第三章高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography

(HPLC)一、高效液相色譜中的速率方程

遷移的流動相滯留的流動相渦流擴散項縱向擴散流動相傳質(zhì)滯留區(qū)傳質(zhì)固定相內(nèi)傳質(zhì)Conclusion:

提高柱效的核心是用小粒徑填料：超高壓液相UPLC

lowerflowrate,highperformance

Viscosityofmobilephase↓,n↑：高溫液相色譜二、高效液相色譜儀1.流程2.檢測器

UltravioletVisibleLightDetector紫外RefractiveIndexDetector示差折光FluorescenceDetector熒光EvaporativeLightScatteringDetector蒸發(fā)光散射ElectrochemicalDetector電化學(xué)FixedWavelengthUVDetector固定波長VariableWavelengthUVDetector可變波長DiodeAssayDetector(DAD)二極管陣列(1)UVdetectorA.FixedWavelengthUVDetectorTypicalflow-throughcell

B.VariableWavelengthUVDetectorC.DiodeAssayDetector

SpectrumcollectionatanytimeLibrarysearchPuritycheckQuantitativeanalysisatseveralwavelengths3-DplotofDADIsoabsorbanceplotofDADD.FeaturesofUVdetector

Selectivedetection,suchasaromaticspecies選擇性Highsensitivity高敏捷度Largelinearrange線性寬Goodstabilityforthechangeofmobilephaseandtemperature穩(wěn)定Suitableforgradienteluting.可做梯度WorkhorsedetectionmethodinHPLC通過選擇適宜的檢測波長來提高辦法的選擇性(2)示差折光檢測器A.StructureUniversalresponse，通用Lowsensitivity，敏捷度低Thebaselineisseriouslyaffectedbytemperature，溫度敏感Anychangesintheeluentcompositionrequiretherebalancingofthedetector.變化流動相要重新平衡Notsuitableforgradienteluting.不能做梯度B.FeaturesofRI

(3)熒光檢測器Selectivedetection.SuchasPAH,protein,orcompoundsmadefluorescentbyderivatization.高選擇性Highsensitivity.Upto1000timesmoresensitivethantheUVdetector.高敏捷度Itshighspecificityalsoresultsinlessinterferencesfromthebackground(iefromthesolventorfromimpurities).干擾少Suitableforgradienteluting.可做梯度Detectionatanyexcitationoremissionwavelength.B.Featuresoffluorescencedetector(4)蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)A.PrincipleandstructureNebulizationofthecolumneffluentinnitrogenbymeansofajet.Evaporationofthemobilephaseinaheatedzoneleavingafinemistofsampleparticles.Detectionofthescatteredlight,whenthesampleparticlespassandinterferethelaserlightbeam.lgI=blgm+lgkUniversaldetection.Suchassugars,Fats,Surfactants,Polymers,Naturalcompounds.通用BettersensitivitythanRI，敏捷度較高FasterequilibrationthanRI，方便CapableofdetectioningradientHPLCsystems.可梯度UniversalresponsegivesacloserrepresentationofsamplemassthanUVdetectors,makingquantificationmoreaccurateespeciallywhenstandardsarenotavailable.響應(yīng)與質(zhì)量有關(guān)B.FeaturesofELSD(5)電化學(xué)檢測器Conductivitydetection:measurementofelectricalcurrentcarriedbydissolvedionsinanelectricfield.電導(dǎo)DCAmperometricdetection:measurementofcurrentresultingfromoxidationorreduction(electrolysis)ofanalytemoleculesatthesurfaceofanelectrode.直流安培IntegratedandpulsedamperometricdetectionaresimilartoDCAmperometry.However,currentismeasuredbyintegrationduringaportionofarepeatingpotentialvs.timewaveform.積分或脈沖安培Selectivedetection:suchascarboxylic,alcohols,carbohydrates;amines;sulfates,inorganicionsetc.Highsensitivity.Conductivity:theworkhorsedetectionmethodinionchromatography.DCamperometry:neurochemicalanalyses.Pulsedamperometry:carbohydrates.B.Features附件Degas脫氣機Gradient梯度裝置ColumnThermostat柱溫箱Autosampler自動進樣器Fractioncollector餾分收集器梯度洗提梯度洗脫即程序控制流動相的構(gòu)成，使在整個分離過程中，溶劑強度按照特定的變化規(guī)律增加。優(yōu)點：分離復(fù)雜混合物，使全部組分都處在最佳的k值范疇內(nèi)。缺點：檢測器的使用受到限制，分析成果的重復(fù)性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進行再生解決。裝置低壓梯度（內(nèi)梯度）：溶劑在常壓下混合，再用高壓泵輸送至柱系統(tǒng)。簡樸、經(jīng)濟，只需一種泵，所用溶劑的元數(shù)沒有限制。高壓梯度（外梯度）：普通由兩臺高壓泵構(gòu)成，每臺泵輸送一種溶劑。溶劑在混合室混合后，在輸入柱系統(tǒng)。溶劑的可壓縮性和熱力學(xué)體積的變化可能影響輸入柱子中溶劑的構(gòu)成。溶劑A溶劑B電磁閥A電磁閥B混合室泵溶劑A溶劑B高壓泵A

高壓泵B混合室低壓溶劑梯度方框圖高壓溶劑梯度方框圖實現(xiàn)方式對于復(fù)雜樣品，線性梯度是最佳的。正相色譜中，慣用二氯甲烷加入正己烷來實現(xiàn)。反相色譜中，乙腈，甲醇加入水中是最慣用的。三、HPLC重要類型及其選擇液固色譜法化學(xué)鍵合相色譜法離子對色譜法離子色譜法體積排阻色譜法親和色譜法1.鍵合相色譜法（1）鍵合相色譜法的分類和分離機理正相色譜：流動相極性<固定相極性分派機理反相色譜：流動相極性>固定相極性疏溶劑作用機理反相鍵合相色譜法的疏溶劑機理：溶質(zhì)進入極性流動相后，排擠部分溶質(zhì)分子，其疏水基團由于流動相的斥力推動而直接與非極性固定相上的烷基締合，構(gòu)成單分子吸附層，這種作用時可逆的。當(dāng)流動相極性減小時，這種疏溶劑斥力下降。類型分離方式應(yīng)用特點C-18反相、離子對普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物C-8反相、離子對與C-18類似，保留值略小C-3,C-4反相保留值小，適合肽類和蛋白質(zhì)苯基反相保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物-CN反相、正相選擇性與硅膠類似，保留小，用途廣-NH2反相、正相、離子交換分離糖類、核苷酸、固醇等二醇基正相分離有機酸、排阻分蛋白質(zhì)等醚基反相、正相分離酚類、芳硝基化合物，保留比C-18強聚苯乙烯基反相PH使用范圍廣，對部分分離峰形好，壽命長（2）慣用固定相固定相的碳鏈長度對保存時間的影響固定相的商品牌號對分離的影響（3）流動相表征溶劑特性的重要參數(shù)溶劑強度ε°：溶劑分子與吸附劑的親合程度溶解度參數(shù)δ：衡量溶劑極性強度的指標(biāo)，δ越大，極性越強。是溶劑和溶質(zhì)分子間色散力、偶極力、接受質(zhì)子或予以質(zhì)子能力的總和。δ相近的混合溶劑，它的選擇性α不同。極性參數(shù)P’：溶劑與乙醇、二氧六環(huán)、硝基甲烷互相作用的度量，比較全方面的反映了溶劑的性質(zhì)。粘度η：溶劑Eηε°δPˊxexdxn正己烷1.880.300.017.30.1

四氫呋喃7.60.460.579.14.00.380.200.42乙腈37.50.340.6511.85.80.310.270.42甲醇32.70.540.9512.95.10.480.220.31水78.50.89

2110.20.370.370.25溶劑的選擇原則

溶劑含有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)溶劑的選擇與使用的檢測器要有相容性溶劑的粘度要小溶劑的沸點不能太低溶劑的純度要高且價格便宜

正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，加入質(zhì)子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質(zhì)子予以體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，加入質(zhì)子接受體甲醇，質(zhì)子予以體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃。（4）影響保存值的因素溶質(zhì)構(gòu)造對保存值的影響：正相：溶質(zhì)極性越強，官能團越多，保存值越大反相：溶質(zhì)極性越弱，疏水性越強，保存值越大。溶質(zhì)的保存值與其分子非極性部分的總面積有關(guān)，面積大，保存值大。烷基鍵合固定相特性對保存值的影響：反相：鍵合相烷鏈長，k大，選擇性好。溶劑性質(zhì)：正相：溶劑極性越弱，保存越大反相：流動相表面張力大、介電常數(shù)大，則極性越強。其斥力越大，溶質(zhì)與固定相鍵合越強，保存值越大。鹽的影響：普通加入醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無機鹽使流動相表面張力增大，對非離子性溶質(zhì)，使k增加，對離子型溶質(zhì)，k下降。對堿性有機物有改善峰形的作用。pH值：加入酸、堿或緩沖液，控制PH，克制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿。應(yīng)用2離子對色譜法

Ion-pairchromatography

（1）基本原理將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（A+）相反的離子(B-)（稱為對離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對（中性締合物）的分離辦法。多為反相離子對色譜（2）固定相、流動相和離子對試劑固定相多為C18,C8反相鍵合相流動相是以水為主的緩沖液，或水-甲醇、水-乙腈等混合溶劑離子對試劑：四丁基銨正離子、十六烷基三甲基銨正離子，ClO4-，十二烷基磺酸根等（3）影響保存值的因素pH的影響：改善分離選擇性的有效辦法。反相中，對于陰離子的分離，pH下降，k減小。離子對試劑的性質(zhì)與濃度：反相中，離子對試劑烷基鏈越長，疏水性越大，k越大。溶劑的極性：反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脫強度增大，k下降。洗脫強度與極性參數(shù)、介電常數(shù)同時有關(guān)離子強度：反相中，離子強度增加，溶質(zhì)k下降（4）應(yīng)用有機酸、有機堿特別是強酸強堿的分析，如羧酸、磺酸、胺類、酚類、藥品、染料等反相離子對色譜分析有機酸固定相：C18烷基鍵合相流動相：0.03mol/L四丁基銨+戊醇1.4-氨基苯甲酸；2.3-氨基苯甲酸；3.4-羥基苯甲酸；4.3-羥基苯甲酸；5.苯磺酸；6.苯甲酸；7.甲苯-4-磺酸3.液固色譜法（1）分離機理以固體吸附劑為固定相的液相色譜法由于溶質(zhì)分子和流動相分子在吸附劑表面的吸附活性中心上進行競爭吸附，這種競爭吸附形成不同溶質(zhì)在吸附劑表面的吸附、解吸平衡。平衡常數(shù)的不同造成不同溶質(zhì)得以分離。（2）固定相極性：硅膠、氧化鎂、氧化鋁等非極性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等（3）流動相ε°越大，洗脫力越強。硅膠為固定相時：以弱極性的正構(gòu)烷烴為主體，加入二氯甲烷等中檔極性溶劑調(diào)節(jié)適宜的洗脫強度?？捎盟畬枘z進行減活解決，或加入四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑（4）影響保存值的因素樣品分子構(gòu)造溶質(zhì)分子的官能團極性增加，保存值增加溶質(zhì)分子的官能團數(shù)目增加，保存值增加保存值與溶質(zhì)的空間效應(yīng)有關(guān)保存值與吸附中心的幾何分布有關(guān)吸附劑吸附劑的孔徑越小，表面積越大，保存值越大吸附劑的活性越強，保存值越大流動相D.應(yīng)用中檔分子量的油溶性樣品如油品、脂肪、芳烴等不同極性取代基的化合物構(gòu)造異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的分離4.離子色譜法

(1)分離機理不同的離子與樹脂離子的交換能力（親和能力）不同，親和力越大，離子越難洗脫，從而得以分離。（2）離子色譜的儀器離子色譜的分離原理與離子交換色譜同樣。最大的改善是解決了微量組分的檢測問題。雙柱克制型：在分離柱和檢測器之間加一種化學(xué)克制器，其作用有二，一是減少淋洗液的背景電導(dǎo)，二是增加被測離子的電導(dǎo)值，改善信噪比。敏捷度高。單柱非克制型：淋洗液直接進入電導(dǎo)檢測器。簡樸、分辨率較好。（2）固定相離子交換劑，根據(jù)功效基可分為：強酸型（磺酸基團）、強堿型（季銨基）、弱酸型（羧酸）、弱堿型（伯、仲、叔胺）等（3）流動相雙柱克制型：分離陽離子，普通采用無機酸如HCl，HNO3等；分離陰離子，普通采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。單柱非克制型：分離陽離子，用低濃度的HCl，HNO3等；分離陰離子，可用苯甲酸及其鹽、酒石酸、檸檬酸等（4）影響保存值的因素溶質(zhì)無機陰離子：與水合離子的半徑有關(guān)，半徑越大，保存值越大。還與離子的價態(tài)有關(guān)，價數(shù)越高，保存越強。有機陰離子：一元脂肪酸<一元芳香酸<二元脂肪酸<二元芳香酸，并于Pka有關(guān)陽離子：與價數(shù)及分子大小有關(guān)固定相：選擇性的變化重要通過固定相來實現(xiàn)。選擇性與固定相的構(gòu)成（如交聯(lián)度）、交換基團的構(gòu)造、位置都有關(guān)。流動相的構(gòu)成：構(gòu)成不同，保存和選擇性不同。流動相的濃度：濃度高，k下降，由于下降幅度與離子電荷數(shù)有關(guān)，因此用于變化一價離子和二價離子的選擇性流動相的離子強度：離子強度增加，k下降流動相的pH：pH升高，陽離子交換色譜中，陽離子的保存值下降；因離子交換色譜中，陰離子保存值增加有機調(diào)節(jié)劑：如甲醇、丁醇、乙腈等。影響選擇性。注意與柱的匹配。

（5）應(yīng)用分析無機陰離子的首選辦法還可用于分析無機陽離子，有機酸、堿，糖類、蛋白質(zhì)等。多聚磷酸鹽的分析常見陰離子分析5.體積排阻色譜法

（1）分離原理以多孔凝膠為固定相，運用精確控制的凝膠孔徑，使樣品中不同分子大小的組分得以分離。VR=V0+KD·Vp0<KD<1.0洗脫體積在V0和V0+Vp之間，峰容量有限，10-12個峰分子大小差不不大于10%的樣品GFC(GelFiltrationChromatography)使用水溶液的凝膠過濾色譜法（GFC），重要用于分析多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多糖等。GPC(GelPermeationChromatography)使用有機溶劑的凝膠滲入色譜法(GPC)，重要用于高聚物（如聚乙烯、聚氯乙烯等）分子量的測定。（2）固定相軟質(zhì)凝膠：交聯(lián)葡聚糖等，水相分離生化物質(zhì)，適于低、中壓操作半剛性凝膠：較高交聯(lián)度的苯乙烯、二乙烯苯共聚物，有機相洗脫，可承受10Mpa的壓力硬質(zhì)凝膠高交聯(lián)度苯乙烯、二乙烯苯共聚物：凝膠滲入色譜法多孔球形硅膠：凝膠過濾色譜法、凝膠滲入色譜法羥基化聚醚多孔微球：凝膠過濾色譜法特性參數(shù)：滲入極限，分離范疇，固流相比（凝膠孔體積Vp/顆粒間體積Vo），柱效（3）流動相

改善分離重要通過固定相來實現(xiàn)。流動相的選擇原則是：能溶解樣品與凝膠浸潤與檢測器匹配粘度小如四氫呋喃；緩沖溶液（4）應(yīng)用（分子量的測定）（1）固定相將一種水溶性配基共價結(jié)合在水不溶性多孔載體上，如葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等，制成親和色譜的固定相。配基的選擇原則是：蛋白質(zhì)和配基之間必須有強的親和力配基必須含有適宜的化學(xué)基團進行鍵合

Affinitychromatography,AC（6）親和色譜法用染料模擬某些自然界中經(jīng)常出現(xiàn)的配基如NADH,ATP，可用于結(jié)合某些類型的蛋白，且便宜，易得，也更穩(wěn)定（2）流動相（洗脫劑）加入游離的配基緩沖液作為洗脫劑通過變化洗脫劑的pH、離子強度