人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)構(gòu)建及特性研究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌作為常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和病死率均位居前列。據(jù)統(tǒng)計，結(jié)直腸癌（colorectalcarcinoma，CRC）的病死率居癌癥病死率的第2位，在全世界范圍居第4位，好發(fā)于直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處，約占65%，發(fā)病大多在40歲以后，男女比例為2-3：1，以40-50歲年齡組發(fā)病率最高。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，然而其療效卻并不樂觀，5年生存率徘徊在50%-60%。結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因。當(dāng)癌細(xì)胞侵襲周圍組織并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時，治療難度大幅增加，患者的生存質(zhì)量和生存期都會受到嚴(yán)重影響。因此，深入研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點和干預(yù)措施，對于提高結(jié)腸癌患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要意義。尼克酰胺N-甲基化酶（nicotinamideN-methyltransferase，NNMT）作為一種在多種生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶，近年來在腫瘤研究領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。NNMT編碼基因位于第11號染色體，由2個內(nèi)含子和3個外顯子構(gòu)成，全長16.5kb，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA具有1579個堿基，編碼的蛋白具有264個氨基酸。其最重要的功能是以S-腺苷基甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）為甲基供體催化尼克酰胺（nicotinamide，NAM）的甲基化反應(yīng)，生成S-腺苷-L-高半胱氨酸（s-adenosyl-l-homocysteine，SAH）和甲基尼克酰胺（N1-methylnicotinamide，MNA）。最初對NNMT的研究多集中在其甲基化功能對脂肪細(xì)胞功能及能量代謝的影響。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，NNMT在炎性反應(yīng)、腫瘤形成等過程中也具有重要作用。在腫瘤研究中，與正常組織和癌旁組織相比，NNMT在結(jié)直腸癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺乳頭狀癌、腎透明細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌和胰腺等腫瘤組織中有過表達(dá)，并在多種腫瘤患者的血清中升高。這些研究提示NNMT與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，推測其可能參與腫瘤細(xì)胞的多種生物功能，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，或可影響化療、放療效果。NNMT在腫瘤中的作用機(jī)制可能涉及多個方面，例如通過調(diào)節(jié)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide，NAD+）代謝，影響細(xì)胞的能量代謝和氧化還原狀態(tài)；參與炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境；以及通過影響細(xì)胞內(nèi)的信號通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程。然而，目前關(guān)于NNMT在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚未完全闡明，仍存在許多未知的領(lǐng)域有待深入探索。人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株是研究結(jié)腸癌的常用細(xì)胞模型，具有典型的結(jié)腸癌細(xì)胞特征。構(gòu)建尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，能夠為深入研究NNMT在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供有力的工具。通過對該細(xì)胞株的研究，可以更加直觀地觀察NNMT高表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，包括細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等方面。這有助于揭示NNMT在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制，為開發(fā)新的治療策略提供理論依據(jù)。例如，若能明確NNMT在腫瘤細(xì)胞中的具體作用靶點和信號通路，就有可能針對這些靶點開發(fā)特異性的抑制劑或激動劑，從而實現(xiàn)對結(jié)腸癌的精準(zhǔn)治療，提高治療效果，減少副作用，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。此外，構(gòu)建高表達(dá)細(xì)胞株也有助于篩選和評估潛在的抗癌藥物，為新藥研發(fā)提供重要的實驗基礎(chǔ)。綜上所述，構(gòu)建尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值，有望為結(jié)腸癌的研究和治療帶來新的突破。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在成功構(gòu)建尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，并深入探究其生物學(xué)特性及相關(guān)作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制研究和治療策略開發(fā)提供新的思路和實驗依據(jù)。具體研究內(nèi)容如下：構(gòu)建高表達(dá)細(xì)胞株：通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將尼克酰胺N-甲基化酶的編碼基因?qū)肴私Y(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中，篩選并建立穩(wěn)定高表達(dá)尼克酰胺N-甲基化酶的細(xì)胞株。在這一過程中，需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，包括選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑和方法，確定最佳的轉(zhuǎn)染時間和細(xì)胞密度等，以提高轉(zhuǎn)染效率，確保足夠數(shù)量的細(xì)胞成功導(dǎo)入目的基因。同時，利用抗生素篩選等手段，獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞克隆，經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)，驗證其穩(wěn)定性，為后續(xù)實驗提供可靠的細(xì)胞模型。檢測基因和蛋白表達(dá)水平：運用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等技術(shù)，對構(gòu)建的高表達(dá)細(xì)胞株中尼克酰胺N-甲基化酶的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行精確檢測，并與未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的對照細(xì)胞進(jìn)行對比分析。實時熒光定量PCR可以準(zhǔn)確測定mRNA的相對表達(dá)量，通過設(shè)計特異性引物，對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，利用熒光信號的變化來反映基因表達(dá)水平的差異。WesternBlot則能夠直觀地檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，通過特異性抗體與目的蛋白結(jié)合，經(jīng)過顯色或發(fā)光反應(yīng)，顯示出蛋白條帶，從而比較不同細(xì)胞組中尼克酰胺N-甲基化酶的表達(dá)差異，確保構(gòu)建的細(xì)胞株確實實現(xiàn)了尼克酰胺N-甲基化酶的高表達(dá)。分析細(xì)胞生物學(xué)行為變化：采用一系列細(xì)胞生物學(xué)實驗，如細(xì)胞增殖實驗（MTT法、CCK-8法等）、細(xì)胞凋亡實驗（AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法等）、細(xì)胞遷移和侵襲實驗（Transwell小室實驗、劃痕實驗等），全面分析尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480生物學(xué)行為的影響。細(xì)胞增殖實驗可以評估細(xì)胞的生長速度和活力，通過檢測細(xì)胞代謝活性的變化，了解尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)是否促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡實驗則用于檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況，確定高表達(dá)該酶是否誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞遷移和侵襲實驗?zāi)軌蛴^察細(xì)胞的運動能力和侵襲能力的改變，判斷尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的影響，為揭示其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供直接的實驗證據(jù)。探究作用機(jī)制：從分子生物學(xué)和信號通路角度出發(fā)，深入探究尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)影響人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480生物學(xué)行為的潛在作用機(jī)制。運用基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)或生物信息學(xué)分析等手段，篩選與尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)相關(guān)的差異表達(dá)基因和蛋白，以及可能參與的信號通路。例如，通過基因芯片分析，可以同時檢測成千上萬的基因表達(dá)變化，篩選出在高表達(dá)細(xì)胞株中顯著上調(diào)或下調(diào)的基因，進(jìn)一步研究這些基因的功能和相互作用。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)則能夠全面分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾變化，為揭示尼克酰胺N-甲基化酶的作用機(jī)制提供蛋白質(zhì)水平的證據(jù)。在此基礎(chǔ)上，通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)敲低或過表達(dá)相關(guān)關(guān)鍵基因，利用特異性抑制劑阻斷相關(guān)信號通路，驗證其在尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)介導(dǎo)的細(xì)胞生物學(xué)行為變化中的作用，深入闡明其分子機(jī)制。1.3研究方法與創(chuàng)新點本研究綜合運用多種實驗技術(shù)，從細(xì)胞、分子等多個層面深入探究尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的影響，具體研究方法如下：細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫獲取人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480，將其置于含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時，進(jìn)行傳代或?qū)嶒炋幚怼鞔鷷r，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，按照1:3-1:4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，確保細(xì)胞的良好生長和活性。基因轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將攜帶尼克酰胺N-甲基化酶編碼基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中。在轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6孔板中，使其在轉(zhuǎn)染時達(dá)到約70%-80%的融合度。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將適量的重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中。轉(zhuǎn)染后4-6小時，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。為篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，在轉(zhuǎn)染后48小時，加入含有適量嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，持續(xù)篩選2-3周，直至獲得穩(wěn)定表達(dá)尼克酰胺N-甲基化酶的細(xì)胞克隆。實時熒光定量PCR：提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。引物的設(shè)計依據(jù)尼克酰胺N-甲基化酶基因序列，通過在線引物設(shè)計軟件進(jìn)行設(shè)計，并經(jīng)過BLAST比對驗證其特異性。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix等，按照儀器說明書設(shè)置反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。通過檢測Ct值，利用2^(-ΔΔCt)法計算尼克酰胺N-甲基化酶mRNA的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比較不同細(xì)胞組中尼克酰胺N-甲基化酶mRNA的表達(dá)差異。蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）：收集細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。加入抗尼克酰胺N-甲基化酶的一抗，4℃孵育過夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。接著加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時，通過二抗與一抗的結(jié)合，放大檢測信號。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算尼克酰胺N-甲基化酶蛋白的相對表達(dá)量，分析不同細(xì)胞組中蛋白表達(dá)的差異。細(xì)胞增殖實驗（MTT法）：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于96孔板中，每組設(shè)置多個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0、24、48、72小時時，向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時。然后吸出上清液，加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，評估尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)對細(xì)胞增殖能力的影響。細(xì)胞凋亡實驗（AnnexinV-FITC/PI雙染法）：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量的BindingBuffer重懸細(xì)胞。按照試劑盒說明書，向細(xì)胞懸液中加入AnnexinV-FITC和PI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，通過分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的比例，確定早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的數(shù)量，從而評估尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響。細(xì)胞遷移和侵襲實驗（Transwell小室實驗）：對于細(xì)胞遷移實驗，在Transwell小室的上室加入無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞，下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。對于細(xì)胞侵襲實驗，先將Matrigel基質(zhì)膠鋪于Transwell小室的上室，待膠凝固后，加入無血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞，下室同樣加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。將Transwell小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，然后用甲醇固定下室的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色10-15分鐘，用清水沖洗干凈。在顯微鏡下隨機(jī)選取多個視野，計數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，以此評估尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。本研究在方法和視角上具有以下創(chuàng)新點：在研究方法上，綜合運用了多種先進(jìn)的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，如基因芯片技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)的細(xì)胞功能實驗相結(jié)合，從基因、蛋白質(zhì)和細(xì)胞功能多個層面全面深入地研究尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的影響，使研究結(jié)果更加系統(tǒng)和全面。在研究視角上，首次聚焦于尼克酰胺N-甲基化酶在人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的高表達(dá)，深入探究其對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及潛在作用機(jī)制，為結(jié)腸癌的研究提供了新的靶點和方向，有望揭示結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為臨床治療提供更具針對性的理論依據(jù)和治療策略。二、人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480與尼克酰胺N-甲基化酶概述2.1人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480源自一位51歲白人男性患者的原位直腸腺癌，而SW620則源自同一病人一年后的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶。該細(xì)胞具有一系列獨特的生物學(xué)特性，在結(jié)腸癌研究領(lǐng)域中占據(jù)著重要地位。從細(xì)胞特性來看，SW480細(xì)胞呈現(xiàn)上皮細(xì)胞樣形態(tài)，生長特征為貼壁生長。其倍增時間約為30-50小時，這一生長速度相較于其他一些細(xì)胞株具有一定的特點，使得在實驗研究中能夠較為穩(wěn)定地進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和相關(guān)實驗操作。在基因表達(dá)方面，SW480細(xì)胞具有復(fù)雜的基因表達(dá)譜。其CSAp和直腸抗原3呈陰性，而角蛋白陽性。p53基因存在特定突變，第273位密碼子的G→A突變引起Arg→His替代，309位密碼子的C→T突變導(dǎo)致Pro→Ser替代，進(jìn)而使得細(xì)胞p53蛋白表達(dá)水平升高。癌基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、myb、sis和fos的表達(dá)呈陽性，未檢測到癌基因N-myc的表達(dá)。此外，該細(xì)胞不表達(dá)Matrilysin（一種與腫瘤侵襲相關(guān)的金屬蛋白酶），但有報道稱其表達(dá)GM-CSF。這些基因表達(dá)特征不僅反映了SW480細(xì)胞的惡性程度和生物學(xué)行為，也為研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制和治療靶點提供了重要的線索。例如，p53基因的突變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過研究SW480細(xì)胞中p53基因的突變情況，可以深入了解其在結(jié)腸癌發(fā)生過程中的作用機(jī)制。在腫瘤研究中，SW480細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于多個方面。由于其具有典型的結(jié)腸癌細(xì)胞特征，常被用于結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制的研究，通過對該細(xì)胞的研究，可以深入探討結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中的分子機(jī)制，為尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。在抗癌藥物研發(fā)方面，SW480細(xì)胞是重要的研究模型，用于評估各種抗癌藥物的療效和作用機(jī)制，篩選出具有潛在臨床應(yīng)用價值的藥物。在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性研究中，SW480細(xì)胞也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，有助于深入了解腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為，為制定有效的腫瘤治療策略提供實驗基礎(chǔ)。SW480細(xì)胞的培養(yǎng)需要特定的條件和注意事項。在培養(yǎng)基選擇上，通常使用Leibovitz'sL-15培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清和1%雙抗，這種培養(yǎng)基以磷酸鹽和高濃度氨基酸作為緩沖劑，適合在無二氧化碳的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度需設(shè)置為37℃。也有研究使用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，但DMEM培養(yǎng)基以碳酸氫鹽作為緩沖劑，故使用時培養(yǎng)箱需要通入5%CO?以平衡培養(yǎng)基酸堿度。兩種培養(yǎng)體系下細(xì)胞生長速度差異不大，但細(xì)胞形態(tài)有所不同，使用L-15培養(yǎng)體系，細(xì)胞形態(tài)扁平，圓形細(xì)胞較少；使用DMEM培養(yǎng)體系，細(xì)胞偏圓，呈鵝卵石狀或圓形貼壁，可根據(jù)實驗室具體情況選擇合適的培養(yǎng)體系。在傳代時，一般按1:2-1:4的比例進(jìn)行傳代，首次傳代建議1:2。傳代過程中，需使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞大部分變圓并脫落時，迅速加入完全培養(yǎng)基終止消化，然后進(jìn)行離心、重懸和分瓶操作。換液頻率為每周2-3次，定期更換培養(yǎng)基可以保證細(xì)胞生長環(huán)境的穩(wěn)定，提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，同時去除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止微生物污染，影響細(xì)胞的生長和實驗結(jié)果。在收到細(xì)胞后，應(yīng)用75%酒精噴灑整個細(xì)胞瓶，消毒后放到超凈臺內(nèi)進(jìn)行嚴(yán)格無菌操作，將細(xì)胞瓶放入37℃培養(yǎng)箱中靜置3-4小時以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)后再做處理。人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480因其獨特的來源和生物學(xué)特性，在結(jié)腸癌研究中具有不可替代的作用。了解其培養(yǎng)條件和注意事項，能夠更好地利用該細(xì)胞株進(jìn)行相關(guān)研究，為揭示結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)有效的治療方法提供有力支持。2.2尼克酰胺N-甲基化酶尼克酰胺N-甲基化酶（NNMT）是一種在生物體內(nèi)具有重要作用的酶，其編碼基因位于第11號染色體，由2個內(nèi)含子和3個外顯子構(gòu)成，全長16.5kb，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA具有1579個堿基，編碼的蛋白具有264個氨基酸。從結(jié)構(gòu)上看，NNMT蛋白具有特定的三維結(jié)構(gòu)，其活性中心的氨基酸殘基對于催化反應(yīng)至關(guān)重要。研究表明，NNMT的晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出獨特的折疊方式，活性中心的一些關(guān)鍵氨基酸，如半胱氨酸、組氨酸等，通過與底物和輔助因子的相互作用，實現(xiàn)對尼克酰胺的甲基化催化功能。這種結(jié)構(gòu)特征決定了NNMT的催化特異性和效率。NNMT最重要的功能是以S-腺苷基甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，催化尼克酰胺（NAM）的甲基化反應(yīng)，生成S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH）和甲基尼克酰胺（MNA）。在這一催化過程中，SAM的甲基基團(tuán)在NNMT的作用下轉(zhuǎn)移到NAM分子上，形成MNA，同時SAM轉(zhuǎn)化為SAH。這一甲基化反應(yīng)在維持細(xì)胞內(nèi)的代謝平衡和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，在肝臟中，NNMT參與藥物的生物轉(zhuǎn)化過程，通過對一些藥物分子中的吡啶類結(jié)構(gòu)進(jìn)行甲基化修飾，改變藥物的活性和代謝途徑，從而影響藥物的療效和毒性。NNMT的作用機(jī)制較為復(fù)雜，除了直接參與甲基化反應(yīng)外，還與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）代謝密切相關(guān)。NAM是生成NAD+的前體，理論上NNMT甲基化NAM的過程可影響NAD+依賴性酶的活性。雖然實驗證實NNMT并不直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NAM及NAD+的量，但它可能通過影響NAD+代謝途徑中的其他環(huán)節(jié)，間接影響細(xì)胞的能量代謝和氧化還原狀態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，在某些細(xì)胞模型中，NNMT的表達(dá)變化會引起NAD+代謝相關(guān)酶的活性改變，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和凋亡等生物學(xué)過程。此外，NNMT還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的甲基化水平，影響基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的功能。由于SAM是細(xì)胞內(nèi)重要的甲基供體，NNMT催化反應(yīng)消耗SAM，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SAM/SAH比值發(fā)生變化，而這一比值的改變會影響DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而調(diào)控基因的甲基化修飾和表達(dá)水平，對細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在腫瘤研究領(lǐng)域，NNMT與腫瘤的關(guān)聯(lián)備受關(guān)注。與正常組織和癌旁組織相比，NNMT在結(jié)直腸癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺乳頭狀癌、腎透明細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌和胰腺癌等多種腫瘤組織中有過表達(dá)，并在多種腫瘤患者的血清中升高。這種過表達(dá)現(xiàn)象提示NNMT與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。研究表明，NNMT可能通過多種途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。一方面，它可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的能量代謝，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量支持。腫瘤細(xì)胞具有高代謝需求，NNMT通過影響NAD+代謝，改變細(xì)胞的能量代謝模式，使腫瘤細(xì)胞能夠適應(yīng)快速增殖的需求。另一方面，NNMT可能參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。有研究發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤細(xì)胞系中，敲低NNMT的表達(dá)會降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而過表達(dá)NNMT則會增強(qiáng)這些能力，表明NNMT可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，影響腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能。此外，NNMT還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。在腫瘤微環(huán)境中，炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子的相互作用對腫瘤的發(fā)展至關(guān)重要，NNMT可能通過影響炎癥相關(guān)信號通路，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的浸潤和細(xì)胞因子的分泌，從而影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。尼克酰胺N-甲基化酶作為一種具有獨特結(jié)構(gòu)和重要功能的酶，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。深入研究NNMT的結(jié)構(gòu)、功能、作用機(jī)制及其與腫瘤的關(guān)聯(lián)，對于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點具有重要意義。三、尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建3.1實驗材料與準(zhǔn)備細(xì)胞：人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞復(fù)蘇后，置于含有10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS，Gibco公司）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素，Solarbio公司）的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司）中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)期時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio公司）消化傳代，傳代比例為1:3-1:4，每2-3天換液一次，以保證細(xì)胞的良好生長狀態(tài)。試劑：攜帶尼克酰胺N-甲基化酶（NNMT）編碼基因的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NNMT由本實驗室前期構(gòu)建并保存。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（Invitrogen公司）用于將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞。嘌呤霉素（Puromycin，Solarbio公司）用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。Trizol試劑（Invitrogen公司）用于提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。實時熒光定量PCR試劑SYBRGreenMasterMix（TaKaRa公司）用于進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)。RIPA裂解液（Solarbio公司）用于提取細(xì)胞總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒（Solarbio公司）用于測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Beyotime公司）用于制備SDS-PAGE凝膠。PVDF膜（Millipore公司）用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗。抗NNMT一抗（Abcam公司）、抗β-actin一抗（CellSignalingTechnology公司）、HRP標(biāo)記的二抗（JacksonImmunoResearch公司）用于蛋白質(zhì)免疫印跡檢測。MTT試劑（Solarbio公司）用于細(xì)胞增殖實驗。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司）用于細(xì)胞凋亡實驗。Transwell小室（Corning公司）、Matrigel基質(zhì)膠（BDBiosciences公司）用于細(xì)胞遷移和侵襲實驗。儀器：CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）用于細(xì)胞培養(yǎng)。超凈工作臺（ESCO公司）用于細(xì)胞操作，保證實驗環(huán)境的無菌。倒置顯微鏡（Olympus公司）用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)。高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）用于細(xì)胞和蛋白的離心分離。PCR儀（Bio-Rad公司）用于基因擴(kuò)增。實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司）用于檢測基因表達(dá)水平。電泳儀（Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中的電泳和結(jié)果檢測。酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司）用于MTT實驗中檢測吸光度值。流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司）用于細(xì)胞凋亡實驗的檢測。材料處理與準(zhǔn)備：在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染前，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NNMT用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒（Qiagen公司）進(jìn)行提取和純化，以保證質(zhì)粒的質(zhì)量和純度。使用前，將質(zhì)粒濃度調(diào)整至1μg/μL，并保存于-20℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)實驗需求，提前將Lipofectamine3000試劑和Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）在室溫下平衡。Matrigel基質(zhì)膠需在4℃冰箱中過夜融化，使用時在冰上操作，避免其凝固。將Transwell小室提前從冰箱中取出，平衡至室溫后再進(jìn)行后續(xù)實驗操作。3.2載體構(gòu)建引物設(shè)計與合成：根據(jù)GenBank中公布的尼克酰胺N-甲基化酶（NNMT）基因序列（登錄號：XXXXXX），運用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計。上游引物序列為5'-[具體序列1]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列2]-3'。為便于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)，在上游引物的5'端添加BamHI酶切位點（GGATCC），下游引物的5'端添加XhoI酶切位點（CTCGAG）。引物由上海生工生物工程有限公司合成，合成后經(jīng)PAGE純化，用無菌雙蒸水溶解至100μM的儲存濃度，保存于-20℃?zhèn)溆谩；驍U(kuò)增：從本實驗室液氮保存的人肝臟組織中提取總RNA。使用Trizol試劑按照說明書操作，具體步驟如下：將約50-100mg肝臟組織加入到1mLTrizol試劑中，用勻漿器充分勻漿，室溫靜置5分鐘，使組織充分裂解。然后加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，取上層無色水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄上清，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀兩次，每次4℃、7500rpm離心5分鐘。棄上清，將RNA沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用Nanodrop2000超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer（50μM）1μL、Random6mers（100μM）1μL、總RNA1μg，加RNaseFreedH?O至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括2×TaqPCRMasterMix25μL、上游引物（10μM）2μL、下游引物（10μM）2μL、cDNA模板2μL，加ddH?O至50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察是否有預(yù)期大小的條帶，結(jié)果顯示在約[X]bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期的NNMT基因片段大小一致。3.載體酶切與連接：將PCR擴(kuò)增得到的NNMT基因片段和真核表達(dá)載體pcDNA3.1（本實驗室保存）分別用BamHI和XhoI進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為20μL，包括10×Buffer2μL、BamHI1μL、XhoI1μL、DNA（目的基因片段或載體）10μL，加ddH?O至20μL。37℃水浴酶切3-4小時。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒（Qiagen公司）回收目的基因片段和線性化的載體片段。按照說明書操作，將切下的含目的條帶的凝膠放入離心管中，加入適量的BufferQG，50℃水浴10分鐘，使凝膠完全溶解。將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，棄濾液。加入750μLBufferPE洗滌吸附柱，12000rpm離心1分鐘，棄濾液，重復(fù)洗滌一次。將吸附柱放入新的離心管中，12000rpm離心1分鐘，以去除殘留的洗滌液。向吸附柱中加入適量的ElutionBuffer，室溫靜置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集洗脫液，即回收的目的基因片段或載體片段。取回收的目的基因片段和線性化載體片段，按照3:1-5:1的摩爾比進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為10μL，包括T4DNALigaseBuffer1μL、T4DNALigase1μL、目的基因片段3-5μL、線性化載體片段1μL，加ddH?O至10μL。16℃連接過夜。4.轉(zhuǎn)化與鑒定：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（本實驗室制備）中。從-80℃冰箱取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化。取5μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上靜置30分鐘。然后將離心管放入42℃水浴中熱激90秒，迅速取出后冰上冷卻2-3分鐘。向離心管中加入900μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時，使細(xì)菌復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時，直至長出單菌落。挑取平板上的單菌落，接種到含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒（Qiagen公司）提取質(zhì)粒，按照說明書操作，將過夜培養(yǎng)的菌液12000rpm離心1分鐘，棄上清。加入250μLBufferP1（含RNaseA）重懸菌體，充分振蕩混勻。加入250μLBufferP2，溫和顛倒混勻4-6次，使菌體充分裂解，溶液變澄清。加入350μLBufferN3，立即溫和顛倒混勻4-6次，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm離心1分鐘，棄濾液。加入500μLBufferPB洗滌吸附柱，12000rpm離心1分鐘，棄濾液。加入750μLBufferPE洗滌吸附柱，12000rpm離心1分鐘，棄濾液，重復(fù)洗滌一次。將吸附柱放入新的離心管中，12000rpm離心1分鐘，以去除殘留的洗滌液。向吸附柱中加入適量的ElutionBuffer，室溫靜置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集洗脫液，即提取的質(zhì)粒。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測序鑒定。雙酶切鑒定反應(yīng)體系和條件同上述酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否有預(yù)期大小的目的基因片段和載體片段條帶。測序由上海生工生物工程有限公司完成，將測序結(jié)果與GenBank中公布的NNMT基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NNMT中NNMT基因序列正確，無突變和缺失，表明含尼克酰胺N-甲基化酶基因的表達(dá)載體構(gòu)建成功。3.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備：在轉(zhuǎn)染實驗前1天，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液將處于對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480從培養(yǎng)瓶中消化下來，以每孔3×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，加入2mL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基。將6孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時達(dá)到70%-80%的融合度。在轉(zhuǎn)染前1小時，將Opti-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司）從冰箱中取出，平衡至室溫，用于稀釋重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000。同時，將無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒提取的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NNMT和空質(zhì)粒pcDNA3.1（作為陰性對照）從-20℃冰箱取出，置于冰上融化備用。轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備：按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。在一個無菌的EP管中，加入100μLOpti-MEM培養(yǎng)基，然后加入4μLLipofectamine3000試劑，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘，形成脂質(zhì)體稀釋液。在另一個無菌EP管中，加入100μLOpti-MEM培養(yǎng)基，再加入4μg重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NNMT或空質(zhì)粒pcDNA3.1，輕輕混勻，得到質(zhì)粒稀釋液。將上述脂質(zhì)體稀釋液和質(zhì)粒稀釋液混合，輕輕吹打混勻，室溫孵育20分鐘，使脂質(zhì)體與質(zhì)粒充分結(jié)合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。轉(zhuǎn)染操作：將6孔板從培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺內(nèi)，用移液器吸去每孔中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，以去除殘留的血清和雜質(zhì)。向每孔中加入1.8mLOpti-MEM培養(yǎng)基，然后將制備好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。將6孔板放回37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4-6小時后，吸去含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，加入2mL含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選：轉(zhuǎn)染48小時后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效率。此時，部分細(xì)胞可能已經(jīng)成功攝取了重組質(zhì)粒，呈現(xiàn)出不同的形態(tài)變化或熒光標(biāo)記（若重組質(zhì)粒帶有熒光標(biāo)記）。為篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，向培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素（Puromycin），使其終濃度為2μg/mL。嘌呤霉素是一種氨基糖苷類抗生素，能夠抑制蛋白質(zhì)合成，只有成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)抗性基因（重組質(zhì)粒中攜帶的抗性基因）的細(xì)胞才能在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中存活。每2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周，期間可見未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞逐漸死亡，而成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則形成克隆并繼續(xù)生長。當(dāng)細(xì)胞克隆生長至足夠大時，用胰蛋白酶消化單個克隆，將其轉(zhuǎn)移至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后，再轉(zhuǎn)移至6孔板和培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)尼克酰胺N-甲基化酶的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480-NNMT及轉(zhuǎn)染空載體的對照細(xì)胞株SW480-vector。在篩選過程中，定期觀察細(xì)胞的生長情況，記錄細(xì)胞的形態(tài)變化和克隆形成數(shù)量，確保篩選過程的順利進(jìn)行。3.4篩選與鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選：采用嘌呤霉素篩選法獲得穩(wěn)定高表達(dá)尼克酰胺N-甲基化酶（NNMT）的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480。在轉(zhuǎn)染48小時后，向培養(yǎng)基中加入嘌呤霉素，其終濃度設(shè)定為2μg/mL。嘌呤霉素能夠抑制未轉(zhuǎn)染抗性基因細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在篩選過程中，每2-3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周。在顯微鏡下定期觀察細(xì)胞生長情況，可見未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞逐漸死亡，而成功攝取并表達(dá)重組質(zhì)粒（含抗性基因）的細(xì)胞則能夠存活并形成克隆。待細(xì)胞克隆生長至足夠大時，用胰蛋白酶消化單個克隆，將其轉(zhuǎn)移至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。在24孔板中，細(xì)胞逐漸長滿，此時再將其轉(zhuǎn)移至6孔板和培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，最終獲得穩(wěn)定表達(dá)NNMT的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480-NNMT及轉(zhuǎn)染空載體的對照細(xì)胞株SW480-vector。實時熒光定量PCR鑒定：運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中NNMT基因的mRNA表達(dá)水平。首先，使用Trizol試劑提取SW480-NNMT細(xì)胞、SW480-vector細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞的總RNA。具體操作如下：將細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌2次，加入1mLTrizol試劑，用移液器反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分裂解。室溫靜置5分鐘后，加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，此時溶液分為三層，小心吸取上層無色水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，4℃、12000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄上清，用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀兩次，每次4℃、7500rpm離心5分鐘。棄上清，將RNA沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用Nanodrop2000超微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL、OligodTPrimer（50μM）1μL、Random6mers（100μM）1μL、總RNA1μg，加RNaseFreedH?O至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒，4℃保存。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)NNMT基因設(shè)計，上游引物為5'-[具體序列3]-3'，下游引物為5'-[具體序列4]-3'，以β-actin作為內(nèi)參基因，上游引物為5'-[具體序列5]-3'，下游引物為5'-[具體序列6]-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenMasterMix10μL、上下游引物（10μM）各0.8μL、cDNA模板2μL，加ddH?O至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。通過檢測Ct值，利用2^(-ΔΔCt)法計算NNMTmRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，SW480-NNMT細(xì)胞中NNMTmRNA的表達(dá)水平顯著高于SW480-vector細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞，表明NNMT基因在SW480-NNMT細(xì)胞中成功實現(xiàn)高表達(dá)。3.蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）鑒定：采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中NNMT蛋白的表達(dá)水平。收集SW480-NNMT細(xì)胞、SW480-vector細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘振蕩一次。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白和樣品蛋白加入到96孔板中，每孔加入20μL蛋白樣品和200μLBCA工作液，充分混勻。37℃孵育30分鐘后，使用酶標(biāo)儀在562nm波長處檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品蛋白的濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電泳條件為：濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，60-90分鐘，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠的底部。電泳結(jié)束后，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA，90-120分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。加入抗NNMT一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。接著加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時，通過二抗與一抗的結(jié)合，放大檢測信號。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶的灰度值。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算NNMT蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，SW480-NNMT細(xì)胞中NNMT蛋白的表達(dá)水平明顯高于SW480-vector細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞，進(jìn)一步證實了NNMT在SW480-NNMT細(xì)胞中實現(xiàn)了高表達(dá)。四、構(gòu)建細(xì)胞株的特性分析4.1生長特性分析為深入探究尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480生長特性的影響，本研究采用MTT法繪制細(xì)胞生長曲線并計算倍增時間。實驗分組設(shè)置為SW480-NNMT組（穩(wěn)定高表達(dá)尼克酰胺N-甲基化酶的細(xì)胞株）、SW480-vector組（轉(zhuǎn)染空載體的對照細(xì)胞株）和SW480組（未轉(zhuǎn)染的人結(jié)腸癌細(xì)胞株）。將處于對數(shù)生長期的三組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個/mL。在96孔板中，每孔加入200μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)置6個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0、24、48、72和96小時時進(jìn)行檢測。向每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），37℃孵育4小時。之后小心吸出上清液，加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值）。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)初期（0-24小時），三組細(xì)胞的生長情況無明顯差異，OD值增長趨勢相近。隨著培養(yǎng)時間的延長（24-72小時），SW480-NNMT組細(xì)胞的OD值增長速度明顯快于SW480-vector組和SW480組，表明尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。在72-96小時，SW480-NNMT組細(xì)胞的OD值繼續(xù)上升，但增長速度略有減緩，可能是由于細(xì)胞密度增加，營養(yǎng)物質(zhì)相對不足，出現(xiàn)了接觸抑制現(xiàn)象；而SW480-vector組和SW480組細(xì)胞的OD值增長更為緩慢，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。通過細(xì)胞生長曲線計算倍增時間，公式為：t_d=t\times\log_2(N_t/N_0)，其中t_d為倍增時間，t為培養(yǎng)時間，N_t為培養(yǎng)t時間后的細(xì)胞數(shù)量，N_0為初始細(xì)胞數(shù)量。在本實驗中，以O(shè)D值代表細(xì)胞數(shù)量，計算得出SW480-NNMT組細(xì)胞的倍增時間約為28小時，SW480-vector組細(xì)胞的倍增時間約為36小時，SW480組細(xì)胞的倍增時間約為38小時。這進(jìn)一步證實了尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)可顯著縮短細(xì)胞的倍增時間，促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的增殖。尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)能夠顯著改變?nèi)私Y(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的生長特性，促進(jìn)細(xì)胞增殖，縮短細(xì)胞倍增時間，為深入研究其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的實驗依據(jù)。4.2形態(tài)學(xué)觀察在成功構(gòu)建尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480（SW480-NNMT）后，為進(jìn)一步探究其生物學(xué)特性，對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了細(xì)致觀察。使用倒置顯微鏡，在100倍和200倍放大倍數(shù)下，對SW480-NNMT組、SW480-vector組（轉(zhuǎn)染空載體的對照細(xì)胞株）和SW480組（未轉(zhuǎn)染的人結(jié)腸癌細(xì)胞株）的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察并拍照記錄。在100倍鏡下，SW480-vector組和SW480組細(xì)胞形態(tài)較為相似，均呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，貼壁生長，細(xì)胞之間緊密相連，形成較為規(guī)則的細(xì)胞單層。而SW480-NNMT組細(xì)胞形態(tài)則出現(xiàn)了明顯變化，部分細(xì)胞體積增大，形態(tài)變得更為不規(guī)則，呈現(xiàn)出一種更為松散的生長狀態(tài)，細(xì)胞之間的連接相對疏松。將放大倍數(shù)提高至200倍后，SW480-vector組和SW480組細(xì)胞的細(xì)胞核清晰可見，呈圓形或橢圓形，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)均勻分布，細(xì)胞器形態(tài)正常。在SW480-NNMT組中，除了觀察到細(xì)胞形態(tài)的不規(guī)則外，還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核的形態(tài)也發(fā)生了改變，部分細(xì)胞核出現(xiàn)了增大、變形的現(xiàn)象，核仁更為明顯且數(shù)量增多，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)了一些空泡狀結(jié)構(gòu)。通過對不同組細(xì)胞形態(tài)的對比分析，發(fā)現(xiàn)尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)可導(dǎo)致人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著改變。這些形態(tài)學(xué)變化可能與細(xì)胞的生物學(xué)行為改變密切相關(guān)，例如細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力等。細(xì)胞形態(tài)的改變可能是由于尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)影響了細(xì)胞內(nèi)的信號通路和基因表達(dá)，進(jìn)而改變了細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間的相互作用。這一發(fā)現(xiàn)為深入研究尼克酰胺N-甲基化酶在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)，有助于進(jìn)一步揭示其對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。4.3侵襲與遷移能力研究為深入探究尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480侵襲與遷移能力的影響，本研究采用Transwell小室實驗進(jìn)行檢測。實驗設(shè)置SW480-NNMT組（穩(wěn)定高表達(dá)尼克酰胺N-甲基化酶的細(xì)胞株）、SW480-vector組（轉(zhuǎn)染空載體的對照細(xì)胞株）和SW480組（未轉(zhuǎn)染的人結(jié)腸癌細(xì)胞株）。在進(jìn)行細(xì)胞侵襲實驗時，先將Matrigel基質(zhì)膠用無血清RPMI1640培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，取50μL稀釋后的基質(zhì)膠均勻鋪于Transwell小室的上室，37℃孵育4-6小時，使其凝固形成基質(zhì)膜，模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。將處于對數(shù)生長期的三組細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。在Transwell小室的上室加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入600μL含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，使細(xì)胞能夠穿過基質(zhì)膜和聚碳酸酯膜遷移到下室。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未侵襲的細(xì)胞，然后用甲醇固定下室的細(xì)胞15分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘，用清水沖洗干凈，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞遷移實驗的操作與侵襲實驗類似，但無需鋪Matrigel基質(zhì)膠。直接將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時后進(jìn)行后續(xù)的固定、染色和計數(shù)操作。實驗結(jié)果顯示，在細(xì)胞侵襲實驗中，SW480-NNMT組穿過基質(zhì)膜遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于SW480-vector組和SW480組，平均細(xì)胞數(shù)分別為[X1]、[X2]和[X3]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在細(xì)胞遷移實驗中，SW480-NNMT組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量也顯著高于SW480-vector組和SW480組，平均細(xì)胞數(shù)分別為[Y1]、[Y2]和[Y3]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。通過Transwell小室實驗結(jié)果表明，尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的侵襲與遷移能力。這一結(jié)果提示，NNMT可能在結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，其高表達(dá)可能促進(jìn)癌細(xì)胞突破組織屏障，向周圍組織浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，為進(jìn)一步研究NNMT在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用提供了重要的實驗依據(jù)，有助于深入理解結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展過程，為尋找有效的抗轉(zhuǎn)移治療靶點提供方向。4.4相關(guān)基因與蛋白表達(dá)分析為深入探究尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480生物學(xué)行為的影響機(jī)制，本研究采用實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，對與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)的基因和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測與分析。在實時熒光定量PCR實驗中，選取了多個關(guān)鍵基因，包括原癌基因c-myc、K-ras，抑癌基因p53，以及與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因MMP-2（基質(zhì)金屬蛋白酶-2）和MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）等。實驗分組設(shè)置為SW480-NNMT組（穩(wěn)定高表達(dá)尼克酰胺N-甲基化酶的細(xì)胞株）、SW480-vector組（轉(zhuǎn)染空載體的對照細(xì)胞株）和SW480組（未轉(zhuǎn)染的人結(jié)腸癌細(xì)胞株）。提取三組細(xì)胞的總RNA，使用Trizol試劑按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行提取，確保RNA的完整性和純度。經(jīng)Nanodrop2000超微量分光光度計檢測，A260/A280比值均在1.8-2.0之間，滿足后續(xù)實驗要求。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增。引物序列根據(jù)各基因的mRNA序列設(shè)計，通過在線引物設(shè)計軟件進(jìn)行優(yōu)化，并經(jīng)BLAST比對驗證其特異性。反應(yīng)體系和條件嚴(yán)格按照SYBRGreenMasterMix試劑說明書進(jìn)行設(shè)置，以保證實驗的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。通過檢測Ct值，利用2^(-ΔΔCt)法計算各基因mRNA的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果顯示，與SW480-vector組和SW480組相比，SW480-NNMT組中c-myc和K-ras基因的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別增加了[X]倍和[Y]倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而抑癌基因p53的mRNA表達(dá)水平則明顯下調(diào)，降低了[Z]倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因方面，MMP-2和MMP-9基因的mRNA表達(dá)水平在SW480-NNMT組中也顯著升高，分別為SW480-vector組和SW480組的[M]倍和[N]倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。為進(jìn)一步驗證基因表達(dá)水平的變化在蛋白質(zhì)層面的體現(xiàn)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)對相應(yīng)蛋白進(jìn)行檢測。收集三組細(xì)胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間每隔5分鐘振蕩一次，以充分裂解細(xì)胞并防止蛋白降解。4℃、12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確保各樣本蛋白上樣量一致。將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液混合，100℃煮沸5分鐘使蛋白變性。進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，電泳條件為：濃縮膠80V，30分鐘；分離膠120V，60-90分鐘，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠的底部。電泳結(jié)束后，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA，90-120分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1-2小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。加入抗c-myc、K-ras、p53、MMP-2、MMP-9的一抗（均1:1000稀釋），4℃孵育過夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。接著加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時，通過二抗與一抗的結(jié)合，放大檢測信號。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后使用化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶的灰度值。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算各目的蛋白的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果與實時熒光定量PCR結(jié)果一致，SW480-NNMT組中c-myc和K-ras蛋白的表達(dá)水平顯著升高，p53蛋白的表達(dá)水平明顯降低，MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平也顯著上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。通過對相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平的檢測與分析，發(fā)現(xiàn)尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)可顯著改變?nèi)私Y(jié)腸癌細(xì)胞株SW480中與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。原癌基因的上調(diào)和抑癌基因的下調(diào)可能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化，而腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白的高表達(dá)則與細(xì)胞侵襲和遷移能力的增強(qiáng)密切相關(guān)。這些結(jié)果為深入揭示尼克酰胺N-甲基化酶在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供了重要的分子生物學(xué)依據(jù)，有助于進(jìn)一步闡明其在腫瘤進(jìn)程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為尋找新的治療靶點和干預(yù)策略奠定基礎(chǔ)。五、構(gòu)建細(xì)胞株的機(jī)制探討5.1代謝途徑變化尼克酰胺N-甲基化酶（NNMT）高表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480構(gòu)建成功后，其細(xì)胞代謝途徑發(fā)生了顯著變化，這對于深入理解NNMT在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制具有重要意義。NNMT催化尼克酰胺（NAM）甲基化反應(yīng)，這一過程與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）代謝密切相關(guān)。NAM是生成NAD+的前體，理論上NNMT甲基化NAM的過程可影響NAD+依賴性酶的活性。在NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞中，雖然實驗證實NNMT并不直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NAM及NAD+的量，但研究發(fā)現(xiàn)其可能通過影響NAD+代謝途徑中的其他環(huán)節(jié)來間接發(fā)揮作用。有研究表明，在一些腫瘤細(xì)胞模型中，NNMT表達(dá)變化會引起NAD+代謝相關(guān)酶的活性改變。在NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞中，NAD+合成酶的活性可能受到影響，進(jìn)而改變細(xì)胞內(nèi)NAD+的合成速率和水平。這可能導(dǎo)致細(xì)胞的能量代謝和氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量支持。腫瘤細(xì)胞具有高代謝需求，需要大量的能量來維持其快速分裂和生長。NNMT高表達(dá)通過影響NAD+代謝，可能使細(xì)胞的能量代謝模式發(fā)生適應(yīng)性改變，如增強(qiáng)糖酵解途徑，提高葡萄糖的攝取和利用效率，從而滿足腫瘤細(xì)胞對能量的需求。NNMT高表達(dá)還可能對細(xì)胞的脂質(zhì)代謝產(chǎn)生影響。有研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪組織和肝臟中，NNMT參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)。在NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞中，可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成相關(guān)酶的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成和積累。一些研究表明，腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)代謝異常與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。NNMT高表達(dá)導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝改變，可能為腫瘤細(xì)胞提供更多的生物膜合成原料，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，同時也可能影響腫瘤細(xì)胞的膜流動性和信號傳導(dǎo)，進(jìn)一步影響腫瘤的生物學(xué)行為。NNMT高表達(dá)對細(xì)胞代謝途徑的影響還可能涉及氨基酸代謝。氨基酸是細(xì)胞生長和增殖的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，參與蛋白質(zhì)合成、能量代謝和信號傳導(dǎo)等過程。在NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞中，可能通過調(diào)節(jié)氨基酸轉(zhuǎn)運體和代謝酶的表達(dá)和活性，改變細(xì)胞對氨基酸的攝取、利用和代謝。有研究報道，在某些腫瘤細(xì)胞中，氨基酸代謝的改變與腫瘤的耐藥性和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。NNMT高表達(dá)引起的氨基酸代謝變化，可能影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，同時也可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480在代謝途徑上發(fā)生了多方面的變化，包括NAD+代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝等。這些代謝途徑的改變相互關(guān)聯(lián)，共同影響著腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了有利條件。深入研究這些代謝途徑的變化及其機(jī)制，對于揭示NNMT在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制，尋找新的治療靶點和干預(yù)策略具有重要意義。5.2信號通路研究深入探究尼克酰胺N-甲基化酶（NNMT）高表達(dá)對人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480相關(guān)信號通路的調(diào)控機(jī)制，對于揭示其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，多條信號通路相互交織，共同調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。有研究表明，NNMT可能參與調(diào)控多條與腫瘤相關(guān)的信號通路。其中，PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞的生長、增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路被激活。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，與SW480-vector組和SW480組相比，SW480-NNMT組中p-Akt（磷酸化的Akt）的表達(dá)水平顯著升高，而總Akt的表達(dá)水平無明顯變化。這表明NNMT高表達(dá)可能通過促進(jìn)Akt的磷酸化，激活PI3K/Akt信號通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用PI3K抑制劑LY294002處理SW480-NNMT細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到顯著抑制，細(xì)胞凋亡率明顯增加。這一結(jié)果證實了PI3K/Akt信號通路在NNMT高表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為改變中的重要作用，提示NNMT可能通過激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而推動結(jié)腸癌的發(fā)展。Wnt/β-catenin信號通路也是一條與腫瘤密切相關(guān)的信號通路，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和腫瘤發(fā)生等過程中起關(guān)鍵作用。在NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號通路的活性也發(fā)生了改變。通過實時熒光定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測發(fā)現(xiàn)，SW480-NNMT組中Wnt信號通路相關(guān)基因（如c-myc、cyclinD1）的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，同時β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累增加。這表明NNMT高表達(dá)可能激活Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)β-catenin入核，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。為了驗證這一推測，采用siRNA干擾技術(shù)敲低SW480-NNMT細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯下降，c-myc和cyclinD1等靶基因的表達(dá)也顯著降低。這一結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號通路在NNMT高表達(dá)介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為改變中發(fā)揮重要作用，NNMT可能通過激活該信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的進(jìn)展。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多個亞家族，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，在NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞中，ERK1/2的磷酸化水平顯著升高，而JNK和p38MAPK的磷酸化水平無明顯變化。這表明NNMT高表達(dá)可能特異性地激活ERK1/2信號通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，使用ERK1/2抑制劑U0126處理SW480-NNMT細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率增加。這一結(jié)果證實了ERK1/2信號通路在NNMT高表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移中的重要作用，提示NNMT可能通過激活ERK1/2信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和遷移相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響結(jié)腸癌的發(fā)展。尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480在PI3K/Akt、Wnt/β-catenin和ERK1/2等信號通路的調(diào)控方面發(fā)生了顯著變化。這些信號通路的激活可能是NNMT促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制。深入研究這些信號通路的調(diào)控機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示NNMT在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為尋找新的治療靶點和干預(yù)策略提供重要的理論依據(jù)。5.3與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)尼克酰胺N-甲基化酶（NNMT）高表達(dá)的人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的構(gòu)建，為深入研究NNMT與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)提供了有力的實驗?zāi)Ｐ汀１姸嘌芯勘砻鳎琋NMT在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥等多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。在腫瘤發(fā)生過程中，細(xì)胞的增殖和凋亡失衡是關(guān)鍵因素之一。本研究構(gòu)建的NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞株呈現(xiàn)出明顯的增殖優(yōu)勢，細(xì)胞倍增時間顯著縮短，生長曲線顯示其生長速度明顯快于對照組細(xì)胞。這一現(xiàn)象表明NNMT高表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，NNMT高表達(dá)可上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而加速細(xì)胞增殖。同時，在細(xì)胞凋亡方面，NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞凋亡率明顯降低，這可能與NNMT對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控有關(guān)。有研究報道，NNMT可抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，為腫瘤細(xì)胞的持續(xù)生長提供了有利條件。腫瘤的發(fā)展過程涉及細(xì)胞代謝的重編程，以滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的能量和物質(zhì)需求。NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞在代謝途徑上發(fā)生了顯著變化，這些變化與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。在NAD+代謝方面，盡管NNMT并不直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NAD+的量，但它可能通過影響NAD+代謝途徑中的其他環(huán)節(jié)來間接影響細(xì)胞的能量代謝。例如，NNMT高表達(dá)可能改變NAD+合成酶的活性，進(jìn)而影響NAD+的合成速率和水平，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供能量支持。在脂質(zhì)代謝方面，NNMT高表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成相關(guān)酶的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成和積累。腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)代謝異常與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，NNMT高表達(dá)導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝改變，可能為腫瘤細(xì)胞提供更多的生物膜合成原料，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。此外，在氨基酸代謝方面，NNMT高表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)氨基酸轉(zhuǎn)運體和代謝酶的表達(dá)和活性，改變細(xì)胞對氨基酸的攝取、利用和代謝，為腫瘤細(xì)胞的生長和增殖提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因之一，而細(xì)胞的侵襲和遷移能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。本研究通過Transwell小室實驗證實，NNMT高表達(dá)的SW480細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng)。這一結(jié)果表明NNMT在結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，NNMT高表達(dá)可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)，這兩種酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移創(chuàng)造條件。此外，NNMT還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞與周圍組織的黏附能力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移。腫瘤的耐藥性是臨床治療中的一大難題，嚴(yán)重影響患者的治療效果和生存率。有研究報道，NNMT與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)。在NNMT高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，可能通過調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)和活性，影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的攝取和外排，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。例如，NNMT高表達(dá)可能上調(diào)P-糖蛋白（P-gp）的表達(dá)，P-gp是一種重要的藥物外排泵，能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。此外，NNMT還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，影響腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤耐藥性的產(chǎn)生。尼克酰胺N-甲基化酶高表達(dá)在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)中都發(fā)揮著重要作用，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增強(qiáng)細(xì)胞侵襲和遷移能力以及誘導(dǎo)腫瘤耐藥性等。深入研究NNMT與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)，對于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點和干預(yù)策略具有重要意義。六、結(jié)果與討論6.1實驗結(jié)果總結(jié)本研究成功構(gòu)建了尼克酰胺N-甲基化酶（NNM