【辰輝創聚生物】HIF-2α蛋白技術概述：科研試劑中的低氧通路關鍵因子低氧誘導因子-2α（HIF-2α），也稱為EPAS1（EndothelialPASDomain-ContainingProtein1），是一種在哺乳動物細胞中對氧氣濃度變化高度敏感的轉錄因子。作為HIF家族的重要成員，HIF-2α在細胞低氧應答、轉錄調控以及蛋白互作網絡中發揮核心作用。隨著對低氧信號通路的研究不斷深入，HIF-2α的結構和功能特性已成為基礎生命科學、細胞生物學、分子機制研究等多個方向的重要研究內容。本技術文檔旨在從科研角度系統介紹HIF-2α蛋白的結構特性、調控機制及其在體外實驗中的常見應用場景，為科研人員在構建實驗模型、分析蛋白功能及篩選調控因子等方面提供參考。一、蛋白結構與功能域HIF-2α蛋白為全長約870個氨基酸的核內轉錄調控蛋白，屬于bHLH-PAS家族，具有典型的多個功能域：bHLH結構域（basichelix-loop-helix）：位于N端，參與DNA結合與二聚化，是識別低氧反應元件（HRE）的關鍵區域；PAS-A與PAS-B結構域：調控與ARNT（芳香烴受體核轉位蛋白）的異源二聚體形成，同時是小分子配體結合位點，尤以PAS-B結構域在構象變化中尤為關鍵；ODDD結構域（oxygen-dependentdegradationdomain）：位于蛋白中段，在常氧狀態下被脯氨酰羥化酶修飾，隨后被VHL復合物識別并介導泛素化降解；轉錄激活區（TAD）：分布在C端區域，負責與共激活因子（如CBP/p300）結合并啟動靶基因的轉錄過程。這種多功能結構為HIF-2α提供了復雜的調控能力，使其能在不同氧環境下動態調節基因表達網絡。二、調控機制與二聚體形成在常氧條件下，HIF-2α蛋白的兩個關鍵脯氨酸位點（Pro405和Pro531）被脯氨酰羥化酶（PHD）修飾，從而暴露出VHL識別位點。隨后，VHL泛素連接酶復合物介導其多泛素化并靶向蛋白酶體降解。而在低氧環境下，羥化過程被抑制，HIF-2α得以穩定積累并轉位至細胞核內，與ARNT形成異源二聚體。該復合物隨后結合DNA中含有HRE序列的靶基因啟動子，啟動多種與低氧應答相關的轉錄程序。在實驗設計中，研究者通常使用重組HIF-2α與ARNT蛋白構建體外二聚體系統，以研究其在低氧條件下的信號級聯反應，是探索HIF通路機制不可或缺的工具之一。三、科研試劑中的應用場景在科研層面，重組HIF-2α蛋白常被應用于以下多個方向，支持各類體外分析與機制研究：1.DNA結合實驗利用EMSA（電泳遷移率分析）或DNApull-down實驗，檢測HIF-2α對HRE序列的結合能力。研究者可使用標記探針與重組蛋白共同孵育，以觀察結合遷移帶。2.蛋白互作分析HIF-2α可與ARNT、VHL、p300等蛋白形成復合物。重組蛋白常被用于GSTpull-down、免疫共沉淀（Co-IP）或表面等離子體共振（SPR）實驗，以定量或定性分析蛋白-蛋白間的結合親和力和區域。3.小分子結合與篩選PAS-B結構域可作為小分子配體結合的熱點區域，適用于熒光偏振（FP）、AlphaScreen、等溫滴定量熱（ITC）等高通量篩選方法。科研人員可利用重組HIF-2α蛋白篩選其穩定劑、抑制劑或構象調節因子。4.轉錄活性構建通過與共激活因子共表達或重組，HIF-2α可構建入體外轉錄系統中，分析特定靶基因啟動子區的活性響應，常配合熒光素酶報告系統使用。5.結構生物學研究為了明確其在氧調控和小分子結合過程中的結構變構過程，科研人員通常重組表達PAS-B單域蛋白進行X-射線晶體學、核磁共振（NMR）或冷凍電鏡（Cryo-EM）分析。該方法可用于精確解析結合口袋與抑制機制，是結構設計與機理研究的基礎。四、科研優勢HIF-2α作為一種氧濃度響應的關鍵轉錄因子，其重組形式為科研提供了精準、可控且復現性高的實驗工具，主要優勢包括：實驗條件穩定、避免低氧培養的技術干擾；支持片段表達與全長構建，適用于不同實驗目的；可在細胞外重建HIF信號網絡，構建模塊化體外系統；有助于靶點篩選、結構功能分析及突變驗證。五、常見研究物種與標簽形式人源HIF-2α蛋白（recombinanthumanHIF-2αprotein）為最常用表達形式，也有小鼠、大鼠來源蛋白。常見標簽包括His、GST、Flag、Strep等，方便純化、捕獲和檢測。科研工作中亦有使用功能缺失突變體（如ΔODDD）或結構域表達體（如PAS-B）以滿足特定研究目的，這些構建體通過體外系統更便于機制研究或篩選平臺搭建。參考文獻1.Scheuermann,T.H.etal.Allostericinhibitionofhypoxiainduciblefactor-2αbyasmallmolecule.Nat.Chem.Biol.9,271–276(2013).2.Wu,D.etal.StructuralbasisofHIF-2αrecognitionbysmallmolecules.Nature539,270–273(2016).3.Tarade,D.etal.HIF-2α–ARNTheterodimerizationinhibitors:evaluationusingAlphaScreen.J.Biol.Chem.293,13449–13463(2018).4.Sharma,S.etal.StructuralcharacterizationofHIF-2α–ARNT–DNAcomplexes.Nat.Commun.10,1031(2019).5.Cho,H.etal.On-targetefficacyofaHIF-2αantagonistinclearcellrenalcellcarcinoma.Nature539,107–111(2016).6.Shen,C.etal.Functionalanalysisoftheoxygen-dependentdegradationdomaininHIF-2α.CellRep.19,159–172(2017).7.Kim,B.W.etal.RoleofPAS-BdomainintheconformationalcontrolofHIF-2α.Structure28,1–12(2020).8.Rankin,E.B.&Giaccia,A.J.Hypoxiccontrolofmetastasis.Science352,175–180(2016).9.Loboda,A.etal.HIFsignalingpathwayanditsregulators.Int.J.Mol.Sci.23,378(2022).10.Soucy,T.A.etal.PharmacologictargetingoftheHIF-2α–ARNTinterface.Nat.Chem.Biol.15,357–366(2019).11.Ye,Y.etal.RecombinantHIFproteinsforfunctionalandstructuralstudies.Biochem.J.475,3021–3034(2018).12.Olcina,M.M.etal.HIF-2α:regulationandroleindevelopment.TrendsCellBiol.30,807–820(2020).13.Wang,V.Y.-F.etal.RegulationofHIF-2αinthenormoxicnucleus.Nature603,111–117(2022).14.Gordan,J.D.etal.HIF-2αpromotestumorcellp