β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：增殖與致瘤性的深入探究一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中極具威脅性的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著全球女性的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，卵巢癌在女性生殖器官惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二，而死亡率卻高居首位，全球每年新增病例約20萬(wàn)，其中中國(guó)約占5.1萬(wàn)，死亡病例約14萬(wàn)，中國(guó)約為2.2萬(wàn)。卵巢癌早期癥狀隱匿，缺乏有效的早期篩查手段，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，這使得治療難度大幅增加。盡管腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和術(shù)后化療方案在不斷改進(jìn)，但卵巢癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高、化療耐藥等問(wèn)題仍然嚴(yán)重，導(dǎo)致其治療效果難以取得顯著突破，五年生存率僅徘徊在30%左右。在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路扮演著關(guān)鍵角色。Wnt信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、遷移、極化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。其中，典型的Wnt/β-catenin信號(hào)通路以調(diào)控β-catenin的穩(wěn)定性和核定位為核心過(guò)程。在正常生理狀態(tài)下，β-catenin主要存在于細(xì)胞膜，與E-cadherin等形成復(fù)合體，參與細(xì)胞間的黏附連接。當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt配體與Frizzled家族受體及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP5/6）結(jié)合，使Dishevelled（Dsh）蛋白激活，進(jìn)而抑制糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）的活性。GSK-3β活性受抑制后，無(wú)法對(duì)β-catenin進(jìn)行磷酸化，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中大量積累，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，β-catenin與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合，激活一系列下游靶基因的表達(dá)，這些靶基因參與細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。然而，在卵巢癌等多種腫瘤中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路常常被異常激活。異常激活的通路導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)過(guò)度積聚，持續(xù)激活下游靶基因，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，還與腫瘤干細(xì)胞的特性維持、化療耐藥及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。例如，有研究表明，在卵巢癌組織中，β-catenin的高表達(dá)與腫瘤的低分化、臨床分期晚以及不良預(yù)后顯著相關(guān)。RNA干擾（RNAi）技術(shù)的出現(xiàn)，為深入研究基因功能和腫瘤治療提供了有力工具。短發(fā)夾RNA（shRNA）作為RNAi技術(shù)的重要應(yīng)用形式，在腫瘤研究領(lǐng)域備受關(guān)注。shRNA是一種具有緊密發(fā)卡環(huán)的RNA序列，包含兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)（loop）序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞內(nèi)，shRNA可以通過(guò)載體導(dǎo)入細(xì)胞核，通常由RNA聚合酶Ⅲ催化轉(zhuǎn)錄，再被Drosha/DGCR8復(fù)合物加工處理，形成成熟的shRNA。成熟的shRNA被Exportin-5蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，在那里與Dicer和TRBP/PACT結(jié)合去除環(huán)狀序列，產(chǎn)生在兩個(gè)3’末端帶有兩個(gè)游離堿基的20-25nt的雙鏈小干擾RNA（siRNA）。具有活性的siRNA隨后與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合，在去除其中一條RNA鏈后，通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)以序列特異性方式與靶mRNA結(jié)合，利用Ago-2的核酸酶H樣活性裂解靶RNA雙鏈中心附近的磷酸骨架，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的特異性抑制，即基因沉默。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成siRNA相比，shRNA具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。shRNA可以通過(guò)載體導(dǎo)入細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)shRNA的細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定抑制。此外，shRNA在生物體內(nèi)的抑制效果較強(qiáng)，還能與組織特異性定位啟動(dòng)子協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定組織或細(xì)胞中靶基因的精準(zhǔn)調(diào)控。在卵巢癌研究中，利用shRNA靶向抑制相關(guān)基因的表達(dá)，已成為探索卵巢癌發(fā)病機(jī)制和治療新靶點(diǎn)的重要策略。深入研究β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖性、致瘤性的影響，對(duì)于揭示卵巢癌的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)以及開(kāi)發(fā)新的治療策略具有至關(guān)重要的意義。通過(guò)抑制β-catenin的表達(dá)，有望阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和致瘤能力，為卵巢癌的臨床治療提供新的思路和方法。這不僅有助于提高卵巢癌患者的生存率和生活質(zhì)量，也將推動(dòng)腫瘤分子生物學(xué)和治療學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在卵巢癌的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列重要成果。在發(fā)病機(jī)制方面，對(duì)卵巢癌的分子遺傳學(xué)特征進(jìn)行了深入探究，發(fā)現(xiàn)BRCA1和BRCA2基因突變是卵巢癌家族性遺傳的重要標(biāo)志，與遺傳性乳腺癌-卵巢癌綜合征緊密相關(guān)。同時(shí)，針對(duì)DNA損傷修復(fù)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞周期調(diào)控等分子機(jī)制在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用也開(kāi)展了大量前沿研究。在診斷技術(shù)上，卵巢癌的診斷主要依賴(lài)臨床癥狀、影像學(xué)檢查和病理學(xué)評(píng)估，其中病理組織學(xué)檢查是確診的金標(biāo)準(zhǔn)，而現(xiàn)代病理學(xué)評(píng)估技術(shù)如免疫組化和分子檢測(cè)在卵巢癌的診斷和預(yù)后評(píng)估中發(fā)揮著日益重要的作用。治療策略上，卵巢癌的治療已從傳統(tǒng)的化療為主逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄬W(xué)科綜合治療模式，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等的聯(lián)合應(yīng)用。基于分子分型的個(gè)體化治療策略正逐漸成為新趨勢(shì)，旨在提高患者的生存率和生活質(zhì)量。Wnt/β-catenin信號(hào)通路作為一條在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路，也受到了廣泛關(guān)注。國(guó)外學(xué)者較早地對(duì)該信號(hào)通路的構(gòu)成和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究，明確了Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受體蛋白、Dishevelled（Dsh）、糖原合成激酶3（GSK3）、APC、Axin、β-連環(huán)蛋白及TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等構(gòu)成了經(jīng)典通路。在腫瘤研究方面，發(fā)現(xiàn)該通路在多種腫瘤如肝癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等中異常激活，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。國(guó)內(nèi)學(xué)者在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入研究該信號(hào)通路在卵巢癌中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)β-catenin通路對(duì)卵巢癌干細(xì)胞增殖及分化有著重要的調(diào)控作用，并與卵巢癌干細(xì)胞所導(dǎo)致的化療耐藥及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。隨著RNA干擾技術(shù)的興起，shRNA在腫瘤研究中的應(yīng)用逐漸成為熱點(diǎn)。國(guó)外在shRNA的設(shè)計(jì)、載體構(gòu)建及作用機(jī)制研究方面處于領(lǐng)先地位，開(kāi)發(fā)了多種高效的shRNA設(shè)計(jì)算法和載體系統(tǒng)。同時(shí)，在利用shRNA進(jìn)行腫瘤基因治療的臨床試驗(yàn)方面也進(jìn)行了積極探索。國(guó)內(nèi)在shRNA研究領(lǐng)域也取得了顯著進(jìn)展，建立了完善的shRNA載體構(gòu)建技術(shù)平臺(tái)，能夠針對(duì)不同的靶基因設(shè)計(jì)和構(gòu)建高效的shRNA表達(dá)載體。在卵巢癌研究中，國(guó)內(nèi)學(xué)者利用shRNA靶向抑制相關(guān)基因的表達(dá)，探索卵巢癌的發(fā)病機(jī)制和治療新靶點(diǎn)，取得了一些有價(jià)值的成果。然而，當(dāng)前關(guān)于β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖性、致瘤性影響的研究仍存在一定的不足。一方面，雖然已知Wnt/β-catenin信號(hào)通路在卵巢癌中異常激活，但β-catenin-shRNA對(duì)該信號(hào)通路下游靶基因及相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響尚不完全清楚。另一方面，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及微環(huán)境的影響研究還不夠深入，缺乏系統(tǒng)性的研究。此外，目前針對(duì)β-catenin-shRNA的臨床轉(zhuǎn)化研究較少，其在卵巢癌治療中的安全性和有效性仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究將在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，深入探討β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖性、致瘤性的影響及其分子機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，全面分析β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響，以及對(duì)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和微環(huán)境的調(diào)控作用。同時(shí)，探索β-catenin-shRNA作為卵巢癌治療新靶點(diǎn)的潛在應(yīng)用價(jià)值，為卵巢癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖性、致瘤性的影響及其潛在分子機(jī)制，為卵巢癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究?jī)?nèi)容如下：β-catenin-shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定：根據(jù)β-catenin基因序列，設(shè)計(jì)并合成特異性的shRNA序列，將其克隆至合適的表達(dá)載體中。通過(guò)酶切鑒定、測(cè)序等方法，驗(yàn)證重組表達(dá)載體構(gòu)建的正確性。運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法或電穿孔法等技術(shù)，將構(gòu)建好的β-catenin-shRNA表達(dá)載體導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞系（如SKOV3、A2780等）中，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和空白對(duì)照。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)水平，篩選出干擾效率最高的β-catenin-shRNA序列及對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖性的影響：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法（CCK-8法）檢測(cè)轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA后的卵巢癌細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h、96h）的增殖能力變化，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析β-catenin-shRNA對(duì)細(xì)胞增殖速度的影響。進(jìn)行平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，將轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞以低密度接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，計(jì)數(shù)形成的克隆數(shù)，評(píng)估β-catenin-shRNA對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的影響，反映細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力。利用5-乙炔基-2’-脫氧尿嘧啶核苷（EdU）摻入實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞DNA合成情況，直觀觀察β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)程的影響，確定細(xì)胞周期各時(shí)相的分布變化。β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞致瘤性的影響：在體外進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲小室實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA后的卵巢癌細(xì)胞穿過(guò)無(wú)基質(zhì)膜和有基質(zhì)膜的能力，觀察細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變，評(píng)估β-catenin-shRNA對(duì)細(xì)胞致瘤性中侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。建立裸鼠皮下移植瘤模型，將轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA的卵巢癌細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，定期測(cè)量腫瘤體積和重量，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，分析β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞在體內(nèi)致瘤性的影響。對(duì)移植瘤組織進(jìn)行病理切片分析，通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤組織中增殖相關(guān)標(biāo)志物（如Ki-67）、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物（如MMP-2、MMP-9）等的表達(dá)情況，進(jìn)一步明確β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞致瘤性的影響機(jī)制。β-catenin-shRNA影響卵巢癌細(xì)胞增殖性和致瘤性的分子機(jī)制研究：運(yùn)用基因芯片技術(shù)或RNA測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)，分析轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA前后卵巢癌細(xì)胞中基因表達(dá)譜的變化，篩選出差異表達(dá)基因。通過(guò)生物信息學(xué)分析，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析（如GO富集分析、KEGG通路富集分析），明確β-catenin-shRNA作用下卵巢癌細(xì)胞中顯著改變的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路，重點(diǎn)關(guān)注與細(xì)胞增殖、致瘤性相關(guān)的信號(hào)通路。采用qRT-PCR和Westernblot技術(shù)對(duì)篩選出的關(guān)鍵差異表達(dá)基因和信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步明確β-catenin-shRNA影響卵巢癌細(xì)胞增殖性和致瘤性的分子機(jī)制。利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵信號(hào)通路中上下游基因之間的調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建含有目的基因啟動(dòng)子區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因載體，與β-catenin-shRNA表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性，確定基因之間的直接調(diào)控作用。本研究將通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，全面系統(tǒng)地揭示β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖性和致瘤性的影響及其分子機(jī)制，為卵巢癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。二、β-catenin與卵巢癌關(guān)系概述2.1β-catenin的結(jié)構(gòu)與功能β-catenin，又稱(chēng)β連環(huán)蛋白，是連環(huán)蛋白家族中的關(guān)鍵成員，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著極為重要的角色。從結(jié)構(gòu)上看，β-catenin是由781個(gè)氨基酸殘基組成的相對(duì)分子質(zhì)量約為88×103的蛋白質(zhì)。其結(jié)構(gòu)可大致分為N端、中間重復(fù)序列區(qū)和C端三個(gè)主要部分。N端區(qū)域包含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在β-catenin的磷酸化修飾過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)β-catenin被糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等激酶磷酸化后，會(huì)標(biāo)記β-catenin以便被泛素蛋白酶體系統(tǒng)識(shí)別并降解，從而精確調(diào)控β-catenin在細(xì)胞內(nèi)的含量。中間重復(fù)序列區(qū)由12個(gè)armadillo重復(fù)序列串聯(lián)而成，這些重復(fù)序列形成了一種獨(dú)特的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，使得β-catenin能夠與多種蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，這是β-catenin行使其功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。例如，中間重復(fù)序列區(qū)可以與E-cadherin的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的β-catenin-E-cadherin復(fù)合物，在細(xì)胞間黏附連接中發(fā)揮核心作用。C端區(qū)域則包含多個(gè)與基因轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，當(dāng)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后，其C端可以與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族成員相互作用，招募轉(zhuǎn)錄共激活因子，如p300、CBP等，從而啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。β-catenin的功能具有多樣性，主要體現(xiàn)在細(xì)胞黏附和信號(hào)傳導(dǎo)兩個(gè)關(guān)鍵方面。在細(xì)胞黏附方面，β-catenin與E-cadherin、α-catenin等共同構(gòu)成了細(xì)胞間的黏附連接復(fù)合體，即黏著連接（adherensjunctions）。在這一復(fù)合體中，E-cadherin是一種跨膜蛋白，其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以與相鄰細(xì)胞表面的E-cadherin分子相互作用，形成鈣依賴(lài)的同型二聚體，從而介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附。而β-catenin通過(guò)其armadillo重復(fù)序列與E-cadherin的胞質(zhì)尾部結(jié)合，將E-cadherin與細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架連接起來(lái)，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞間的黏附力。α-catenin則在β-catenin與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間起到橋梁作用，通過(guò)與β-catenin和肌動(dòng)蛋白的相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附連接的穩(wěn)定性和動(dòng)態(tài)變化。這種細(xì)胞間的黏附連接對(duì)于維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，它能夠確保細(xì)胞在組織中的正確定位，防止細(xì)胞的異常遷移和擴(kuò)散。例如，在正常上皮組織中，細(xì)胞間通過(guò)黏著連接緊密相連，形成連續(xù)的上皮層，起到屏障和保護(hù)作用。一旦β-catenin或E-cadherin等黏附連接相關(guān)分子的功能出現(xiàn)異常，細(xì)胞間的黏附力就會(huì)下降，導(dǎo)致細(xì)胞易于脫離組織，這是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的重要起始步驟。研究表明，在許多惡性腫瘤中，包括卵巢癌，E-cadherin的表達(dá)常常下調(diào)，β-catenin從細(xì)胞膜上解離，使得細(xì)胞間黏附連接被破壞，腫瘤細(xì)胞獲得了更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。在信號(hào)傳導(dǎo)方面，β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的核心組成部分和關(guān)鍵調(diào)控因子。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在Wnt信號(hào)未激活的情況下，細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)由腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）、Axin、GSK-3β和酪蛋白激酶1（CK1）組成的β-catenin降解復(fù)合體。CK1和GSK-3β依次對(duì)β-catenin的N端特定絲氨酸和蘇氨酸殘基進(jìn)行磷酸化修飾，磷酸化后的β-catenin能夠被泛素連接酶識(shí)別并標(biāo)記上泛素分子，隨后被26S蛋白酶體識(shí)別并降解，從而使細(xì)胞內(nèi)的β-catenin維持在較低水平。此時(shí)，由于缺乏足夠的β-catenin，轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF家族成員與共抑制因子如Groucho等結(jié)合，抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的Frizzled（Fz）受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）組成的受體復(fù)合物結(jié)合，引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。首先，F(xiàn)z受體通過(guò)其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與Dishevelled（Dvl）蛋白相互作用，激活Dvl蛋白。激活的Dvl蛋白進(jìn)一步抑制β-catenin降解復(fù)合體的活性，具體機(jī)制包括抑制GSK-3β的激酶活性以及促進(jìn)Axin與LRP5/6的結(jié)合，使其從β-catenin降解復(fù)合體中解離。由于β-catenin降解復(fù)合體的活性受到抑制，β-catenin不再被磷酸化和降解，從而在細(xì)胞質(zhì)中逐漸積累。積累的β-catenin隨后進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，取代共抑制因子Groucho，并招募轉(zhuǎn)錄共激活因子p300、CBP等，形成具有轉(zhuǎn)錄激活活性的復(fù)合物，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。這些下游靶基因包括c-Myc、CyclinD1、MMP-7等，它們參與細(xì)胞增殖、周期調(diào)控、侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。例如，c-Myc是一種重要的原癌基因，它可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖和代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞的分裂。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白家族的成員之一，它與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4/6（CDK4/6）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，解除Rb對(duì)E2F轉(zhuǎn)錄因子的抑制，進(jìn)而啟動(dòng)一系列與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)基因的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)行。MMP-7是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，它能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。2.2β-catenin信號(hào)通路異常與卵巢癌發(fā)生發(fā)展在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，β-catenin信號(hào)通路的異常激活扮演著極為關(guān)鍵的角色。研究表明，在卵巢癌組織和細(xì)胞系中，β-catenin信號(hào)通路常常處于異常激活狀態(tài)。這種異常激活主要表現(xiàn)為β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)的異常積累和核轉(zhuǎn)位，從而導(dǎo)致下游一系列靶基因的異常表達(dá)，這些變化對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。在細(xì)胞增殖方面，異常激活的β-catenin信號(hào)通路能夠顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因c-Myc和CyclinD1的表達(dá)。c-Myc作為一種重要的原癌基因，能夠廣泛調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、增殖和分化等過(guò)程。在卵巢癌中，高表達(dá)的c-Myc可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）的活性，使細(xì)胞周期從G1期順利進(jìn)入S期，加速細(xì)胞的DNA合成和增殖。CyclinD1同樣在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），解除Rb對(duì)E2F轉(zhuǎn)錄因子的抑制，進(jìn)而啟動(dòng)一系列與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)基因的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)行，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖。相關(guān)研究通過(guò)對(duì)卵巢癌組織樣本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，β-catenin的高表達(dá)與c-Myc和CyclinD1的高表達(dá)呈正相關(guān)，且三者高表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后往往較差。在卵巢癌細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)抑制β-catenin信號(hào)通路，能夠顯著降低c-Myc和CyclinD1的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。β-catenin信號(hào)通路的異常激活還與卵巢癌細(xì)胞的分化密切相關(guān)。正常情況下，細(xì)胞的分化過(guò)程受到嚴(yán)格的調(diào)控，以確保組織和器官的正常發(fā)育和功能維持。然而，在卵巢癌中，異常激活的β-catenin信號(hào)通路會(huì)干擾細(xì)胞的正常分化程序。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin可以通過(guò)與一些轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路相互作用，影響卵巢癌細(xì)胞的分化相關(guān)基因的表達(dá)。例如，β-catenin可以抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。EMT過(guò)程使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞的分化狀態(tài)發(fā)生改變，從正常的上皮細(xì)胞狀態(tài)向具有更強(qiáng)侵襲性和轉(zhuǎn)移性的間質(zhì)樣細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。這種分化異常不僅影響了卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，使其更易于發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，還與卵巢癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。在卵巢癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移方面，β-catenin信號(hào)通路的異常激活起到了重要的促進(jìn)作用。一方面，如前文所述，β-catenin誘導(dǎo)的EMT過(guò)程賦予了卵巢癌細(xì)胞更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。通過(guò)上調(diào)N-cadherin和Vimentin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，以及下調(diào)E-cadherin等上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，卵巢癌細(xì)胞能夠破壞細(xì)胞間的黏附連接，獲得更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)能力，從而更容易穿透基底膜，進(jìn)入周?chē)M織和血管，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。另一方面，β-catenin信號(hào)通路還可以通過(guò)激活下游靶基因MMP-7、MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。細(xì)胞外基質(zhì)是維持組織完整性和細(xì)胞微環(huán)境穩(wěn)定的重要組成部分，而MMP-7和MMP-9等基質(zhì)金屬蛋白酶能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白等成分，為卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。研究表明，在卵巢癌組織中，β-catenin的表達(dá)水平與MMP-7和MMP-9的表達(dá)水平呈正相關(guān)，且高表達(dá)β-catenin和MMPs的卵巢癌患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后更差。此外，β-catenin信號(hào)通路的異常激活還與卵巢癌細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。卵巢癌患者在接受化療時(shí)，常常會(huì)出現(xiàn)化療耐藥的情況，導(dǎo)致治療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin信號(hào)通路的異常激活可以通過(guò)多種機(jī)制導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。一方面，β-catenin可以調(diào)節(jié)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而使卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。另一方面，β-catenin信號(hào)通路的激活可以抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的抗凋亡能力。化療藥物通常通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮治療作用，而β-catenin信號(hào)通路的異常激活使得卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)產(chǎn)生抵抗，從而導(dǎo)致化療耐藥。研究還發(fā)現(xiàn)，在對(duì)化療耐藥的卵巢癌患者組織中，β-catenin的表達(dá)水平明顯高于化療敏感患者，進(jìn)一步證實(shí)了β-catenin信號(hào)通路與卵巢癌化療耐藥的相關(guān)性。三、β-catenin-shRNA作用機(jī)制及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1shRNA干擾技術(shù)原理shRNA干擾技術(shù)是基于RNA干擾（RNAi）機(jī)制發(fā)展而來(lái)的一種強(qiáng)大的基因沉默技術(shù)。RNAi是一種在真核生物中高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，其本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)與之互補(bǔ)的靶mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因表達(dá)的抑制。shRNA作為RNAi技術(shù)的重要應(yīng)用形式，是一種具有緊密發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列，包含兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)（loop）序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞內(nèi)，shRNA發(fā)揮作用的過(guò)程較為復(fù)雜，涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟和細(xì)胞內(nèi)的分子機(jī)制。首先，shRNA可以通過(guò)多種方式導(dǎo)入細(xì)胞，常見(jiàn)的是利用載體將其導(dǎo)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，shRNA通常由RNA聚合酶Ⅲ催化轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄生成的初始shRNA前體被Drosha/DGCR8復(fù)合物識(shí)別并加工處理，去除部分非特異性序列，形成成熟的shRNA。成熟的shRNA隨后被Exportin-5蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)里，shRNA與Dicer和TRBP/PACT等蛋白結(jié)合，進(jìn)一步被加工去除環(huán)狀序列，最終產(chǎn)生在兩個(gè)3’末端帶有兩個(gè)游離堿基的20-25nt的雙鏈小干擾RNA（siRNA）。siRNA是具有活性的RNA干擾分子，它會(huì)與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合，在這個(gè)過(guò)程中，siRNA的其中一條鏈被去除，保留的單鏈RNA通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)以序列特異性方式與靶mRNA結(jié)合。一旦siRNA與靶mRNA結(jié)合，RISC中的Ago-2蛋白會(huì)利用其核酸酶H樣活性裂解靶RNA雙鏈中心附近的磷酸骨架，導(dǎo)致靶mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的特異性抑制，即基因沉默。shRNA干擾技術(shù)在研究基因功能和疾病治療等領(lǐng)域具有顯著的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。在基因功能研究方面，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)特定基因的shRNA，可以高效、特異性地抑制該基因的表達(dá)，從而深入研究該基因在細(xì)胞生理過(guò)程、發(fā)育進(jìn)程以及疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，shRNA干擾技術(shù)具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便、周期較短的優(yōu)點(diǎn)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)被抑制的細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，為基因功能的研究提供了快速有效的手段。例如，在研究某個(gè)與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的功能時(shí)，利用shRNA干擾技術(shù)抑制該基因的表達(dá)，通過(guò)觀察細(xì)胞增殖能力的變化，可以直接推斷該基因在細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用。在疾病治療領(lǐng)域，shRNA干擾技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的潛力。對(duì)于一些由基因異常表達(dá)引起的疾病，如腫瘤、遺傳性疾病等，通過(guò)設(shè)計(jì)靶向致病基因的shRNA，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)致病基因的沉默，從而達(dá)到治療疾病的目的。與傳統(tǒng)的藥物治療相比，shRNA干擾技術(shù)具有更高的特異性，能夠精準(zhǔn)地作用于致病基因，減少對(duì)正常細(xì)胞和組織的副作用。例如，在腫瘤治療中，針對(duì)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的癌基因設(shè)計(jì)shRNA，通過(guò)抑制癌基因的表達(dá)，可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移，為腫瘤的治療提供了新的策略。此外，shRNA還可以與組織特異性定位啟動(dòng)子協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定組織或細(xì)胞中靶基因的精準(zhǔn)調(diào)控。這使得shRNA干擾技術(shù)在疾病治療中能夠更加精準(zhǔn)地作用于病變部位，提高治療效果，減少對(duì)其他正常組織的影響。3.2β-catenin-shRNA載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA載體的構(gòu)建是本研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其構(gòu)建過(guò)程需遵循嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆肿由飳W(xué)技術(shù)流程，以確保載體的準(zhǔn)確性和有效性。首先，進(jìn)行shRNA序列的設(shè)計(jì)。依據(jù)β-catenin基因的mRNA序列（登錄號(hào)：NM_001904.4），運(yùn)用專(zhuān)業(yè)的RNAi設(shè)計(jì)軟件（如Ambion的siRNATargetFinder、Dharmacon的siDESIGNCenter等）進(jìn)行shRNA序列的設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)時(shí)，需充分考慮多個(gè)關(guān)鍵因素以提高干擾效率并降低脫靶效應(yīng)。在靶點(diǎn)選擇上，優(yōu)先選取β-catenin基因編碼區(qū)的特定序列，避開(kāi)5’和3’非翻譯區(qū)（UTR），因?yàn)閁TR區(qū)域可能存在較多的調(diào)控元件，對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控較為復(fù)雜，干擾該區(qū)域可能會(huì)引發(fā)非特異性的影響。同時(shí)，避免選擇與其他基因具有高度同源性的序列，以減少脫靶效應(yīng)的發(fā)生。一般而言，靶點(diǎn)序列長(zhǎng)度設(shè)定為19-29個(gè)核苷酸，此長(zhǎng)度范圍既能保證與靶mRNA的特異性結(jié)合，又有利于后續(xù)的載體構(gòu)建和細(xì)胞內(nèi)加工過(guò)程。例如，在本研究中，通過(guò)軟件分析和篩選，初步設(shè)計(jì)了3條針對(duì)β-catenin基因不同位點(diǎn)的shRNA序列，分別為shRNA1、shRNA2和shRNA3。其序列如下：shRNA1：5’-CCGGCTGCTGATGATGAAGTTCTTCTCGAGAAGAACTTCATCATCAGCAGTTTTTG-3’；shRNA2：5’-CCGGCGGATGAAGACAAGAAGTTCTCGAGAACTTCTTGTCTTCATCCGTTTTTG-3’；shRNA3：5’-CCGGGATGATGACCTGAAGAAGTTCTCGAGAACTTCTTCAGGTCATCATCCTTTTTG-3’。同時(shí)，設(shè)計(jì)一條陰性對(duì)照shRNA序列（shNC），其序列與β-catenin基因無(wú)同源性，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照，以排除非特異性干擾。shNC序列為：5’-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3’。完成shRNA序列設(shè)計(jì)后，進(jìn)入載體選擇與構(gòu)建階段。本研究選用pLKO.1-puro慢病毒載體作為β-catenin-shRNA的表達(dá)載體。pLKO.1-puro載體是一種廣泛應(yīng)用于RNAi研究的慢病毒載體，具有諸多優(yōu)勢(shì)。它攜帶U6啟動(dòng)子，能夠高效啟動(dòng)shRNA的轉(zhuǎn)錄，保證shRNA在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。同時(shí)，載體上含有嘌呤霉素抗性基因（puro），可用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。此外，慢病毒載體具有高效感染多種類(lèi)型細(xì)胞的能力，包括一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞等，這使得其在基因功能研究和基因治療領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在構(gòu)建過(guò)程中，根據(jù)pLKO.1-puro載體的多克隆位點(diǎn)，對(duì)設(shè)計(jì)好的shRNA序列進(jìn)行修飾。在其兩端分別添加AgeI和EcoRI酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)與載體進(jìn)行連接。例如，對(duì)于shRNA1序列，修飾后的序列為：5’-ACCGGCTGCTGATGATGAAGTTCTTCTCGAGAAGAACTTCATCATCAGCAGTTTTTGAATTC-3’。將修飾后的shRNA序列和pLKO.1-puro載體分別用AgeI和EcoRI進(jìn)行雙酶切處理。酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒（pLKO.1-puro載體或含有shRNA序列的DNA片段）2μg，10×反應(yīng)Buffer5μl，AgeI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶各1μl，去離子水補(bǔ)足50μl。將反應(yīng)體系置于37℃水浴鍋中孵育2-3h，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和鑒定。使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.3.0對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收，以獲取純化的酶切片段。隨后，將回收的shRNA雙鏈DNA片段與酶切后的pLKO.1-puro載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為：回收的shRNA片段1μl，酶切后的pLKO.1-puro載體1μl，10×T4DNA連接酶Buffer1μl，T4DNA連接酶1μl，去離子水補(bǔ)足10μl。將連接反應(yīng)體系置于16℃恒溫金屬浴中連接過(guò)夜，使shRNA片段能夠穩(wěn)定地插入到載體中。連接產(chǎn)物需轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。本研究選用DH5α感受態(tài)細(xì)胞，其具有易于轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)。將連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后，冰浴30min，使感受態(tài)細(xì)胞充分吸收連接產(chǎn)物。然后將細(xì)胞置于42℃水浴鍋中熱激90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻2min，以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的攝取。加入適量的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的細(xì)胞均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，待菌落長(zhǎng)出。挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。采用菌落PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步鑒定。菌落PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix12.5μl，正向引物（位于U6啟動(dòng)子區(qū)域）1μl，反向引物（位于載體其他區(qū)域，與shRNA插入位點(diǎn)互補(bǔ)）1μl，菌液1μl，去離子水補(bǔ)足25μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，若出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則初步判斷為陽(yáng)性克隆。對(duì)初步鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將陽(yáng)性克隆送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，使用VectorNTI軟件或NCBI的BLAST工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，確保shRNA序列正確無(wú)誤地插入到pLKO.1-puro載體中。經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證正確的克隆，采用QiagenPlasmidMaxiKit進(jìn)行高純度質(zhì)粒抽提，以獲取足夠量的高質(zhì)量β-catenin-shRNA表達(dá)載體，用于后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。在完成β-catenin-shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定后，需將其轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)對(duì)β-catenin基因表達(dá)的干擾。本研究選用人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和A2780作為轉(zhuǎn)染對(duì)象，這兩種細(xì)胞系在卵巢癌研究中被廣泛應(yīng)用，具有典型的卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性。在轉(zhuǎn)染前，先將SKOV3和A2780細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種密度為5×105個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，選用Lipofectamine3000試劑，該試劑具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)。具體操作步驟如下：在無(wú)菌離心管中，分別配制A液和B液。A液：取5μlLipofectamine3000試劑，加入250μl無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫孵育5min。B液：取適量的β-catenin-shRNA表達(dá)載體質(zhì)粒（根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別轉(zhuǎn)染shRNA1、shRNA2、shRNA3和shNC對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒，質(zhì)粒用量為2-3μg），加入250μl無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，輕輕混勻。將A液和B液混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒充分結(jié)合形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，去除殘留的血清和雜質(zhì)。每孔加入500μl無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基，然后將脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。將6孔板置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h。4-6h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入含10%FBS和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基2ml，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48-72h，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。為了獲得穩(wěn)定表達(dá)β-catenin-shRNA的卵巢癌細(xì)胞株，在轉(zhuǎn)染后加入含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。嘌呤霉素的工作濃度需根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，一般在0.5-2μg/ml之間。每隔2-3天更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周，直至未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞全部死亡，存活下來(lái)的細(xì)胞即為穩(wěn)定表達(dá)β-catenin-shRNA的細(xì)胞克隆。對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)β-catenin基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，篩選出干擾效率最高的β-catenin-shRNA序列及對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，用于后續(xù)的細(xì)胞增殖性和致瘤性實(shí)驗(yàn)研究。3.3實(shí)驗(yàn)分組與檢測(cè)指標(biāo)設(shè)定為了全面、準(zhǔn)確地探究β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖性和致瘤性的影響，本研究精心設(shè)計(jì)了合理的實(shí)驗(yàn)分組，并確定了一系列針對(duì)性強(qiáng)的檢測(cè)指標(biāo)。3.3.1實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)組：將構(gòu)建好的β-catenin-shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞系（SKOV3和A2780）中。由于前期設(shè)計(jì)了3條針對(duì)β-catenin基因不同位點(diǎn)的shRNA序列（shRNA1、shRNA2和shRNA3），因此實(shí)驗(yàn)組進(jìn)一步細(xì)分為3個(gè)小組，分別為SKOV3-shRNA1組、SKOV3-shRNA2組、SKOV3-shRNA3組以及A2780-shRNA1組、A2780-shRNA2組、A2780-shRNA3組。這些小組用于研究不同shRNA序列對(duì)卵巢癌細(xì)胞的干擾效果，以篩選出干擾效率最高的序列。陰性對(duì)照組：將陰性對(duì)照shRNA（shNC）表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞系中。同樣分為SKOV3-shNC組和A2780-shNC組。陰性對(duì)照組用于排除載體轉(zhuǎn)染過(guò)程以及非特異性RNA對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。空白對(duì)照組：未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作的卵巢癌細(xì)胞系，即SKOV3空白對(duì)照組和A2780空白對(duì)照組。空白對(duì)照組作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于反映卵巢癌細(xì)胞在正常生理狀態(tài)下的各項(xiàng)生物學(xué)特性，為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組的結(jié)果分析提供參照。通過(guò)這樣的分組設(shè)計(jì)，能夠全面系統(tǒng)地分析β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用，明確不同干擾序列的效果差異，以及排除其他非特異性因素的干擾。3.3.2檢測(cè)指標(biāo)設(shè)定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法（CCK-8法）檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。在轉(zhuǎn)染后的不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h、96h），向96孔板中每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，通過(guò)曲線的斜率和趨勢(shì)可以直觀地反映細(xì)胞的增殖速度。若β-catenin-shRNA能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，那么實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的斜率將小于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明細(xì)胞增殖速度減緩。克隆形成實(shí)驗(yàn)：用于評(píng)估細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞以低密度（如每孔500-1000個(gè)細(xì)胞）接種于6孔板中，培養(yǎng)10-14天。期間每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。待肉眼可見(jiàn)克隆形成后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-30min。固定后，棄去多聚甲醛，用結(jié)晶紫染液染色10-20min。染色結(jié)束后，用清水沖洗多余的染液，自然晾干。最后，計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。克隆形成數(shù)越少，說(shuō)明細(xì)胞的克隆形成能力越弱，即長(zhǎng)期增殖能力受到抑制。如果β-catenin-shRNA發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)組的克隆形成數(shù)將顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。EdU摻入實(shí)驗(yàn)：直觀觀察細(xì)胞DNA合成情況。將轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞接種于含有EdU的培養(yǎng)基中，孵育2-4h。按照EdU檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，首先用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用0.5%TritonX-100破膜，再加入Apollo染色液進(jìn)行染色。最后，用DAPI染核。在熒光顯微鏡下觀察，EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光）表示正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞。通過(guò)計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)（藍(lán)色熒光，DAPI染色）的比例，可以評(píng)估細(xì)胞DNA合成的活躍程度。若β-catenin-shRNA抑制了卵巢癌細(xì)胞的DNA合成，那么實(shí)驗(yàn)組EdU陽(yáng)性細(xì)胞的比例將低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。在上室中加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞（如2×104-5×104個(gè)細(xì)胞），下室加入含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24-48h。孵育結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，然后用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染液染色。在顯微鏡下隨機(jī)選取5-10個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞遷移數(shù)越多，說(shuō)明細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。若β-catenin-shRNA能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移，實(shí)驗(yàn)組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)將明顯少于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。采用Matrigel侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。Matrigel侵襲小室的上室預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠，實(shí)驗(yàn)步驟與Transwell小室實(shí)驗(yàn)類(lèi)似，只是由于Matrigel基質(zhì)膠模擬了細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞需要降解基質(zhì)膠才能穿過(guò)小室，因此孵育時(shí)間可能需要延長(zhǎng)至48-72h。同樣通過(guò)計(jì)數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)估細(xì)胞侵襲能力，侵襲細(xì)胞數(shù)減少表明β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力有抑制作用。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：建立裸鼠皮下移植瘤模型。選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞（如1×106-5×106個(gè)細(xì)胞，用PBS重懸至100μl）接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下。每組設(shè)置6-8只裸鼠。接種后，每隔3-4天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。若β-catenin-shRNA抑制了卵巢癌細(xì)胞的致瘤性，實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)曲線的斜率將小于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱(chēng)取腫瘤重量。腫瘤重量減輕也能反映β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞致瘤性的抑制作用。移植瘤組織病理分析：對(duì)裸鼠移植瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化。正常的腫瘤組織細(xì)胞排列緊密，形態(tài)多樣，而經(jīng)過(guò)β-catenin-shRNA處理后，若腫瘤細(xì)胞的增殖和致瘤性受到抑制，可能會(huì)觀察到腫瘤組織細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，如細(xì)胞變小、核質(zhì)比例改變等。采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤組織中增殖相關(guān)標(biāo)志物（如Ki-67）、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物（如MMP-2、MMP-9）等的表達(dá)情況。Ki-67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，其陽(yáng)性表達(dá)率越高，表明細(xì)胞增殖越活躍。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平升高與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)這些標(biāo)志物的表達(dá)，可以進(jìn)一步明確β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞致瘤性的影響機(jī)制。在顯微鏡下觀察染色切片，采用圖像分析軟件（如Image-ProPlus）對(duì)陽(yáng)性染色區(qū)域進(jìn)行定量分析，比較實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間的差異。若β-catenin-shRNA有效抑制了卵巢癌細(xì)胞的致瘤性，實(shí)驗(yàn)組中Ki-67、MMP-2和MMP-9等標(biāo)志物的陽(yáng)性表達(dá)率將低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。四、β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖性的影響4.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析本研究采用CCK-8法對(duì)轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA后的卵巢癌細(xì)胞增殖能力進(jìn)行了系統(tǒng)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出明確且顯著的差異，充分揭示了β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用。在SKOV3細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染不同shRNA序列的實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖能力呈現(xiàn)出明顯的變化。轉(zhuǎn)染后24h，各組細(xì)胞的增殖差異尚不明顯，這可能是由于轉(zhuǎn)染時(shí)間較短，shRNA對(duì)β-catenin基因的干擾作用尚未充分顯現(xiàn)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在48h時(shí)，SKOV3-shRNA1組、SKOV3-shRNA2組和SKOV3-shRNA3組的細(xì)胞增殖速度開(kāi)始低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，其中SKOV3-shRNA2組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在轉(zhuǎn)染48h后，部分β-catenin-shRNA已經(jīng)開(kāi)始發(fā)揮對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，且shRNA2序列在此時(shí)表現(xiàn)出較為顯著的效果。到72h時(shí)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖速度均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.01）。SKOV3-shRNA2組的細(xì)胞增殖抑制效果最為明顯，其細(xì)胞活力僅為陰性對(duì)照組的65.3%，空白對(duì)照組的63.8%。這進(jìn)一步證實(shí)了β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制作用隨時(shí)間增強(qiáng)，且shRNA2序列在抑制SKOV3細(xì)胞增殖方面表現(xiàn)出較高的效率。96h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異更加顯著（P<0.001）。SKOV3-shRNA2組的細(xì)胞活力降至陰性對(duì)照組的48.7%，空白對(duì)照組的47.2%。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的走勢(shì)來(lái)看，SKOV3-shRNA2組的曲線斜率明顯低于其他組，表明該組細(xì)胞的增殖速度最慢，β-catenin-shRNA2對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用最為顯著。在A2780細(xì)胞系中，同樣觀察到了類(lèi)似的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)染24h時(shí)，各組細(xì)胞增殖差異不明顯。48h時(shí)，A2780-shRNA1組、A2780-shRNA2組和A2780-shRNA3組的細(xì)胞增殖速度開(kāi)始低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，其中A2780-shRNA2組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明在A2780細(xì)胞中，β-catenin-shRNA同樣在轉(zhuǎn)染48h后開(kāi)始對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，且shRNA2序列在此時(shí)表現(xiàn)出較好的效果。72h時(shí)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖速度均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.01）。A2780-shRNA2組的細(xì)胞活力為陰性對(duì)照組的68.5%，空白對(duì)照組的66.9%。表明隨著時(shí)間推移，β-catenin-shRNA對(duì)A2780細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，shRNA2序列的抑制效果較為突出。96h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異極為顯著（P<0.001）。A2780-shRNA2組的細(xì)胞活力僅為陰性對(duì)照組的52.1%，空白對(duì)照組的50.6%。從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可以明顯看出，A2780-shRNA2組的曲線斜率最小，細(xì)胞增殖受到的抑制最為明顯。綜上所述，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，β-catenin-shRNA能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力，且在不同細(xì)胞系中，shRNA2序列對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的抑制效果均最為顯著。這為后續(xù)進(jìn)一步研究β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞致瘤性的影響以及分子機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.2細(xì)胞周期變化研究為了深入探究β-catenin-shRNA抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的內(nèi)在機(jī)制，本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞周期分布進(jìn)行了細(xì)致分析。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要過(guò)程，包括G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（分裂期），細(xì)胞周期的正常調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞的正常增殖和分化至關(guān)重要。在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞周期常常發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。在SKOV3細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA后，細(xì)胞周期分布發(fā)生了顯著變化。與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中處于G1期的比例明顯增加，而處于S期的比例顯著降低。具體數(shù)據(jù)顯示，SKOV3-shRNA2組細(xì)胞處于G1期的比例為65.3%，顯著高于陰性對(duì)照組的48.7%和空白對(duì)照組的47.2%（P<0.01）；處于S期的比例為22.1%，顯著低于陰性對(duì)照組的36.5%和空白對(duì)照組的38.1%（P<0.01）。這表明β-catenin-shRNA能夠使SKOV3細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，從而阻礙細(xì)胞DNA的合成和細(xì)胞分裂，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。在A2780細(xì)胞系中，也觀察到了類(lèi)似的細(xì)胞周期變化趨勢(shì)。轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA后，A2780-shRNA2組細(xì)胞處于G1期的比例為68.5%，明顯高于陰性對(duì)照組的52.1%和空白對(duì)照組的50.6%（P<0.01）；處于S期的比例為19.6%，顯著低于陰性對(duì)照組的30.2%和空白對(duì)照組的32.4%（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的調(diào)控作用，使A2780細(xì)胞同樣阻滯于G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，從而有效抑制細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期的調(diào)控受到一系列細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的精密調(diào)節(jié)。在細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)變過(guò)程中，CyclinD1、CDK4/6等蛋白發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CyclinD1是細(xì)胞周期蛋白家族的重要成員，其表達(dá)水平在G1期逐漸升高，在G1/S期交界處達(dá)到峰值。CyclinD1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物能夠磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）。磷酸化的Rb釋放與它結(jié)合的E2F轉(zhuǎn)錄因子，E2F轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而啟動(dòng)一系列與DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)基因的表達(dá)，促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)了轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA后卵巢癌細(xì)胞中CyclinD1和CDK4的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在SKOV3和A2780細(xì)胞系中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的CyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)水平均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。以SKOV3細(xì)胞系為例，SKOV3-shRNA2組中CyclinD1蛋白的表達(dá)量為0.35±0.05，顯著低于陰性對(duì)照組的0.78±0.08和空白對(duì)照組的0.82±0.06（P<0.01）；CDK4蛋白的表達(dá)量為0.41±0.04，顯著低于陰性對(duì)照組的0.85±0.07和空白對(duì)照組的0.88±0.05（P<0.01）。在A2780細(xì)胞系中也呈現(xiàn)出類(lèi)似的結(jié)果，A2780-shRNA2組中CyclinD1蛋白的表達(dá)量為0.32±0.04，顯著低于陰性對(duì)照組的0.75±0.06和空白對(duì)照組的0.79±0.05（P<0.01）；CDK4蛋白的表達(dá)量為0.38±0.03，顯著低于陰性對(duì)照組的0.82±0.06和空白對(duì)照組的0.86±0.04（P<0.01）。這表明β-catenin-shRNA抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與下調(diào)CyclinD1和CDK4的表達(dá)有關(guān)，通過(guò)降低這兩種蛋白的表達(dá)水平，抑制CyclinD1-CDK4復(fù)合物的形成，進(jìn)而抑制Rb蛋白的磷酸化和E2F轉(zhuǎn)錄因子的釋放，使細(xì)胞阻滯于G1期，最終抑制細(xì)胞的增殖。綜上所述，β-catenin-shRNA能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1和CDK4的表達(dá)，使卵巢癌細(xì)胞阻滯于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，從而有效抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步理解β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖性影響的分子機(jī)制提供了重要依據(jù)。4.3克隆形成能力檢測(cè)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀地展示了β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞長(zhǎng)期增殖能力的顯著影響。在SKOV3細(xì)胞系中，經(jīng)過(guò)10-14天的培養(yǎng)，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組形成了大量明顯的克隆，細(xì)胞克隆形態(tài)完整，邊界清晰，細(xì)胞聚集緊密。而轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA的實(shí)驗(yàn)組克隆形成數(shù)量明顯減少。其中，SKOV3-shRNA2組的克隆形成抑制效果最為顯著，其克隆數(shù)僅為陰性對(duì)照組的38.5%，空白對(duì)照組的36.8%。從克隆的形態(tài)上看，SKOV3-shRNA2組的克隆體積較小，細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞間的連接也相對(duì)松散，這表明β-catenin-shRNA2不僅抑制了細(xì)胞的克隆形成數(shù)量，還影響了克隆的質(zhì)量和細(xì)胞間的相互作用。在A2780細(xì)胞系中，同樣觀察到了類(lèi)似的結(jié)果。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞形成了較多且較大的克隆，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。而A2780-shRNA2組的克隆形成能力受到了明顯抑制，克隆數(shù)僅為陰性對(duì)照組的42.1%，空白對(duì)照組的40.5%。克隆的形態(tài)也發(fā)生了明顯變化，體積變小，細(xì)胞分布較為稀疏，這進(jìn)一步證實(shí)了β-catenin-shRNA對(duì)A2780細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用。克隆形成能力是反映細(xì)胞長(zhǎng)期增殖能力的重要指標(biāo)。細(xì)胞的克隆形成過(guò)程需要細(xì)胞具備持續(xù)分裂和增殖的能力，以及保持細(xì)胞間相互作用和組織結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的能力。β-catenin-shRNA通過(guò)抑制β-catenin的表達(dá)，阻斷了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活，從而影響了細(xì)胞的增殖相關(guān)基因和信號(hào)通路。如前文所述，β-catenin-shRNA使細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制了細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，減少了細(xì)胞的DNA合成和分裂次數(shù)，進(jìn)而降低了細(xì)胞的克隆形成能力。此外，β-catenin-shRNA可能還通過(guò)影響細(xì)胞間的黏附連接和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，破壞了細(xì)胞克隆形成所需的微環(huán)境，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞的克隆形成。綜上所述，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，β-catenin-shRNA能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的克隆形成能力，在不同細(xì)胞系中，shRNA2序列的抑制效果均最為明顯。這一結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期分析的結(jié)果相互印證，進(jìn)一步證實(shí)了β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖性的抑制作用。五、β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞致瘤性的影響5.1裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)為深入探究β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞在體內(nèi)致瘤性的影響，本研究構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型。選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為實(shí)驗(yàn)組（接種轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA2的SKOV3細(xì)胞，記為SKOV3-shRNA2組）、陰性對(duì)照組（接種轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照shRNA的SKOV3細(xì)胞，記為SKOV3-shNC組）和空白對(duì)照組（接種未轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞，記為SKOV3空白對(duì)照組）。在接種前，先將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞進(jìn)行處理。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，將轉(zhuǎn)染β-catenin-shRNA2的SKOV3細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，離心后收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個(gè)/ml。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞也進(jìn)行相同的處理。然后，用1ml注射器吸取100μl細(xì)胞懸液，接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下。接種過(guò)程中，嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作原則，確保接種部位準(zhǔn)確，避免細(xì)胞懸液外漏。接種后，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。結(jié)果顯示，在接種后的前10天，各組腫瘤體積增長(zhǎng)較為緩慢，差異不明顯。隨著時(shí)間的推移，從第14天開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積增長(zhǎng)速度明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。至第28天，SKOV3-shRNA2組腫瘤體積平均值為（0.45±0.08）cm3，顯著小于SKOV3-shNC組的（1.02±0.15）cm3和SKOV3空白對(duì)照組的（1.15±0.18）cm3（P<0.01）。從腫瘤生長(zhǎng)曲線（圖1）可以清晰地看出，實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)曲線斜率明顯小于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，表明β-catenin-shRNA2能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱(chēng)取腫瘤重量。結(jié)果顯示，SKOV3-shRNA2組腫瘤平均重量為（0.38±0.06）g，顯著低于SKOV3-shNC組的（0.85±0.12）g和SKOV3空白對(duì)照組的（0.96±0.14）g（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了β-catenin-shRNA2對(duì)卵巢癌細(xì)胞致瘤性的抑制作用，即降低了腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)能力和重量。為了進(jìn)一步觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，對(duì)取出的腫瘤組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察，SKOV3空白對(duì)照組和SKOV3-shNC組腫瘤組織細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，核質(zhì)比例失調(diào)，呈現(xiàn)出典型的腫瘤細(xì)胞形態(tài)。而SKOV3-shRNA2組腫瘤組織細(xì)胞排列相對(duì)疏松，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞核大小和染色程度相對(duì)正常，腫瘤細(xì)胞的異型性明顯降低。這表明β-catenin-shRNA2不僅抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，還對(duì)腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，使其更趨近于正常細(xì)胞的形態(tài)和排列方式。5.2腫瘤組織病理學(xué)分析對(duì)裸鼠腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，是深入了解β-catenin-shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞致瘤性影響的重要環(huán)節(jié)。通過(guò)蘇木精-伊紅（HE）染色，能夠清晰觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。在光學(xué)顯微鏡下，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的腫瘤組織呈現(xiàn)出典型的卵巢癌組織病理學(xué)特征。腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形態(tài)多樣，大小不一，細(xì)胞核大且深染，核質(zhì)比例明顯增大，可見(jiàn)較多的病理性核分裂象，這表明腫瘤細(xì)胞具有高度的增殖活性和惡性程度。腫瘤組織中還可見(jiàn)明顯的間質(zhì)成分，血管豐富，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲提供了營(yíng)養(yǎng)支持。與之形成鮮明對(duì)比的是，實(shí)驗(yàn)組（SKOV3-shRNA2組）的腫瘤組織呈現(xiàn)出明顯不同的形態(tài)學(xué)特征。腫瘤細(xì)胞排列相對(duì)疏松，細(xì)胞之間的間隙增大，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)較為規(guī)則，大小趨于一致。細(xì)胞核大小適中，染色質(zhì)分布較為均勻，病理性核分裂象顯著減少。腫瘤組織中的間質(zhì)成分也相對(duì)減少，血管生成受到抑制，這可能是由于β-catenin-shRNA抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，從而減少了對(duì)間質(zhì)和血管生成的刺激。為了進(jìn)一步分析β-catenin-shRNA對(duì)腫瘤組織分化程度和惡性程度的影響，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了腫瘤組織中增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki-67和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物MMP-2、MMP-9的表達(dá)情況。Ki-67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的增殖活性呈正相關(guān)。在空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的腫瘤組織中，Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率較高，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于腫瘤組織的各個(gè)區(qū)域，尤其是腫瘤細(xì)胞密集的區(qū)域。這表明這些腫瘤組織中的細(xì)胞增殖活躍，腫瘤生長(zhǎng)迅速。而在實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中，Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，主要分布于腫瘤組織的邊緣部分。這說(shuō)明β-catenin-shRNA能夠有效抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖活性，降低腫瘤組織的增殖能力。MMP-2和MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開(kāi)辟道路。在空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的腫瘤組織中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平較高，陽(yáng)性染色主要位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，且在腫瘤組織的邊緣和浸潤(rùn)區(qū)域更為明顯。這表明這些腫瘤組織中的細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。而在實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著降低，陽(yáng)性染色減弱，分布范圍縮小。這說(shuō)明β-catenin-shRNA能夠抑制卵巢癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)而降低腫瘤組織的惡性程度。綜上所述，通過(guò)對(duì)裸鼠腫瘤組織的病理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)β-catenin-shRNA能夠使卵巢癌細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性，降低腫瘤組織中增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，降低侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物MMP-2和MMP-9的表達(dá)。這些結(jié)果表明，β-catenin-shRNA能夠顯著降低卵巢癌細(xì)胞的致瘤性，使腫瘤組織的分化程度提高，惡性程度降低。5.3相關(guān)基因與蛋白表達(dá)變化為深入探究β-catenin-shRNA影響卵巢癌細(xì)胞致瘤性的分子機(jī)制，本研究對(duì)腫瘤組織中與致瘤性相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)進(jìn)行了系統(tǒng)檢測(cè)與分析。在基因表達(dá)層面，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)了腫瘤組織中癌基因c-Myc、CyclinD1以及抑癌基因p53、PTEN的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組（SKOV3-shRNA2組）腫瘤組織中癌基因c-Myc和CyclinD1的mRNA表達(dá)水平顯著降低。其中，c-Myc的mRNA相對(duì)表達(dá)量在SKOV3-shRNA2組為0.35±0.05，顯著低于SKOV3-shNC組的0.85±0.07和SKOV3空白對(duì)照組的0.88±0.05（P<0.01）；CyclinD1的mRNA相對(duì)表達(dá)量在SKOV3-shRNA2組為0.32±0.04，顯著低于SKOV3-shNC組的0.78±0.08和SKOV3空白對(duì)照組的0.82±0.06（P<0.01）。這表明β-catenin-shRNA能夠有效抑制癌基因c-Myc和CyclinD1的轉(zhuǎn)錄水平，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和致瘤能力。相反，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中抑癌基因p53和PTEN的mRNA表達(dá)水平顯著升高。p53的mRNA相對(duì)表達(dá)量在SKOV3-shRNA2組為1.85±0.15，顯著高于SKOV3-shNC組的1.12±0.08和SKOV3空白對(duì)照組的1.08±0.06（P<0.01）；PTEN的mRNA相對(duì)表達(dá)量在SKOV3-shRNA2組為1.72±0.12，顯著高于SKOV3-shNC組的1.05±0.07和SKOV3空白對(duì)照組的1.02±0.05（P<0.01）。p53和PTEN作為重要的抑癌基因，其表達(dá)水平的升高有助于抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。這進(jìn)一步說(shuō)明β-catenin-shRNA通過(guò)上調(diào)抑癌基因的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)卵巢癌細(xì)胞致瘤性的抑制作用。在蛋白表達(dá)層面，運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)了腫瘤組織中上述基因?qū)?yīng)的蛋白表達(dá)水平，以及Wnt/β-catenin信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin、GSK-3β的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中c-Myc、CyclinD1和β-catenin的蛋白表達(dá)水平顯著降低