得到血紅蛋白的P??值（氧飽和度為50%時的氧分壓）。P??值是衡量血紅蛋白對氧親和力的重要指標，P??值越大，表明血紅蛋白對氧的親和力越低，在組織中釋放氧的能力越強。通過比較修飾前后血紅蛋白的P??值以及氧解離曲線的變化，可以評估修飾對血紅蛋白氧親和力和釋氧性能的影響。血氧分析儀還可以用于監測修飾血紅蛋白在模擬生理條件下的氧運輸能力，為其作為血液代用品的性能評價提供重要的數據支持。1.7研究思路與方法1.7.1技術路線本研究的技術路線旨在系統、全面地制備并表征三重化學修飾的血紅蛋白氧載體，探索其攜放氧活性，具體步驟如下（圖1）：血紅蛋白提取與純化：選用新鮮的牛血作為原料，通過離心分離去除血漿和白細胞等雜質，得到富含紅細胞的沉淀。采用低滲溶血法使紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。利用離子交換層析和凝膠過濾層析等技術對粗提的血紅蛋白進行純化，去除殘留的雜質和小分子物質，得到高純度的血紅蛋白溶液。血紅蛋白修飾：首先進行分子內交聯修飾，將純化后的血紅蛋白溶液與雙功能交聯劑（如戊二醛）在特定條件下反應，使血紅蛋白分子內的亞基之間形成共價交聯，穩定其四級結構。通過調節交聯劑的濃度和反應時間，控制交聯程度。然后進行分子間聚合修飾，向分子內交聯后的血紅蛋白溶液中加入多聚體交聯劑（如右旋糖酐二醛），使多個血紅蛋白分子相互連接形成聚合物，增大分子量。在聚合過程中，嚴格控制反應條件，如溫度、pH值和反應時間，以獲得理想的聚合產物。最后進行聚乙二醇修飾，根據血紅蛋白表面氨基酸殘基的特點，選擇合適的聚乙二醇修飾基團（如NHS-PEG）。將修飾劑與經過分子內交聯和分子間聚合的血紅蛋白在溫和條件下反應，使聚乙二醇連接到血紅蛋白分子表面，改善其生物相容性和穩定性。修飾產物分離純化：采用離子交換層析、凝膠過濾層析和反相高效液相層析等多種技術對修飾后的血紅蛋白進行分離純化。通過選擇合適的層析介質和洗脫條件，去除未反應的修飾劑、副產物以及未修飾的血紅蛋白等雜質，得到高純度的三重化學修飾血紅蛋白氧載體。修飾產物表征：運用拉曼光譜、高效液相色譜、圓二色光譜和血氧分析儀等多種表征手段對修飾后的血紅蛋白進行全面分析。拉曼光譜用于檢測修飾過程對血紅蛋白分子結構的影響，特別是血紅素基團和多肽鏈的結構變化；高效液相色譜用于分析修飾產物的純度和組成，確定修飾程度；圓二色光譜用于研究修飾后血紅蛋白的二級結構變化，評估修飾對其構象穩定性的影響；血氧分析儀用于測定修飾血紅蛋白的氧飽和度和氧分壓，繪制氧解離曲線，評估其攜放氧活性。攜放氧活性研究：在模擬生理條件下，通過改變氧分壓、pH值和溫度等因素，研究三重化學修飾血紅蛋白氧載體的攜放氧性能。測定不同條件下的P??值，分析修飾對血紅蛋白氧親和力的影響。探討修飾產物在不同環境中的氧釋放特性，評估其作為血液代用品的潛在應用價值。[此處插入技術路線圖]1.7.2研究方法本研究綜合運用多種實驗方法，從不同角度對血紅蛋白進行修飾、分離純化以及性能表征，具體如下：化學合成法：在血紅蛋白的修飾過程中，采用化學合成法引入各種修飾基團。通過精確控制反應條件，如反應物的比例、反應溫度、pH值和反應時間等，實現分子內交聯、分子間聚合以及聚乙二醇修飾反應。在分子內交聯反應中，將血紅蛋白與戊二醛按照一定比例混合，在pH值為7.5-8.5、溫度為4-10℃的條件下反應2-4小時，使血紅蛋白分子內的亞基之間形成共價交聯。在分子間聚合反應中，向血紅蛋白溶液中加入適量的右旋糖酐二醛，在pH值為8.0-8.5、溫度為25-30℃的條件下反應6-8小時，實現血紅蛋白分子間的聚合。在聚乙二醇修飾反應中，根據血紅蛋白的濃度和修飾程度的要求，計算并加入適量的NHS-PEG，在pH值為7.0-7.5、溫度為20-25℃的條件下反應4-6小時，使聚乙二醇與血紅蛋白分子表面的賴氨酸殘基發生反應。光譜分析法：運用拉曼光譜、圓二色光譜等光譜分析技術，對血紅蛋白修飾前后的結構變化進行深入研究。拉曼光譜采用共聚焦拉曼顯微鏡進行測定，激發波長選擇532nm，掃描范圍為400-2000cm?1，通過分析拉曼光譜中特征峰的位置、強度和峰形變化，獲取血紅蛋白分子結構的信息，特別是血紅素基團和多肽鏈的結構變化。圓二色光譜使用圓二色光譜儀進行測定，掃描波長范圍為190-260nm，掃描速度為100nm/min，通過測量圓二色信號，分析血紅蛋白的二級結構變化，確定α-螺旋、β-折疊等結構的相對含量變化。色譜分析法：利用離子交換層析、凝膠過濾層析和反相高效液相層析等色譜分析技術，對修飾后的血紅蛋白進行分離純化和純度分析。離子交換層析選用合適的離子交換樹脂，如DEAE-SepharoseFastFlow（用于陰離子交換）或CM-SepharoseFastFlow（用于陽離子交換），根據血紅蛋白修飾產物與雜質的電荷差異進行分離。凝膠過濾層析采用SephadexG-200或SephacrylS-300等凝膠介質，根據分子大小不同對修飾血紅蛋白和雜質進行分離。反相高效液相層析使用C??色譜柱，以甲醇-水-三氟乙酸為流動相，通過梯度洗脫實現修飾血紅蛋白與雜質的有效分離，并根據色譜峰的面積計算修飾產物的純度。血氧分析：使用血氧分析儀測定修飾血紅蛋白的氧飽和度和氧分壓，研究其攜放氧性能。將修飾后的血紅蛋白溶液置于血氧分析儀的樣品池中，通過改變樣品池中的氧分壓，測量不同氧分壓下修飾血紅蛋白的氧飽和度，繪制氧解離曲線。根據氧解離曲線，計算P??值，評估修飾對血紅蛋白氧親和力的影響。同時，在不同的pH值和溫度條件下，重復上述實驗，研究環境因素對修飾血紅蛋白攜放氧性能的影響。二、三重修飾血紅蛋白氧載體的制備與鑒定2.1實驗材料與設備血紅蛋白原料：新鮮牛血，購自當地正規屠宰場，采集后立即進行低溫保存和處理，以保證血紅蛋白的活性。修飾劑：戊二醛（分析純，純度≥98%），作為分子內交聯劑，用于穩定血紅蛋白的四級結構；右旋糖酐二醛（平均分子量為10000Da），作為分子間聚合交聯劑，使血紅蛋白分子相互連接形成聚合物；八臂聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯（8-armPEG-NHS，分子量為20000Da），用于聚乙二醇修飾，改善血紅蛋白的生物相容性和穩定性。試劑：磷酸二氫鉀（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、氯化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純），用于配制各種緩沖溶液，維持反應體系的pH值穩定；Tris-HCl緩沖液（pH7.4），用于血紅蛋白的提取、純化及修飾反應過程中的緩沖；乙腈（色譜純）、三氟乙酸（分析純），用于反相高效液相色譜分析；透析袋（截留分子量為10000Da），用于去除修飾產物中的小分子雜質；SDS-PAGE凝膠電泳相關試劑，包括丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸鈉、溴酚藍、甘油、考馬斯亮藍R-250等，用于分析修飾產物的純度和分子量。儀器設備：高速冷凍離心機（最大轉速可達15000r/min，用于紅細胞的分離和血紅蛋白溶液的離心；恒溫搖床（溫度控制范圍為10-60℃，振蕩頻率可調節，用于修飾反應過程中的恒溫振蕩；pH計（精度為0.01，用于測量和調節反應體系的pH值；紫外可見分光光度計（波長范圍為190-1100nm，用于測定血紅蛋白溶液的濃度和純度；凝膠過濾色譜柱（如SephadexG-200，柱床體積為100mL，用于血紅蛋白的純化和修飾產物的分離；離子交換色譜柱（如DEAE-SepharoseFastFlow，用于血紅蛋白的進一步純化；反相高效液相色譜儀（配備紫外檢測器和C??色譜柱，用于分析修飾產物的純度和組成；SDS-PAGE垂直電泳系統，用于蛋白質的電泳分析；凝膠成像系統，用于觀察和記錄SDS-PAGE凝膠電泳結果。2.2實驗方法2.2.1血紅蛋白的純化紅細胞洗滌：取新鮮牛血100mL，加入3g檸檬酸鈉，以防止血液凝固。將血液轉移至離心管中，在4℃下以3000r/min的轉速離心10min，使紅細胞沉淀。小心吸去上層血漿，留下紅細胞。向紅細胞中加入5倍體積的生理鹽水，輕輕攪拌10min，使紅細胞充分懸浮。再次以3000r/min的轉速離心10min，棄去上清液，重復洗滌3次，直至上清液無黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。血紅蛋白釋放：將洗滌好的紅細胞轉移至燒杯中，加入等體積的蒸餾水，使紅細胞吸水脹破。再加入適量甲苯，甲苯的作用是溶解紅細胞的細胞膜，加速紅細胞的破裂。充分攪拌30min，促使血紅蛋白釋放到溶液中，形成紅細胞混合液。分離血紅蛋白：將紅細胞混合液用濾紙過濾，去除未破裂的紅細胞和其他雜質，得到血紅蛋白溶液。將血紅蛋白溶液轉移至離心管中，在4℃下以10000r/min的轉速離心20min，使血紅蛋白沉淀。小心吸去上層有機溶劑和脂類物質，留下血紅蛋白沉淀。透析：將血紅蛋白沉淀溶解在適量的20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）中，裝入透析袋（截留分子量為10000Da）中。將透析袋放入裝有大量20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）的燒杯中，4℃透析12h，以去除血紅蛋白中的小分子雜質。透析過程中，需更換2-3次透析液，以提高透析效果。離子交換層析：選用DEAE-SepharoseFastFlow離子交換樹脂，將其裝填入離子交換色譜柱中，用20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）平衡色譜柱。將透析后的血紅蛋白溶液上樣到色譜柱中，用含0-0.5mol/LNaCl的20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）進行梯度洗脫，流速控制在1mL/min。收集含有血紅蛋白的洗脫液，用紫外可見分光光度計檢測洗脫液在280nm和415nm處的吸光度，根據吸光度變化確定血紅蛋白的洗脫峰。凝膠過濾層析：選用SephadexG-200凝膠過濾介質，將其裝填入凝膠過濾色譜柱中，用20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）平衡色譜柱。將離子交換層析收集的血紅蛋白洗脫液上樣到凝膠過濾色譜柱中，用20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）進行洗脫，流速控制在0.5mL/min。收集含有血紅蛋白的洗脫液，再次用紫外可見分光光度計檢測洗脫液在280nm和415nm處的吸光度，確定血紅蛋白的洗脫峰，得到高純度的血紅蛋白溶液。2.2.2血紅蛋白修飾產物的制備和純化分子內交聯修飾：取上述純化后的血紅蛋白溶液，調整其濃度至10mg/mL。將血紅蛋白溶液與戊二醛溶液按照10:1（v/v）的比例混合，使戊二醛的終濃度為0.1%。在pH值為8.0、溫度為4℃的條件下，恒溫振蕩反應3h，使血紅蛋白分子內的亞基之間形成共價交聯。反應結束后，加入適量的甘氨酸終止反應，甘氨酸與戊二醛的摩爾比為10:1。分子間聚合修飾：向分子內交聯后的血紅蛋白溶液中加入右旋糖酐二醛溶液，血紅蛋白與右旋糖酐二醛的質量比為5:1。在pH值為8.5、溫度為25℃的條件下，恒溫振蕩反應7h，使多個血紅蛋白分子通過右旋糖酐二醛相互連接形成聚合物。反應結束后，加入適量的硼氫化鈉進行還原，硼氫化鈉與右旋糖酐二醛的摩爾比為5:1，以穩定聚合物結構。產物純化：將經過分子內交聯和分子間聚合修飾后的血紅蛋白溶液，采用離子交換層析和凝膠過濾層析進行純化。離子交換層析選用DEAE-SepharoseFastFlow離子交換樹脂，用含0-0.5mol/LNaCl的20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）進行梯度洗脫，流速為1mL/min，去除未反應的修飾劑和小分子雜質。凝膠過濾層析選用SephacrylS-300凝膠過濾介質，用20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）進行洗脫，流速為0.5mL/min，進一步純化修飾后的血紅蛋白聚合物。收集含有修飾血紅蛋白聚合物的洗脫液，用紫外可見分光光度計檢測洗脫液在280nm和415nm處的吸光度，確定修飾血紅蛋白聚合物的洗脫峰。2.2.3HbA溶液的聚乙二醇化修飾產物的制備與純化聚乙二醇修飾：根據血紅蛋白的濃度，計算并加入適量的八臂聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯（8-armPEG-NHS，分子量為20000Da）。使8-armPEG-NHS與血紅蛋白的摩爾比為10:1。將兩者在pH值為7.5、溫度為20℃的條件下，恒溫振蕩反應5h，使聚乙二醇通過琥珀酰亞胺碳酸酯基團與血紅蛋白分子表面的賴氨酸殘基發生反應，實現聚乙二醇化修飾。產物純化：聚乙二醇化修飾反應結束后，將反應液采用凝膠過濾層析進行純化。選用SephadexG-200凝膠過濾介質，用20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）進行洗脫，流速為0.5mL/min，去除未反應的8-armPEG-NHS和其他小分子雜質。收集含有聚乙二醇修飾血紅蛋白的洗脫液，用紫外可見分光光度計檢測洗脫液在280nm和415nm處的吸光度，確定聚乙二醇修飾血紅蛋白的洗脫峰。為進一步提高產物純度，可將凝膠過濾層析收集的洗脫液進行透析，透析袋截留分子量為10000Da，在4℃下用20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）透析12h，徹底去除殘留的小分子雜質。2.2.4SDS-PAGE凝膠電泳分析制膠：根據目的蛋白分子量范圍，選用10%分離膠和5%濃縮膠。將凹型玻璃與平玻璃重疊，放入電泳槽支架內（短玻璃朝里），并固定在制膠器上。按照配方配制10%分離膠10mL（用于制備2塊膠），加入四甲基乙二胺（TEMED）后立即混勻，迅速沿凝膠腔的長玻璃板內面緩緩滴入，給濃縮膠留出約2cm的空間。在丙烯酰胺溶液上緩慢覆蓋純化水進行壓實，防止空氣擴散到凝膠中抑制聚合作用，并保證凝膠表面水平。在室溫條件下，約30min分離膠聚合完成，聚合后凝膠和上層液相之間可見折射率的變化。倒掉覆蓋層純化水，并用濾紙條吸凈殘留的水，注意勿破壞凝膠表面。再按照配方配制4mL5%的濃縮膠（用于制備2塊膠），加入TEMED混勻后迅速加在分離膠上，并立即插入干凈的加樣梳，注意不要混入氣泡。約30min濃縮膠聚合后，拆下制膠器，放入電泳槽內，在兩片玻璃板中間加注1×電泳緩沖液后小心移去梳子，避免破壞加樣孔。制樣：將修飾前后的血紅蛋白樣品（約1mg/mL）于-20℃冰箱中取出，室溫融化后混合均勻。取出25μL樣品置于一新1.5mLEP管內，加入5μL6XLoadingBuffer，混合均勻，蓋上管蓋，并在管蓋上標記好組別。用防爆夾夾住管口，插入到浮漂孔內，100℃煮沸5-15min，使蛋白質變性。本實驗采用的蛋白Marker為預處理樣本，不需要煮樣操作。加樣與電泳：在電泳槽內加入電泳緩沖液，使其沒過加樣孔，傾斜整個裝置以趕走凝膠下面可能留有的氣泡。按預定順序加樣，每孔加入20μL樣品，在蛋白Marker孔中加入5μL蛋白Marker。加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關后，設置恒壓80V（電壓調80V，電流調最大）20min，使樣品中的溴酚藍指示劑壓縮成一條直線且到達分離膠。之后調節恒壓120V約1h40min（或200V30-40min），當溴酚藍指示劑遷移到凝膠前沿時關閉電源停止電泳。染色與脫色：從電泳裝置上卸下玻璃板，用卡片剝下凝膠后切除一角以標注凝膠方位（或將Marker孔設置在前面）。將凝膠沖洗后浸泡在考馬斯亮藍染色液中，置于搖床上37℃染色2h或者室溫染色過夜（快速染色可用微波爐煮沸后靜置10min，2-3次重復），染色液可回收重復利用。染色結束后，將凝膠漂洗后浸泡在脫色液中，置于搖床上脫色過夜，其間更換脫色液3次；或采用快速脫色，微波爐煮沸后靜置15min，3-4次重復，每次均換新脫色液，直至蛋白條帶清晰為止。分析：將顯示蛋白條帶的凝膠拍照，采用凝膠成像系統軟件計算分子量和純度。根據蛋白Marker的條帶位置和已知分子量，繪制標準曲線，通過修飾前后血紅蛋白條帶的遷移率，從標準曲線上計算出其分子量。同時，根據條帶的深淺和數量，評估修飾產物的純度和修飾程度。2.2.5HbA溶液濃度的測定采用紫外可見分光光度法測定血紅蛋白溶液的濃度。血紅蛋白在280nm和415nm處有特征吸收峰，其中415nm處的吸收峰主要由血紅素基團貢獻，且在一定濃度范圍內，吸光度與血紅蛋白濃度呈線性關系。因此，使用紫外可見分光光度計，以20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.4）為空白對照，測定血紅蛋白溶液在415nm處的吸光度A415。根據Lambert-Beer定律，A=εcl（其中A為吸光度，ε為摩爾吸光系數，c為物質濃度，l為光程），已知血紅蛋白在415nm處的摩爾吸光系數ε415=126000M?1cm?1（假設光程l=1cm），則血紅蛋白溶液的濃度c（mol/L）可通過公式c=A415/ε415計算得出。將計算得到的濃度單位轉換為mg/mL，以便于后續實驗操作和數據處理。2.2.6凝膠過濾高效液相色譜分析色譜柱準備：選用合適的凝膠過濾色譜柱，如TSKgelG3000SWXL，該色譜柱適用于分離蛋白質等生物大分子。使用前，用流動相（如0.1mol/L磷酸緩沖液，pH7.0，含0.1mol/LNaCl）平衡色譜柱，流速為0.5mL/min，平衡時間不少于30min，直至基線穩定。樣品準備：將修飾前后的血紅蛋白樣品用流動相稀釋至適當濃度（如1-5mg/mL），以確保樣品在色譜柱中的分離效果和檢測靈敏度。將樣品離心，以10000r/min的轉速離心10min，去除可能存在的不溶性雜質。進樣與洗脫：取適量離心后的樣品注入高效液相色譜儀的進樣環中，進樣體積一般為20-100μL。以恒定流速（0.5mL/min）的流動相進行洗脫，收集流出液。在洗脫過程中，利用紫外檢測器監測流出液在280nm處的吸光度變化，記錄色譜圖。數據分析：根據色譜圖中峰的保留時間和峰面積進行分析。保留時間反映了樣品中各組分在色譜柱中的洗脫順序，與分子大小有關，分子量大的組分先流出，保留時間短；分子量小的組分后流出，保留時間長。通過與已知分子量的標準蛋白的保留時間進行對比，可以初步判斷修飾血紅蛋白的分子大小。峰面積則與樣品中各組分的含量成正比，通過計算修飾前后血紅蛋白峰面積的變化，可以評估修飾反應的程度和產物的純度。還可以根據色譜峰的形狀和對稱性，判斷修飾產物的均一性和分離效果。2.3實驗結果與討論2.3.1血紅蛋白的純化結果經過一系列的純化步驟，包括紅細胞洗滌、血紅蛋白釋放、分離、透析以及離子交換層析和凝膠過濾層析，最終得到了高純度的血紅蛋白溶液。通過紫外可見分光光度計檢測，在280nm和415nm處均出現了血紅蛋白的特征吸收峰，且415nm處的吸光度與理論值相符，表明血紅蛋白的純度較高。在紅細胞洗滌過程中，通過多次離心和生理鹽水洗滌，有效地去除了血漿中的雜質和白細胞，使得紅細胞的純度得到了顯著提高。在血紅蛋白釋放步驟中，通過加入蒸餾水和甲苯，成功地使紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。在分離和透析過程中，去除了大部分的有機溶劑、脂類物質和小分子雜質，為后續的離子交換層析和凝膠過濾層析提供了良好的樣品。離子交換層析和凝膠過濾層析進一步提高了血紅蛋白的純度。離子交換層析利用血紅蛋白與雜質在離子交換樹脂上的吸附差異，通過梯度洗脫的方式，有效地去除了未反應的小分子和帶不同電荷的雜質。凝膠過濾層析則根據分子大小的不同，將血紅蛋白與其他大分子雜質分離，得到了高純度的血紅蛋白。經過純化后，血紅蛋白的回收率為[X]%，純度達到了[X]%以上?；厥章适艿蕉鄠€因素的影響，如紅細胞的破裂程度、洗滌過程中的損失以及層析過程中的吸附等。在后續的實驗中，可以進一步優化實驗條件，提高血紅蛋白的回收率。純度的提高為后續的修飾反應提供了高質量的原料，確保了修飾產物的質量和性能。2.3.2αα-Hb與Glx-Hb的純化結果在血紅蛋白的分子內交聯修飾和分子間聚合修飾過程中，得到了αα-Hb（分子內交聯血紅蛋白）和Glx-Hb（分子間聚合血紅蛋白）。這兩種修飾產物的純化效果對于后續的研究至關重要。αα-Hb的純化主要通過離子交換層析和凝膠過濾層析實現。在離子交換層析中，由于αα-Hb分子內形成了交聯結構，其表面電荷分布與未修飾的血紅蛋白有所不同。通過選擇合適的離子交換樹脂和洗脫條件，能夠有效地將αα-Hb與未反應的血紅蛋白和小分子雜質分離。在凝膠過濾層析中，αα-Hb的分子量相對較大，能夠在凝膠顆粒之間快速通過，而小分子雜質則會進入凝膠顆粒內部，從而實現分離。經過純化后，αα-Hb的純度達到了[X]%以上，回收率為[X]%。Glx-Hb的純化同樣采用離子交換層析和凝膠過濾層析。在分子間聚合過程中，多個血紅蛋白分子通過右旋糖酐二醛相互連接形成聚合物，使得Glx-Hb的分子量顯著增大。在離子交換層析中，需要調整洗脫條件，以適應Glx-Hb的電荷特性。在凝膠過濾層析中，由于Glx-Hb的大分子聚合物性質，其在凝膠柱中的洗脫時間較早，能夠與小分子雜質有效分離。最終，Glx-Hb的純度達到了[X]%以上，回收率為[X]%。影響αα-Hb與Glx-Hb純化效果的因素包括修飾反應的程度、離子交換樹脂的選擇、洗脫條件的優化以及凝膠過濾介質的特性等。在修飾反應中，如果交聯或聚合程度不足，可能會導致未反應的血紅蛋白殘留，影響純化效果；而過度交聯或聚合則可能導致產物的結構不穩定，在純化過程中發生降解。離子交換樹脂的類型和性能直接影響對修飾產物的吸附和分離能力，不同的離子交換樹脂對αα-Hb和Glx-Hb的選擇性不同，需要根據實驗需求進行篩選。洗脫條件如洗脫液的pH值、離子強度和洗脫速度等，對修飾產物的洗脫效果和純度也有重要影響。凝膠過濾介質的孔徑大小和排阻極限決定了其對不同分子量物質的分離能力，選擇合適的凝膠過濾介質能夠提高Glx-Hb的分離效果。通過優化這些因素，可以進一步提高αα-Hb與Glx-Hb的純化效果，為后續的研究提供高質量的修飾產物。2.3.3雙修飾產物的純化和電泳結果經過分子內交聯修飾和分子間聚合修飾后的雙修飾產物，在進一步的純化過程中，通過離子交換層析和凝膠過濾層析，成功去除了未反應的修飾劑、小分子雜質以及未修飾的血紅蛋白，得到了高純度的雙修飾產物。在離子交換層析中，根據雙修飾產物與雜質在電荷性質上的差異，選擇合適的離子交換樹脂和洗脫條件，實現了有效分離。雙修飾產物由于分子內交聯和分子間聚合，其電荷分布發生了明顯變化，與未修飾血紅蛋白和小分子雜質在離子交換樹脂上的吸附能力不同。通過梯度洗脫，逐步增加洗脫液的離子強度，使雙修飾產物與雜質依次被洗脫下來。在凝膠過濾層析中，利用雙修飾產物分子量較大的特點，使其在凝膠顆粒之間快速通過，而小分子雜質則進入凝膠顆粒內部，從而實現了進一步的純化。經過這兩步純化后，雙修飾產物的純度達到了[X]%以上，滿足了后續研究的要求。對純化后的雙修飾產物進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結果如圖[X]所示。在電泳圖譜中，可以清晰地觀察到一條單一的蛋白條帶，其遷移率與預期的雙修飾產物分子量相符。與未修飾的血紅蛋白相比，雙修飾產物的蛋白條帶位置發生了明顯的遷移，這是由于分子內交聯和分子間聚合導致分子量增大所致。而且，該蛋白條帶的寬度較窄，表明雙修飾產物的純度較高，幾乎不存在雜質條帶。通過與蛋白Marker進行對比，根據標準曲線計算出雙修飾產物的分子量為[X]kDa，與理論計算值相符。這一結果不僅驗證了雙修飾反應的成功進行，還表明所采用的純化方法能夠有效地去除雜質，獲得高純度的雙修飾產物。2.3.4八臂聚乙二醇修飾產物的純化和電泳結果八臂聚乙二醇修飾產物的純化采用凝膠過濾層析結合透析的方法，以去除未反應的八臂聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯（8-armPEG-NHS）和其他小分子雜質。在凝膠過濾層析過程中，利用修飾產物與小分子雜質分子大小的差異，使修飾產物先于小分子雜質從凝膠柱中流出。由于八臂聚乙二醇修飾后的血紅蛋白分子量顯著增大，其在凝膠柱中的洗脫時間較短，而未反應的8-armPEG-NHS等小分子雜質則會進入凝膠顆粒內部，從而實現分離。經過凝膠過濾層析后，收集含有修飾產物的洗脫液，再進行透析處理，進一步去除殘留的小分子雜質。最終，八臂聚乙二醇修飾產物的純度達到了[X]%以上，滿足了對高純度修飾產物的要求。對純化后的八臂聚乙二醇修飾產物進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結果如圖[X]所示。在電泳圖譜中，修飾產物呈現出一條清晰的蛋白條帶，且條帶位置相較于未修飾血紅蛋白和雙修飾產物發生了明顯的遷移。這是因為八臂聚乙二醇的引入增加了修飾產物的分子量，導致其在凝膠中的遷移速度減慢。通過與蛋白Marker對比，根據標準曲線計算出八臂聚乙二醇修飾產物的分子量為[X]kDa，與理論預期值相符。而且，該蛋白條帶的強度較高，寬度適中，表明修飾產物的純度較高，幾乎不存在其他雜質條帶。這一結果證明了八臂聚乙二醇修飾反應的成功進行，以及所采用的純化方法能夠有效地分離和純化修飾產物，為后續對修飾產物的結構和功能研究提供了可靠的樣本。2.3.5分子排阻高效液相色譜鑒定結果采用分子排阻高效液相色譜（SEC-HPLC）對修飾產物進行鑒定，以進一步分析其分子結構和純度。實驗中選用了TSKgelG3000SWXL凝膠過濾色譜柱，以0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.0，含0.1mol/LNaCl）為流動相，流速為0.5mL/min，在280nm波長下檢測洗脫液的吸光度。未修飾血紅蛋白的SEC-HPLC色譜圖呈現出一個明顯的主峰，其保留時間為[X]min，對應著血紅蛋白的洗脫峰。這表明未修飾血紅蛋白在該色譜柱條件下能夠得到良好的分離。經過分子內交聯修飾和分子間聚合修飾后的雙修飾產物，其色譜圖中主峰的保留時間提前至[X]min。這是由于分子內交聯和分子間聚合使得血紅蛋白分子相互連接，形成了更大的聚合物，分子量增大，在凝膠過濾色譜柱中的排阻效應增強，從而導致洗脫時間縮短。八臂聚乙二醇修飾產物的色譜圖中，主峰的保留時間進一步提前至[X]min。這是因為八臂聚乙二醇的引入顯著增加了修飾產物的分子量，使其在色譜柱中的洗脫速度更快。通過與標準蛋白的保留時間進行對比，可以初步判斷修飾產物的分子大小。根據色譜峰的面積計算，未修飾血紅蛋白的純度為[X]%，雙修飾產物的純度為[X]%，八臂聚乙二醇修飾產物的純度為[X]%。這一結果與之前的SDS-PAGE凝膠電泳分析結果一致，進一步證明了修飾產物的純度較高。SEC-HPLC鑒定結果還表明，修飾產物的分子結構發生了明顯變化。分子內交聯和分子間聚合改變了血紅蛋白的四級結構，使其形成了更大的聚合物；而八臂聚乙二醇的修飾則在血紅蛋白分子表面引入了大量的聚乙二醇鏈，增加了分子的空間位阻和分子量。這些結構變化不僅影響了修飾產物在色譜柱中的洗脫行為，還對其性能和功能產生了重要影響。通過SEC-HPLC分析，能夠直觀地了解修飾產物的分子結構和純度變化，為深入研究修飾血紅蛋白的性能和應用提供了重要的依據。2.4本章總結本章通過一系列實驗成功制備了三重化學修飾的血紅蛋白氧載體，并對其進行了分離純化和鑒定。利用新鮮牛血為原料，經過紅細胞洗滌、血紅蛋白釋放、分離、透析以及離子交換層析和凝膠過濾層析等步驟，成功獲得了高純度的血紅蛋白溶液，回收率達到[X]%，純度達到[X]%以上，為后續修飾反應提供了優質原料。在血紅蛋白修飾過程中，依次進行分子內交聯修飾、分子間聚合修飾以及聚乙二醇修飾，每一步修飾反應都通過優化反應條件，如反應物比例、反應溫度、pH值和反應時間等，成功實現了預期的修飾目標。通過離子交換層析和凝膠過濾層析對修飾產物進行純化，有效去除了未反應的修飾劑、小分子雜質以及未修飾的血紅蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分析和分子排阻高效液相色譜鑒定結果表明，成功制備了分子內交聯血紅蛋白（αα-Hb）、分子間聚合血紅蛋白（Glx-Hb）、雙修飾產物以及八臂聚乙二醇修飾產物，且各修飾產物的純度均達到[X]%以上，分子量與理論預期值相符。然而，實驗過程中也存在一些問題。在血紅蛋白純化過程中，回收率仍有待提高，后續可進一步優化實驗條件，如改進紅細胞破裂方法、減少洗滌和層析過程中的損失等。在修飾反應中，雖然通過優化條件獲得了較高純度的修飾產物，但修飾反應的效率還有提升空間，未來可探索更高效的修飾方法和反應體系。在產物表征方面，雖然運用了多種表征手段，但對于修飾產物的微觀結構和修飾位點的精確分析還不夠深入，后續可結合更先進的技術，如質譜分析等，進行更全面的表征。三、三重化學修飾血紅蛋白氧載體的結構和功能性質研究3.1實驗材料與設備材料：上一章制備并純化得到的三重化學修飾血紅蛋白氧載體（T-Hb）溶液；未修飾的血紅蛋白（Hb）溶液作為對照；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉等試劑用于配制不同pH值的緩沖溶液；2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG），用于研究其對血紅蛋白氧親和力的影響。儀器：圓二色光譜儀（JascoJ-815型，可在190-260nm波長范圍內進行掃描，用于檢測蛋白質的二級結構變化；拉曼光譜儀（RenishawinVia型，激發波長為532nm，掃描范圍為400-2000cm?1，用于分析血紅蛋白分子的結構信息，特別是血紅素基團和多肽鏈的結構變化；血氧分析儀（ABL800型，能夠精確測量血紅蛋白的氧飽和度和氧分壓，用于測定血紅蛋白的氧解離曲線；恒溫搖床（能夠精確控制溫度，用于維持實驗過程中的恒溫條件；pH計（精度為0.01，用于準確測量和調節溶液的pH值。3.2實驗方法3.2.1圓二色光譜表征取適量未修飾血紅蛋白溶液和三重化學修飾血紅蛋白氧載體溶液，分別用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋至蛋白濃度為0.1mg/mL。將稀釋后的樣品轉移至1mm光程的石英比色皿中，使用圓二色光譜儀進行檢測。在190-260nm波長范圍內進行掃描，掃描速度設定為100nm/min，響應時間為1s，掃描帶寬為1nm。每個樣品重復掃描3次，取平均值以減少誤差。測量過程中，保持樣品室溫度為25℃，以消除溫度對光譜的影響。通過分析圓二色光譜數據，利用相關軟件（如CDPro軟件包中的CONTINLL、SELCON3和CDSSTR算法）計算蛋白質的二級結構含量，包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲等。這些算法基于已知結構的蛋白質數據庫，通過與樣品光譜的匹配和擬合，得出各種二級結構的相對含量。比較未修飾血紅蛋白和三重化學修飾血紅蛋白氧載體的二級結構含量，評估修飾過程對血紅蛋白二級結構的影響。3.2.2拉曼光譜表征使用拉曼光譜儀對未修飾血紅蛋白和三重化學修飾血紅蛋白氧載體進行檢測。將樣品滴在潔凈的石英片上，待溶劑揮發后，置于拉曼光譜儀的樣品臺上。采用532nm波長的激光作為激發光源，激光功率設置為10mW，以避免樣品因激光照射而發生光降解或結構變化。在400-2000cm?1的波數范圍內進行掃描，掃描步長為1cm?1，積分時間為10s，每個樣品重復掃描5次，取平均光譜進行分析。分析拉曼光譜中特征峰的位置、強度和峰形變化，獲取血紅蛋白分子結構的信息。在1340-1390cm?1范圍內的拉曼峰與血紅素環內電子密度相關，可反映血紅蛋白的氧化還原態；1470-1650cm?1區域的峰與血紅素中心尺寸相關，能體現鐵離子自旋態的變化。在400-650cm?1范圍內的峰與Fe-配體振動相關，可用于分析血紅素與配體的結合情況。通過比較修飾前后血紅蛋白拉曼光譜特征峰的變化，探討修飾對血紅蛋白分子結構，特別是血紅素基團和多肽鏈結構的影響。3.2.3氧飽和曲線測定采用血氧分析儀測定未修飾血紅蛋白和三重化學修飾血紅蛋白氧載體的氧飽和曲線。將樣品用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋至血紅蛋白濃度為5g/dL。將稀釋后的樣品置于血氧分析儀的樣品池中，在37℃恒溫條件下，逐步改變樣品池中的氧分壓（PO?），范圍從0mmHg到150mmHg。在每個PO?值下，平衡5min，使血紅蛋白與氧氣充分結合或解離，然后測量樣品的氧飽和度（SO?）。以PO?為橫坐標，SO?為縱坐標，繪制氧飽和曲線。根據氧飽和曲線，計算血紅蛋白的P??值，即氧飽和度為50%時的氧分壓。P??值是衡量血紅蛋白對氧親和力的重要指標，P??值越大，表明血紅蛋白對氧的親和力越低，在組織中釋放氧的能力越強。比較未修飾血紅蛋白和三重化學修飾血紅蛋白氧載體的P??值，評估修飾對血紅蛋白氧親和力的影響。3.2.4別構效應分析為研究修飾對血紅蛋白別構效應的影響，在測定氧飽和曲線的基礎上，分析氧結合的正協同性。通過Hill方程對氧飽和曲線進行擬合，計算Hill系數（n）。Hill方程為：Y=[PO?]?/（P???+[PO?]?），其中Y為氧飽和度，PO?為氧分壓，P??為氧飽和度為50%時的氧分壓，n為Hill系數。Hill系數反映了血紅蛋白亞基之間的協同效應，n值越大，表明協同效應越強。研究pH值對血紅蛋白與氧親和力的影響，即玻爾效應。配制不同pH值（如pH7.0、7.2、7.4、7.6、7.8）的磷酸緩沖液，用這些緩沖液分別稀釋未修飾血紅蛋白和三重化學修飾血紅蛋白氧載體樣品，使其血紅蛋白濃度為5g/dL。按照上述氧飽和曲線測定方法，在不同pH值條件下測定氧飽和曲線，計算相應的P??值。分析P??值隨pH值的變化情況，評估修飾對玻爾效應的影響。同樣，研究2,3-二磷酸甘油酸（2,3-DPG）對血紅蛋白氧親和力的影響。在血紅蛋白樣品中加入不同濃度的2,3-DPG（如0mmol/L、1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L），用pH7.4的磷酸緩沖液稀釋至血紅蛋白濃度為5g/dL。測定不同2,3-DPG濃度下的氧飽和曲線，計算P??值，分析2,3-DPG對修飾前后血紅蛋白氧親和力的影響差異。3.2.5自氧化速率及高鐵血紅蛋白（metHb）含量測定將未修飾血紅蛋白和三重化學修飾血紅蛋白氧載體溶液分別置于帶塞的比色管中，濃度均調整為5g/dL，在37℃恒溫條件下孵育。每隔1h，取適量樣品，用紫外可見分光光度計測定其在576nm和540nm處的吸光度。根據公式：metHb%=（A???-0.75A???）/（0.92A???-0.75A???）×100%，計算高鐵血紅蛋白的含量。其中A???和A???分別為樣品在576nm和540nm處的吸光度。以高鐵血紅蛋白含量為縱坐標，時間為橫坐標，繪制高鐵血紅蛋白含量隨時間的變化曲線，曲線的斜率即為自氧化速率。比較未修飾血紅蛋白和三重化學修飾血紅蛋白氧載體的自氧化速率和高鐵血紅蛋白含量隨時間的變化情況，評估修飾對血紅蛋白自氧化穩定性的影響。3.2.6巰基數目滴定采用Ellman試劑（5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)）滴定法測定未修飾血紅蛋白和三重化學修飾血紅蛋白氧載體中巰基的數目。取適量樣品溶液，用pH8.0的Tris-HCl緩沖液稀釋至血紅蛋白濃度為1mg/mL。向稀釋后的樣品溶液中加入過量的Ellman試劑，使Ellman試劑與巰基充分反應。在室溫下避光反應30min后，用紫外可見分光光度計測定反應液在412nm處的吸光度。根據公式：巰基濃度（μmol/L）=A???/（13600×l），計算樣品中巰基的濃度。其中A???為反應液在412nm處的吸光度，l為光程（通常為1cm），13600為Ellman試劑與巰基反應產物在412nm處的摩爾吸光系數。根據樣品的濃度和體積，計算巰基的數目。比較未修飾血紅蛋白和三重化學修飾血紅蛋白氧載體中巰基數目，分析修飾對血紅蛋白巰基含量的影響。3.2.7胰蛋白酶肽圖譜取適量未修飾血紅蛋白和三重化學修飾血紅蛋白氧載體溶液，用pH8.0的Tris-HCl緩沖液稀釋至血紅蛋白濃度為1mg/mL。向樣品溶液中加入胰蛋白酶，使胰蛋白酶與血紅蛋白的質量比為1:50。在37℃恒溫條件下酶解反應4h。反應結束后，加入適量的三氟乙酸（TFA）終止反應，使TFA的終濃度為0.1%。將酶解產物進行反相高效液相色譜（RP-HPLC）分析。選用C??色譜柱，流動相A為含0.1%TFA的水溶液，流動相B為含0.1%TFA的乙腈溶液。采用梯度洗脫程序：0-5min，5%B；5-40min，5%-50%B；40-50min，50%