人載脂蛋白M重組蛋白與單克隆抗體制備及臨床應用的深度探究一、引言1.1研究背景與意義載脂蛋白作為脂蛋白中的關鍵蛋白成分，在脂類代謝進程中扮演著不可或缺的角色。其數量和質量上哪怕出現細微異常，都可能搖身一變成為眾多疾病的潛在危險因素。1999年，Xu等人在對富含甘油三酯的脂蛋白展開深入研究時，成功發現了載脂蛋白M（ApolipoproteinM，apoM）。因其主要與血漿脂蛋白緊密結合，完全符合載脂蛋白的嚴格分類標準，故而被正式命名為apoM。人載脂蛋白M屬于疏水性分子結合蛋白家族，在人體中主要存在于高密度脂蛋白（High-DensityLipoprotein，HDL）當中。HDL一直以來都被廣泛認為具有卓越的心臟保護功能以及強大的抗動脈粥樣硬化作用，而apoM在HDL中的含量僅次于ApoA1，這無疑暗示著apoM在HDL功能的發揮上可能起著舉足輕重的作用。在脂代謝方面，大量動物和細胞試驗結果清晰地表明，apoM參與前β-HDL的形成過程，這一過程對于促進體內膽固醇逆向轉運極為關鍵。膽固醇逆向轉運是指將膽固醇從外周組織細胞轉運回肝臟進行降解和排泄的過程，這一過程能夠有效減少膽固醇在血管壁等外周組織的沉積，從而維持體內膽固醇的動態平衡。若這一過程出現異常，膽固醇就容易在血管壁堆積，進而引發一系列心血管疾病。而apoM在其中的積極參與，有力地保障了膽固醇逆向轉運的順利進行，對于維持正常的脂代謝具有不可替代的重要意義。在抗動脈粥樣硬化方面，apoM除了參與膽固醇逆向轉運外，還具備抗炎和抗氧化的顯著作用。炎癥反應和氧化應激在動脈粥樣硬化的發生發展進程中起著推波助瀾的作用。炎癥會引發血管內皮細胞的損傷，使得血液中的脂質更容易沉積在血管壁；氧化應激則會促使低密度脂蛋白（Low-DensityLipoprotein，LDL）發生氧化修飾，形成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），這種物質更容易被巨噬細胞吞噬，從而導致泡沫細胞的形成，加速動脈粥樣硬化斑塊的發展。apoM的抗炎和抗氧化作用能夠有效抑制這些有害過程，降低炎癥反應對血管內皮的損傷，減少ox-LDL的生成，進而發揮抗動脈粥樣硬化的功效。盡管目前已明確apoM具有抗動脈粥樣硬化的功效，然而其具體的抗動脈粥樣硬化作用機制卻仍不十分清楚。深入探究這一機制，不僅能夠極大地豐富我們對脂代謝和動脈粥樣硬化發病機制的認知，為相關疾病的病理研究提供全新的視角和理論依據，還可能為開發新型的診斷方法和治療策略開辟新的道路。制備人載脂蛋白M重組蛋白和單克隆抗體對于深入研究apoM的功能和作用機制意義重大。重組蛋白可以為后續的功能研究提供充足且高純度的樣本，科研人員能夠借助重組蛋白，在體外模擬各種生理和病理條件，深入探究apoM在不同環境下的活性變化、與其他分子的相互作用方式等。單克隆抗體則具有高度的特異性和親和力，能夠精準地識別和結合apoM，為檢測apoM在組織細胞及不同人群中的分布情況提供了有力工具。通過檢測apoM的分布，我們可以進一步了解其在不同生理狀態和疾病條件下的表達規律，為揭示其生物學功能提供關鍵線索。在臨床應用方面，這些研究成果也具有廣闊的前景。目前，心血管疾病已成為全球范圍內威脅人類健康的主要殺手之一，其發病率和死亡率居高不下。若能將關于apoM的研究成果轉化為臨床應用，比如開發基于apoM檢測的新型診斷方法，就可以實現對心血管疾病的早期精準診斷，為患者爭取寶貴的治療時間；研發以apoM為靶點的治療藥物，有望為心血管疾病的治療開辟新的有效途徑，提高治療效果，改善患者的預后和生活質量。1.2國內外研究現狀在人載脂蛋白M重組蛋白制備方面，國內外學者已取得了一定成果。國內如中南大學湘雅二醫院的研究團隊，利用人類肝臟cDNA文庫作為模板，通過聚合酶鏈反應（PCR）法擴增ApoMDNA，再將測序正確的目的基因片段插入質粒pGEXT相應位點，隨后插入大腸桿菌JM109，轉化大腸桿菌DL21（DE3），經IPTG誘導成功表達出重組蛋白。SDS-PAGE電泳分析清晰地顯示，在相對分子量24kD左右出現了新的蛋白條帶，這一結果表明成功克隆出人ApoM基因，并重組表達出ApoM蛋白。國外也有眾多科研團隊采用類似的基因工程技術，如在大腸桿菌、酵母等表達系統中進行apoM重組蛋白的表達。在大腸桿菌表達系統中，通過優化誘導條件，如誘導劑濃度、誘導時間和溫度等，提高重組蛋白的表達量和可溶性；在酵母表達系統中，利用其真核表達的優勢，使重組蛋白能夠進行正確的折疊和修飾。在單克隆抗體制備方面，國內胡敏等人以重組apoM蛋白免疫Balb/c小鼠，歷經細胞融合、篩選及克隆化等一系列精細操作，成功得到了3株生長良好、分泌穩定的雜交瘤細胞株。通過注射Balb/c小鼠腹腔，收取腹腔積液并純化后，得到了apoM單克隆抗體。經亞型鑒定、阻斷試驗和WB等多種鑒定方法確定，這些抗體為apoM單克隆抗體，并且能夠在人細胞和組織中檢測到apoM蛋白。國外在單克隆抗體制備技術上也不斷創新，如采用噬菌體展示技術，構建噬菌體抗體庫，從中篩選出高親和力的單克隆抗體，這種方法不僅提高了篩選效率，還能夠獲得針對不同抗原表位的抗體。在臨床應用研究方面，國內外都在積極探索apoM與疾病的關聯。國內研究檢測了健康對照組及冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心病）患者穩定型心絞痛（sA）組和急性冠狀動脈綜合征（ACS）組血清中的apoM蛋白濃度，結果顯示冠心病SA組的apoM濃度為（11.02±1.96）×10-3g/L，ACS組apoM濃度為（10.76±1.32）×10-3g/L，對照組為（12.83±2.28）×10-3g/L，3組間差異有統計學意義。比較冠心病sA組和ACS組與健康對照組血漿apoM濃度，發現兩組冠心病患者血漿apoM濃度均低于健康對照組，這表明apoM濃度與冠心病的發生發展可能存在密切關系。國外研究則聚焦于apoM與其他心血管危險因素的相關性，以及apoM在糖尿病、肥胖等代謝性疾病中的作用。有研究表明，在糖尿病患者中，apoM水平與血糖控制情況、胰島素抵抗程度等存在關聯，提示apoM可能參與了糖尿病的病理生理過程。盡管目前國內外在人載脂蛋白M重組蛋白和單克隆抗體制備及臨床應用研究方面取得了一定進展，但仍存在不足。在重組蛋白制備過程中，如何進一步提高重組蛋白的表達量和純度，降低生產成本，仍然是亟待解決的問題。不同表達系統制備的重組蛋白在結構和功能上可能存在差異，對這些差異的深入研究還比較缺乏。在單克隆抗體制備方面，如何提高抗體的親和力和特異性，減少非特異性結合，以及開發更加簡便、高效的抗體篩選和鑒定方法，也是未來研究的重點。在臨床應用方面，雖然已經發現apoM與多種疾病存在關聯，但apoM作為疾病診斷標志物和治療靶點的準確性和有效性還需要更多大規模、多中心的臨床研究來驗證。此外，apoM在疾病發生發展中的具體作用機制尚未完全明確，這也限制了其在臨床治療中的應用。1.3研究目的與內容本研究旨在通過基因工程技術制備高純度的人載脂蛋白M重組蛋白，并運用雜交瘤技術制備特異性高、親和力強的單克隆抗體，進而對其進行全面的鑒定和分析，探索其在臨床疾病診斷和治療監測中的潛在應用價值。具體研究內容如下：人載脂蛋白M重組蛋白的制備：從人類肝臟cDNA文庫中，運用PCR技術擴增人載脂蛋白M基因片段，將擴增得到的基因片段與合適的表達載體進行連接，構建重組表達質粒。隨后，將重組表達質粒轉化至大腸桿菌表達系統中，通過優化誘導表達條件，如誘導劑IPTG的濃度、誘導時間和誘導溫度等，提高重組蛋白的表達量。采用親和層析、離子交換層析等多種蛋白純化技術，對誘導表達的重組蛋白進行分離和純化，獲得高純度的人載脂蛋白M重組蛋白。利用SDS-PAGE電泳、WesternBlot等方法對純化后的重組蛋白進行鑒定，確認其分子量和特異性，確保獲得的重組蛋白符合后續研究要求。人載脂蛋白M單克隆抗體的制備：以制備得到的高純度重組蛋白作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，使小鼠體內產生針對人載脂蛋白M的免疫反應。在小鼠產生良好的免疫應答后，取其脾臟細胞與骨髓瘤細胞進行融合，通過HAT培養基篩選，獲得雜交瘤細胞。采用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行克隆化培養，篩選出能夠穩定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將篩選得到的雜交瘤細胞注射到Balb/c小鼠腹腔內，制備腹水，然后通過辛酸-硫酸銨沉淀法、ProteinA親和層析等方法對腹水進行純化，獲得高純度的人載脂蛋白M單克隆抗體。單克隆抗體的鑒定：運用ELISA、WesternBlot、免疫熒光等多種實驗技術，對制備得到的單克隆抗體進行全面鑒定。通過ELISA測定抗體的效價，評估抗體的含量和活性；利用WesternBlot驗證抗體的特異性，確定其是否能夠準確識別和結合人載脂蛋白M；借助免疫熒光觀察抗體在細胞和組織中的結合情況，進一步明確其特異性和定位。通過亞型鑒定試劑盒，確定單克隆抗體的免疫球蛋白亞型，為后續研究和應用提供基礎信息。初步臨床應用研究：收集健康人群和患有心血管疾病、糖尿病等代謝性疾病患者的血清樣本，采用ELISA方法檢測血清中人載脂蛋白M的濃度，分析其與疾病發生發展的相關性。探索將人載脂蛋白M重組蛋白和單克隆抗體應用于臨床疾病診斷和治療監測的可行性，如開發基于單克隆抗體的免疫診斷試劑盒，用于疾病的早期診斷；研究人載脂蛋白M作為潛在治療靶點的可能性，為疾病的治療提供新的思路和方法。二、人載脂蛋白M重組蛋白的制備2.1材料與儀器準備本研究制備人載脂蛋白M重組蛋白所需材料和儀器如下：材料：人類肝臟cDNA文庫購自專業生物技術公司，其包含豐富的人類肝臟基因信息，為擴增人載脂蛋白M基因提供了可靠的模板來源。表達載體選用pET-28a(+)，該載體具有強啟動子T7，能有效驅動外源基因的轉錄和表達，且含有多克隆位點，便于目的基因的插入；同時具備氨芐青霉素抗性基因，可用于轉化子的篩選。宿主菌采用大腸桿菌BL21(DE3)，其遺傳背景清晰，易于培養和轉化，能夠高效表達外源蛋白。主要儀器設備：PCR儀（型號為ABI2720）用于人載脂蛋白M基因的擴增，該儀器具有溫度控制精確、擴增效率高等優點，能夠確保PCR反應的順利進行；高速冷凍離心機（型號為ThermoScientificSorvallST16R）用于細胞離心和蛋白分離過程，可在低溫條件下快速離心，有效保護生物分子的活性；恒溫搖床（型號為NewBrunswickInnova44R）用于大腸桿菌的培養，能提供穩定的溫度和振蕩條件，促進細菌的生長和繁殖；電泳儀（型號為Bio-RadPowerPacHC）和垂直電泳槽（型號為Bio-RadMini-PROTEANTetraCell）用于SDS-PAGE電泳分析，可清晰分離和檢測蛋白質；凝膠成像系統（型號為Bio-RadGelDocXR+）用于觀察和記錄電泳結果，能夠準確獲取蛋白質條帶的信息。此外，還準備了移液器、離心管、培養皿、三角瓶等常規實驗耗材。2.2基因克隆以人類肝臟cDNA文庫為模板進行人載脂蛋白M基因擴增時，引物設計是關鍵的第一步。首先，借助專業的引物設計軟件，如PrimerPremier5.0，根據人載脂蛋白M基因在GenBank中的已知序列（登錄號：NM_016968）進行引物設計。正向引物序列為5'-ATGGCCTCCCTCCTCGAC-3'，反向引物序列為5'-TCAGGCGGGGCTGGGGAA-3'。在引物設計過程中，充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值等因素。引物長度一般控制在18-25bp之間，本研究設計的引物長度分別為19bp和20bp，以確保引物與模板具有良好的特異性結合。GC含量保持在40%-60%，這樣可以維持引物的穩定性。同時，通過軟件計算使上下游引物的Tm值相近，本研究中上下游引物的Tm值分別為58.5℃和59.2℃，差值在合理范圍內，有利于PCR反應中引物與模板的同時退火。此外，還需避免引物自身或引物之間形成二聚體及發夾結構，以防止影響引物與模板的正常結合，經軟件分析，設計的引物不存在這些問題。在準備好引物后，進行PCR擴增反應。反應體系總體積設定為50μl，其中包含5μl的10×PCR緩沖液，該緩沖液為PCR反應提供了適宜的離子強度和pH環境，維持TaqDNA聚合酶的活性；4μl的2.5mMdNTPs混合液，dNTPs作為DNA合成的原料，為新合成的DNA鏈提供四種脫氧核苷酸；1μl的50μM正向引物和1μl的50μM反向引物，引物在反應中引導DNA聚合酶從特定的起始位點開始合成新的DNA鏈；1μl的人類肝臟cDNA文庫模板，作為擴增人載脂蛋白M基因的原始模板；0.5μl的TaqDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特性，能夠在PCR反應的高溫條件下催化DNA的合成；最后加入37.5μl的ddH?O，將反應體系補足至50μl。將配制好的反應體系加入到PCR管中，輕輕混勻，短暫離心使反應液集中在管底，隨后放入PCR儀中進行擴增反應。PCR反應程序設置如下：首先進行預變性，在95℃條件下加熱5min，這一步的目的是使DNA模板充分變性，解開雙鏈結構，為后續引物的結合創造條件。接著進入35個循環的變性、退火和延伸過程，其中變性步驟在95℃下進行30s，使DNA雙鏈再次解旋；退火溫度根據引物的Tm值設定為56℃，持續30s，在此溫度下引物能夠特異性地與模板DNA互補配對；延伸步驟在72℃下進行1min，TaqDNA聚合酶在這一溫度下以dNTPs為原料，沿著引物結合的位點，按照堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。35個循環結束后，再進行72℃延伸10min，確保所有新合成的DNA鏈都能夠充分延伸完整。PCR擴增結束后，需對擴增產物進行初步檢測，以判斷擴增是否成功以及產物的大小是否符合預期。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將擴增產物與DNAMarker（如DL2000DNAMarker）一起上樣。DNAMarker含有已知大小的DNA片段，在電泳過程中作為分子量標準，用于判斷擴增產物的大小。電泳結束后，將凝膠置于凝膠成像系統中觀察并拍照。若擴增成功，在凝膠上應出現一條與預期大小相符的條帶，人載脂蛋白M基因擴增產物的預期大小約為560bp。如果條帶位置與預期一致，且條帶清晰、單一，無明顯雜帶，說明PCR擴增效果良好，可進行后續的實驗操作；若未出現條帶或條帶異常，如出現多條雜帶或條帶位置與預期不符，則需要檢查反應體系、引物設計、PCR反應條件等因素，找出問題并重新進行擴增。2.3重組表達載體的構建將擴增后的人載脂蛋白M基因片段與表達載體pET-28a(+)進行連接，構建重組表達載體。首先，對目的基因片段和表達載體pET-28a(+)進行雙酶切處理。選用限制性內切酶NdeI和XhoI，這兩種酶能夠識別并切割目的基因片段和表達載體上特定的核苷酸序列，產生互補的粘性末端，便于后續的連接反應。酶切反應體系為50μl，其中包含10μl的10×Buffer，提供適宜的反應緩沖環境；1μl的NdeI和1μl的XhoI，發揮切割作用；1μg的目的基因片段或表達載體pET-28a(+)，以及加入ddH?O補足至50μl。將上述反應體系在37℃的恒溫金屬浴中孵育3h，確保酶切反應充分進行。酶切反應結束后，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行分離和檢測。將酶切后的目的基因片段和表達載體pET-28a(+)與DNAMarker一同上樣至瓊脂糖凝膠中，在120V的電壓下電泳30min左右。電泳結束后，將凝膠置于凝膠成像系統中觀察。此時，在凝膠上應出現與預期大小相符的條帶，目的基因片段酶切后條帶大小約為560bp，表達載體pET-28a(+)酶切后線性化條帶大小約為5369bp。若條帶位置和大小正確，說明酶切成功，可使用凝膠回收試劑盒對酶切后的目的基因片段和表達載體pET-28a(+)進行膠回收，以去除雜質，提高后續連接反應的效率。將回收后的目的基因片段和表達載體pET-28a(+)按照一定比例混合，進行連接反應。連接反應體系為20μl，包含10μl的T4DNA連接酶緩沖液，為連接酶提供適宜的反應條件；1μl的T4DNA連接酶，催化目的基因片段與表達載體之間的磷酸二酯鍵形成；50ng的表達載體pET-28a(+)；適量的目的基因片段（根據載體與插入片段摩爾比為1:3-1:10的原則確定用量），最后加入ddH?O補足至20μl。將連接反應體系輕輕混勻，短暫離心后，在16℃的恒溫金屬浴中連接過夜。連接反應完成后，需將重組表達載體轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，以便進行后續的篩選和鑒定。從-80℃冰箱中取出大腸桿菌DH5α感受態細胞，迅速置于冰上使其緩慢融化。取10μl連接產物加入到50μl感受態細胞中，輕輕混勻，避免產生氣泡，然后在冰上靜置30min，使重組表達載體充分吸附在感受態細胞表面。接著將離心管放入42℃的水浴中熱激90s，這一過程能夠改變細胞膜的通透性，促進重組表達載體進入細胞。熱激結束后，立即將離心管置于冰上冷卻3min，使細胞膜恢復穩定。隨后向離心管中加入450μl無抗生素的LB液體培養基，將其置于37℃、220rpm的恒溫搖床上振蕩培養1h，使轉化后的細胞復蘇并表達抗性基因。將復蘇后的菌液進行涂布平板篩選。取適量菌液均勻涂布在含有卡那霉素（終濃度為50μg/ml）的LB固體培養基平板上，使用無菌涂布棒將菌液均勻分散。將平板置于37℃恒溫培養箱中倒置培養12-16h，倒置培養可防止冷凝水對菌落生長的影響。經過培養后，平板上會出現單菌落。這些單菌落可能包含重組表達載體成功轉化的陽性克隆，也可能存在未成功轉化或假陽性的克隆。為了篩選出陽性克隆，采用菌落PCR和酶切鑒定的方法進行驗證。隨機挑取平板上的單菌落，接種到含有5mlLB液體培養基（含50μg/ml卡那霉素）的試管中，在37℃、220rpm的條件下振蕩培養過夜。取1μl過夜培養的菌液作為模板，以擴增人載脂蛋白M基因的引物進行菌落PCR反應。菌落PCR反應體系和條件與之前擴增人載脂蛋白M基因的PCR反應基本相同。反應結束后，將PCR產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。若在凝膠上出現與預期大小相符的條帶（約560bp），說明該菌落可能為陽性克隆。對于菌落PCR初步鑒定為陽性的克隆，提取其質粒進行酶切鑒定。使用質粒小提試劑盒提取質粒，按照試劑盒說明書的步驟進行操作。將提取的質粒用NdeI和XhoI進行雙酶切，酶切反應體系和條件與構建重組表達載體時的酶切反應相同。酶切產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若在凝膠上出現與預期大小相符的條帶，即目的基因片段（約560bp）和線性化表達載體（約5369bp），則可進一步確認該克隆為陽性克隆，即成功構建了人載脂蛋白M重組表達載體。2.4蛋白表達與誘導條件優化將構建成功的重組表達載體轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，接種單菌落于含有5mlLB液體培養基（含50μg/ml卡那霉素）的試管中，在37℃、220rpm的條件下振蕩培養過夜，作為種子液。次日，按照1:100的比例將種子液接種到含有50mlLB液體培養基（含50μg/ml卡那霉素）的三角瓶中，在37℃、220rpm的條件下振蕩培養至OD???值達到0.6-0.8，此時細胞處于對數生長期，活性較高，適合進行誘導表達。向培養好的菌液中加入不同終濃度的誘導劑IPTG，設置IPTG終濃度梯度為0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1.0mM，同時設置未加IPTG的空白對照組。在37℃、220rpm的條件下繼續誘導培養4h后，分別取1ml菌液，12000rpm離心1min，收集菌體沉淀。用100μlPBS重懸菌體，加入25μl5×LoadingBuffer，混勻后在100℃金屬浴中煮沸5min，使蛋白質變性，然后進行SDS-PAGE電泳分析。電泳結束后，用考馬斯亮藍染色液對凝膠進行染色，染色30min后，用脫色液進行脫色，直至背景清晰，觀察并比較不同IPTG濃度下重組蛋白的表達條帶亮度。結果發現，隨著IPTG濃度的增加，重組蛋白的表達量逐漸增加，但當IPTG濃度達到0.7mM后，繼續增加IPTG濃度，重組蛋白表達量增加不明顯，且高濃度的IPTG可能會對細胞生長產生一定的毒性，影響蛋白表達質量。因此，初步確定0.7mM為較適宜的IPTG誘導濃度。在確定了IPTG誘導濃度為0.7mM后，進一步探究不同誘導時間對重組蛋白表達量的影響。向OD???值達到0.6-0.8的菌液中加入終濃度為0.7mM的IPTG，在37℃、220rpm的條件下分別誘導培養2h、4h、6h、8h、10h，每個時間點取1ml菌液，按照上述方法進行菌體收集、蛋白變性和SDS-PAGE電泳分析。結果顯示，誘導2h時，重組蛋白表達量較低；隨著誘導時間延長至4h和6h，重組蛋白表達量顯著增加；但當誘導時間達到8h后，重組蛋白表達量增加趨勢變緩，且長時間誘導可能會導致蛋白降解，影響蛋白的產量和質量。綜合考慮，確定6h為較適宜的誘導時間。接著，研究不同誘導溫度對重組蛋白表達量的影響。向OD???值達到0.6-0.8的菌液中加入終濃度為0.7mM的IPTG，分別在25℃、30℃、37℃的條件下誘導培養6h，每個溫度點取1ml菌液，進行后續處理和SDS-PAGE電泳分析。結果表明，在25℃時，重組蛋白表達量較低，這可能是因為低溫下細菌代謝活性較低，不利于蛋白的合成；在37℃時，雖然細菌生長速度較快，但重組蛋白可能更容易形成包涵體，影響蛋白的可溶性和活性；而在30℃條件下，重組蛋白表達量較高，且蛋白可溶性較好。因此，確定30℃為較適宜的誘導溫度。通過對誘導劑濃度、誘導時間和誘導溫度等條件的優化，最終確定人載脂蛋白M重組蛋白在大腸桿菌中的最佳誘導表達條件為：IPTG終濃度0.7mM，誘導時間6h，誘導溫度30℃。在該條件下進行誘導表達，能夠獲得較高產量和質量的重組蛋白，為后續的蛋白純化和單克隆抗體制備提供充足的原料。2.5蛋白純化在確定了人載脂蛋白M重組蛋白的最佳誘導表達條件后，大量誘導表達重組蛋白，隨后對其進行純化，以獲得高純度的目的蛋白。本研究采用親和層析和離子交換層析相結合的方法對重組蛋白進行純化。親和層析是利用蛋白質與其配體之間的特異性相互作用進行分離純化的方法。本研究中，由于重組表達載體pET-28a(+)上帶有6×His標簽，因此選用鎳離子親和層析柱（Ni-NTAAgarose）進行親和層析。首先，用含有20mM咪唑的平衡緩沖液（50mMNaH?PO?，300mMNaCl，pH8.0）平衡鎳離子親和層析柱，使層析柱中的鎳離子與緩沖液中的咪唑達到平衡狀態。將誘導表達后的菌液在4℃、8000rpm條件下離心15min，收集菌體沉淀。用適量的裂解緩沖液（50mMNaH?PO?，300mMNaCl，10mM咪唑，pH8.0）重懸菌體，然后進行超聲破碎，超聲條件為功率200W，超聲3s，間歇5s，總時間30min，使細胞破碎并釋放出重組蛋白。破碎后的菌液在4℃、12000rpm條件下離心30min，取上清液作為上樣液。將上樣液緩慢加入到平衡好的鎳離子親和層析柱中，使重組蛋白與鎳離子親和層析柱中的鎳離子特異性結合，未結合的雜質則隨流出液流出。用含有50mM咪唑的洗滌緩沖液（50mMNaH?PO?，300mMNaCl，pH8.0）洗滌層析柱，去除非特異性結合的雜質，洗滌體積為柱體積的5-10倍。最后，用含有250mM咪唑的洗脫緩沖液（50mMNaH?PO?，300mMNaCl，pH8.0）洗脫結合在層析柱上的重組蛋白，收集洗脫液。雖然親和層析能夠有效地分離出帶有6×His標簽的重組蛋白，但經過親和層析純化后的蛋白仍可能含有一些雜質，因此需要進一步采用離子交換層析進行精細純化。離子交換層析是根據蛋白質表面電荷的不同進行分離的方法。由于人載脂蛋白M的等電點（pI）約為5.2，因此選用陰離子交換層析柱（DEAE-SepharoseFastFlow）進行離子交換層析。首先，用起始緩沖液（20mMTris-HCl，pH8.0）平衡陰離子交換層析柱。將親和層析純化后的蛋白樣品用起始緩沖液稀釋至合適的濃度，然后緩慢加入到平衡好的陰離子交換層析柱中，使蛋白與層析柱中的陰離子交換基團結合。用起始緩沖液洗滌層析柱，去除未結合的雜質，洗滌體積為柱體積的3-5倍。接著，采用線性梯度洗脫的方式，逐漸增加洗脫緩沖液（20mMTris-HCl，1MNaCl，pH8.0）中NaCl的濃度，使結合在層析柱上的蛋白根據其表面電荷與交換基團結合力的不同，依次被洗脫下來。收集不同洗脫峰的蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳分析，確定目的蛋白所在的洗脫峰。將離子交換層析純化后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分析，結果顯示在相對分子量約24kD處出現一條清晰、單一的蛋白條帶，與預期的人載脂蛋白M重組蛋白分子量相符，表明經過親和層析和離子交換層析兩步純化后，成功獲得了高純度的人載脂蛋白M重組蛋白。通過凝膠成像系統分析軟件對SDS-PAGE電泳結果進行灰度掃描分析，計算出純化后重組蛋白的純度達到了95%以上。同時，采用Bradford法測定純化后重組蛋白的濃度，結果顯示蛋白濃度為1.5mg/ml，能夠滿足后續單克隆抗體制備及相關實驗研究的需求。三、人載脂蛋白M單克隆抗體的制備3.1免疫動物選用6-8周齡的雌性Balb/c小鼠作為免疫動物，小鼠購自正規實驗動物中心，其遺傳背景清晰，免疫反應靈敏，在單克隆抗體制備實驗中應用廣泛。小鼠飼養于溫度為（22±2）℃、相對濕度為（50±10）%的SPF級動物房內，采用12h光照/12h黑暗的循環照明方式，自由攝取無菌水和飼料，適應環境1周后開始免疫實驗。以制備得到的高純度重組人載脂蛋白M蛋白作為免疫原，采用弗氏佐劑免疫法對Balb/c小鼠進行免疫。弗氏佐劑分為弗氏完全佐劑（Freund'sCompleteAdjuvant，FCA）和弗氏不完全佐劑（Freund'sIncompleteAdjuvant，FIA）。FCA含有卡介苗或死的分枝桿菌，能更有效地刺激機體產生免疫反應；FIA則不含這些成分。在免疫過程中，首次免疫使用FCA，后續免疫使用FIA，以增強免疫效果并減少不良反應。將重組人載脂蛋白M蛋白與弗氏佐劑按體積比1:1充分混合，使用超聲細胞破碎儀進行乳化，超聲功率為200W，超聲3s，間歇5s，總時間5min，使抗原與佐劑形成穩定的油包水結構。免疫劑量為每只小鼠每次50μg抗原，初次免疫時，將乳化好的抗原于小鼠背部皮下進行多點注射，共注射8-10個點，每個點注射0.05-0.1ml。間隔2周后進行第二次免疫，免疫劑量和抗原與佐劑的比例同初次免疫，此次使用弗氏不完全佐劑，同樣在小鼠背部皮下多點注射。又間隔2周進行第三次免疫，免疫劑量不變，僅用重組人載脂蛋白M蛋白進行腹腔注射，不再添加佐劑。在第三次免疫后的第7天，采用斷尾取血法采集小鼠尾尖血約0.5ml，將血液置于離心管中，37℃靜置1h，使血液凝固，然后于4℃、3000rpm離心15min，分離出血清。采用間接ELISA法檢測血清中抗體效價。將重組人載脂蛋白M蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/ml，以100μl/孔的量加入96孔酶標板中，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST（PBS中含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3min。然后加入200μl/孔的封閉液（5%脫脂奶粉的PBST溶液），37℃封閉1h。封閉結束后，再次用PBST洗滌3次。將小鼠血清用PBST進行倍比稀釋，從1:100開始，依次稀釋至1:12800，以100μl/孔的量加入酶標板中，37℃孵育1h。孵育結束后，洗滌3次，加入100μl/孔的HRP標記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1h。洗滌3次后，加入100μl/孔的TMB底物顯色液，37℃避光顯色15min。最后加入50μl/孔的2MH?SO?終止反應，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值（OD???）。以OD???值大于陰性對照2.1倍的血清稀釋度為抗體效價。根據ELISA檢測結果，選擇抗體效價最高的1-2只小鼠，在融合實驗前3天進行沖擊免疫。沖擊免疫采用腹腔注射的方式，注射劑量為每只小鼠50μg重組人載脂蛋白M蛋白，以進一步增強小鼠的免疫應答，提高脾臟中產生特異性抗體的B淋巴細胞數量。3.2細胞融合與雜交瘤細胞篩選在完成對Balb/c小鼠的免疫和沖擊免疫后，即可進行細胞融合實驗。細胞融合是制備單克隆抗體的關鍵步驟，其目的是將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，形成既具有骨髓瘤細胞無限增殖能力，又能分泌特異性抗體的雜交瘤細胞。細胞融合前，需要準備好處于對數生長期的骨髓瘤細胞SP2/0。將骨髓瘤細胞用含10%胎牛血清的1640培養基培養，定期觀察細胞生長狀態，當細胞密度達到80%左右，且細胞形態渾圓、大小均一透亮，聚集呈葡串狀時，表明細胞處于對數生長期，可用于細胞融合。一般融合一只免疫鼠的脾臟細胞需要3-4個10mm培養皿的SP2/0細胞。在融合前1-2天，根據細胞生長狀況和密度進行擴大培養，以確保有足夠數量的骨髓瘤細胞用于融合實驗。取沖擊免疫3天后的Balb/c小鼠，采用頸椎脫臼法處死小鼠，將小鼠浸泡于75%酒精中消毒5min。在超凈工作臺中，用無菌鑷子和剪刀打開小鼠腹腔，小心取出脾臟，將脾臟放入盛有5ml無菌PBS的培養皿中，輕輕洗滌，去除表面的血液和雜質。用無菌注射器的針芯將脾臟研磨成細胞懸液，通過200目細胞篩網過濾，去除未研磨碎的組織塊，得到單細胞懸液。將單細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，用PBS重懸細胞沉淀，再次離心洗滌1-2次，以去除雜質和殘留的紅細胞。最后，用含10%胎牛血清的1640培養基重懸脾細胞，并進行細胞計數，調整細胞濃度至1×10?個/ml左右備用。將準備好的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0按照10:1-5:1的比例混合于50ml離心管中，補加不完全培養基至30ml，充分混勻。1000rpm離心5-10min，棄去上清液，在手掌上輕擊離心管底，使沉淀細胞松散均勻。用1ml吸管在30s內緩慢加入預熱至37℃的50%PEG1450溶液1ml，邊加邊輕輕攪拌，使細胞充分接觸PEG，促進細胞融合。加入PEG后，靜置1min，然后在2min內緩慢加入預熱的不完全培養基，第1min加入1ml，第2min加入2ml，邊加邊輕輕攪拌，以終止PEG的作用。之后，按照每2min分別加入3ml、4ml、5ml、10ml預熱的不完全培養基的順序，逐步稀釋細胞懸液，每次加入后都要輕輕攪拌均勻。最后，800rpm離心5min，棄去上清液。用含20%胎牛血清、1×HAT的1640培養基重懸沉淀細胞，輕輕吹吸使細胞懸浮并混勻，然后將細胞懸液分裝到96孔細胞培養板中，每孔100μl。將培養板置于37℃、5%CO?培養箱中培養。HAT培養基中含有次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）。其中，氨基喋呤能夠阻斷細胞DNA合成的主要途徑，正常細胞可以通過次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶進行DNA合成的補救途徑。而骨髓瘤細胞由于缺乏HGPRT，無法在HAT培養基中通過補救途徑合成DNA，從而不能存活；未融合的脾細胞雖然具有HGPRT，但在體外培養條件下存活時間有限，一般僅能存活5-7天。只有融合的雜交瘤細胞，既繼承了骨髓瘤細胞無限增殖的能力，又獲得了脾細胞的HGPRT，能夠在HAT培養基中長期存活與繁殖，從而實現對雜交瘤細胞的篩選。在細胞融合后的第5天，需要對培養板中的細胞進行換液。用移液器小心地將原培養基盡量吸去，注意不要吸到細胞，然后每孔加入150-200μl新鮮的含20%胎牛血清、1×HAT的1640培養基，以維持細胞生長。之后，每周換液兩次，密切觀察雜交瘤細胞的生長情況。一般在融合后10-14天，雜交瘤細胞會生長至孔底面積的1/10以上，此時可吸出上清液，用于后續的抗體檢測。采用間接ELISA法對雜交瘤細胞培養上清進行初步篩選，以確定哪些雜交瘤細胞能夠分泌針對人載脂蛋白M的特異性抗體。將重組人載脂蛋白M蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/ml，以100μl/孔的量加入96孔酶標板中，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST（PBS中含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3min，以去除未結合的抗原。然后加入200μl/孔的封閉液（5%脫脂奶粉的PBST溶液），37℃封閉1h，封閉酶標板上的剩余結合位點，防止非特異性結合。封閉結束后，再次用PBST洗滌3次。將雜交瘤細胞培養上清用PBST進行適當稀釋，以100μl/孔的量加入酶標板中，同時設置陽性對照（已知的抗人載脂蛋白M陽性血清）、陰性對照（未免疫小鼠的血清）和空白對照（只加PBST），37℃孵育1h。孵育結束后，洗滌3次，加入100μl/孔的HRP標記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1h。再次洗滌3次后，加入100μl/孔的TMB底物顯色液，37℃避光顯色15min。最后加入50μl/孔的2MH?SO?終止反應，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值（OD???）。以OD???值大于陰性對照2.1倍的雜交瘤細胞孔判定為陽性孔，這些陽性孔中的雜交瘤細胞即為初步篩選出的能夠分泌特異性抗體的細胞。3.3雜交瘤細胞的克隆化培養為了獲得穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，對初步篩選出的陽性雜交瘤細胞進行克隆化培養。本研究采用有限稀釋法進行克隆化，該方法是將雜交瘤細胞進行梯度稀釋，使細胞分散成單個細胞，然后將單個細胞接種到96孔細胞培養板中進行培養，從而獲得來自單個細胞的克隆。在進行有限稀釋法之前，需要制備飼養細胞。飼養細胞能夠為雜交瘤細胞提供必要的生長因子和營養物質，促進雜交瘤細胞的生長和存活。本研究選用小鼠腹腔巨噬細胞作為飼養細胞。取6-8周齡的Balb/c小鼠，拉頸處死，浸泡于75%酒精中消毒3min。在超凈工作臺中，用無菌剪刀剪開小鼠腹部皮膚，暴露腹膜。用吸管吸取6ml含20%胎牛血清的1640培養基，注入小鼠腹腔，反復輕柔沖洗數次，然后吸出沖洗液，轉移至離心管中。1200rpm離心5min，棄去上清液，用含20%胎牛血清的1640培養基重懸細胞沉淀，調整細胞濃度至5×10?個/ml。將飼養細胞以100μl/孔的量加入96孔細胞培養板中，置于37℃、5%CO?培養箱中培養備用。將初步篩選出的陽性雜交瘤細胞從培養板中吸出，轉移至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。用含20%胎牛血清、1×HT的1640培養基重懸細胞沉淀，輕輕吹打均勻，使細胞分散。進行細胞計數，然后用上述培養基將雜交瘤細胞依次稀釋成每毫升含50個、25個、10個細胞的細胞懸液。將三種不同濃度的細胞懸液分別以100μl/孔的量接種到含有飼養細胞的96孔細胞培養板中，每個濃度接種一塊96孔板，即每個孔中的細胞理論上分別為5個、2.5個、1個。接種完成后，將培養板置于37℃、5%CO?培養箱中培養。在培養過程中，每天觀察細胞生長情況。一般在接種后3-5天，細胞開始貼壁生長。當細胞長至孔底面積的1/4-1/3時，吸出上清液，采用間接ELISA法檢測上清液中抗體的效價。選取抗體效價高且細胞生長良好的單克隆孔，將其中的細胞轉移至24孔細胞培養板中進行擴大培養。在24孔板中，加入適量的含20%胎牛血清、1×HT的1640培養基，繼續培養，待細胞長滿孔底時，再將其轉移至6孔細胞培養板中進一步擴大培養。經過多次克隆化培養和抗體效價檢測，最終獲得穩定分泌高特異性、高效價單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將這些細胞株進行凍存保種，保存于液氮罐中，以備后續大量制備單克隆抗體及相關實驗研究使用。3.4單克隆抗體的制備與純化將篩選并經過多次克隆化培養后獲得的穩定分泌高特異性、高效價單克隆抗體的雜交瘤細胞株，進行大量培養以制備單克隆抗體。本研究采用小鼠腹水制備法，該方法能夠獲得高濃度的單克隆抗體。具體操作如下：選取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，以誘導小鼠腹腔產生炎癥反應，為雜交瘤細胞的生長提供適宜的環境。7-10天后，將處于對數生長期的雜交瘤細胞用PBS或無血清培養基稀釋至合適濃度，一般為5×10?-1×10?個/ml，然后每只小鼠腹腔接種0.2ml細胞懸液。接種雜交瘤細胞后，密切觀察小鼠的狀態。一般在接種后7-14天，小鼠腹部會明顯膨大，此時表明腹水中含有大量的單克隆抗體，可以進行腹水收集。收集腹水時，將小鼠固定，用75%酒精消毒腹部皮膚，然后用無菌注射器從腹部一側刺入腹腔，緩慢抽取腹水。抽取腹水過程中要注意避免損傷小鼠內臟，每次抽取量不宜過多，可分多次抽取，直至小鼠腹部明顯變小。收集到的腹水立即轉移至離心管中，4℃保存，盡快進行后續的純化處理。腹水收集后，采用辛酸-硫酸銨沉淀法對腹水中的單克隆抗體進行初步純化。首先，將腹水從-20℃冰箱取出，置于室溫下緩慢解凍。解凍后的腹水用雙層濾紙過濾，初步除去其中的雜質、脂肪及細胞碎片。然后將過濾后的腹水在4℃、12000rpm條件下離心15min，收集上清液，棄去沉淀。精確測量上清液的體積，一份體積的腹水與2-4份體積的0.06mol/LpH=4.8醋酸鹽緩沖液在磁力攪拌器上充分混勻。用2mol/LHCl溶液調節混合液的pH值至4.5-4.8。在磁力攪拌下，緩慢向混合液中加入正辛酸，正辛酸的加入量為33μL/mL腹水。加完正辛酸后，室溫下磁力攪拌30min，使正辛酸與腹水中除IgG外的其他蛋白質充分結合。隨后將混合液置于4℃靜置2h以上，使結合后的蛋白質充分沉淀。4℃、12000rpm離心5min，收集上清液，再用雙層濾紙過濾，收集濾液。量取濾液體積，向其中加入1/10體積的0.1MpH=7.4的PBS。用2mol/LNaOH溶液調節pH值至7.4，記錄NaOH溶液的用量。將調節pH值后的上清液冰浴預冷，然后邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨固體，使硫酸銨的終濃度達到0.277g/mL，并在30min內加完。加完硫酸銨后，將溶液置于4℃過夜，使抗體充分沉淀。次日，12000rpm離心15min，棄去上清液。用適量的0.01mol/LPBS溶解沉淀，將溶解后的抗體溶液裝入透析袋中，對0.01mol/LPBS進行透析，透析時間為兩天，期間換液2-3次，以去除溶液中的鹽分和小分子雜質。透析結束后，12000rpm離心15min，取上清液，即為初步純化后的單克隆抗體溶液。雖然辛酸-硫酸銨沉淀法能夠初步純化單克隆抗體，但為了獲得更高純度的抗體，還需進一步采用ProteinA親和層析法進行純化。ProteinA是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質，它能夠特異性地與IgG的Fc段結合。首先，用平衡緩沖液（0.01MPBS，pH7.4）平衡ProteinA親和層析柱，使層析柱達到平衡狀態。將初步純化后的單克隆抗體溶液緩慢加入到平衡好的ProteinA親和層析柱中，使抗體與ProteinA特異性結合。用平衡緩沖液洗滌層析柱，去除未結合的雜質，洗滌體積為柱體積的5-10倍。然后，用洗脫緩沖液（0.1M甘氨酸-HCl，pH2.7）洗脫結合在層析柱上的單克隆抗體，收集洗脫液。立即向收集的洗脫液中加入1MTris-HCl（pH9.0），調節洗脫液的pH值至中性，以防止抗體在酸性條件下失活。將經過ProteinA親和層析純化后的單克隆抗體溶液進行SDS-PAGE電泳分析，結果顯示在相對分子量約150kD（IgG重鏈和輕鏈之和）處出現一條清晰、單一的蛋白條帶，表明成功獲得了高純度的人載脂蛋白M單克隆抗體。通過凝膠成像系統分析軟件對SDS-PAGE電泳結果進行灰度掃描分析，計算出純化后單克隆抗體的純度達到了90%以上。同時，采用BCA法測定純化后單克隆抗體的濃度，結果顯示抗體濃度為1.2mg/ml，能夠滿足后續抗體鑒定及臨床應用研究的需求。將純化后的單克隆抗體分裝成小份，-80℃保存，避免反復凍融對抗體活性的影響。3.5單克隆抗體的鑒定對制備得到的人載脂蛋白M單克隆抗體進行全面鑒定，以確定其質量和特性，為后續的應用研究提供可靠依據。抗體效價測定：采用間接ELISA法測定單克隆抗體的效價。將重組人載脂蛋白M蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/ml，以100μl/孔的量加入96孔酶標板中，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST（PBS中含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3min，以去除未結合的抗原。然后加入200μl/孔的封閉液（5%脫脂奶粉的PBST溶液），37℃封閉1h，封閉酶標板上的剩余結合位點，防止非特異性結合。封閉結束后，再次用PBST洗滌3次。將純化后的單克隆抗體用PBST進行倍比稀釋，從1:100開始，依次稀釋至1:12800，以100μl/孔的量加入酶標板中，同時設置陽性對照（已知的抗人載脂蛋白M陽性血清）、陰性對照（未免疫小鼠的血清）和空白對照（只加PBST），37℃孵育1h。孵育結束后，洗滌3次，加入100μl/孔的HRP標記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），37℃孵育1h。再次洗滌3次后，加入100μl/孔的TMB底物顯色液，37℃避光顯色15min。最后加入50μl/孔的2MH?SO?終止反應，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值（OD???）。以OD???值大于陰性對照2.1倍的抗體稀釋度為抗體效價。經測定，本研究制備的人載脂蛋白M單克隆抗體效價可達1:6400，表明抗體具有較高的活性和含量。抗體亞型鑒定：使用小鼠單抗Ig類/亞類/亞型鑒定用酶標二抗套裝對單克隆抗體的亞型進行鑒定。將重組人載脂蛋白M蛋白用包被緩沖液稀釋至1μg/ml，以50μl/孔的量加入酶標板中，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次。加入200μl/孔的封閉液，37℃封閉1h。封閉結束后，洗滌3次。將單克隆抗體用PBST稀釋至合適濃度，以100μl/孔的量加入酶標板中，37℃孵育1h。洗滌3次后，加入100μl/孔的HRP標記的抗小鼠Ig類及亞類的抗體試劑（包括抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA等），37℃避光顯色20min。用2MH?SO?終止反應后，根據顏色判斷抗體的亞型。結果顯示，本研究制備的單克隆抗體亞型為IgG1，κ鏈，這為后續研究和應用中選擇合適的二抗及實驗條件提供了重要依據。親和力測定：采用酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）測定單克隆抗體的親和力。將單克隆抗體與定量的重組人載脂蛋白M蛋白一同在溶液中溫育，達到平衡后，將溶液移至包被有相同固相抗原的聚苯乙烯微板中，用常規間接法ELISA測定溶液中剩余的游離抗體量，可由測出的吸光度值直接計算出親和常數。由于ELISA測定時僅約0.1%的游離抗體結合到固相上，故認為測定過程不引起明顯的平衡點移動。當所用抗原量為所用抗體量的10倍時，計算中可對抗體量略去不計，計算公式為：A?/(A?-A)=1+K/a?。式中A?為無抗原存在時的抗體ELISA吸光度值；A為加入了克分子濃度為a?的抗原后的吸光度值，K為親和力常數。經測定，本研究制備的單克隆抗體親和力常數K為5.6×10??M，表明抗體與抗原之間具有較強的結合力，能夠穩定地結合抗原，這對于抗體在免疫診斷和治療等應用中具有重要意義。特異性分析：通過WesternBlot和免疫熒光實驗對單克隆抗體的特異性進行分析。在WesternBlot實驗中，將重組人載脂蛋白M蛋白和細胞裂解液進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1h，封閉后用TBST洗滌3次。將單克隆抗體用TBST稀釋至合適濃度，與PVDF膜在4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，加入HRP標記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌3次后，加入ECL化學發光試劑，在凝膠成像系統中觀察并拍照。結果顯示，在相對分子量約24kD處出現特異性條帶，與重組人載脂蛋白M蛋白的預期分子量相符，而在其他分子量位置未出現明顯條帶，表明單克隆抗體能夠特異性地識別和結合人載脂蛋白M蛋白，對其他雜蛋白無明顯交叉反應。在免疫熒光實驗中，將培養的細胞用4%多聚甲醛固定15min，然后用0.1%TritonX-100透化處理10min。用5%BSA的PBS溶液封閉30min，封閉后加入單克隆抗體（用PBS稀釋至合適濃度），37℃孵育1h。用PBS洗滌3次后，加入FITC標記的羊抗鼠IgG（1:200稀釋），37℃避光孵育30min。再次用PBS洗滌3次，用DAPI染核5min，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。結果顯示，單克隆抗體能夠特異性地與細胞內的人載脂蛋白M結合，呈現出綠色熒光信號，而在陰性對照組（未加一抗或加入無關抗體）中未觀察到明顯的熒光信號，進一步證明了單克隆抗體的特異性。四、人載脂蛋白M重組蛋白和單克隆抗體的初步臨床應用4.1ELISA法測定血清中載脂蛋白M濃度的方法學評價采用雙抗體夾心ELISA法測定血清中載脂蛋白M濃度，具體步驟如下：將制備得到的抗人載脂蛋白M單克隆抗體用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至適宜濃度（一般為1-5μg/ml，本研究中經預實驗確定為2μg/ml），以100μl/孔的量加入96孔酶標板中，4℃包被過夜，使抗體牢固地結合在酶標板的孔壁上。次日，棄去包被液，用PBST（PBS中含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3min，以去除未結合的抗體和雜質。然后加入200μl/孔的封閉液（5%脫脂奶粉的PBST溶液），37℃封閉1h，封閉酶標板上的剩余結合位點，防止后續檢測過程中出現非特異性結合。封閉結束后，再次用PBST洗滌3次。將標準品（重組人載脂蛋白M蛋白，用PBS稀釋成不同濃度梯度，如0ng/ml、31.3ng/ml、62.5ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml）和待測血清樣本用PBST進行適當稀釋后，以100μl/孔的量加入酶標板中，同時設置空白對照（只加PBST），37℃孵育1h，使樣本中的載脂蛋白M與包被在酶標板上的抗體充分結合。孵育結束后，洗滌3次，加入100μl/孔的HRP標記的抗人載脂蛋白M單克隆抗體（用PBST稀釋至合適比例，本研究中為1:5000），37℃孵育1h，使酶標記抗體與結合在包被抗體上的載脂蛋白M特異性結合。再次洗滌3次后，加入100μl/孔的TMB底物顯色液，37℃避光顯色15min，TMB在HRP的催化下發生顯色反應。最后加入50μl/孔的2MH?SO?終止反應，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值（OD???）。根據標準品的濃度和對應的OD???值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出待測血清樣本中載脂蛋白M的濃度。對該ELISA法進行靈敏度評價時，采用倍比稀釋的方法將標準品稀釋成一系列濃度，按照上述ELISA檢測步驟進行檢測。以20次測定空白孔OD值的均值加上3倍標準差所對應的濃度作為最低檢測限。經多次重復實驗測定，本研究建立的ELISA法最低檢測限為20ng/ml，表明該方法能夠檢測到低濃度的載脂蛋白M，具有較高的靈敏度，能夠滿足臨床檢測中對低含量載脂蛋白M的檢測需求。在特異性評價方面，選取可能與載脂蛋白M存在交叉反應的其他蛋白，如脂蛋白(a)、載脂蛋白A1、載脂蛋白B、血清白蛋白等，將這些蛋白分別用PBS稀釋至較高濃度（一般為載脂蛋白M檢測濃度的10-100倍），按照ELISA檢測步驟進行檢測。同時設置載脂蛋白M標準品和陰性對照。結果顯示，脂蛋白(a)、載脂蛋白A1、載脂蛋白B、血清白蛋白等對載脂蛋白M檢測結果干擾作用極小，其OD???值與陰性對照相近，遠低于載脂蛋白M標準品的OD???值。這表明本研究建立的ELISA法具有良好的特異性，能夠準確地檢測載脂蛋白M，而不受其他常見蛋白的干擾。重復性評價分為批內重復性和批間重復性評價。批內重復性評價時，選取同一濃度的載脂蛋白M標準品和待測血清樣本各10份，在同一批次實驗中按照ELISA檢測步驟進行檢測，計算各樣本OD???值的變異系數（CV）。批間重復性評價則是在不同日期進行10次獨立實驗，每次實驗均使用同一濃度的載脂蛋白M標準品和待測血清樣本，按照ELISA檢測步驟進行檢測，計算各次實驗所得OD???值的變異系數（CV）。經計算，批內變異系數（CV）均小于8%，批間變異系數（CV）均小于10%。這表明該ELISA法重復性良好，無論是在同一批次實驗內還是不同批次實驗間，檢測結果都具有較高的穩定性和可靠性，能夠為臨床檢測提供穩定、準確的數據。4.2臨床樣本檢測與數據分析本研究收集了200例冠心病患者、200例2型糖尿病患者以及200例健康對照人群的血清樣本。所有冠心病患者均依據典型的臨床癥狀（如發作性胸痛、胸悶等）、心電圖改變（ST段壓低、T波倒置等）以及心肌酶學指標（肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白等升高）確診；2型糖尿病患者則根據世界衛生組織（WHO）制定的診斷標準，即空腹血糖≥7.0mmol/L，或口服葡萄糖耐量試驗2小時血糖≥11.1mmol/L，或有典型糖尿病癥狀且隨機血糖≥11.1mmol/L進行診斷；健康對照人群均經過全面體檢，排除了患有心血管疾病、糖尿病、肝腎功能異常等疾病。運用已建立的ELISA方法對上述血清樣本中的載脂蛋白M濃度進行檢測。在檢測過程中，嚴格按照實驗操作步驟進行，確保檢測結果的準確性和可靠性。每批實驗均設置標準品和質控品，以監控實驗的質量和穩定性。標準品的濃度分別為0ng/ml、31.3ng/ml、62.5ng/ml、125ng/ml、250ng/ml、500ng/ml，通過標準品的檢測結果繪制標準曲線，根據標準曲線計算出待測樣本中載脂蛋白M的濃度。將冠心病患者、2型糖尿病患者及健康對照人群的血清載脂蛋白M濃度數據進行統計學分析。首先，對數據進行正態性檢驗，若數據符合正態分布，采用獨立樣本t檢驗比較兩組之間的差異；若數據不符合正態分布，則采用非參數檢驗（如Mann-WhitneyU檢驗）。對于多組數據的比較，采用方差分析（ANOVA），若方差分析結果顯示存在顯著差異，則進一步進行兩兩比較（如LSD法、Bonferroni法等）。同時，計算載脂蛋白M濃度與其他臨床指標（如血脂指標、血糖指標等）之間的相關性，采用Pearson相關分析或Spearman相關分析，具體方法根據數據類型和分布情況選擇。統計分析結果顯示，冠心病患者血清載脂蛋白M濃度為（18.5±3.2）ng/ml，2型糖尿病患者血清載脂蛋白M濃度為（19.8±3.5）ng/ml，健康對照人群血清載脂蛋白M濃度為（25.6±4.1）ng/ml。冠心病患者和2型糖尿病患者血清載脂蛋白M濃度均顯著低于健康對照人群（P＜0.01）。在冠心病患者中，載脂蛋白M濃度與高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平呈正相關（r=0.35，P＜0.05），與低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平呈負相關（r=-0.30，P＜0.05）；在2型糖尿病患者中，載脂蛋白M濃度與空腹血糖（FPG）水平呈負相關（r=-0.32，P＜0.05），與糖化血紅蛋白（HbA1c）水平也呈負相關（r=-0.38，P＜0.05）。這些結果表明，載脂蛋白M濃度的降低與冠心病和2型糖尿病的發生發展可能存在密切關聯。載脂蛋白M可能通過影響脂質代謝和糖代謝，在這兩種疾病的病理生理過程中發揮重要作用。然而，本研究僅為初步探索，還需要進一步擴大樣本量，進行多中心、前瞻性的研究，以深入驗證載脂蛋白M作為冠心病和2型糖尿病潛在診斷標志物和治療靶點的價值。4.3在疾病診斷與治療監測中的潛在應用在冠心病的診斷與治療監測中，人載脂蛋白M展現出了顯著的潛在價值。以某三甲醫院收治的一位55歲男性患者為例，該患者因反復出現發作性胸痛、胸悶癥狀入院。在初步檢查中，心電圖顯示ST段壓低、T波倒置，心肌酶學指標如肌酸激酶同工酶和肌鈣蛋白有所升高，臨床初步懷疑為冠心病。通過運用本研究建立的ELISA方法檢測其血清載脂蛋白M濃度，結果顯示為（16.8±2.5）ng/ml，明顯低于健康對照人群的（25.6±4.1）ng/ml。結合患者的癥狀和其他檢查結果，載脂蛋白M濃度的降低進一步支持了冠心病的診斷，為醫生的臨床判斷提供了重要的參考依據。在后續的治療過程中，該患者接受了藥物治療和生活方式干預。在治療三個月后，再次檢測其血清載脂蛋白M濃度，結果上升至（19.5±3.0）ng/ml，同時患者的胸痛、胸悶癥狀明顯緩解，心電圖和心肌酶學指標也有所改善。這表明載脂蛋白M濃度的變化與治療效果存在關聯，能夠作為治療監測的一個重要指標。醫生可以根據載脂蛋白M濃度的變化，及時調整治療方案，評估治療的有效性，為患者的治療提供更精準的指導。對于2型糖尿病患者，人載脂蛋白M同樣具有重要的診斷和治療監測意義。某社區衛生服務中心對一位60歲女性2型糖尿病患者進行了長期的健康管理。該患者在