1組織提取膠原細胞遷移實驗操作指南備、供試液和對照組樣品的制備、細胞制備YY/T1955-2025組織工程醫療器械產品膠原3.13.2較，以此計算細胞的遷移的程度。試驗通常需設定對照組和供試組,對照組包括陽性對照組和空白對照2％）鈣離子）、胰蛋白酶-EDTA（0.25、磷酸鹽緩沖液（P在2℃~8℃條件下充分振搖約2h，離心或者靜置去除吸附劑，取上清FBS，無菌環境下0.22μm濾5.4.6EGF母液（0.1mg/mL）：開瓶前4℃,4000rpm離心5min，加入適量恢復至常溫的0.1%BSA溶液，使終濃度為0.1mg/mL。輕輕混勻溶解EGF并于超低溫冰箱保存。供試液一般宜在測試的當天配置，必要時可提前1天配制并在2℃~8℃冰箱儲存。6.2供試液的制備受試物為可溶性的組織提取膠原蛋白固體時，稱取適量受試物，加入0.1mol/L的醋酸溶液，使受試物充分溶解，溶解后的終濃度為1mg/mL～受試物為組織提取膠原蛋白凝膠或溶液時，參照上述方法進行稀釋，使終濃度為1mg/mL~3推薦使用表皮生長因子（Animal-FreeRecombinantHumanEGF）作為陽從-18℃或以下冰箱中取出一管經分裝的EGF儲存液（10μg/mL于2℃~8℃冰箱放置10min使其徹底溶解，輕輕吹打混勻，使用基礎培養基稀釋至5ng/mL～10ng/mL。陽性對照應儲存于2℃~人表皮角質形成細胞是構成皮膚的其中一種主要細胞。人永生化角質形成細胞（Hacat細胞）適用于評價終產品使用部位為皮膚表面的組織提取膠原蛋白的細7.2細胞來源人永生化角質形成細胞（HaCaT細胞），編號：KCB200442YJ，購7.3細胞代次按照附錄A進行HaCaT細胞去分化培養、凍存、復蘇、用新鮮的完全培養基重懸細胞，制備成密度為3×105cells/mL的8.2細胞培養板畫線將24孔細胞培養板的每個孔，按照上中下8.3細胞種板CO2條件下培養約24h。在倒置顯微鏡下觀察細胞，細胞培養板中央區域的細胞匯合度約80%～90%,且細胞分布均勻、無明顯堆疊，可進行下述步驟，否則應重新準備細胞懸液并種板培養。8.4劃痕制備劃痕，劃痕寬度0.6mm±0.2mm，盡量使劃痕寬度保持一致，深度達到孔底，確保劃痕區域細胞完4定的時間（如24h或48h）。每種濃度的供試液至少分別設置3個復孔。特定的時間（如24h或48h）。陽性對照和空白對照至少分別設置3個復孔。8.7特定時間劃痕圖像收集取培養特定時間后的細胞，在顯微鏡下拍照（拍照視野如圖1所示），記錄培養特定時間后的A0——0h時的劃痕面積;At——經過特定時間后的劃痕面積。9結果判定5a)產品名稱、型號或規格、生產批號等產品信c)記錄試驗細胞的代次和培養條6細胞表現為細胞間連接緊密，呈現多層生長態勢，并逐漸形成島HaCaT細胞為深入研究細胞增殖、遷移、分化以及相關信號通A.2儀器與試劑A.2.1儀器設備二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、離心機、恒溫水浴鍋、細胞培養A.2.2耗材A.2.3試劑無鈣離子）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、谷氨酰胺、鈣離A.3試劑配制A.3.1去鈣離子血清：同5.4.3。A.3.4凍存液：按9:1的體積比將去鈣離子血清和DMSO混合均勻。A.4HaCaT細胞去分化誘導培養A.4.1HaCaT細胞按照供應商提供的說明書進行復蘇和傳代培養，觀察細胞的匯合程度在7080%顯微鏡下觀察到細胞變圓、開始脫落時，加入適量基礎培養基終止消化。注：建議T75培養瓶接種細胞密度為1.0×106～1.5×106。7圖A.1b）去分化過程中的HaCaT細胞狀態：低鈣培養環境下持續觀察細圖A.1c）去分化HaCaT細胞狀態：細待HaCaT細胞去分化狀態穩定后，按照8將凍存的去分化HaCaT細胞迅速置于37℃水浴