TGEV單克隆抗體制備工藝優(yōu)化與多元檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用一、引言1.1研究背景豬傳染性胃腸炎（TransmissibleGastroenteritisofPigs，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVirus，TGEV）引發(fā)的一種高度接觸性的消化道傳染病，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。TGEV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，具有囊膜。該病毒主要通過消化道和呼吸道傳播，病豬和帶毒豬是主要傳染源，病毒可隨糞便、嘔吐物、乳汁等排出體外，污染飼料、飲水、空氣等，健康豬接觸后極易感染。TGE在冬春季節(jié)高發(fā)，這可能與低溫環(huán)境有利于病毒存活和傳播有關(guān)。幼齡仔豬，尤其是10日齡以內(nèi)的仔豬，感染TGEV后死亡率極高，可達(dá)90%以上。這是因?yàn)橛g仔豬的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對(duì)病毒的抵抗力較弱，且其胃腸道黏膜較為脆弱，更易受到病毒的侵襲。感染后的仔豬主要表現(xiàn)為劇烈腹瀉、嘔吐、脫水等癥狀。腹瀉會(huì)導(dǎo)致仔豬體內(nèi)大量水分和電解質(zhì)丟失，若得不到及時(shí)補(bǔ)充，會(huì)迅速引起脫水和酸堿平衡紊亂；嘔吐不僅影響仔豬的營養(yǎng)攝入，還可能導(dǎo)致誤吸，引發(fā)呼吸道感染；脫水則會(huì)進(jìn)一步加重機(jī)體代謝紊亂，影響各器官的正常功能，最終導(dǎo)致仔豬死亡。即使部分仔豬能夠存活，也會(huì)因生長發(fā)育受阻而降低養(yǎng)殖效益，增加養(yǎng)殖成本。對(duì)于成年豬而言，感染TGEV后的癥狀相對(duì)較輕，多表現(xiàn)為一過性的腹瀉和食欲不振。這是由于成年豬的免疫系統(tǒng)相對(duì)完善，能夠?qū)Σ《靖腥井a(chǎn)生一定的免疫應(yīng)答，限制病毒的復(fù)制和擴(kuò)散。然而，成年豬感染后可能成為帶毒者，持續(xù)向外界排毒，成為豬場(chǎng)中潛在的傳染源，威脅豬群的健康。在養(yǎng)豬業(yè)中，TGE的爆發(fā)會(huì)導(dǎo)致仔豬死亡率上升、育肥豬生長緩慢、飼料轉(zhuǎn)化率降低，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，在TGE流行期間，一些豬場(chǎng)的仔豬死亡率可高達(dá)70%-100%，育肥豬的生長周期延長1-2個(gè)月，飼料消耗增加20%-30%。此外，為了防控TGE，養(yǎng)殖戶需要投入大量的人力、物力和財(cái)力，包括加強(qiáng)豬舍的清潔消毒、購買疫苗和藥物、增加獸醫(yī)監(jiān)測(cè)等，進(jìn)一步增加了養(yǎng)殖成本。因此，TGE已成為制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要因素之一，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和可持續(xù)發(fā)展。準(zhǔn)確、快速地診斷TGEV感染對(duì)于及時(shí)采取防控措施、減少疫情傳播和經(jīng)濟(jì)損失至關(guān)重要。在感染初期，若能及時(shí)發(fā)現(xiàn)并隔離病豬，可有效阻止病毒的傳播，保護(hù)其他健康豬只。傳統(tǒng)的診斷方法如病毒分離、電鏡觀察等，雖然準(zhǔn)確性較高，但操作繁瑣、耗時(shí)較長，需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員，難以滿足臨床快速診斷的需求。血清學(xué)檢測(cè)方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光試驗(yàn)（IFA）等，雖然具有一定的敏感性和特異性，但存在交叉反應(yīng)、假陽性等問題。分子生物學(xué)檢測(cè)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及其衍生技術(shù)，雖然靈敏度高、特異性強(qiáng)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和操作人員的要求較高，且成本相對(duì)較高，在基層養(yǎng)殖場(chǎng)難以廣泛應(yīng)用。因此，開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、簡便、低成本的TGEV檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。單克隆抗體技術(shù)的出現(xiàn)為TGEV的檢測(cè)提供了新的思路和方法。單克隆抗體具有高度特異性、均一性和重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，能夠識(shí)別病毒的特定抗原表位，減少交叉反應(yīng)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。通過制備TGEV單克隆抗體，并建立相應(yīng)的檢測(cè)方法，如雙抗體夾心ELISA、免疫膠體金試紙條等，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)TGEV的快速、靈敏檢測(cè)。這些檢測(cè)方法操作簡便，無需復(fù)雜的儀器設(shè)備，可在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，為TGE的早期診斷和防控提供了有力的技術(shù)支持。同時(shí)，對(duì)TGEV單克隆抗體的研究還有助于深入了解病毒的抗原結(jié)構(gòu)、免疫機(jī)制等，為疫苗研發(fā)和疫病防控提供理論依據(jù)。1.2研究目的和意義本研究旨在制備針對(duì)TGEV的單克隆抗體，并建立基于該單克隆抗體的高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。通過運(yùn)用細(xì)胞融合技術(shù)和雜交瘤技術(shù)，獲得能夠穩(wěn)定分泌抗TGEV單克隆抗體的細(xì)胞株。在此基礎(chǔ)上，利用所制備的單克隆抗體，開發(fā)如雙抗體夾心ELISA、免疫膠體金試紙條等檢測(cè)方法，并對(duì)這些方法的特異性、敏感性和重復(fù)性等性能指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。豬傳染性胃腸炎給養(yǎng)豬業(yè)帶來了沉重的打擊，仔豬的高死亡率直接導(dǎo)致豬群數(shù)量的減少，影響了養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和生豬的供應(yīng)。同時(shí)，育肥豬生長緩慢和飼料轉(zhuǎn)化率降低，增加了養(yǎng)殖成本，降低了養(yǎng)殖效益。此外，為防控疫病投入的大量資源，也進(jìn)一步壓縮了養(yǎng)豬業(yè)的利潤空間。通過制備TGEV單克隆抗體并建立檢測(cè)方法，能夠在感染初期快速、準(zhǔn)確地診斷TGEV感染，及時(shí)采取隔離、治療等防控措施，有效阻止疫情的擴(kuò)散，降低仔豬死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失。這對(duì)于保障養(yǎng)豬業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。從病毒研究角度來看，TGEV的抗原結(jié)構(gòu)和免疫機(jī)制仍有許多未知之處。單克隆抗體能夠特異性地識(shí)別病毒的特定抗原表位，通過對(duì)TGEV單克隆抗體的研究，可以深入了解病毒的抗原結(jié)構(gòu)，明確病毒與宿主細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制。這有助于揭示TGEV的免疫逃逸機(jī)制、致病機(jī)理等，為開發(fā)更有效的疫苗和治療藥物提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，單克隆抗體也可作為研究工具，用于病毒的分離、鑒定和定量分析等，推動(dòng)TGEV相關(guān)研究的深入開展。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，針對(duì)TGEV單克隆抗體制備的研究起步較早。早期，科研人員主要聚焦于通過傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)來獲取單克隆抗體。如[具體文獻(xiàn)]中，研究人員利用TGEV的全病毒抗原免疫小鼠，隨后進(jìn)行細(xì)胞融合和篩選，成功獲得了能夠分泌抗TGEV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。通過對(duì)這些單克隆抗體的特性分析，發(fā)現(xiàn)它們能夠特異性地識(shí)別TGEV的某些抗原表位，為后續(xù)的檢測(cè)方法開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。然而，該研究也指出，傳統(tǒng)方法制備的單克隆抗體在親和力和穩(wěn)定性方面存在一定的局限性，可能影響檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，基因工程技術(shù)逐漸應(yīng)用于TGEV單克隆抗體制備領(lǐng)域。[具體文獻(xiàn)]中采用噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建了TGEV特異性的噬菌體抗體庫，從中篩選出了具有高親和力的單克隆抗體。這種方法克服了傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)的一些缺點(diǎn)，如可避免動(dòng)物免疫過程中的個(gè)體差異，能夠更高效地篩選出優(yōu)質(zhì)的抗體。但該技術(shù)也面臨著操作復(fù)雜、成本較高等問題，限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。在檢測(cè)方法建立方面，國外已經(jīng)開發(fā)了多種基于TGEV單克隆抗體的檢測(cè)技術(shù)。雙抗體夾心ELISA是較為常用的一種方法，[具體文獻(xiàn)]中利用制備的單克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系，該方法能夠快速、靈敏地檢測(cè)出樣品中的TGEV抗原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)下限可達(dá)[具體數(shù)值]，具有較高的敏感性。同時(shí)，通過對(duì)不同病毒的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了其良好的特異性。不過，該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作人員的要求較高，且檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長，在基層養(yǎng)殖場(chǎng)的應(yīng)用受到一定限制。免疫熒光技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于TGEV的檢測(cè)。[具體文獻(xiàn)]利用熒光標(biāo)記的TGEV單克隆抗體，通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛑庇^地觀察到病毒在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。這種方法不僅可以用于病毒的檢測(cè)，還能為研究病毒的感染機(jī)制提供重要信息。然而，免疫熒光技術(shù)需要熒光顯微鏡等專業(yè)設(shè)備，檢測(cè)成本較高，不利于大規(guī)模的臨床檢測(cè)。國內(nèi)在TGEV單克隆抗體制備及檢測(cè)方法研究方面也取得了顯著進(jìn)展。在單克隆抗體制備上，科研人員不斷優(yōu)化傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)流程。[具體文獻(xiàn)]通過改進(jìn)免疫程序和細(xì)胞融合條件，提高了雜交瘤細(xì)胞的陽性率和穩(wěn)定性。該研究采用多次免疫結(jié)合加強(qiáng)免疫的方式，使小鼠產(chǎn)生了更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，從而獲得了更多高質(zhì)量的單克隆抗體。同時(shí)，對(duì)細(xì)胞融合過程中的融合劑種類和濃度進(jìn)行了篩選，提高了細(xì)胞融合的效率。此外，國內(nèi)也在積極探索新的抗體制備技術(shù)。[具體文獻(xiàn)]嘗試?yán)脝蜝細(xì)胞技術(shù)制備TGEV單克隆抗體，該技術(shù)能夠直接從免疫動(dòng)物的脾臟中分離出單個(gè)B細(xì)胞，然后通過PCR擴(kuò)增和表達(dá)獲得單克隆抗體。這種方法具有快速、簡便、可繞過細(xì)胞融合過程等優(yōu)點(diǎn)，為TGEV單克隆抗體的制備提供了新的途徑。但目前該技術(shù)還處于研究階段，在抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量上還有待進(jìn)一步提高。在檢測(cè)方法方面，國內(nèi)除了對(duì)傳統(tǒng)的ELISA和免疫熒光技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化外，還開發(fā)了一些新型的檢測(cè)技術(shù)。免疫膠體金試紙條因其操作簡便、快速、無需專業(yè)設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，在國內(nèi)得到了廣泛的研究和應(yīng)用。[具體文獻(xiàn)]制備了基于TGEV單克隆抗體的免疫膠體金試紙條，該試紙條能夠在15分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，結(jié)果判斷簡單直觀。通過對(duì)臨床樣品的檢測(cè)，驗(yàn)證了其良好的特異性和敏感性。然而，免疫膠體金試紙條在靈敏度方面與ELISA等方法相比仍有一定差距，對(duì)于低濃度的病毒樣本可能出現(xiàn)漏檢的情況。此外，國內(nèi)還開展了基于納米技術(shù)的TGEV檢測(cè)方法研究。[具體文獻(xiàn)]利用納米材料的獨(dú)特性質(zhì)，如高比表面積、良好的光學(xué)和電學(xué)性能等，構(gòu)建了新型的TGEV檢測(cè)平臺(tái)。這些方法具有靈敏度高、檢測(cè)速度快等優(yōu)勢(shì)，但目前還存在成本較高、技術(shù)不夠成熟等問題，需要進(jìn)一步的研究和完善。二、TGEV單克隆抗體制備材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料病毒株：TGEV毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存，其來源清晰，經(jīng)過多次傳代和鑒定，病毒滴度穩(wěn)定，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。在使用前，需對(duì)病毒進(jìn)行復(fù)蘇和擴(kuò)增，通過接種于合適的細(xì)胞系，如ST細(xì)胞，在適宜的培養(yǎng)條件下，使病毒大量繁殖，收獲病毒液后進(jìn)行滴度測(cè)定，確保病毒活性和濃度符合實(shí)驗(yàn)要求。細(xì)胞系：選用ST細(xì)胞作為TGEV的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞系對(duì)TGEV具有良好的敏感性，能夠支持病毒的高效復(fù)制。ST細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，細(xì)胞復(fù)蘇后，在含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，定期傳代，保持細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周齡的雌性BALB/c小鼠，購自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，動(dòng)物健康狀況良好，無特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）。小鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度為50%-60%，給予充足的飼料和飲水，適應(yīng)環(huán)境一周后用于實(shí)驗(yàn)。在免疫過程中，嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求進(jìn)行操作，確保動(dòng)物福利。試劑：弗氏完全佐劑（Freund'sCompleteAdjuvant，F(xiàn)CA）、弗氏不完全佐劑（Freund'sIncompleteAdjuvant，F(xiàn)IA）購自Sigma公司，用于增強(qiáng)小鼠的免疫應(yīng)答；聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PEG）1450用于細(xì)胞融合，其純度高，能夠有效促進(jìn)細(xì)胞融合；HAT（Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine）培養(yǎng)基和HT（Hypoxanthine-Thymidine）培養(yǎng)基用于雜交瘤細(xì)胞的篩選和培養(yǎng)，可提供細(xì)胞生長所需的特殊營養(yǎng)成分；辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體用于ELISA檢測(cè)，其特異性強(qiáng)，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)小鼠抗體；其他常用試劑如碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，用于配制各種緩沖液和培養(yǎng)基。儀器：CO?培養(yǎng)箱用于細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞生長提供穩(wěn)定的環(huán)境；超凈工作臺(tái)用于無菌操作，有效防止實(shí)驗(yàn)過程中的微生物污染；高速離心機(jī)用于病毒和細(xì)胞的分離、濃縮，其轉(zhuǎn)速高，分離效果好；酶標(biāo)儀用于ELISA檢測(cè)結(jié)果的讀取，能夠準(zhǔn)確測(cè)量吸光度值；倒置顯微鏡用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀況，方便及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件；細(xì)胞融合儀用于細(xì)胞融合操作，通過電場(chǎng)誘導(dǎo)等方式促進(jìn)細(xì)胞融合。2.2TGEV的培養(yǎng)與純化將處于對(duì)數(shù)生長期的ST細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長至80%-90%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)液。用PBS緩沖液輕柔沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的血清和雜質(zhì)。按照一定的感染復(fù)數(shù)（MOI）接種TGEV，加入適量的無血清DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中吸附1-2小時(shí)，期間每隔15-30分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使病毒均勻分布，充分吸附于細(xì)胞表面。吸附結(jié)束后，補(bǔ)加含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect，CPE），如細(xì)胞變圓、脫落、融合等。當(dāng)70%-80%的細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE時(shí)，收集病毒培養(yǎng)液。將收集的病毒培養(yǎng)液于4℃、8000rpm離心15分鐘，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。將上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，在4℃條件下，以100000rpm的轉(zhuǎn)速超速離心2小時(shí)，使病毒沉淀。小心棄去上清液，用適量的PBS緩沖液重懸病毒沉淀。接著，在超凈工作臺(tái)中，取適量重懸后的病毒液，緩慢加至預(yù)先制備好的蔗糖密度梯度離心管中，蔗糖濃度梯度從下往上依次為60%、45%、30%和15%。在4℃、100000rpm條件下，進(jìn)行蔗糖密度梯度離心3小時(shí)。離心結(jié)束后，使用移液器小心地從離心管底部吸取不同密度層的病毒帶，將含有病毒的蔗糖溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入適量的PBS緩沖液，充分混合后，在4℃、8000rpm條件下離心15分鐘，去除蔗糖。重復(fù)此洗滌步驟2-3次，以徹底去除蔗糖。最后，用適量的PBS緩沖液重懸純化后的病毒，分裝后于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谡麄€(gè)培養(yǎng)與純化過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止雜菌污染，影響病毒的質(zhì)量和活性。同時(shí)，對(duì)每一步操作進(jìn)行詳細(xì)記錄，包括時(shí)間、溫度、轉(zhuǎn)速等參數(shù)，以便后續(xù)分析和優(yōu)化。2.3動(dòng)物免疫取適量純化后的TGEV病毒，用PBS緩沖液稀釋至合適濃度。首次免疫時(shí)，將TGEV病毒與弗氏完全佐劑按1:1的體積比充分乳化，采用皮下多點(diǎn)注射的方式，每只BALB/c小鼠注射0.2mL乳化后的抗原，其中病毒含量為[X]μg。此次免疫旨在激發(fā)小鼠的初始免疫應(yīng)答，弗氏完全佐劑中的分枝桿菌成分能夠刺激小鼠的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抗原的免疫原性。間隔兩周后進(jìn)行第二次免疫，將TGEV病毒與弗氏不完全佐劑按1:1體積比乳化，同樣采用皮下多點(diǎn)注射，每只小鼠注射0.2mL，病毒含量仍為[X]μg。弗氏不完全佐劑可進(jìn)一步維持和增強(qiáng)免疫應(yīng)答，使小鼠的免疫系統(tǒng)持續(xù)受到刺激。再過兩周進(jìn)行第三次免疫，用不含佐劑的TGEV病毒液，經(jīng)腹腔注射，每只小鼠注射0.2mL，病毒含量為[X]μg。此次免疫的目的是強(qiáng)化小鼠的免疫記憶，使B淋巴細(xì)胞大量增殖并分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生更多的特異性抗體。在第三次免疫后的第7天，通過眼眶采血法采集小鼠少量血液，分離血清，采用間接ELISA法檢測(cè)血清中抗TGEV抗體的效價(jià)。若抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平（如大于1:10000），則表明小鼠免疫成功，可進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)；若效價(jià)未達(dá)標(biāo)，可考慮進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，免疫方式和劑量與第三次免疫相同，加強(qiáng)免疫后3-5天再次檢測(cè)抗體效價(jià)。2.4細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)是制備單克隆抗體的核心技術(shù)，其原理是將免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，形成既能無限增殖又能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中，選用SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫后的BALB/c小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。SP2/0骨髓瘤細(xì)胞具有在體外無限增殖的能力，且缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），在含有次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的HAT培養(yǎng)基中不能生長。而正常的脾細(xì)胞雖具有HGPRT，但在體外培養(yǎng)條件下存活時(shí)間有限，一般只能存活1-2周。當(dāng)脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后形成的雜交瘤細(xì)胞，既具備骨髓瘤細(xì)胞無限增殖的特性，又擁有脾細(xì)胞分泌抗體的能力，且能夠在HAT培養(yǎng)基中生長，從而實(shí)現(xiàn)特異性抗體的持續(xù)分泌。在細(xì)胞融合前，需對(duì)相關(guān)材料和設(shè)備進(jìn)行充分準(zhǔn)備。提前復(fù)蘇并培養(yǎng)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，使其處于對(duì)數(shù)生長期，此時(shí)細(xì)胞活力旺盛，融合效率較高。在融合前1-2天，將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞密度至合適范圍，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時(shí)，準(zhǔn)備好細(xì)胞融合所需的試劑，如PEG1450、DMEM培養(yǎng)基、HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基等，并將其預(yù)熱至37℃，以減少溫度變化對(duì)細(xì)胞的影響。此外，還需準(zhǔn)備好無菌的離心管、移液器、細(xì)胞培養(yǎng)板等實(shí)驗(yàn)器材。融合當(dāng)天，采用頸椎脫臼法處死免疫成功的BALB/c小鼠，將小鼠浸泡于75%酒精中消毒5-10分鐘，以殺滅體表微生物，防止污染。在超凈工作臺(tái)中，用無菌鑷子和剪刀打開小鼠腹腔，取出脾臟，將脾臟置于盛有預(yù)冷PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中，輕輕漂洗，去除表面的血液和雜質(zhì)。用眼科剪將脾臟剪成小塊，然后用注射器芯研磨脾臟組織，使其通過200目細(xì)胞篩網(wǎng)，制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液。將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃條件下，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸沉淀的脾細(xì)胞，再次離心洗滌2-3次，以徹底去除殘留的血細(xì)胞和雜質(zhì)。最后，用適量的DMEM培養(yǎng)基重懸脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?-5×10?個(gè)/mL。取處于對(duì)數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、1000rpm條件下離心10分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸沉淀的SP2/0細(xì)胞，離心洗滌2-3次。然后，用適量的DMEM培養(yǎng)基重懸SP2/0細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?-5×10?個(gè)/mL。將脾細(xì)胞懸液和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞懸液按照4:1-10:1的比例混合于50mL離心管中，輕輕吹打混勻。在4℃、1000rpm條件下離心10分鐘，棄去上清液。輕輕敲擊離心管底部，使細(xì)胞團(tuán)塊松散，將離心管置于37℃水浴鍋中預(yù)熱。向離心管中緩慢滴加預(yù)熱至37℃的50%PEG1450溶液，在1分鐘內(nèi)逐滴加入，邊加邊輕輕搖勻，使PEG均勻作用于細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞融合。滴加完畢后，繼續(xù)在37℃水浴中作用1-2分鐘。然后，緩慢加入預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基，終止PEG的作用。在10分鐘內(nèi)，由慢至快逐步滴加10-15mLDMEM培養(yǎng)基，邊加邊輕輕搖勻。在4℃、1000rpm條件下離心10分鐘，棄去上清液。用含有10%FBS的HAT培養(yǎng)基重懸沉淀的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適范圍。將細(xì)胞懸液接種于提前鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μL，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。飼養(yǎng)細(xì)胞通常選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，其能夠分泌多種細(xì)胞因子，為雜交瘤細(xì)胞的生長提供必要的營養(yǎng)和生長環(huán)境，提高雜交瘤細(xì)胞的存活率和生長速度。在融合后的第3-5天，根據(jù)細(xì)胞生長情況，用含有10%FBS的HT培養(yǎng)基半量換液，去除未融合的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞。此后，每隔2-3天換液一次，密切觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化。2.5陽性雜交瘤細(xì)胞篩選與克隆化在細(xì)胞融合后的第7-10天，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板中生長至孔底面積的1/3-1/2時(shí)，即可進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選。采用間接ELISA法進(jìn)行篩選，該方法的原理是基于抗原抗體的特異性結(jié)合，通過酶標(biāo)二抗與雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體結(jié)合，再利用酶催化底物顯色，根據(jù)吸光度值判斷雜交瘤細(xì)胞是否分泌抗TGEV抗體。具體操作如下：將純化的TGEV抗原用包被緩沖液（如碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至合適濃度（如1-5μg/mL），每孔加入100μL，包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜。包被的目的是使抗原牢固地吸附在酶標(biāo)板孔表面，以便與雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體結(jié)合。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液（如含0.05%Tween-20的PBS，PBST）洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次洗滌時(shí)間為3-5分鐘，以去除未結(jié)合的抗原和雜質(zhì)。然后，每孔加入200μL封閉液（如含5%脫脂奶粉的PBST），37℃孵育1-2小時(shí)，封閉酶標(biāo)板上剩余的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性反應(yīng)。封閉結(jié)束后，再次用PBST洗滌3-5次。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為一抗，每孔加入100μL，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔（加入未免疫小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液）和陽性對(duì)照孔（加入已知的抗TGEV陽性血清），37℃孵育1-2小時(shí)。一抗孵育后，用PBST洗滌3-5次。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，二抗用稀釋液（如含1%BSA的PBST）按一定比例（如1:5000-1:10000）稀釋，每孔加入100μL，37℃孵育1-2小時(shí)。二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，并且其攜帶的HRP可催化后續(xù)加入的底物顯色。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌5-7次，以徹底去除未結(jié)合的二抗。每孔加入100μL底物溶液（如TMB底物緩沖液，含3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫），室溫避光反應(yīng)15-30分鐘。在底物溶液中，HRP催化過氧化氫分解，產(chǎn)生的氧將無色的TMB氧化為藍(lán)色產(chǎn)物，顏色的深淺與雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體量成正比。當(dāng)陽性對(duì)照孔出現(xiàn)明顯的藍(lán)色時(shí)，加入50μL終止液（如2mol/L硫酸）終止反應(yīng)，此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)預(yù)設(shè)的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，如樣品孔的OD值大于陰性對(duì)照孔OD值的2.1倍，則判定該孔的雜交瘤細(xì)胞為陽性。篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞孔做好標(biāo)記，以備后續(xù)克隆化。對(duì)于篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞，為了獲得遺傳穩(wěn)定、分泌單一抗體的細(xì)胞株，需要進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，該方法的原理是將細(xì)胞進(jìn)行梯度稀釋，使每個(gè)孔中平均只含有一個(gè)細(xì)胞，通過單細(xì)胞培養(yǎng)，最終獲得由單個(gè)細(xì)胞增殖而來的細(xì)胞克隆。具體步驟為：將陽性雜交瘤細(xì)胞用含10%FBS的HT培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整至5-10個(gè)/mL。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL飼養(yǎng)細(xì)胞懸液（飼養(yǎng)細(xì)胞的制備方法同細(xì)胞融合時(shí)），然后每孔加入100μL細(xì)胞懸液，使每孔中平均含有0.5-1個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天觀察細(xì)胞生長情況，及時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)液。一般在培養(yǎng)7-10天后，可見單個(gè)細(xì)胞增殖形成細(xì)胞集落。當(dāng)細(xì)胞集落生長至孔底面積的1/3-1/2時(shí)，采用間接ELISA法再次檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗體的分泌情況，篩選出陽性細(xì)胞集落。對(duì)陽性細(xì)胞集落進(jìn)行多次克隆化，一般重復(fù)3-4次，直至所有克隆化細(xì)胞分泌的抗體效價(jià)和特異性均保持穩(wěn)定。經(jīng)過克隆化獲得的穩(wěn)定分泌抗TGEV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和凍存，用于后續(xù)的抗體生產(chǎn)和檢測(cè)方法建立。在克隆化過程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如細(xì)胞濃度、培養(yǎng)環(huán)境等，以提高克隆化的成功率。2.6單克隆抗體的制備與純化選取處于對(duì)數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的穩(wěn)定分泌抗TGEV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整至1×10?-5×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入適量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底部約80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代或用于制備腹水。為了提高腹水的產(chǎn)量和質(zhì)量，在接種雜交瘤細(xì)胞前一周，對(duì)6-8周齡的雌性BALB/c小鼠進(jìn)行預(yù)處理，每只小鼠腹腔注射0.5mL液體石蠟，以刺激小鼠腹腔產(chǎn)生免疫反應(yīng)，為雜交瘤細(xì)胞的生長提供適宜的環(huán)境。一周后，用頸椎脫臼法處死小鼠，將小鼠浸泡于75%酒精中消毒5-10分鐘。在超凈工作臺(tái)中，用無菌注射器吸取適量處于對(duì)數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞懸液，每只小鼠腹腔注射1×10?-5×10?個(gè)細(xì)胞。接種后，密切觀察小鼠的狀態(tài)，如精神狀態(tài)、飲食情況、腹部腫脹程度等。一般在接種雜交瘤細(xì)胞后7-10天，小鼠腹部明顯腫脹，表明腹水中已含有大量單克隆抗體，此時(shí)可進(jìn)行腹水采集。采集時(shí)，將小鼠固定于鼠板上，用碘伏消毒小鼠腹部皮膚。用無菌注射器從小鼠腹部一側(cè)緩慢刺入腹腔，注意避開內(nèi)臟器官，抽取腹水。盡量將腹水中的液體全部抽出，收集到無菌離心管中。每只小鼠可根據(jù)腹水生成情況，多次采集腹水，但每次采集量不宜過多，以免影響小鼠健康和腹水的后續(xù)產(chǎn)量。采集的腹水若不能立即進(jìn)行純化，需分裝后于-80℃保存，防止抗體降解和微生物污染。腹水采集后，需進(jìn)行純化以去除其中的雜質(zhì)和雜蛋白，提高單克隆抗體的純度。采用ProteinG親和層析法對(duì)腹水進(jìn)行純化，ProteinG是一種從鏈球菌中分離得到的蛋白質(zhì)，它能夠特異性地與抗體的Fc段結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)抗體的分離和純化。首先，將ProteinG親和層析柱用適量的平衡緩沖液（如PBS緩沖液，pH7.4）平衡，使層析柱達(dá)到穩(wěn)定的工作狀態(tài)。將收集的腹水從-80℃取出，置于冰上解凍，然后在4℃、10000rpm條件下離心30分鐘，去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。將離心后的上清液緩慢加入到平衡好的ProteinG親和層析柱中，使抗體與ProteinG充分結(jié)合，未結(jié)合的雜質(zhì)則隨流出液流出。用大量的洗滌緩沖液（如含0.05%Tween-20的PBS緩沖液，PBST）洗滌層析柱，以去除未結(jié)合的雜蛋白和其他雜質(zhì)，直到流出液的吸光度值（OD值）在280nm波長處接近基線。用洗脫緩沖液（如0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液，pH2.5-3.0）洗脫與ProteinG結(jié)合的單克隆抗體，收集洗脫液。在洗脫過程中，密切監(jiān)測(cè)流出液的OD值，當(dāng)OD值出現(xiàn)明顯升高時(shí)，開始收集洗脫液，直至OD值降至基線水平。為了使洗脫后的抗體溶液恢復(fù)到適宜的pH值和離子強(qiáng)度，便于后續(xù)的使用和保存，對(duì)收集的洗脫液進(jìn)行透析處理。將洗脫液裝入透析袋中，透析袋的截留分子量應(yīng)根據(jù)抗體的大小選擇合適的規(guī)格，一般為10000-14000Da。將透析袋置于含有大量透析緩沖液（如PBS緩沖液，pH7.4）的容器中，在4℃條件下透析12-24小時(shí)，期間更換透析緩沖液3-4次，以徹底去除洗脫緩沖液中的鹽分和雜質(zhì)。透析結(jié)束后，取出透析袋中的抗體溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝后于-20℃或-80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谡麄€(gè)單克隆抗體制備與純化過程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保抗體的活性和純度不受影響。同時(shí)，對(duì)每一步操作進(jìn)行詳細(xì)記錄，包括細(xì)胞培養(yǎng)情況、腹水采集量、純化過程中的參數(shù)等，以便后續(xù)分析和優(yōu)化。2.7單克隆抗體的鑒定2.7.1亞型鑒定使用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，按照試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行。將純化后的單克隆抗體稀釋至合適濃度，加入到已包被有抗小鼠IgG、IgM、IgA等不同亞型抗體的微孔板中，37℃孵育1-2小時(shí)，使單克隆抗體與相應(yīng)的亞型抗體結(jié)合。用洗滌緩沖液充分洗滌微孔板，去除未結(jié)合的抗體。加入酶標(biāo)記的抗小鼠IgG、IgM、IgA等二抗，37℃孵育1-2小時(shí)。再次洗滌后，加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-30分鐘，當(dāng)顏色變化明顯時(shí)，加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在特定波長下測(cè)定各孔的吸光度值，根據(jù)吸光度值的大小判斷單克隆抗體的亞型。若某一亞型孔的吸光度值顯著高于其他亞型孔，則該單克隆抗體屬于相應(yīng)的亞型。通過亞型鑒定，可以了解單克隆抗體的類別，為后續(xù)的應(yīng)用提供參考，不同亞型的抗體在免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制和應(yīng)用場(chǎng)景可能存在差異。2.7.2Westernblot分析將純化的TGEV病毒蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，通過電泳可根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小將其分離。電泳結(jié)束后，采用半干轉(zhuǎn)印法將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（NC膜）上，使蛋白質(zhì)固定在膜上。將NC膜放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性背景。封閉后，用TBST緩沖液洗滌NC膜3-5次，每次5-10分鐘。將膜與制備的單克隆抗體（用稀釋液按一定比例稀釋，如1:1000-1:5000）在4℃孵育過夜，使單克隆抗體與TGEV病毒蛋白上的相應(yīng)抗原表位特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液充分洗滌NC膜，以去除未結(jié)合的單克隆抗體。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（用稀釋液按一定比例稀釋，如1:5000-1:10000），室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌NC膜5-7次。每孔加入適量的化學(xué)發(fā)光底物溶液，在暗室中孵育1-5分鐘，使HRP催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)，觀察是否出現(xiàn)特異性條帶。若在預(yù)期的分子量位置出現(xiàn)清晰的條帶，且陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)，則表明單克隆抗體能夠特異性識(shí)別TGEV蛋白，可用于后續(xù)的檢測(cè)和研究。Westernblot分析可以直觀地驗(yàn)證單克隆抗體對(duì)TGEV蛋白的特異性識(shí)別能力，為其在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用提供重要依據(jù)。2.7.3間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)將ST細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至70%-80%融合時(shí)，接種TGEV病毒，在適宜條件下培養(yǎng)，使病毒感染細(xì)胞。感染一定時(shí)間后（根據(jù)病毒感染特性和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定，如12-24小時(shí)），取出蓋玻片，用PBS緩沖液輕柔洗滌3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的病毒和雜質(zhì)。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，使細(xì)胞形態(tài)和抗原結(jié)構(gòu)固定。固定后，再次用PBS緩沖液洗滌3次。用0.2%TritonX-100處理細(xì)胞10-15分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。然后，用PBS緩沖液洗滌3次。將制備的單克隆抗體用稀釋液（如含1%BSA的PBS）按一定比例（如1:100-1:500）稀釋，滴加在蓋玻片上，37℃孵育1-2小時(shí)，使單克隆抗體與感染TGEV細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液充分洗滌蓋玻片3-5次。加入熒光素標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（用稀釋液按一定比例稀釋，如1:500-1:1000），37℃避光孵育1-2小時(shí)。孵育期間需注意避光，防止熒光素淬滅。用PBS緩沖液洗滌蓋玻片5-7次。用含有DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的封片劑將蓋玻片封片，DAPI可對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，便于觀察細(xì)胞形態(tài)和定位。在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長根據(jù)所用熒光素的特性選擇，如FITC標(biāo)記的二抗通常用488nm激發(fā)光。若在感染TGEV的細(xì)胞中觀察到特異性的綠色熒光（以FITC標(biāo)記為例），且未感染病毒的細(xì)胞無熒光或熒光很弱，則表明單克隆抗體能夠與感染TGEV的細(xì)胞特異性結(jié)合，可用于免疫熒光檢測(cè)，為病毒感染的可視化檢測(cè)提供了有力手段。2.7.4特異性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)選取與TGEV具有一定相關(guān)性的病毒，如豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（PRV）、II型豬圓環(huán)病毒（PCV2）等。將這些病毒分別感染相應(yīng)的敏感細(xì)胞，培養(yǎng)后收集病毒液。將制備的單克隆抗體用稀釋液按一定比例（如1:100-1:500）稀釋。采用間接ELISA法檢測(cè)單克隆抗體與這些病毒的交叉反應(yīng)情況。將不同病毒的抗原用包被緩沖液稀釋至合適濃度，分別包被96孔酶標(biāo)板，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3-5次。每孔加入200μL封閉液，37℃孵育1-2小時(shí)。封閉結(jié)束后，再次用PBST緩沖液洗滌3-5次。每孔加入100μL稀釋后的單克隆抗體，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照孔（加入已知的抗TGEV陽性血清）和陰性對(duì)照孔（加入未免疫小鼠的血清），37℃孵育1-2小時(shí)。用PBST緩沖液洗滌3-5次。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，37℃孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌5-7次。每孔加入100μL底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-30分鐘。當(dāng)陽性對(duì)照孔出現(xiàn)明顯顏色變化時(shí)，加入50μL終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值。若單克隆抗體與其他病毒孔的吸光度值與陰性對(duì)照孔相近，且顯著低于陽性對(duì)照孔，則表明單克隆抗體與這些病毒無明顯交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，可用于TGEV的特異性檢測(cè)，避免因交叉反應(yīng)導(dǎo)致的誤診。2.7.5效價(jià)測(cè)定采用間接ELISA法測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)。將純化的TGEV抗原用包被緩沖液稀釋至合適濃度（如1-5μg/mL），包被96孔酶標(biāo)板，每孔加入100μL，4℃過夜。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次3-5分鐘。每孔加入200μL封閉液，37℃孵育1-2小時(shí)。封閉結(jié)束后，再次用PBST緩沖液洗滌3-5次。將制備的單克隆抗體用含1%BSA的PBST緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，如從1:100開始，依次稀釋為1:200、1:400、1:800等。每孔加入100μL不同稀釋度的單克隆抗體，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔（加入未免疫小鼠的血清）和陽性對(duì)照孔（加入已知的高滴度抗TGEV抗體），37℃孵育1-2小時(shí)。用PBST緩沖液洗滌3-5次。加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體作為二抗，37℃孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBST緩沖液洗滌5-7次。每孔加入100μL底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-30分鐘。當(dāng)陽性對(duì)照孔出現(xiàn)明顯顏色變化時(shí)，加入50μL終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值。以陰性對(duì)照孔吸光度值的2.1倍作為判斷陽性的標(biāo)準(zhǔn)，將單克隆抗體稀釋度高于該標(biāo)準(zhǔn)且吸光度值大于陰性對(duì)照孔2.1倍的最大稀釋倍數(shù)確定為單克隆抗體的效價(jià)。效價(jià)的測(cè)定可以反映單克隆抗體的濃度和活性，為其在檢測(cè)方法中的應(yīng)用提供重要參數(shù)，效價(jià)越高，說明單克隆抗體的濃度和活性越高，在檢測(cè)中可能具有更高的靈敏度。三、TGEV單克隆抗體檢測(cè)方法的建立3.1雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立3.1.1原理雙抗體夾心ELISA檢測(cè)TGEV的免疫學(xué)原理基于抗原抗體的特異性結(jié)合。該方法使用兩種針對(duì)TGEV不同抗原表位的單克隆抗體，一種作為捕獲抗體，另一種作為檢測(cè)抗體。首先，將捕獲抗體包被在固相載體（如酶標(biāo)板）表面，其能夠特異性地與TGEV抗原結(jié)合。當(dāng)含有TGEV抗原的樣品加入到包被有捕獲抗體的酶標(biāo)板孔中時(shí)，TGEV抗原會(huì)與捕獲抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物。接著，加入酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，檢測(cè)抗體能夠識(shí)別并結(jié)合TGEV抗原上的另一個(gè)不同表位，從而形成“捕獲抗體-TGEV抗原-酶標(biāo)檢測(cè)抗體”的夾心結(jié)構(gòu)。經(jīng)過充分洗滌，去除未結(jié)合的物質(zhì)，此時(shí)固相載體上僅保留與TGEV抗原特異性結(jié)合的抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物。加入酶的底物后，酶標(biāo)檢測(cè)抗體上的酶會(huì)催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物。在一定范圍內(nèi)，底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的顏色深淺與樣品中TGEV抗原的含量成正比。通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可定量分析樣品中TGEV抗原的含量。這種方法利用了兩種抗體對(duì)TGEV抗原不同表位的特異性識(shí)別，大大提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度。由于需要兩個(gè)抗體分別與TGEV抗原的不同表位結(jié)合，因此該方法適用于檢測(cè)具有多個(gè)抗原表位的大分子抗原，而TGEV作為一種病毒，其結(jié)構(gòu)蛋白具有多個(gè)抗原表位，適合用雙抗體夾心ELISA進(jìn)行檢測(cè)。3.1.2實(shí)驗(yàn)步驟將制備的針對(duì)TGEV的捕獲抗體用包被緩沖液（如0.05MpH9.6的碳酸鹽緩沖液）稀釋至合適濃度（如1-10μg/mL），每孔加入100μL到96孔酶標(biāo)板中，4℃過夜包被。包被的目的是使捕獲抗體牢固地吸附在酶標(biāo)板孔表面，以便后續(xù)與TGEV抗原結(jié)合。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS，PBST）洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次洗滌3-5分鐘，以去除未結(jié)合的捕獲抗體和雜質(zhì)。將待檢測(cè)的樣品（如豬糞便懸液、組織勻漿上清液等）用樣品稀釋液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，每孔加入100μL到已包被捕獲抗體的酶標(biāo)板孔中，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照孔（加入已知含有TGEV抗原的標(biāo)準(zhǔn)品）和陰性對(duì)照孔（加入不含TGEV抗原的正常樣品或樣品稀釋液），37℃孵育1-2小時(shí)，使樣品中的TGEV抗原與捕獲抗體充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌酶標(biāo)板3-5次，去除未結(jié)合的樣品和雜質(zhì)。將酶標(biāo)檢測(cè)抗體用稀釋液（如含1%BSA的PBST）按一定比例（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳稀釋度，如1:1000-1:5000）稀釋后，每孔加入100μL到酶標(biāo)板孔中，37℃孵育0.5-1小時(shí)，使酶標(biāo)檢測(cè)抗體與已結(jié)合在捕獲抗體上的TGEV抗原結(jié)合，形成夾心結(jié)構(gòu)。孵育結(jié)束后，再次用PBST洗滌酶標(biāo)板5-7次，以徹底去除未結(jié)合的酶標(biāo)檢測(cè)抗體。每孔加入100μL底物溶液（如TMB底物緩沖液，含3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫），室溫避光反應(yīng)15-30分鐘。在底物溶液中，酶標(biāo)檢測(cè)抗體上的酶（如HRP）催化過氧化氫分解，產(chǎn)生的氧將無色的TMB氧化為藍(lán)色產(chǎn)物。當(dāng)陽性對(duì)照孔出現(xiàn)明顯的藍(lán)色時(shí)，加入50μL終止液（如2mol/L硫酸）終止反應(yīng)，此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)預(yù)設(shè)的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，如樣品孔的OD值大于陰性對(duì)照孔OD值的2.1倍，則判定該樣品為陽性，表明樣品中含有TGEV抗原；若樣品孔的OD值小于陰性對(duì)照孔OD值的2.1倍，則判定為陰性。同時(shí)，可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中TGEV抗原的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制是通過將已知濃度的TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行一系列稀釋后，按照上述步驟進(jìn)行檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際檢測(cè)中，根據(jù)樣品的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對(duì)應(yīng)的濃度，即可得到樣品中TGEV抗原的含量。3.1.3條件優(yōu)化在建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法時(shí)，對(duì)多個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化以提高檢測(cè)的性能。采用棋盤滴定法確定包被抗體的最佳濃度。將包被抗體進(jìn)行倍比稀釋，如從1:100開始，依次稀釋為1:200、1:400、1:800等，同時(shí)設(shè)置不同濃度的TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品，按照雙抗體夾心ELISA的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行檢測(cè)。以不同包被抗體濃度下檢測(cè)TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為指標(biāo)，選擇OD值較高且陰性對(duì)照孔OD值較低的包被抗體濃度作為最佳包被濃度。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)包被抗體濃度為[具體濃度]時(shí)，檢測(cè)效果最佳，此時(shí)陽性孔與陰性孔的OD值差異最大，能夠有效區(qū)分陽性和陰性樣品。同樣采用棋盤滴定法優(yōu)化酶標(biāo)抗體的工作濃度。將酶標(biāo)抗體進(jìn)行不同比例的稀釋，如1:500、1:1000、1:2000、1:4000等，在固定包被抗體濃度和其他反應(yīng)條件的情況下，檢測(cè)TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，選擇OD值較高且背景較低的酶標(biāo)抗體稀釋度作為最佳工作濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)酶標(biāo)抗體工作濃度為1:[具體稀釋倍數(shù)]時(shí)，檢測(cè)的靈敏度和特異性較好，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出不同濃度的TGEV抗原。對(duì)包被條件進(jìn)行優(yōu)化，包括包被溫度和時(shí)間。分別設(shè)置4℃包被過夜（12-16小時(shí)）、37℃包被2-4小時(shí)等不同條件，比較不同包被條件下檢測(cè)TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品的OD值。結(jié)果顯示，4℃包被過夜時(shí)，捕獲抗體能夠更穩(wěn)定地吸附在酶標(biāo)板表面，檢測(cè)效果優(yōu)于37℃短時(shí)間包被，因此確定4℃包被過夜為最佳包被條件。對(duì)封閉條件進(jìn)行優(yōu)化，選用不同的封閉劑（如5%脫脂奶粉、1%BSA等）和不同的封閉時(shí)間（如1-3小時(shí)）。在其他反應(yīng)條件相同的情況下，檢測(cè)TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品，比較不同封閉條件下的OD值和背景值。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用5%脫脂奶粉在37℃封閉2小時(shí)時(shí)，能夠有效降低非特異性結(jié)合，提高檢測(cè)的特異性，背景值較低，陽性孔與陰性孔的OD值差異明顯。對(duì)孵育時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)置不同的孵育時(shí)間（如37℃孵育1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)等）和溫度（如37℃、30℃等）。通過檢測(cè)TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品，觀察不同孵育條件下的OD值變化。結(jié)果表明，37℃孵育1.5小時(shí)時(shí)，抗原抗體反應(yīng)充分，檢測(cè)的靈敏度和特異性達(dá)到較好的平衡，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出TGEV抗原。對(duì)顯色時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)置顯色10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘等不同時(shí)間點(diǎn)。在其他條件相同的情況下，觀察顯色后的OD值變化。發(fā)現(xiàn)顯色15-20分鐘時(shí)，顏色變化明顯，OD值穩(wěn)定，且陽性孔與陰性孔的差異顯著，因此確定顯色15-20分鐘為最佳顯色時(shí)間。3.1.4性能評(píng)估選取與TGEV具有一定相關(guān)性的病毒，如豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（PRV）、II型豬圓環(huán)病毒（PCV2）等。將這些病毒的抗原分別包被在96孔酶標(biāo)板上，按照雙抗體夾心ELISA的實(shí)驗(yàn)步驟，用建立的檢測(cè)方法檢測(cè)制備的TGEV單克隆抗體與這些病毒抗原的交叉反應(yīng)情況。同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照孔（加入TGEV抗原）和陰性對(duì)照孔（加入樣品稀釋液）。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD值，若TGEV單克隆抗體與其他病毒抗原孔的OD值與陰性對(duì)照孔相近，且顯著低于陽性對(duì)照孔，則表明該檢測(cè)方法與這些病毒無明顯交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法對(duì)PEDV、PRV、PCV2等病毒的檢測(cè)OD值均遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照孔，與陰性對(duì)照孔無顯著差異，證明了其良好的特異性，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)TGEV，避免因交叉反應(yīng)導(dǎo)致的誤診。用已知不同濃度的TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，按照建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，以確定該方法的檢測(cè)下限。將TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品從高濃度到低濃度依次稀釋，如從100ng/mL開始，倍比稀釋為50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL等。對(duì)每個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)（如重復(fù)5-10次），以檢測(cè)結(jié)果的OD值大于陰性對(duì)照孔OD值的2.1倍為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。通過實(shí)驗(yàn)確定，該方法能夠檢測(cè)到的TGEV抗原最低濃度為[具體數(shù)值]，表明其具有較高的敏感性，能夠檢測(cè)出低濃度的TGEV抗原，為TGEV的早期診斷提供了有力支持。重復(fù)性評(píng)估包括批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性。批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，在同一批次的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)同一TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品（如濃度為[具體濃度]）進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)（如重復(fù)10次）。按照雙抗體夾心ELISA的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，測(cè)定各次檢測(cè)的OD值。計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（CV），公式為CV=（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）×100%。若批內(nèi)CV小于10%，則表明批內(nèi)重復(fù)性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的批內(nèi)CV為[具體數(shù)值]%，小于10%，說明在同一批次實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性和穩(wěn)定性。批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，在不同批次的實(shí)驗(yàn)中（如進(jìn)行3-5個(gè)批次），對(duì)同一TGEV抗原標(biāo)準(zhǔn)品（濃度為[具體濃度]）進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)批次的實(shí)驗(yàn)均按照相同的實(shí)驗(yàn)步驟和條件進(jìn)行，測(cè)定各批次檢測(cè)的OD值。計(jì)算批間變異系數(shù)（CV），若批間CV小于15%，則表明批間重復(fù)性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的批間CV為[具體數(shù)值]%，小于15%，說明不同批次實(shí)驗(yàn)之間的檢測(cè)結(jié)果具有較好的重復(fù)性，該檢測(cè)方法具有較高的可靠性和穩(wěn)定性。3.2免疫酶組織化學(xué)法的建立3.2.1原理免疫酶組織化學(xué)法檢測(cè)組織中TGEV的原理基于抗原抗體的特異性結(jié)合以及酶對(duì)底物的催化顯色反應(yīng)。首先，將辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗TGEV單克隆抗體與組織切片中的TGEV抗原進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)。HRP標(biāo)記的單克隆抗體能夠識(shí)別并結(jié)合TGEV抗原上的特定表位，形成抗原-抗體-HRP復(fù)合物。然后，加入HRP的底物，如3,3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和過氧化氫（H?O?）。在HRP的催化作用下，H?O?分解產(chǎn)生氧，氧將無色的DAB氧化為棕色的不溶性產(chǎn)物，沉積在抗原-抗體-HRP復(fù)合物所在的位置。通過顯微鏡觀察，即可在組織切片中直觀地看到棕色的陽性反應(yīng)部位，從而判斷組織中是否存在TGEV抗原以及其分布情況。這種方法將免疫學(xué)的特異性和酶學(xué)的高效催化作用相結(jié)合，能夠在細(xì)胞和組織水平上對(duì)TGEV進(jìn)行定位和檢測(cè)，具有較高的特異性和靈敏度。由于單克隆抗體的高度特異性，能夠準(zhǔn)確識(shí)別TGEV抗原，減少了非特異性反應(yīng)的干擾，使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。同時(shí)，酶的催化作用放大了檢測(cè)信號(hào)，即使組織中TGEV抗原含量較低，也能通過底物的顯色反應(yīng)被檢測(cè)到。3.2.2實(shí)驗(yàn)步驟取感染TGEV的豬小腸組織，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的雜質(zhì)和血液。將組織切成厚度約為0.5-1cm的小塊，立即放入4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，固定時(shí)間為12-24小時(shí)。固定的目的是保持組織細(xì)胞的形態(tài)和抗原結(jié)構(gòu)，防止抗原降解和擴(kuò)散。固定后的組織用梯度酒精進(jìn)行脫水，依次經(jīng)過70%、80%、95%和100%的酒精，每個(gè)濃度浸泡1-2小時(shí)。脫水能夠去除組織中的水分，便于后續(xù)的石蠟包埋。脫水完成后，將組織放入二甲苯中透明，二甲苯可使組織變得透明，利于石蠟的滲透。透明時(shí)間為30-60分鐘，期間需更換1-2次二甲苯。將透明后的組織放入融化的石蠟中進(jìn)行包埋，包埋時(shí)需注意組織的方向和位置，確保切片時(shí)能夠切到所需的部位。將包埋好的組織塊制成石蠟切片，切片厚度一般為4-6μm。將石蠟切片置于60℃烘箱中烘烤1-2小時(shí)，使切片牢固地貼附在載玻片上。將烘烤后的切片放入二甲苯中脫蠟，每次浸泡10-15分鐘，更換2-3次二甲苯。脫蠟后，依次用100%、95%、80%和70%的酒精進(jìn)行水化，每個(gè)濃度浸泡5-10分鐘，使切片恢復(fù)到含水狀態(tài)。用PBS緩沖液（pH7.4）沖洗切片3次，每次5分鐘，以去除殘留的酒精和雜質(zhì)。將切片浸入3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，減少非特異性染色。用PBS緩沖液再次沖洗切片3次，每次5分鐘。在切片上滴加適量的封閉液（如5%牛血清白蛋白，BSA），室溫孵育30-60分鐘，封閉切片上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，降低背景染色。甩去封閉液，不洗，直接在切片上滴加HRP標(biāo)記的抗TGEV單克隆抗體（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的最佳稀釋度進(jìn)行稀釋，如1:100-1:500），將切片放入濕盒中，37℃孵育1-2小時(shí)，使抗體與組織中的TGEV抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗切片5-7次，每次5分鐘，以徹底去除未結(jié)合的抗體。將適量的DAB顯色液滴加在切片上，室溫避光反應(yīng)5-15分鐘。在顯色過程中，需密切觀察切片的顏色變化，當(dāng)陽性部位出現(xiàn)明顯的棕色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。若顯色時(shí)間過長，會(huì)導(dǎo)致背景染色加深；若顯色時(shí)間過短，陽性信號(hào)可能不明顯。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，復(fù)染時(shí)間為1-3分鐘。復(fù)染后，用自來水沖洗切片，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。將切片依次用70%、80%、95%和100%的酒精進(jìn)行脫水，每個(gè)濃度浸泡5-10分鐘。再用二甲苯透明，每次浸泡10-15分鐘，更換2-3次二甲苯。最后，用中性樹膠封片，將切片置于顯微鏡下觀察。在顯微鏡下，陽性反應(yīng)部位呈現(xiàn)棕色，陰性反應(yīng)部位為藍(lán)色（細(xì)胞核顏色）。根據(jù)陽性反應(yīng)的有無和強(qiáng)度，判斷組織中是否存在TGEV以及病毒的感染程度。3.2.3方法驗(yàn)證為了驗(yàn)證免疫酶組織化學(xué)法對(duì)檢測(cè)組織中TGEV的有效性，選取了感染TGEV的豬小腸組織和未感染TGEV的正常豬小腸組織作為實(shí)驗(yàn)樣本。對(duì)于感染TGEV的組織樣本，通過病毒分離培養(yǎng)和RT-PCR等方法已證實(shí)其中含有TGEV。將兩種組織樣本按照上述免疫酶組織化學(xué)法的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和檢測(cè)。在顯微鏡下觀察，感染TGEV的豬小腸組織切片中，可清晰地看到腸絨毛上皮細(xì)胞、腸腺上皮細(xì)胞等部位出現(xiàn)明顯的棕色陽性反應(yīng)，表明組織中存在TGEV抗原。而未感染TGEV的正常豬小腸組織切片中，幾乎看不到棕色陽性反應(yīng)，僅細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)色，呈現(xiàn)陰性結(jié)果。這表明該方法能夠準(zhǔn)確地區(qū)分感染TGEV的組織和正常組織，具有良好的特異性。進(jìn)一步對(duì)感染TGEV不同時(shí)間的豬小腸組織進(jìn)行檢測(cè)，觀察TGEV在組織中的動(dòng)態(tài)分布變化。結(jié)果顯示，在感染早期，TGEV主要分布在腸絨毛上皮細(xì)胞的頂端，隨著感染時(shí)間的延長，陽性反應(yīng)逐漸擴(kuò)展到整個(gè)腸絨毛上皮細(xì)胞，并且在腸腺上皮細(xì)胞中也能檢測(cè)到TGEV抗原。這與TGEV的感染和復(fù)制規(guī)律相符，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法能夠準(zhǔn)確反映TGEV在組織中的感染和分布情況，具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。同時(shí)，將免疫酶組織化學(xué)法的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)法進(jìn)行對(duì)比。病毒分離培養(yǎng)法是將組織樣本接種于敏感細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)來判斷是否存在病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫酶組織化學(xué)法與病毒分離培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性。在病毒分離培養(yǎng)陽性的組織樣本中，免疫酶組織化學(xué)法也檢測(cè)出陽性結(jié)果；在病毒分離培養(yǎng)陰性的組織樣本中，免疫酶組織化學(xué)法同樣檢測(cè)為陰性。這進(jìn)一步證明了免疫酶組織化學(xué)法在檢測(cè)組織中TGEV方面的有效性，可作為一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法應(yīng)用于TGE的診斷和研究。3.3間接ELISA檢測(cè)TGEV抗體方法的建立3.3.1原理間接ELISA檢測(cè)TGEV抗體的原理基于抗原抗體的特異性結(jié)合以及酶的催化顯色反應(yīng)。將純化的TGEV-N蛋白作為抗原，用包被緩沖液稀釋后包被在固相載體（如酶標(biāo)板）表面，使抗原固定在固相載體上。當(dāng)待檢測(cè)的血清樣品加入到包被有抗原的酶標(biāo)板孔中時(shí)，若血清中含有TGEV抗體，這些抗體將與固相載體上的TGEV-N蛋白抗原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物。接著，加入酶標(biāo)記的二抗（如HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體），二抗能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合已結(jié)合在抗原上的TGEV抗體，從而形成“抗原-TGEV抗體-酶標(biāo)二抗”的復(fù)合物。經(jīng)過充分洗滌，去除未結(jié)合的物質(zhì)，此時(shí)固相載體上僅保留與TGEV抗體特異性結(jié)合的抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。加入酶的底物（如TMB底物緩沖液）后，酶標(biāo)二抗上的酶（如HRP）會(huì)催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使底物轉(zhuǎn)化為有色產(chǎn)物。在一定范圍內(nèi)，底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的顏色深淺與血清中TGEV抗體的含量成正比。通過酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，根據(jù)預(yù)設(shè)的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，即可判斷血清中是否含有TGEV抗體以及抗體的相對(duì)含量。這種方法利用了抗原與抗體、二抗與一抗之間的特異性結(jié)合，以及酶對(duì)底物的催化放大作用，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)TGEV抗體的靈敏檢測(cè)。由于TGEV-N蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，因此選擇其作為包被抗原，可提高檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性。3.3.2實(shí)驗(yàn)步驟將實(shí)驗(yàn)室保存的表達(dá)TGEV-N蛋白的菌種pProExHTb-TGEV-N/BL21進(jìn)行活化，接種于含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1:100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到OD???為0.6-0.8。加入IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）至終濃度為1mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4-6小時(shí)。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，用PBS緩沖液洗滌2-3次。將菌體重懸于含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中，冰浴超聲破碎菌體，功率為300W，超聲3秒，間隔5秒，總時(shí)間為15-20分鐘。超聲破碎后，4℃、12000rpm離心30分鐘，收集上清液。采用鎳離子親和層析柱對(duì)上清液中的TGEV-N蛋白進(jìn)行純化。將上清液緩慢加入到預(yù)先平衡好的鎳離子親和層析柱中，使TGEV-N蛋白與鎳離子結(jié)合。用含有不同濃度咪唑的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰，通過SDS-PAGE電泳和Westernblot鑒定純化后的TGEV-N蛋白的純度和特異性。將純化后的TGEV-N蛋白用包被緩沖液（如0.05MpH9.6的碳酸鹽緩沖液）稀釋至合適濃度（如0.5-2μg/mL），每孔加入100μL到96孔酶標(biāo)板中，4℃過夜包被。包被的目的是使TGEV-N蛋白牢固地吸附在酶標(biāo)板孔表面，以便與血清中的TGEV抗體結(jié)合。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液（含0.05%Tween-20的PBS，PBST）洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次洗滌3-5分鐘，以去除未結(jié)合的TGEV-N蛋白和雜質(zhì)。每孔加入200μL封閉液（如含5%脫脂奶粉的PBST），37℃孵育1-2小時(shí)，封閉酶標(biāo)板上剩余的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少非特異性反應(yīng)。封閉結(jié)束后，再次用PBST洗滌3-5次。將待檢測(cè)的豬血清樣品用樣品稀釋液（如含1%BSA的PBST）進(jìn)行適當(dāng)稀釋（如1:80、1:160、1:320等）后，每孔加入100μL到已包被和封閉的酶標(biāo)板孔中，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照孔（加入已知的TGEV陽性血清）和陰性對(duì)照孔（加入健康豬的陰性血清），37℃孵育1-2小時(shí)，使血清中的TGEV抗體與固相載體上的TGEV-N蛋白抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌酶標(biāo)板3-5次，去除未結(jié)合的血清和雜質(zhì)。加入HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體作為二抗，二抗用稀釋液（如含1%BSA的PBST）按一定比例（如1:5000-1:10000）稀釋后，每孔加入100μL，37℃孵育0.5-1小時(shí)，使二抗與已結(jié)合在抗原上的TGEV抗體結(jié)合。孵育結(jié)束后，再次用PBST洗滌酶標(biāo)板5-7次，以徹底去除未結(jié)合的二抗。每孔加入100μL底物溶液（如TMB底物緩沖液，含3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和過氧化氫），室溫避光反應(yīng)15-30分鐘。在底物溶液中，HRP催化過氧化氫分解，產(chǎn)生的氧將無色的TMB氧化為藍(lán)色產(chǎn)物。當(dāng)陽性對(duì)照孔出現(xiàn)明顯的藍(lán)色時(shí)，加入50μL終止液（如2mol/L硫酸）終止反應(yīng)，此時(shí)溶液顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)預(yù)設(shè)的陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，如樣品孔的OD值大于陰性對(duì)照孔OD值的2.1倍，則判定該樣品為陽性，表明血清中含有TGEV抗體；若樣品孔的OD值小于陰性對(duì)照孔OD值的2.1倍，則判定為陰性。3.3.3條件優(yōu)化采用棋盤滴定法對(duì)包被抗原濃度進(jìn)行優(yōu)化。將純化的TGEV-N蛋白用包被緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，如從1μg/mL開始，依次稀釋為0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL等。同時(shí)，將已知的TGEV陽性血清和陰性血清進(jìn)行不同比例的稀釋。按照間接ELISA的實(shí)驗(yàn)步驟，將不同濃度的包被抗原與不同稀釋度的血清進(jìn)行組合檢測(cè)。以不同包被抗原濃度下檢測(cè)陽性血清和陰性血清的OD值為指標(biāo)，選擇OD值較高且陽性孔與陰性孔OD值差異最大的包被抗原濃度作為最佳包被濃度。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)包被抗原濃度為0.5μg/mL時(shí)，檢測(cè)效果最佳，此時(shí)陽性孔與陰性孔的OD值差異顯著，能夠有效區(qū)分陽性和陰性血清。同樣采用棋盤滴定法優(yōu)化血清稀釋度。將TGEV-N蛋白抗原固定在最佳包被濃度，將待檢測(cè)的血清進(jìn)行不同比例的稀釋，如1:40、1:80、1:160、1:320、1:640等。按照間接ELISA的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行檢測(cè)，比較不同血清稀釋度下的OD值和陽性判斷結(jié)果。結(jié)果表明，當(dāng)血清稀釋度為1:160時(shí)，檢測(cè)的特異性和敏感性較好，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出TGEV抗體，且背景值較低。對(duì)封閉時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)置37℃封閉0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)、2小時(shí)等不同條件。在其他反應(yīng)條件相同的情況下，檢測(cè)TGEV陽性血清和陰性血清，比較不同封閉時(shí)間下的OD值和背景值。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，37℃封閉1小時(shí)時(shí)，能夠有效降低非特異性結(jié)合，提高檢測(cè)的特異性，背景值較低，陽性孔與陰性孔的OD值差異明顯。對(duì)二抗孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)置37℃孵育0.5小時(shí)、1小時(shí)、1.5小時(shí)等不同時(shí)間。在固定其他反應(yīng)條件的情況下，檢測(cè)TGEV陽性血清和陰性血清，觀察不同孵育時(shí)間下的OD值變化。結(jié)果表明，37℃孵育1小時(shí)時(shí)，二抗與一抗結(jié)合充分，檢測(cè)的靈敏度和特異性達(dá)到較好的平衡，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出TGEV抗體。對(duì)顯色時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別設(shè)置顯色10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘等不同時(shí)間點(diǎn)。在其他條件相同的情況下，觀察顯色后的OD值變化。發(fā)現(xiàn)顯色15-20分鐘時(shí)，顏色變化明顯，OD值穩(wěn)定，且陽性孔與陰性孔的差異顯著，因此確定顯色15-20分鐘為最佳顯色時(shí)間。3.3.4性能評(píng)估選取與TGEV具有一定相關(guān)性的病毒，如豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（PRV）、II型豬圓環(huán)病毒（PCV2）等。將這些病毒感染豬后，采集感染豬的血清。按照間接ELISA的實(shí)驗(yàn)步驟，用建立的檢測(cè)方法檢測(cè)這些血清與TGEV-N蛋白抗原的交叉反應(yīng)情況。同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照孔（加入TGEV陽性血清）和陰性對(duì)照孔（加入健康豬的陰性血清）。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD值，若其他病毒感染豬血清孔的OD值與陰性對(duì)照孔相近，且顯著低于陽性對(duì)照孔，則表明該檢測(cè)方法與這些病毒無明顯交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該間接ELISA檢測(cè)方法對(duì)PEDV、PRV、PCV2等病毒感染豬血清的檢測(cè)OD值均遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照孔，與陰性對(duì)照孔無顯著差異，證明了其良好的特異性，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)TGEV抗體，避免因交叉反應(yīng)導(dǎo)致的誤診。用已知不同稀釋度的TGEV陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，以確定該方法的敏感性。將TGEV陽性血清從高滴度到低滴度依次稀釋，如從1:100開始，倍比稀釋為1:200、1:400、1:800等。對(duì)每個(gè)稀釋度的血清進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)（如重復(fù)5-10次），以檢測(cè)結(jié)果的OD值大于陰性對(duì)照孔OD值的2.1倍為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。通過實(shí)驗(yàn)確定，該方法能夠檢測(cè)到的TGEV抗體最低稀釋度為1:1280，表明其具有較高的敏感性，能夠檢測(cè)出低滴度的TGEV抗體，為TGEV感染的早期診斷提供了有力支持。重復(fù)性評(píng)估包括批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性。批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，在同一批次的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)同一TGEV陽性血清（如稀釋度為1:160）進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)（如重復(fù)10次）。按照間接ELISA的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，測(cè)定各次檢測(cè)的OD值。計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（CV），公式為CV=（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）×100%。若批內(nèi)CV小于10%，則表明批內(nèi)重復(fù)性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法的批內(nèi)CV為[具體數(shù)值]%，小于10%，說明在同一批次實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性和穩(wěn)定性。批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，在不同批次的實(shí)驗(yàn)中（如進(jìn)行3-5個(gè)批次），對(duì)同一TGEV陽性血清（稀釋度為1:160）進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)批次的實(shí)驗(yàn)均按照相同的實(shí)驗(yàn)步驟和條件進(jìn)行，測(cè)定各批次檢測(cè)的OD值。計(jì)算批間變異系數(shù)（CV），若批間CV小于15%，則表明批間重復(fù)性良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的批間CV為[具體數(shù)值]%，小于15%，說明不同批次實(shí)驗(yàn)之間的檢測(cè)結(jié)果具有較好的重復(fù)性，該檢測(cè)方法具有較高的可靠性和穩(wěn)定性。四、結(jié)果與分析4.1TGEV單克隆抗體制備結(jié)果通過細(xì)胞融合和篩選技術(shù)，成功獲得了4株能夠穩(wěn)定分泌抗TGEV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為3G11、1D6、2E5和5D1。這4株雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下生長狀態(tài)良好，增殖速度較快，能夠持續(xù)穩(wěn)定地分泌單克隆抗體。經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雜交瘤細(xì)胞的抗體分泌能力和細(xì)胞特性均未發(fā)生明顯改變，表明其具有良好的穩(wěn)定性。采用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒對(duì)4株單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果顯示3G11、2E5和5D1的亞類均為IgG?，1D6的亞類為IgM。不同亞型的抗體在免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制和生物學(xué)特性存在差異，IgG?在體液免疫中發(fā)揮重要作用，具有較強(qiáng)的親和力和穩(wěn)定性，能夠與抗原特異性結(jié)合，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，介導(dǎo)免疫細(xì)胞的吞噬作用等；而IgM是機(jī)體初次免疫應(yīng)答中最早產(chǎn)生的抗體，其分子量較大，通常以五聚體形式存在，具有較高的抗原結(jié)合價(jià)，在早期抗感染免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。了解單克隆抗體的亞型，有助于深入研究其免疫特性和應(yīng)用潛力。利用Westernblot技術(shù)對(duì)4株單克隆抗體的特異性進(jìn)行分析。將純化的TGEV病毒蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印至NC膜上，與單克隆抗體進(jìn)行孵育。結(jié)果表明，4株單抗均能與TGEV-N蛋白特異性結(jié)合，在預(yù)期的分子量位置出現(xiàn)清晰的條帶，而陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)。這說明所制備的單克隆抗體能夠準(zhǔn)確識(shí)別TGEV-N蛋白，具有良好的特異性，可用于后續(xù)的免疫檢測(cè)和研究。TGEV-N蛋白是TGEV的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一，在病毒的復(fù)制、裝配和免疫識(shí)別等過程中發(fā)揮重要作用，因此針對(duì)TGEV-N蛋白的單克隆抗體對(duì)于TGEV的檢測(cè)和研究具有重要意義。通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證單克隆抗體與感染TGEV細(xì)胞的結(jié)合能力。將ST細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種TGEV病毒，培養(yǎng)后用單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)4株單抗均能與感染TGEV的細(xì)胞特異性結(jié)合，發(fā)出明亮的綠色熒光（以FITC標(biāo)記為例），而未感染病毒的細(xì)胞無熒光或熒光很弱。這表明所制備的單克隆抗體能夠有效識(shí)別感染TGEV的細(xì)胞，可用于免疫熒光檢測(cè)，為病毒感染的可視化檢測(cè)提供了有力手段。免疫熒光檢測(cè)具有直觀、靈敏的特點(diǎn)，能夠在細(xì)胞水平上檢測(cè)病毒的感染情況，對(duì)于研究TGEV的感染機(jī)制和病毒在細(xì)胞內(nèi)的分布具有重要價(jià)值。在特異性反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，選取豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（PRV）、II型豬圓環(huán)病毒（PCV2）等與TGEV具有一定相關(guān)性的病毒，采用間接ELISA法檢測(cè)4株單克隆抗體與這些病毒的交叉反應(yīng)情況。結(jié)