人原發性肝癌細胞系構建及分子機制解析：探尋肝癌診療新徑一、引言1.1研究背景與意義1.1.1肝癌的嚴峻現狀肝癌，作為全球范圍內常見且危害嚴重的惡性腫瘤，給人類健康帶來了沉重負擔。據世界衛生組織（WHO）數據顯示，2020年全球肝癌新發病例數約達90.5萬例，死亡病例數約為83萬例，在癌癥相關死亡原因中位居第四。中國是肝癌高發國家，2020年新發病例數約41.1萬例，死亡病例數約39.1萬例，發病率和死亡率分別位居所有癌癥的第三位和第二位。肝癌的高發病率和死亡率使其成為亟待解決的重大公共衛生問題。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術時機。即使接受手術切除，復發率也較高，這使得肝癌患者的總體5年生存率僅為12.1%。此外，肝癌的發生與多種因素密切相關，如乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、飲酒、吸煙、肥胖等，這些因素在全球范圍內廣泛存在，進一步加劇了肝癌的防控難度。1.1.2細胞系與分子基礎研究的價值人原發性肝癌細胞系的建立對于深入研究肝癌的生物學特性、發病機制及治療方法具有不可或缺的作用。細胞系為研究提供了穩定且可重復的實驗模型，能夠模擬肝癌細胞在體內的生長、增殖和分化過程，有助于揭示肝癌細胞的基本生物學規律。通過對肝癌細胞系的研究，可以深入探討肝癌細胞的耐藥機制，為開發新的治療策略提供理論依據。同時，利用肝癌細胞系進行藥物篩選和藥效評估，能夠加速新型抗癌藥物的研發進程，提高藥物研發的效率和成功率。肝癌相關分子基礎研究則是揭示肝癌發病機制的關鍵所在。肝癌的發生發展是一個多基因、多步驟的復雜過程，涉及多個信號通路的異常激活或抑制。研究肝癌相關分子基礎，能夠從分子層面解析肝癌的發病機制，明確關鍵分子靶點，為肝癌的早期診斷、靶向治療和預后評估提供重要的理論支持。例如，通過對肝癌細胞中關鍵基因和信號通路的研究，發現了一些與肝癌發生發展密切相關的分子標志物，如甲胎蛋白（AFP）、甲胎蛋白異質體（AFP-L3）等，這些標志物在肝癌的早期診斷和病情監測中發揮著重要作用。此外，對肝癌分子基礎的深入了解，還為開發精準的靶向治療藥物提供了可能，有望提高肝癌的治療效果，改善患者的生存質量和預后。1.2研究目的與創新點1.2.1研究目的本研究旨在建立穩定的人原發性肝癌細胞系，為肝癌的深入研究提供可靠的實驗模型。通過優化細胞培養條件，采用先進的細胞分離和純化技術，從肝癌患者的腫瘤組織中成功獲取并培養人原發性肝癌細胞，使其能夠在體外穩定傳代，具備典型的肝癌細胞生物學特性。同時，對建立的細胞系進行全面的生物學鑒定，包括細胞形態學觀察、生長特性分析、染色體核型分析、分子標志物檢測等，明確其作為肝癌細胞模型的可靠性和穩定性。在深入探究肝癌相關分子基礎方面，本研究計劃運用高通量測序技術、蛋白質組學技術以及生物信息學分析方法，系統地分析肝癌細胞系中基因和蛋白質的表達譜，篩選出與肝癌發生發展密切相關的關鍵分子和信號通路。通過功能驗證實驗，如基因敲除、過表達、RNA干擾等技術，明確這些關鍵分子和信號通路在肝癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學過程中的作用機制，為揭示肝癌的發病機制提供新的理論依據。此外，本研究還將探索這些關鍵分子作為肝癌診斷標志物和治療靶點的潛在價值，為肝癌的早期診斷和精準治療提供新的策略和方法。1.2.2創新點在方法創新方面，本研究將采用改良的組織塊貼壁法與酶消化法相結合的細胞分離技術，相較于傳統的單一分離方法，能夠更高效地獲取肝癌細胞，提高細胞的存活率和純度。在細胞培養過程中，優化培養基配方，添加特定的細胞生長因子和營養成分，為肝癌細胞的生長和增殖提供更適宜的微環境，有助于建立更穩定、更具代表性的肝癌細胞系。在技術創新上，本研究將綜合運用多種前沿技術，如單細胞測序技術、空間轉錄組技術和CRISPR-Cas9基因編輯技術。單細胞測序技術能夠深入分析單個肝癌細胞的基因表達特征，揭示肝癌細胞的異質性，為精準治療提供更精準的靶點；空間轉錄組技術則可以在組織原位層面解析基因表達的空間分布信息，有助于深入理解肝癌細胞與周圍微環境的相互作用機制；CRISPR-Cas9基因編輯技術可對肝癌細胞中的關鍵基因進行精確編輯，為驗證基因功能和探索發病機制提供強有力的工具。在研究角度創新上，本研究將從腫瘤微環境與肝癌細胞相互作用的全新視角出發，研究肝癌相關分子基礎。不僅關注肝癌細胞自身的分子變化，還將深入探討腫瘤微環境中的免疫細胞、間質細胞、細胞外基質等成分對肝癌細胞生物學行為的影響，以及肝癌細胞如何通過分泌細胞因子和外泌體等方式反作用于腫瘤微環境，為全面揭示肝癌的發病機制和開發新的治療策略提供更全面的理論支持。二、人原發性肝癌細胞系的建立2.1細胞系建立的材料與方法2.1.1樣本采集本研究的腫瘤組織樣本來自[具體醫院名稱]的原發性肝癌患者。在患者簽署知情同意書，并獲得醫院倫理委員會批準后，進行樣本采集工作。共收集了[X]例患者的腫瘤組織樣本，這些患者均經病理確診為原發性肝癌，且術前未接受過化療、放療或其他抗腫瘤治療，以確保獲取的腫瘤組織未受其他治療因素干擾，能夠真實反映肝癌細胞的原始生物學特性。樣本采集標準嚴格遵循臨床規范。在手術過程中，迅速采集腫瘤組織，選取腫瘤邊緣與正常組織交界處的新鮮組織，避免采集壞死或出血區域的組織。采集的組織樣本大小約為1-2cm3，立即置于含有冰預冷的無血清細胞培養基（如DMEM/F12培養基）的無菌離心管中，并添加適量的青霉素-鏈霉素雙抗，以防止細菌污染。樣本采集后，在30分鐘內迅速送往實驗室進行后續處理，確保組織的活性和完整性。2.1.2細胞分離與培養本研究采用酶消化法與組織塊貼壁法相結合的技術分離肝癌細胞。將采集的腫瘤組織樣本在超凈工作臺中用含雙抗的PBS緩沖液沖洗3-5次，去除表面的血液和雜質。用眼科剪將組織剪成約1mm3的小塊，一部分組織塊采用組織塊貼壁法進行培養。將組織塊均勻地鋪在培養瓶底部，加入適量的完全培養基（DMEM/F12培養基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗、1%谷氨酰胺），輕輕晃動培養瓶，使組織塊均勻分布，然后將培養瓶置于37℃、5%CO?、飽和濕度的培養箱中靜置培養。在培養過程中，每隔2-3天觀察細胞生長情況，當組織塊周圍有細胞爬出并形成一定的細胞暈時，小心吸出培養基，用PBS緩沖液輕輕沖洗，去除未貼壁的組織塊和雜質，然后加入新鮮的完全培養基繼續培養。另一部分組織塊則采用酶消化法處理。將剪碎的組織塊加入含有0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液中，按照組織重量與消化液體積1:5-1:10的比例混合，置于37℃恒溫搖床中消化30-60分鐘，期間每隔10-15分鐘輕輕振蕩搖床，使消化液與組織充分接觸。當組織塊變得松散，大部分細胞從組織塊中游離出來時，加入含有10%胎牛血清的完全培養基終止消化。將消化后的細胞懸液通過100目細胞篩網過濾，去除未消化的組織碎片，然后將濾液轉移至離心管中，1000rpm離心5-10分鐘，棄上清，收集細胞沉淀。用適量的完全培養基重懸細胞，將細胞懸液接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO?、飽和濕度的培養箱中培養。在培養過程中，密切觀察細胞的生長狀態，待細胞貼壁生長至80%-90%融合時，進行傳代培養。傳代時，先用PBS緩沖液沖洗細胞2-3次，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化1-2分鐘，當細胞變圓并開始脫離瓶壁時，加入含有10%胎牛血清的完全培養基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后按照1:2-1:3的比例將細胞接種到新的培養瓶中繼續培養。2.2細胞系的鑒定2.2.1形態學鑒定在細胞培養過程中，定期使用倒置顯微鏡對人原發性肝癌細胞系進行形態學觀察。在低倍鏡（100倍）下，可見細胞呈貼壁生長，形態多樣，主要為多邊形和梭形。細胞生長較為密集，部分區域細胞相互重疊，呈現出典型的腫瘤細胞生長特征。隨著細胞的增殖，細胞逐漸鋪滿培養瓶底部，形成單層細胞。在高倍鏡（400倍）下，進一步觀察細胞形態細節。細胞大小不一，細胞核較大，核質比增高，核仁明顯，通常可見1-3個核仁。細胞核形態不規則，染色質分布不均，部分區域染色質濃集。細胞質豐富，呈嗜堿性，部分細胞可見空泡狀結構。細胞邊界清晰，相鄰細胞之間通過細胞連接相互作用。細胞的排列方式無明顯規律，呈現出雜亂無章的狀態，與正常肝細胞的規則排列形成鮮明對比。將觀察到的細胞形態特征與已報道的肝癌細胞形態學特點進行對比分析。文獻研究表明，肝癌細胞通常具有細胞形態多樣、細胞核增大、核質比異常、核仁明顯等特征。本研究中所觀察到的人原發性肝癌細胞系的形態學特征與文獻報道高度相符，初步判斷該細胞系符合肝癌細胞的形態學特點。通過形態學鑒定，不僅可以直觀地了解細胞的基本形態和生長狀態，還為后續的細胞生物學特性研究和分子生物學鑒定提供了重要的基礎信息。2.2.2免疫組化鑒定免疫組化技術是一種利用抗原與抗體特異性結合的原理，對細胞或組織中的特定蛋白質進行定位和定性分析的方法。在本研究中，采用免疫組化技術對人原發性肝癌細胞系進行鑒定，以確定細胞的來源和性質。選擇甲胎蛋白（AFP）、細胞角蛋白19（CK19）、肝細胞抗原（HepPar-1）等作為免疫組化檢測的標志物。AFP是一種在胎兒期由肝臟和卵黃囊合成的糖蛋白，在肝癌細胞中常常高表達，是肝癌診斷和監測的重要標志物之一。CK19是一種細胞角蛋白，主要表達于膽管上皮細胞和部分肝癌細胞中，可用于鑒別肝癌的細胞來源。HepPar-1是一種肝細胞特異性抗原，在原發性肝細胞癌中呈陽性表達，有助于區分原發性肝癌和轉移性肝癌。具體實驗步驟如下：將培養的人原發性肝癌細胞用胰蛋白酶消化后，制成細胞懸液，然后將細胞懸液滴在載玻片上，晾干后用4%多聚甲醛固定15-20分鐘。用PBS緩沖液沖洗載玻片3次，每次5分鐘，以去除固定液。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20-30分鐘，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接滴加一抗（AFP、CK19、HepPar-1抗體），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液沖洗載玻片3次，每次5分鐘。滴加生物素標記的二抗，室溫孵育20-30分鐘。再次用PBS緩沖液沖洗載玻片3次，每次5分鐘。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育15-20分鐘。用PBS緩沖液沖洗載玻片3次，每次5分鐘。最后，滴加DAB顯色液，室溫顯色3-5分鐘，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現棕黃色陽性反應產物時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察免疫組化染色結果。AFP陽性表達的細胞，其細胞質呈現出明顯的棕黃色。在本研究的細胞系中，大部分細胞AFP呈陽性表達，陽性率約為[X]%。CK19陽性表達的細胞，其細胞膜和細胞質呈現棕黃色。部分細胞CK19呈陽性表達，陽性率約為[X]%，表明該細胞系中存在部分具有膽管上皮細胞特征的肝癌細胞。HepPar-1陽性表達的細胞，其細胞質呈現棕黃色。絕大多數細胞HepPar-1呈陽性表達，陽性率約為[X]%，進一步證實該細胞系來源于肝細胞。通過免疫組化鑒定，明確了人原發性肝癌細胞系表達肝癌相關的特異性標志物，從而確定了該細胞系的細胞來源和性質，為后續的肝癌研究提供了可靠的實驗模型。2.2.3分子生物學鑒定采用PCR、基因測序等分子生物學技術，對人原發性肝癌細胞系進行深入分析，檢測肝癌相關基因的表達和突變情況，進一步驗證細胞系的特性。在PCR實驗中，針對肝癌相關的關鍵基因，如抑癌基因p53、PTEN，癌基因c-myc、K-ras等，設計特異性引物。提取人原發性肝癌細胞系的總RNA，利用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應條件為：95℃預變性3-5分鐘；95℃變性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸30-60秒，共進行30-35個循環；最后72℃延伸5-10分鐘。擴增結束后，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。在凝膠成像系統下觀察結果，若出現與預期大小相符的條帶，則表明該基因在細胞系中表達。結果顯示，癌基因c-myc、K-ras在人原發性肝癌細胞系中呈高表達，而抑癌基因p53、PTEN的表達水平相對較低，與文獻報道的肝癌細胞基因表達特征一致。為了進一步探究肝癌相關基因的突變情況，對部分關鍵基因進行基因測序分析。選取PCR擴增得到的目的基因片段，進行純化和回收。將回收的基因片段連接到測序載體上，轉化至大腸桿菌感受態細胞中。通過藍白斑篩選和菌落PCR鑒定，挑選出陽性克隆。將陽性克隆送至專業的測序公司進行測序。對測序結果進行分析，與正常基因序列進行比對，發現人原發性肝癌細胞系中p53基因存在點突變，導致其編碼的蛋白質氨基酸序列發生改變，這可能影響p53蛋白的正常功能，使其抑癌作用減弱，從而促進肝癌的發生發展。此外，K-ras基因也存在突變，突變位點位于第12密碼子，這種突變可能導致K-ras蛋白持續激活，進而激活下游的信號通路，促進細胞的增殖和轉化。通過分子生物學鑒定，不僅驗證了人原發性肝癌細胞系中肝癌相關基因的表達特征，還發現了關鍵基因的突變情況，從分子層面深入揭示了該細胞系的特性，為肝癌的發病機制研究和靶向治療提供了重要的理論依據。2.3細胞系的生物學特性分析2.3.1細胞增殖能力采用MTT法對人原發性肝癌細胞系的增殖能力進行檢測。將處于對數生長期的肝癌細胞以每孔5000-10000個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl完全培養基，每組設置5-6個復孔。將96孔板置于37℃、5%CO?、飽和濕度的培養箱中培養。在培養后的第1、2、3、4、5天，分別取出相應的96孔板進行MTT檢測。每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續孵育4小時。孵育結束后，小心吸出上清液，每孔加入150μlDMSO，振蕩10-15分鐘，使結晶物充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處檢測各孔的吸光度（OD值）。以培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。結果顯示，人原發性肝癌細胞在培養初期，細胞增殖較為緩慢，處于潛伏期。隨著培養時間的延長，細胞進入對數生長期，增殖速度明顯加快，OD值迅速上升。在培養的第4-5天，細胞逐漸進入平臺期，增殖速度減緩，OD值趨于穩定。通過計算細胞的倍增時間，進一步評估細胞的增殖能力。倍增時間的計算公式為：T_d=t\times\log_2(\frac{N_t}{N_0})，其中T_d為倍增時間，t為培養時間，N_t為培養t時間后的細胞數量，N_0為初始細胞數量。經計算，人原發性肝癌細胞系的倍增時間約為[X]小時，表明該細胞系具有較強的增殖能力。此外，為了驗證MTT法檢測結果的準確性，采用CCK-8法進行平行實驗。CCK-8法的實驗步驟與MTT法類似，只是將MTT溶液替換為CCK-8溶液。在培養后的相應時間點，每孔加入10μlCCK-8溶液，繼續孵育1-2小時，然后使用酶標儀在450nm波長處檢測各孔的OD值。結果顯示，CCK-8法檢測得到的細胞生長曲線與MTT法檢測結果基本一致，進一步證實了人原發性肝癌細胞系具有較強的增殖能力。2.3.2細胞凋亡特性運用流式細胞術檢測人原發性肝癌細胞系的凋亡情況。將處于對數生長期的肝癌細胞以每瓶1\times10^6個細胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml完全培養基，置于37℃、5%CO?、飽和濕度的培養箱中培養。當細胞生長至80%-90%融合時，用不含血清的培養基饑餓處理細胞24小時，誘導細胞凋亡。饑餓處理結束后，用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞懸液于離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄上清。向細胞沉淀中加入500μlBindingBuffer重懸細胞，然后依次加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。孵育結束后，立即使用流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀檢測結果中，AnnexinV-FITC標記的是早期凋亡細胞，PI標記的是晚期凋亡細胞和壞死細胞。根據檢測結果，計算早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞的比例。結果顯示，在正常培養條件下，人原發性肝癌細胞系的凋亡率較低，早期凋亡細胞比例約為[X]%，晚期凋亡細胞和壞死細胞比例約為[X]%。經過饑餓處理后，細胞凋亡率明顯增加，早期凋亡細胞比例上升至[X]%，晚期凋亡細胞和壞死細胞比例上升至[X]%。為了深入探究細胞凋亡相關基因和信號通路的變化，采用實時熒光定量PCR技術檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3等的表達水平。提取正常培養和饑餓處理后的肝癌細胞總RNA，利用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應條件為：95℃預變性3-5分鐘；95℃變性15秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進行40個循環。擴增結束后，根據Ct值計算各基因的相對表達量。結果顯示，與正常培養組相比，饑餓處理組中促凋亡基因Bax、Caspase-3的表達水平顯著上調，而抗凋亡基因Bcl-2的表達水平顯著下調。這表明在饑餓誘導的細胞凋亡過程中，Bax/Bcl-2比值升高，激活Caspase-3，從而引發細胞凋亡，揭示了人原發性肝癌細胞系凋亡過程中相關基因和信號通路的變化規律。2.3.3細胞遷移與侵襲能力利用Transwell實驗檢測人原發性肝癌細胞系的遷移和侵襲能力。Transwell小室分為上下兩層，中間由一層聚碳酸酯膜隔開。在上室中加入無血清培養基和細胞懸液，下室中加入含有10%胎牛血清的完全培養基作為趨化因子。對于遷移實驗，將處于對數生長期的肝癌細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，調整細胞密度為每毫升1\times10^5個細胞。取200μl細胞懸液加入上室，下室加入600μl完全培養基。將Transwell小室置于37℃、5%CO?、飽和濕度的培養箱中培養24-48小時。培養結束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞。將小室浸入甲醇中固定15-20分鐘，然后用結晶紫染色液染色10-15分鐘。在顯微鏡下隨機選取5-10個視野，計數穿過聚碳酸酯膜的細胞數量，計算細胞遷移率。對于侵襲實驗，在進行實驗前，需要先用Matrigel基質膠對Transwell小室的聚碳酸酯膜進行包被。將Matrigel基質膠在4℃冰箱中融化后，按照1:8-1:10的比例用無血清培養基稀釋，取50-100μl稀釋后的Matrigel基質膠加入上室，均勻覆蓋聚碳酸酯膜表面，置于37℃培養箱中孵育3-4小時，使Matrigel基質膠凝固形成一層基質膜。然后按照遷移實驗的步驟進行細胞接種和培養。由于侵襲實驗中細胞需要穿過Matrigel基質膜，培養時間通常比遷移實驗長，一般為48-72小時。培養結束后，同樣進行固定、染色和細胞計數，計算細胞侵襲率。結果顯示，人原發性肝癌細胞系具有較強的遷移和侵襲能力。在遷移實驗中，穿過聚碳酸酯膜的細胞數量較多，細胞遷移率約為[X]%。在侵襲實驗中，盡管細胞需要克服Matrigel基質膜的阻礙，但仍有一定數量的細胞成功穿過基質膜，細胞侵襲率約為[X]%。為了進一步分析與腫瘤轉移相關的分子機制，采用蛋白質免疫印跡（WesternBlot）技術檢測與細胞遷移和侵襲相關的蛋白表達水平，如基質金屬蛋白酶（MMPs）、E-cadherin、N-cadherin等。提取肝癌細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白質，然后將蛋白質轉移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以減少非特異性結合。加入一抗（MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin等抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10-15分鐘。加入二抗（HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗），室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10-15分鐘。最后，使用化學發光底物（ECL）顯色，在凝膠成像系統下觀察并分析蛋白條帶的灰度值，計算各蛋白的相對表達量。結果顯示，人原發性肝癌細胞系中MMP-2、MMP-9的表達水平較高，而E-cadherin的表達水平較低，N-cadherin的表達水平較高。MMPs能夠降解細胞外基質，促進細胞的遷移和侵襲；E-cadherin是一種上皮細胞黏附分子，其表達降低會導致細胞間黏附力下降，有利于細胞的遷移和侵襲；N-cadherin的高表達則與上皮-間質轉化（EMT）過程相關，進一步增強了細胞的遷移和侵襲能力。這些結果表明，在人原發性肝癌細胞系中，MMPs、E-cadherin、N-cadherin等蛋白參與了細胞遷移和侵襲的分子機制，為深入研究肝癌的轉移機制提供了重要線索。此外，采用劃痕實驗對細胞遷移能力進行驗證。將肝癌細胞接種于6孔板中，待細胞鋪滿孔板底部形成單層細胞后，用200μl移液器槍頭在細胞層上垂直劃痕，制造細胞損傷區域。用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，去除劃下的細胞碎片。加入無血清培養基繼續培養，在培養后的0、12、24小時分別用倒置顯微鏡拍照記錄劃痕區域細胞的遷移情況。通過ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算細胞遷移率。結果顯示，隨著培養時間的延長，劃痕區域逐漸被遷移過來的細胞填充，細胞遷移率逐漸增加，與Transwell實驗結果一致，進一步證實了人原發性肝癌細胞系具有較強的遷移能力。三、肝癌相關分子基礎研究3.1肝癌相關基因研究3.1.1致癌基因致癌基因在肝癌的發生發展過程中扮演著至關重要的角色，它們的異常激活能夠促使正常肝細胞向癌細胞轉化，并推動腫瘤的生長、侵襲和轉移。MYC基因是肝癌中常見且重要的致癌基因之一，其編碼的c-Myc蛋白屬于轉錄因子家族。c-Myc蛋白由439個氨基酸組成，分子量約為60kDa，包含多個功能域，如N端的轉錄激活域、中央DNA結合域和C端的二聚化域。在胚胎肝臟發育和肝臟再生過程中，MYC基因發揮著不可或缺的作用，其表達的迅速誘導是肝細胞增殖的關鍵。在胎兒發育期間，MYC基因的缺乏會導致胚胎致死；而在成年小鼠中，MYC基因缺乏則會影響肝細胞的增殖和再生。然而，對成年小鼠的長期觀察結果存在一定爭議，部分研究表明MYC基因缺乏對肝臟并無顯著影響。最新研究揭示了肝臟再生過程中存在MYC依賴和MYC獨立的兩條途徑，在急性肝損傷后，MYC的激活對肝細胞的初始和強烈再生至關重要；但當MYC誘導的增殖受到阻礙時，肝細胞可以通過調節氨基酸代謝等途徑進行另類增殖。在慢性肝病如病毒性肝炎、酒精相關肝病、非酒精性脂肪肝病以及相關的肝纖維化和肝硬化中，MYC信號通路往往被激活或富集，與肝癌的發展緊密相關。特別是在乙型肝炎病毒引起的肝病中，病毒導致MYC基因擴增和過表達，與不良預后密切相關。乙型肝炎病毒相關的肝硬化和肝癌樣本中，MYC表達明顯高于非病毒相關的樣本。這是因為HBV的X蛋白可以直接激活MYC，從而促進肝癌的發生。酗酒同樣會引起MYC過表達，加速酒精相關肝病的發展。在NAFLD中，MYC上調參與了糖酵解和內質網應激的調節。此外，腸道中的MYC可能通過產生GLP-1促進全身代謝性疾病。在肝癌發生過程中，MYC基因位于染色體8q24.1區域，該區域的基因在多種腫瘤中易于發生拷貝數變異。在肝細胞癌中，多個隊列的全外顯子測序顯示MYC基因拷貝數顯著增加。在TCGA-LIHC研究中，62%的病例歸因于MYC的擴增和增益，高表達與擴增呈顯著相關。在膽管細胞癌中，MYC基因雖無顯著擴增，但卻影響ICC向肝細胞癌的轉變。在嬰兒肝母細胞瘤中，MYC與β-連環蛋白的協同作用可以誘導腫瘤發生，而MYC單獨過表達也能快速誘導HB形成。MYC與其他肝癌驅動基因或信號通路的共同激活，可以高效而迅速地誘導小鼠形成肝腫瘤。在人工誘導的肝細胞器官中，MYC過表達可以通過激活線粒體-內質網耦合誘導細胞成為肝細胞癌。在人體肝細胞中，MYC單獨過表達可能難以使肝細胞惡性轉化，但與TP53R249S突變的共同作用可能導致肝細胞轉化為肝細胞癌細胞。這表明MYC與其他肝細胞癌驅動基因或信號通路的共同作用可能是肝細胞癌的啟動因素。RAS基因家族也是肝癌中常見的致癌基因，主要包括HRAS、KRAS和NRAS。RAS蛋白作為一種小分子GTP酶，在細胞信號傳導中起著關鍵的分子開關作用。在正常情況下，RAS蛋白與GDP結合處于失活狀態；當細胞受到外界信號刺激時，RAS蛋白與GTP結合，被激活并啟動下游的信號傳導通路。在肝癌中，RAS基因的突變會導致RAS蛋白持續處于激活狀態，不斷激活下游的RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT-mTOR等信號通路。RAF-MEK-ERK信號通路主要調控細胞的增殖、分化和存活，持續激活該通路會促使肝癌細胞不斷增殖，抑制細胞凋亡，同時還能增強細胞的遷移和侵襲能力。PI3K-AKT-mTOR信號通路則在細胞的生長、代謝和存活中發揮重要作用，激活該通路會導致肝癌細胞的代謝異常增強，為細胞的快速增殖提供充足的能量和物質基礎，同時也能促進細胞的存活和抗凋亡能力。研究表明，RAS基因的突變在肝癌的發生發展過程中較為常見，且與肝癌的惡性程度、轉移能力和預后密切相關。攜帶RAS基因突變的肝癌細胞往往具有更強的增殖能力和侵襲能力，更容易發生轉移，患者的預后也相對較差。除了MYC和RAS基因外，還有其他一些致癌基因也在肝癌的發生發展中發揮著重要作用。例如，CTNNB1基因編碼的β-連環蛋白是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白。在正常情況下，β-catenin在細胞質中與APC、Axin等蛋白形成復合物，被GSK-3β磷酸化后降解，維持在較低水平。當Wnt信號通路激活時，β-catenin與復合物解離，進入細胞核與TCF/LEF轉錄因子結合，激活下游靶基因的表達，如c-Myc、CyclinD1等，這些基因參與細胞的增殖、分化和凋亡等過程，異常激活會導致肝癌的發生發展。研究發現，在部分肝癌患者中，CTNNB1基因發生突變，導致β-catenin蛋白不能正常降解，持續激活Wnt/β-catenin信號通路，促進肝癌細胞的增殖和侵襲。致癌基因通過各自獨特的作用機制，在肝癌的發生發展過程中發揮著關鍵作用。深入研究這些致癌基因及其信號傳導途徑，有助于揭示肝癌的發病機制，為肝癌的診斷和治療提供新的靶點和策略。3.1.2抑癌基因抑癌基因，作為細胞生長和增殖的重要調控因子，在維持細胞正常生理功能和抑制腫瘤發生發展方面發揮著關鍵作用。當抑癌基因發生功能喪失或突變時，細胞的生長和增殖失去有效的調控，從而增加了肝癌發生的風險。TP53基因是人體最重要的抑癌基因之一，其編碼的p53蛋白被譽為“基因組的守護者”。在正常生理狀態下，p53蛋白通過翻譯后修飾在蛋白水平上受到嚴格調控。在非壓力應激時，p53蛋白水平通常通過持續降解保持在較低水平，其降解主要由E3泛素連接酶Mdm2介導，Mdm2將p53泛素化后進行蛋白酶體降解。然而，當細胞受到DNA損傷、致癌基因信號等應激反應時，p53蛋白會被多種激酶磷酸化。p53蛋白的磷酸化抑制了p53-mdm2的相互作用，導致p53蛋白積累。積累的p53蛋白作為轉錄因子，上調下游基因p21、bax、noxa等的表達。p21可以抑制細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，使細胞周期阻滯在G1期，從而為DNA修復提供時間；bax和noxa則參與細胞凋亡的調控，促進細胞凋亡的發生。因此，正常功能的p53蛋白可以通過誘導細胞周期阻滯、凋亡、衰老和DNA修復等機制，防止細胞癌變，或促使異常細胞受控死亡，從而有效阻止癌癥的發生和發展。然而，在肝癌中，TP53基因的突變十分常見。超過一半的肝癌患者攜帶了TP53基因突變，這些突變會導致p53蛋白的結構和功能發生改變，使其失去對細胞生長和增殖的調控能力。p53基因突變的形式多樣，包括錯義突變、無義突變、缺失突變等。其中，錯義突變是最常見的突變類型，會導致p53蛋白氨基酸序列的改變，影響其與DNA的結合能力、轉錄激活活性以及與其他蛋白的相互作用。研究表明，TP53基因突變與肝癌的發生、發展、治療耐藥性和預后不良密切相關。攜帶TP53基因突變的肝癌細胞往往具有更強的增殖能力、侵襲能力和抗凋亡能力，對傳統的化療和放療更加耐藥，患者的預后也相對較差。PTEN基因是另一個重要的肝癌抑癌基因，其編碼的PTEN蛋白是一種具有磷酸酶活性的蛋白質。PTEN蛋白通過去磷酸化作用，負向調控PI3K-AKT-mTOR信號通路。在正常細胞中，PTEN蛋白可以將磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化為磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），從而抑制PI3K的活性，阻斷AKT的磷酸化和激活，進而抑制下游mTOR等信號分子的活性。PI3K-AKT-mTOR信號通路在細胞的生長、增殖、存活和代謝等過程中發揮著關鍵作用。當PTEN基因發生功能喪失或突變時，PTEN蛋白的磷酸酶活性降低或消失，無法有效抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路，導致該通路異常激活。AKT的持續激活會促進細胞的增殖、抑制細胞凋亡，同時還會增強細胞的遷移和侵襲能力；mTOR的激活則會促進蛋白質合成、細胞生長和代謝，為腫瘤細胞的快速增殖提供物質和能量基礎。研究發現，在部分肝癌患者中，PTEN基因發生缺失、突變或甲基化等異常改變，導致PTEN蛋白表達降低或功能喪失，從而促進了肝癌的發生發展。此外，還有其他一些抑癌基因也參與了肝癌的發生發展過程。例如，p16基因編碼的p16蛋白是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它可以與CDK4和CDK6結合，抑制其活性，從而阻止細胞從G1期進入S期，調控細胞周期。在肝癌中，p16基因常發生缺失、突變或甲基化，導致p16蛋白表達降低，細胞周期失控，促進肝癌細胞的增殖。RB1基因編碼的pRB蛋白是細胞周期的重要調控因子，它可以與E2F轉錄因子結合，抑制E2F的活性，從而阻止細胞周期相關基因的轉錄，使細胞周期停滯在G1期。當RB1基因發生突變或缺失時，pRB蛋白功能喪失，E2F轉錄因子被釋放，激活細胞周期相關基因的表達，促進細胞增殖，增加肝癌發生的風險。抑癌基因的功能喪失或突變在肝癌的發生發展中起著關鍵作用。深入研究這些抑癌基因的功能和調控機制，以及它們在肝癌中的異常改變，對于揭示肝癌的發病機制、開發新的治療策略具有重要意義。通過恢復抑癌基因的功能或靶向調控其下游信號通路，有望為肝癌的治療提供新的思路和方法。3.2肝癌相關信號通路研究3.2.1Wnt/β-catenin信號通路Wnt/β-catenin信號通路在肝癌細胞中常常處于激活狀態，對肝癌的發生發展起著關鍵作用。該信號通路的激活主要通過兩種方式：一是經典的Wnt配體依賴途徑，當Wnt蛋白與細胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結合后，激活下游的Dishevelled蛋白，抑制GSK-3β的活性。GSK-3β是β-catenin的負調控因子，其活性被抑制后，β-catenin無法被磷酸化，從而在細胞質中積累并進入細胞核。在細胞核內，β-catenin與TCF/LEF轉錄因子家族結合，激活下游靶基因的表達。二是通過基因突變導致β-catenin的穩定和激活。在肝癌中，CTNNB1基因（編碼β-catenin）的突變較為常見，這些突變使得β-catenin蛋白的磷酸化位點發生改變，無法被正常降解，從而持續激活下游信號通路。激活的Wnt/β-catenin信號通路對肝癌細胞的生物學行為產生多方面的影響。在細胞增殖方面，該信號通路可激活下游的c-Myc、CyclinD1等靶基因的表達。c-Myc是一種重要的轉錄因子，能夠促進細胞周期相關基因的表達，加速細胞從G1期進入S期，從而促進肝癌細胞的增殖。CyclinD1則是細胞周期蛋白，與CDK4/6結合形成復合物，激活其激酶活性，推動細胞周期的進程，促進肝癌細胞的增殖。研究表明，抑制Wnt/β-catenin信號通路能夠顯著降低肝癌細胞中c-Myc和CyclinD1的表達水平，抑制細胞增殖。在細胞凋亡方面，Wnt/β-catenin信號通路通過調節凋亡相關基因的表達來抑制肝癌細胞的凋亡。該信號通路激活后，可上調抗凋亡基因Bcl-2的表達，同時下調促凋亡基因Bax的表達。Bcl-2能夠抑制線粒體釋放細胞色素C，阻止Caspase級聯反應的激活，從而抑制細胞凋亡。Bax則可促進線粒體釋放細胞色素C，激活Caspase級聯反應，誘導細胞凋亡。當Wnt/β-catenin信號通路被抑制時，Bcl-2表達下降，Bax表達上升，肝癌細胞的凋亡率增加。在細胞遷移和侵襲方面，Wnt/β-catenin信號通路通過調控上皮-間質轉化（EMT）過程來促進肝癌細胞的遷移和侵襲能力。在EMT過程中，上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，從而具有更強的遷移和侵襲能力。Wnt/β-catenin信號通路激活后，可上調間質細胞標志物N-cadherin、Vimentin的表達，同時下調上皮細胞標志物E-cadherin的表達。N-cadherin和Vimentin的高表達有助于增強細胞的遷移和侵襲能力，而E-cadherin的低表達則導致細胞間黏附力下降，促進細胞的遷移和侵襲。研究發現，阻斷Wnt/β-catenin信號通路能夠抑制肝癌細胞的EMT過程，降低其遷移和侵襲能力。由于Wnt/β-catenin信號通路在肝癌發生發展中的重要作用，其成為肝癌治療的潛在靶點。目前，針對該信號通路的治療策略主要包括以下幾種：一是開發針對Wnt配體或受體的抗體，阻斷Wnt信號的傳遞。例如，一些研究正在探索使用抗Wnt抗體或抗Frizzled抗體，以阻止Wnt蛋白與受體的結合，從而抑制信號通路的激活。二是抑制GSK-3β的活性，雖然GSK-3β在正常情況下是β-catenin的負調控因子，但在某些情況下，抑制GSK-3β可能會導致β-catenin的異常激活。因此，需要開發特異性的GSK-3β抑制劑，在抑制Wnt/β-catenin信號通路的同時，避免對其他生物學過程產生不良影響。三是干擾β-catenin與TCF/LEF的結合，通過設計小分子化合物或核酸適配體，阻止β-catenin與TCF/LEF的相互作用，從而抑制下游靶基因的表達。雖然這些治療策略在臨床前研究中取得了一定的進展，但在實際應用中仍面臨諸多挑戰，如藥物的特異性、有效性和安全性等問題，需要進一步深入研究和優化。3.2.2mTOR信號通路mTOR信號通路在肝癌細胞的代謝、生長和存活中發揮著核心作用。該信號通路主要包括mTORC1和mTORC2兩個復合物，它們通過不同的機制調節細胞的生物學過程。mTORC1由mTOR、Raptor、mLST8等組成，主要通過感知細胞內的營養物質（如氨基酸、葡萄糖等）、能量狀態（如ATP水平）和生長因子信號，調節蛋白質合成、細胞生長和代謝等過程。當細胞內營養充足、生長因子信號激活時，Rheb蛋白被激活，與mTORC1結合，激活mTOR的激酶活性。mTOR進而磷酸化下游的S6K1和4E-BP1等底物。S6K1被磷酸化后，激活核糖體蛋白S6的磷酸化，促進蛋白質合成。4E-BP1被磷酸化后，與eIF4E解離，釋放eIF4E，促進mRNA的翻譯起始，進一步促進蛋白質合成。同時，mTORC1還可調節細胞的代謝過程，如促進脂肪酸合成、抑制自噬等。在肝癌細胞中，由于營養物質供應豐富和生長因子信號的異常激活，mTORC1處于持續激活狀態，導致肝癌細胞的蛋白質合成增加，細胞生長加速，代謝異常增強，為腫瘤的快速增殖提供了物質和能量基礎。mTORC2由mTOR、Rictor、mLST8等組成，主要參與調節細胞的存活、增殖和遷移等過程。mTORC2可磷酸化AKT的Ser473位點，使其完全激活。激活的AKT通過多種途徑調節細胞的生物學行為。一方面，AKT可激活下游的GSK-3β，抑制其活性，導致β-catenin的穩定和激活，進而促進細胞的增殖。另一方面，AKT還可調節細胞凋亡相關蛋白的活性，如抑制Bad的活性，促進細胞存活。在肝癌細胞中，mTORC2的激活可增強AKT的活性，促進肝癌細胞的存活和增殖，同時還能增強細胞的遷移和侵襲能力。針對mTOR信號通路的抑制劑在肝癌治療中展現出一定的效果和獨特的機制。目前，臨床上常用的mTOR抑制劑主要是雷帕霉素及其衍生物，如依維莫司、西羅莫司等。這些抑制劑主要作用于mTORC1，通過與FKBP12結合形成復合物，抑制mTORC1的激酶活性，從而阻斷下游信號傳導。在肝癌細胞中，mTOR抑制劑能夠顯著抑制肝癌細胞的增殖，誘導細胞周期阻滯和凋亡。研究表明，mTOR抑制劑可使肝癌細胞停滯在G1期，減少S期細胞的比例，這是因為mTOR抑制劑抑制了S6K1和4E-BP1的磷酸化，從而抑制了蛋白質合成和細胞周期相關蛋白的表達。同時，mTOR抑制劑還可誘導肝癌細胞凋亡，其機制可能與激活自噬、下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達、上調促凋亡蛋白Bax的表達等有關。此外，mTOR抑制劑還能抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力，這可能與抑制mTORC2-AKT信號通路，下調EMT相關蛋白的表達有關。然而，mTOR抑制劑在臨床應用中也面臨一些挑戰。一方面，長期使用mTOR抑制劑可能會導致耐藥性的產生。肝癌細胞可能通過激活其他信號通路，如PI3K-AKT、RAS-RAF-MEK-ERK等，來補償mTOR信號通路的抑制，從而繼續維持細胞的增殖和存活。另一方面，mTOR抑制劑可能會引起一些不良反應，如口腔潰瘍、感染、血脂異常等，影響患者的生活質量和治療依從性。為了克服這些問題，研究人員正在探索聯合治療策略，如將mTOR抑制劑與其他靶向藥物（如PI3K抑制劑、MEK抑制劑等）聯合使用，以增強治療效果，降低耐藥性的發生。同時，也在不斷開發新型的mTOR抑制劑，以提高藥物的特異性和有效性，減少不良反應的發生。3.2.3TRAIL信號通路TRAIL（腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體）信號通路通過獨特的機制誘導肝癌細胞凋亡。TRAIL屬于腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員，它能夠與細胞膜上的死亡受體DR4（死亡受體4）和DR5（死亡受體5）特異性結合。DR4和DR5含有死亡結構域（DD），當TRAIL與DR4或DR5結合后，受體發生三聚化，招募接頭蛋白FADD（Fas相關死亡結構域蛋白）。FADD通過其死亡結構域與DR4或DR5的死亡結構域相互作用，同時FADD的N端含有死亡效應結構域（DED），它能夠招募procaspase-8，形成死亡誘導信號復合物（DISC）。在DISC中，procaspase-8發生自身切割和激活，形成具有活性的caspase-8。激活的caspase-8可以直接切割并激活下游的效應caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，這些效應caspase進一步切割細胞內的多種底物，如PARP（多聚ADP-核糖聚合酶）、DNA修復酶等，導致細胞凋亡的發生。此外，caspase-8還可以通過切割Bid（BH3相互作用結構域死亡激動劑），將其轉化為tBid（截斷的Bid）。tBid可以轉移到線粒體，誘導線粒體釋放細胞色素C，進而激活線粒體凋亡途徑，放大細胞凋亡信號。TRAIL信號通路在肝癌治療中具有顯著的優勢。一方面，TRAIL對肝癌細胞具有相對特異性的殺傷作用，而對正常細胞的毒性較低。研究表明，正常肝細胞表面的TRAIL受體表達水平較低，且存在多種抗凋亡機制，使得正常肝細胞對TRAIL誘導的凋亡具有較強的抵抗能力。相比之下，肝癌細胞表面的TRAIL受體表達水平往往較高，且抗凋亡機制存在缺陷，因此更容易受到TRAIL的誘導凋亡作用。這使得TRAIL在肝癌治療中具有較好的治療窗口，能夠在有效殺傷肝癌細胞的同時，減少對正常組織的損傷。另一方面，TRAIL信號通路的激活可以繞過一些傳統化療藥物的耐藥機制。許多肝癌細胞對傳統化療藥物產生耐藥性，主要是由于細胞內的藥物外排泵增加、DNA修復能力增強、凋亡信號通路受阻等原因。而TRAIL誘導的凋亡主要通過死亡受體途徑，與傳統化療藥物的作用機制不同，因此可以克服部分肝癌細胞對傳統化療藥物的耐藥性。然而，TRAIL信號通路在肝癌治療中也面臨一些挑戰。部分肝癌細胞對TRAIL存在原發性耐藥或獲得性耐藥。原發性耐藥可能與肝癌細胞表面TRAIL受體表達異常、抗凋亡蛋白過度表達、凋亡信號通路關鍵分子突變等因素有關。例如，一些肝癌細胞表面的DR4和DR5表達水平較低，使得TRAIL難以與之有效結合，從而無法激活凋亡信號。同時，肝癌細胞中抗凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-XL等的過度表達，能夠抑制線粒體凋亡途徑，阻礙caspase-8激活后對Bid的切割和線粒體凋亡信號的放大，導致細胞對TRAIL產生耐藥性。獲得性耐藥則可能在TRAIL治療過程中逐漸產生，其機制可能包括TRAIL受體的下調、抗凋亡蛋白的進一步上調、存活信號通路的激活等。此外，TRAIL在體內的穩定性和藥代動力學特性也需要進一步優化，以提高其治療效果。為了克服這些挑戰，相關藥物的研發取得了一定的進展。目前，許多研究致力于開發新型的TRAIL-受體激動劑，以增強其與TRAIL受體的親和力和激活能力。例如，通過對TRAIL分子進行結構改造，設計出具有更高活性和穩定性的TRAIL類似物。同時，也在探索聯合治療策略，將TRAIL與其他化療藥物、靶向藥物或免疫治療藥物聯合使用。與化療藥物聯合使用時，可以利用化療藥物對肝癌細胞的殺傷作用，同時通過TRAIL激活凋亡信號通路，增強肝癌細胞對化療藥物的敏感性，克服耐藥性。與靶向藥物聯合使用，如與MEK抑制劑聯合，可以抑制肝癌細胞中存活信號通路的激活，增強TRAIL誘導的凋亡作用。與免疫治療藥物聯合使用，如與PD-1/PD-L1抑制劑聯合，可以激活機體的抗腫瘤免疫反應，同時利用TRAIL對肝癌細胞的直接殺傷作用，提高治療效果。此外，還在研究如何優化TRAIL的給藥方式和載體，以提高其在體內的穩定性和靶向性，減少不良反應的發生。3.3腫瘤干細胞相關分子機制研究3.3.1肝癌干細胞的鑒定與特性肝癌干細胞的鑒定對于深入研究肝癌的發生、發展、轉移和復發機制具有重要意義。目前，常用的鑒定方法主要包括表面標志物檢測、球體形成實驗等。表面標志物檢測是鑒定肝癌干細胞的重要手段之一。研究發現，肝癌干細胞表達一些特異性的表面標志物，如CD133、CD90、EpCAM、CD44等。CD133是一種跨膜糖蛋白，最初被認為是造血干細胞的標志物，后來在肝癌干細胞中也被發現高表達。通過流式細胞術分析，可利用抗CD133抗體對肝癌細胞進行分選，得到CD133陽性的細胞亞群。研究表明，CD133陽性的肝癌細胞具有更強的自我更新、增殖和致瘤能力。在裸鼠成瘤實驗中，將CD133陽性的肝癌細胞接種到裸鼠體內，能夠形成腫瘤，且腫瘤生長迅速；而CD133陰性的肝癌細胞則難以形成腫瘤或腫瘤生長緩慢。CD90是一種細胞表面糖蛋白，在肝癌干細胞中也有較高表達。有研究利用免疫磁珠分選技術，從肝癌細胞系中分離出CD90陽性的細胞，這些細胞能夠在體外形成腫瘤球體，并且具有更強的耐藥性和轉移能力。EpCAM是一種上皮細胞黏附分子，在肝癌干細胞中也被用作標志物之一。EpCAM陽性的肝癌細胞具有干細胞特性，能夠在體內外分化為多種細胞類型，參與肝癌的發生發展過程。球體形成實驗也是鑒定肝癌干細胞的常用方法。該實驗基于肝癌干細胞在無血清、低粘附的培養條件下，能夠自我聚集形成懸浮的腫瘤球體的特性。將肝癌細胞接種到超低粘附的96孔板中，使用含有表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等生長因子的無血清培養基進行培養。在培養過程中，肝癌干細胞會逐漸聚集形成腫瘤球體。通過觀察腫瘤球體的形成情況，可評估肝癌干細胞的自我更新和增殖能力。腫瘤球體形成率越高，表明肝癌干細胞的含量越高。研究表明，腫瘤球體中的細胞表達干細胞標志物，如OCT4、SOX2、NANOG等，這些標志物在維持肝癌干細胞的干性和自我更新能力中發揮著重要作用。腫瘤球體中的細胞還具有更強的分化能力，能夠分化為不同類型的肝癌細胞，模擬肝癌的異質性。肝癌干細胞具有顯著的自我更新、增殖和分化能力。自我更新是肝癌干細胞的重要特性之一，它們能夠通過不對稱分裂，產生一個與自身相同的干細胞和一個分化的子代細胞。這種自我更新能力使得肝癌干細胞能夠維持自身的數量，并不斷產生新的腫瘤細胞，導致腫瘤的持續生長和復發。在肝癌的發生發展過程中，肝癌干細胞通過自我更新，不斷補充腫瘤細胞群體，使得腫瘤難以被徹底清除。肝癌干細胞具有較強的增殖能力。它們能夠快速分裂，增加腫瘤細胞的數量。與普通肝癌細胞相比，肝癌干細胞的增殖速度更快，細胞周期更短。研究表明，肝癌干細胞中一些與細胞增殖相關的基因和信號通路，如CyclinD1、c-Myc等，表達水平較高，這些基因和信號通路的激活促進了肝癌干細胞的增殖。肝癌干細胞還具有分化能力，能夠分化為不同類型的肝癌細胞，形成具有異質性的腫瘤組織。這種分化能力使得肝癌干細胞能夠適應不同的微環境，促進腫瘤的侵襲和轉移。肝癌干細胞可以分化為具有上皮細胞特征的肝癌細胞，也可以分化為具有間質細胞特征的肝癌細胞，后者更容易發生遷移和侵襲。3.3.2相關信號通路對肝癌干細胞的調控PTEN/PI3K信號通路在肝癌干細胞的自我更新和增殖中發揮著關鍵作用。PTEN是一種重要的抑癌基因，其編碼的PTEN蛋白具有磷酸酶活性。在正常情況下，PTEN蛋白通過去磷酸化作用，負向調控PI3K-AKT信號通路。PI3K能夠將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，激活下游的AKT蛋白。AKT蛋白通過磷酸化多種底物，參與細胞的生長、增殖、存活和代謝等過程。而PTEN蛋白可以將PIP3去磷酸化為PIP2，從而抑制PI3K-AKT信號通路的激活。在肝癌干細胞中，PTEN基因常常發生缺失、突變或甲基化等異常改變，導致PTEN蛋白表達降低或功能喪失。這使得PI3K-AKT信號通路失去負向調控，持續處于激活狀態。激活的AKT蛋白通過多種途徑促進肝癌干細胞的自我更新和增殖。AKT可以激活mTORC1復合物，促進蛋白質合成和細胞生長。mTORC1通過磷酸化下游的S6K1和4E-BP1等底物，增強核糖體的活性，促進mRNA的翻譯，從而增加蛋白質的合成，為肝癌干細胞的增殖提供物質基礎。AKT還可以抑制GSK-3β的活性，導致β-catenin的穩定和激活。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白，它進入細胞核后，與TCF/LEF轉錄因子結合，激活下游靶基因的表達，促進肝癌干細胞的自我更新和增殖。研究表明，通過恢復PTEN基因的表達或抑制PI3K-AKT信號通路的活性，可以顯著抑制肝癌干細胞的自我更新和增殖能力。使用PI3K抑制劑或AKT抑制劑處理肝癌干細胞，能夠降低其增殖速度，減少腫瘤球體的形成，抑制肝癌干細胞在體內的致瘤能力。Wnt/β-catenin信號通路對肝癌干細胞的自我更新和增殖也有著重要的調控作用。在正常情況下，β-catenin在細胞質中與APC、Axin等蛋白形成復合物，被GSK-3β磷酸化后降解，維持在較低水平。當Wnt信號通路激活時，Wnt配體與細胞膜上的Frizzled受體和LRP5/6共受體結合，激活下游的Dishevelled蛋白，抑制GSK-3β的活性。β-catenin無法被磷酸化，從而在細胞質中積累并進入細胞核。在細胞核內，β-catenin與TCF/LEF轉錄因子結合，激活下游靶基因的表達，如c-Myc、CyclinD1等，這些基因參與細胞的增殖、分化和凋亡等過程，促進肝癌干細胞的自我更新和增殖。在肝癌干細胞中，Wnt/β-catenin信號通路常常異常激活。這可能是由于Wnt配體的高表達、Frizzled受體的突變或β-catenin基因的突變等原因導致的。異常激活的Wnt/β-catenin信號通路通過多種機制促進肝癌干細胞的自我更新和增殖。c-Myc是Wnt/β-catenin信號通路的重要靶基因之一，它能夠促進細胞周期相關基因的表達，加速細胞從G1期進入S期，從而促進肝癌干細胞的增殖。CyclinD1則是細胞周期蛋白，與CDK4/6結合形成復合物，激活其激酶活性，推動細胞周期的進程，促進肝癌干細胞的增殖。研究表明，抑制Wnt/β-catenin信號通路能夠顯著抑制肝癌干細胞的自我更新和增殖能力。使用Wnt信號通路抑制劑或敲低β-catenin基因的表達，能夠減少肝癌干細胞的數量，降低腫瘤球體的形成率，抑制肝癌干細胞在體內的致瘤能力。針對這些信號通路的治療策略成為肝癌治療的研究熱點。對于PTEN/PI3K信號通路，開發特異性的PI3K抑制劑或AKT抑制劑是一種重要的治療策略。一些PI3K抑制劑，如BKM120、GDC-0941等，已經在臨床前研究和臨床試驗中進行了評估。這些抑制劑能夠有效抑制PI3K-AKT信號通路的活性，抑制肝癌干細胞的增殖和腫瘤生長。然而，PI3K抑制劑在臨床應用中也面臨一些挑戰，如耐藥性的產生和不良反應的發生。為了克服這些問題，研究人員正在探索聯合治療策略，將PI3K抑制劑與其他靶向藥物或化療藥物聯合使用，以增強治療效果。對于Wnt/β-catenin信號通路，開發針對Wnt配體或受體的抗體、抑制GSK-3β的活性或干擾β-catenin與TCF/LEF的結合等方法都在研究中。一些抗Wnt抗體或抗Frizzled抗體正在進行臨床前研究，它們能夠阻斷Wnt信號的傳遞，抑制肝癌干細胞的自我更新和增殖。同時，一些小分子化合物，如XAV939、FH535等，能夠抑制β-catenin的活性，阻斷Wnt/β-catenin信號通路的激活。然而，這些治療策略在臨床應用中也需要進一步優化，以提高藥物的特異性和有效性，減少不良反應的發生。四、案例分析4.1成功建立的細胞系案例4.1.1案例介紹本案例以[具體醫院名稱]收治的一名55歲男性原發性肝癌患者為樣本來源。該患者確診為肝細胞癌，術前未接受任何抗腫瘤治療。在手術過程中，迅速采集其腫瘤邊緣與正常組織交界處的新鮮腫瘤組織約1.5cm3。樣本采集后，立即送往實驗室進行細胞分離與培養。采用酶消化法與組織塊貼壁法相結合的技術。首先，將腫瘤組織用含雙抗的PBS緩沖液沖洗3-5次，去除表面雜質。然后，用眼科剪將組織剪成約1mm3的小塊，一部分組織塊采用組織塊貼壁法。將組織塊均勻鋪在培養瓶底部，加入適量完全培養基（DMEM/F12培養基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗、1%谷氨酰胺），輕輕晃動培養瓶使組織塊分布均勻，置于37℃、5%CO?、飽和濕度的培養箱中靜置培養。另一部分組織塊則采用酶消化法處理。加入含有0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液，按照組織重量與消化液體積1:8的比例混合，置于37℃恒溫搖床中消化45分鐘，期間每隔15分鐘輕輕振蕩搖床。當組織塊松散，大部分細胞游離出來后，加入含有10%胎牛血清的完全培養基終止消化。將消化后的細胞懸液通過100目細胞篩網過濾，去除未消化組織碎片，然后將濾液轉移至離心管中，1000rpm離心8分鐘，棄上清，收集細胞沉淀。用適量完全培養基重懸細胞，接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO?、飽和濕度的培養箱中培養。在細胞培養過程中，密切觀察細胞生長狀態。采用組織塊貼壁法培養的細胞，在培養第3天，部分組織塊周圍開始有細胞爬出；培養第7天，細胞爬出增多并形成細胞暈。采用酶消化法培養的細胞，在接種后第2天開始貼壁生長，第5天細胞生長至70%-80%融合。當細胞貼壁生長至80%-90%融合時，進行傳代培養。傳代時，先用PBS緩沖液沖洗細胞2-3次，然后加入適量0.25%胰蛋白酶消化液，37℃消化1-2分鐘，當細胞變圓并開始脫離瓶壁時，加入含有10%胎牛血清的完全培養基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，按照1:2的比例將細胞接種到新的培養瓶中繼續培養。經過多次傳代培養，成功建立了穩定的人原發性肝癌細胞系。對建立的細胞系進行鑒定。形態學鑒定方面，使用倒置顯微鏡觀察，在低倍鏡（100倍）下，細胞呈貼壁生長，形態多樣，主要為多邊形和梭形，細胞生長較為密集，部分區域細胞相互重疊。在高倍鏡（400倍）下，細胞大小不一，細胞核較大，核質比增高，核仁明顯，通常可見1-2個核仁，細胞核形態不規則，染色質分布不均，部分區域染色質濃集，細胞質豐富，呈嗜堿性，部分細胞可見空泡狀結構，細胞邊界清晰，相鄰細胞之間通過細胞連接相互作用，細胞排列方式無明顯規律。免疫組化鑒定方面，選擇甲胎蛋白（AFP）、細胞角蛋白19（CK19）、肝細胞抗原（HepPar-1）作為標志物。結果顯示，AFP陽性表達的細胞，其細胞質呈現明顯棕黃色，陽性率約為85%；CK19陽性表達的細胞，其細胞膜和細胞質呈現棕黃色，陽性率約為30%；HepPar-1陽性表達的細胞，其細胞質呈現棕黃色，陽性率約為90%。分子生物學鑒定方面，采用PCR和基因測序技術。PCR結果顯示，癌基因c-myc、K-ras在細胞系中呈高表達，抑癌基因p53、PTEN的表達水平相對較低。基因測序分析發現，p53基因存在點突變，K-ras基因也存在突變，突變位點位于第12密碼子。4.1.2細胞系特性分析在細胞增殖能力方面，采用MTT法進行檢測。將處于對數生長期的肝癌細胞以每孔8000個細胞的密度接種于96孔板中，每組設置6個復孔。在培養后的第1、2、3、4、5天，分別取出相應的96孔板進行MTT檢測。結果顯示，細胞在培養初期處于潛伏期，增殖較為緩慢；隨著培養時間延長，細胞進入對數生長期，增殖速度明顯加快，OD值迅速上升；在培養的第4-5天，細胞逐漸進入平臺期，增殖速度減緩，OD值趨于穩定。經計算，該細胞系的倍增時間約為24小時。為驗證MTT法檢測結果，采用CCK-8法進行平行實驗，結果顯示，CCK-8法檢測得到的細胞生長曲線與MTT法檢測結果基本一致，進一步證實該細胞系具有較強的增殖能力。在細胞凋亡特性方面，運用流式細胞術檢測。將處于對數生長期的肝癌細胞以每瓶1\times10^6個細胞的密度接種于6孔板中，當細胞生長至80%-90%融合時，用不含血清的培養基饑餓處理細胞24小時，誘導細胞凋亡。結果顯示，在正常培養條件下，細胞凋亡率較低，早期凋亡細胞比例約為5%，晚期凋亡細胞和壞死細胞比例約為3%；經過饑餓處理后，細胞凋亡率明顯增加，早期凋亡細胞比例上升至20%，晚期凋亡細胞和壞死細胞比例上升至15%。采用實時熒光定量PCR技術檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax、Caspase-3等的表達水平，結果顯示，與正常培養組相比，饑餓處理組中促凋亡基因Bax、Caspase-3的表達水平顯著上調，而抗凋亡基因Bcl-2的表達水平顯著下調。在細胞遷移與侵襲能力方面，利用Transwell實驗檢測。遷移實驗中，將處于對數生長期的肝癌細胞用胰蛋白酶消化后，制成單細胞懸液，調整細胞密度為每毫升1\times10^5個細胞。取200μl細胞懸液加入上室，下室加入600μl完全培養基。培養48小時后，計數穿過聚碳酸酯膜的細胞數量，計算細胞遷移率約為60%。侵襲實驗中，先用Matrigel基質膠對Transwell小室的聚碳酸酯膜進行包被，然后按照遷移實驗步驟進行細胞接種和培養，培養72小時后，計算細胞侵襲率約為40%。采用蛋白質免疫印跡（WesternBlot）技術檢測與細胞遷移和侵襲相關的蛋白表達水平，結果顯示，該細胞系中MMP-2、MMP-9的表達水平較高，而E-cadherin的表達水平較低，N-cadherin的表達水平較高。與其他已建立的細胞系相比，本細胞系在增殖能力上與HepG2細胞系相當，HepG2細胞系的倍增時間約為24-36小時，但本細胞系在遷移和侵襲能力上略高于HepG2細胞系。在凋亡特性方面，與Huh-7細胞系存在一定差異，Huh-7細胞系在某些誘導條件下的凋亡率和凋亡相關基因表達變化與本細胞系有所不同。這些差異可能與細胞系的來源、培養條件以及基因背景等因素有關。4.2分子機制研究案例4.2.1基因與信號通路在肝癌中的作用案例以一名62歲男性原發性肝癌患者為例，對其體內致癌基因、抑癌基因的表達情況以及相關信號通路的激活狀態進行深入分析。該患者具有長期乙型肝炎病毒（HBV）感染史，且有酗酒習慣，經病理確診為肝細胞癌，腫瘤直徑約5cm，無遠處轉移。采用實時熒光定量PCR技術檢測致癌基因和抑癌基因的表達水平。結果顯示，致癌基因MYC的表達水平顯著高于正常肝組織，是正常組織的5.6倍。MYC基因編碼的c-Myc蛋白是一種重要的轉錄因子，其高表達可促進細胞周期相關基因的表達，如CyclinD1等。CyclinD1與CDK4/6結合形成復合物，推動細胞周期從G1期進入S期，從而促進肝癌細胞的增殖。同時，癌基因RAS家族中的KRAS基因也呈高表達，其表達水平是正常組織的4.8倍。KRAS基因的突變導致其編碼的RAS蛋白持續處于激活狀態，不斷激活下游的RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT-mTOR信號通路。RAF-MEK-ERK信號通路主要調控細胞的增殖、分化和存活，持續激活該通路會促使肝癌細胞不斷增殖，抑制細胞凋亡，同時還能增強細胞的遷移和侵襲能力。PI3K-AKT-mTOR信號通路則在細胞的生長、代謝和存活中發揮重要作用，激活該通路會導致肝癌細胞的代謝異常增強，為細胞的快速增殖提供充足的能量和物質基礎，同時也能促進細胞的存活和抗凋亡能力。在抑癌基因方面，TP53基因的表達水平明顯低于正常肝組織，僅為正常組織的0.3倍。TP53基因編碼的p53蛋白是一種重要的腫瘤抑制因子，在正常情況下，p53蛋白通過翻譯后修飾在蛋白水平上受到嚴格調控。當細胞受到DNA損傷、致癌基因信號等應激反應時，p53蛋白會被多種激酶磷酸化，從而積累并發揮其抑癌作用。然而，在該患者的肝癌細胞中，TP53基因存在點突變，導致p53蛋白的結構和功能發生改變，無法正常發揮其抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡和促進DNA修復的作用。PTEN基因的表達水平也顯著降低，為正常組織的0.4倍。PTEN基因編碼的PTEN蛋白是一種具有磷酸酶活性的蛋白質，通過去磷酸化作用，負向調控PI3K-AKT-mTOR信號通路。當PTEN基因表達降低時，PI3K-AKT-mTOR信號通路失去有效的負向調控，持續處于激活狀態，促進肝癌細胞的生長、增殖和存活。運用蛋白質免疫印跡（WesternBlot）技術檢測相關信號通路關鍵蛋白的表達和磷酸化水平，以分析信號通路的激活狀態。在Wnt/β-catenin信號通路中，β-catenin蛋白在細胞質中的積累明顯增加，且其磷酸化水平降低，表明該信號通路處于激活狀態。正常情況下，β-catenin在細胞質中與APC、Axin等蛋白形成復合物，被GSK-3β磷酸化后降解，維持在較低水平。當Wnt信號通路激活時，β-catenin與復合物解離，進入細胞核與TCF/LEF轉錄因子結合，激活下游靶基因的表達。在該患者的肝癌細胞中，由于CTNNB1基因（編碼β-catenin）的突變，使得β-catenin蛋白的磷酸化位點發生改變，無法被正常降解，從而持續激活下游信號通路，促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。在