乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的多維度影響及機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1動(dòng)脈粥樣硬化的危害與研究現(xiàn)狀動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的慢性血管疾病，其特征為動(dòng)脈血管內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，形成粥樣硬化斑塊，導(dǎo)致血管狹窄和血流減少。這種疾病主要累及大型肌性動(dòng)脈，如主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈，可引發(fā)許多嚴(yán)重的健康問題，如心臟病、腦卒中和外周血管疾病等，已成為全球范圍內(nèi)致病率和致死率居高不下的主要原因之一。在我國，隨著人口老齡化和生活方式的改變，動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。盡管目前對動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，但尚未完全明確。已知?jiǎng)用}粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素，包括遺傳、炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血脂異常等。遺傳因素中，許多基因如APOE、IL-6、TNF-α等被發(fā)現(xiàn)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，這些基因的變異可影響脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)和血管損傷修復(fù)等功能，進(jìn)而增加發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病。在其發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞可分泌多種炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），這些介質(zhì)會(huì)促進(jìn)斑塊的形成和進(jìn)展。內(nèi)皮細(xì)胞作為血管壁的第一道防線，具有重要的屏障功能，但高血壓、高血脂、吸煙和糖尿病等眾多危險(xiǎn)因素，都可能損傷內(nèi)皮細(xì)胞，使其功能失調(diào)，從而增加動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病幾率。血脂異常，尤其是高膽固醇血癥，是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素，其中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平升高可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。當(dāng)前，針對動(dòng)脈粥樣硬化的治療手段主要包括藥物治療、飲食療法和運(yùn)動(dòng)療法等。藥物治療是重要手段，他汀類藥物可降低血脂水平，抗血小板藥物可預(yù)防血栓形成，β受體阻滯劑可降低心肌耗氧量、減輕心臟負(fù)擔(dān)。飲食療法是預(yù)防和治療的基礎(chǔ)措施，通過減少高脂肪、高膽固醇和高糖食物的攝入，增加水果、蔬菜和全谷物食物的攝入，可降低血脂水平，減少發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。運(yùn)動(dòng)療法則可改善血液循環(huán)，增強(qiáng)心血管功能，預(yù)防和延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。然而，現(xiàn)有的治療方法仍存在一定的局限性，藥物治療可能會(huì)帶來副作用，且部分患者對藥物的耐受性和依從性較差；飲食和運(yùn)動(dòng)療法雖有一定效果，但難以完全控制病情的發(fā)展。因此，深入研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，尋找新的防治方法具有迫切的現(xiàn)實(shí)需求。1.1.2乳酸桿菌的特性與應(yīng)用前景乳酸桿菌是一群桿狀或球狀的革蘭氏陽性菌，其DNA中G+C含量低于55%，可發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸，因此而得名。乳酸桿菌在自然界中分布廣泛，是動(dòng)物和人腸道等處重要的生理性菌群之一。其生物學(xué)特性表現(xiàn)為無芽孢的桿菌，在光學(xué)顯微鏡下常呈單個(gè)、成雙或短鏈狀排布。乳酸桿菌具有多種生理功能。在阻止病原菌對腸道的入侵和定植方面，它能夠通過競爭黏附位點(diǎn)和產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式，抵御外來致病菌的入侵，保護(hù)人體腸道健康。在抑制病原菌、抗感染方面，乳酸桿菌可以分泌細(xì)菌素、過氧化氫等物質(zhì)，抑制有害菌的生長繁殖，增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力。維持腸道的微生態(tài)平衡是乳酸桿菌的重要功能之一，它能調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌的生長，抑制有害菌的過度繁殖，從而維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。此外，乳酸桿菌還具有預(yù)防和抑制腫瘤的發(fā)生、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)消化、合成氨基酸和維生素、降低膽固醇、抑制內(nèi)毒素的生產(chǎn)、延緩衰老和抗輻射等功能。由于乳酸桿菌具有上述諸多有益功能，其在食品和醫(yī)療領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。在食品領(lǐng)域，乳酸桿菌廣泛應(yīng)用于制作酸奶、泡菜等發(fā)酵食品，不僅可以改善食品的風(fēng)味和質(zhì)地，還能延長食品的保質(zhì)期。在醫(yī)療領(lǐng)域，含有乳酸桿菌的微生態(tài)制劑常用于治療菌群失調(diào)相關(guān)的腹脹、腹瀉、便秘等疾病，還可用于調(diào)節(jié)腸道免疫功能，預(yù)防和輔助治療一些腸道相關(guān)疾病。近年來，隨著對乳酸桿菌研究的不斷深入，其對心血管疾病的影響逐漸受到關(guān)注。有研究表明，乳酸菌菌體可以和腸道內(nèi)的膽固醇相結(jié)合，減慢膽固醇的吸收，降低血液中脂蛋白的形成速度，減少循環(huán)系統(tǒng)中存在的膽固醇含量。同時(shí)，乳酸菌、自由態(tài)膽鹽、膽固醇三者的共沉淀加快了膽鹽由結(jié)合態(tài)向游離態(tài)的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致了更多的膽酸鹽的分泌，使消化道內(nèi)膽固醇物質(zhì)代謝的速度變快，乳酸菌與膽固醇的共沉淀還可加速肝臟內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽酸的速度，從而降低血液中的膽固醇含量，提示乳酸菌具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。然而，目前乳酸桿菌對動(dòng)脈粥樣硬化形成影響的研究還相對較少，其具體作用機(jī)制尚不明確。因此，深入研究乳酸桿菌對動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及機(jī)制，對于拓展乳酸桿菌的應(yīng)用領(lǐng)域，開發(fā)新的動(dòng)脈粥樣硬化防治策略具有重要的理論和實(shí)際意義。1.2研究目的與內(nèi)容1.2.1研究目的本研究旨在深入探究乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響，并從多個(gè)角度揭示其潛在的作用機(jī)制。具體而言，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和相關(guān)檢測方法，觀察乳酸桿菌干預(yù)后ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變的變化情況，分析乳酸桿菌對血脂代謝、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和腸道菌群等方面的調(diào)節(jié)作用，明確乳酸桿菌在動(dòng)脈粥樣硬化防治中的潛在價(jià)值，為開發(fā)新的動(dòng)脈粥樣硬化防治策略提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。1.2.2研究內(nèi)容乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響：選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠，構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。將其隨機(jī)分為模型對照組、乳酸桿菌低劑量組和乳酸桿菌高劑量組，同時(shí)設(shè)置野生型C57BL/6J小鼠灌胃生理鹽水作為正常對照組。分別給予不同處理，每天灌胃體積為0.5mL，連續(xù)12周。實(shí)驗(yàn)過程中定期記錄小鼠體重，觀察其生長狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠麻醉處死并取材。對小鼠主動(dòng)脈大體和主動(dòng)脈根部冰凍切片行油紅O染色，定量分析動(dòng)脈粥樣斑塊面積；對主動(dòng)脈根部切片進(jìn)行H&E染色，觀察粥樣斑塊的病理變化，以此明確乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響。乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠血脂代謝的影響：利用全自動(dòng)生化分析儀檢測各組小鼠血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平，分析乳酸桿菌干預(yù)后血脂指標(biāo)的變化，探討乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠血脂代謝的調(diào)節(jié)作用。乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠炎癥反應(yīng)的影響：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測小鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-10（IL-10）的蛋白水平；運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timePCR）檢測各組小鼠主動(dòng)脈的TNF-α和IL-10的mRNA表達(dá)水平；通過westernblot檢測核因子P65（NF-κBP65）信號通路相關(guān)蛋白，如總蛋白核因子KB抑制蛋白α（IκB-α）、胞漿蛋白和胞核蛋白NF-κBP65的蛋白表達(dá)水平，從多方面探究乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠炎癥反應(yīng)的影響及相關(guān)機(jī)制。乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠氧化應(yīng)激的影響：用ELISA檢測各組小鼠血清中氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）的水平，使用生化檢測試劑盒檢測小鼠血清和肝臟中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）的水平，評估乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，分析其是否通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激來影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成。乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠腸道菌群的影響：對小鼠糞便進(jìn)行倍比稀釋后，利用選擇性培養(yǎng)基，如Mac用于大腸桿菌、EC用于腸球菌、MRS用于乳酸桿菌和BS用于雙岐桿菌的分離培養(yǎng)，并進(jìn)行菌落的鑒定和計(jì)數(shù)，研究乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響，探討腸道菌群在乳酸桿菌抗動(dòng)脈粥樣硬化作用中的潛在介導(dǎo)機(jī)制。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng)：選取8周齡雄性ApoE-/-小鼠，將其隨機(jī)分為模型對照組、乳酸桿菌低劑量組和乳酸桿菌高劑量組。另取相同周齡的野生型C57BL/6J小鼠作為正常對照組。正常對照組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，ApoE-/-小鼠給予高脂高膽固醇飼料（含15%豬油+0.25%膽固醇）喂養(yǎng)，以加速動(dòng)脈粥樣硬化模型的形成。每天對各組小鼠進(jìn)行灌胃處理，正常對照組和模型對照組給予生理鹽水，乳酸桿菌低劑量組和高劑量組分別給予不同濃度的乳酸桿菌菌液，灌胃體積均為0.5mL，連續(xù)12周。實(shí)驗(yàn)過程中，每周固定時(shí)間記錄小鼠體重，觀察其生長狀況和精神狀態(tài)。動(dòng)脈粥樣硬化病變檢測：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠麻醉處死，迅速取出主動(dòng)脈。對主動(dòng)脈進(jìn)行大體觀察，拍照記錄其形態(tài)和病變情況。將主動(dòng)脈根部進(jìn)行冰凍切片，行油紅O染色，在顯微鏡下觀察并定量分析動(dòng)脈粥樣斑塊面積。同時(shí)，對主動(dòng)脈根部切片進(jìn)行H&E染色，觀察粥樣斑塊的病理變化，包括斑塊內(nèi)細(xì)胞成分、脂質(zhì)沉積、纖維組織增生等情況。血脂代謝指標(biāo)檢測：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測各組小鼠血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平。具體操作按照生化分析儀的說明書進(jìn)行，先采集小鼠血清樣本，然后將樣本加入相應(yīng)的檢測試劑中，在儀器上進(jìn)行分析測定，獲取各項(xiàng)血脂指標(biāo)的數(shù)值。炎癥反應(yīng)指標(biāo)檢測：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）：使用ELISA試劑盒檢測小鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-10（IL-10）的蛋白水平。按照試劑盒操作步驟，將血清樣本加入包被有特異性抗體的96孔板中，經(jīng)過孵育、洗滌、加酶標(biāo)二抗、顯色等步驟，最后在酶標(biāo)儀上測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中TNF-α和IL-10的濃度。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timePCR）：提取各組小鼠主動(dòng)脈組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板進(jìn)行real-timePCR反應(yīng)，檢測TNF-α和IL-10的mRNA表達(dá)水平。設(shè)計(jì)特異性引物，使用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，通過分析Ct值和相對定量方法，計(jì)算出目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量。westernblot檢測：提取小鼠主動(dòng)脈組織的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉后，分別加入核因子P65（NF-κBP65）信號通路相關(guān)蛋白，如總蛋白核因子KB抑制蛋白α（IκB-α）、胞漿蛋白和胞核蛋白NF-κBP65的一抗，4℃孵育過夜。次日，洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。利用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，通過圖像分析軟件分析條帶的灰度值，比較不同組之間蛋白表達(dá)水平的差異。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：ELISA檢測氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）：采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中OX-LDL的水平，操作步驟同上述ELISA檢測方法，通過測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出OX-LDL的含量。生化檢測試劑盒檢測：使用生化檢測試劑盒分別檢測小鼠血清和肝臟中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）的水平。按照試劑盒說明書，對血清和肝臟勻漿樣本進(jìn)行處理，加入相應(yīng)的檢測試劑，通過比色法或其他檢測原理，在分光光度計(jì)上測定吸光度值，計(jì)算出MDA、SOD和GSH的含量。腸道菌群檢測：收集小鼠糞便樣本，進(jìn)行倍比稀釋后，利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)。Mac培養(yǎng)基用于大腸桿菌的分離培養(yǎng)，EC培養(yǎng)基用于腸球菌的分離培養(yǎng)，MRS培養(yǎng)基用于乳酸桿菌的分離培養(yǎng)，BS培養(yǎng)基用于雙岐桿菌的分離培養(yǎng)。將稀釋后的糞便懸液涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)一定時(shí)間后，對長出的菌落進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)，分析腸道菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化。1.3.2技術(shù)路線本研究技術(shù)路線如下：實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：獲取8周齡雄性ApoE-/-小鼠和野生型C57BL/6J小鼠，準(zhǔn)備高脂高膽固醇飼料、普通飼料、乳酸桿菌菌液、各種檢測試劑和儀器設(shè)備。動(dòng)物分組與干預(yù)：將小鼠分為正常對照組、模型對照組、乳酸桿菌低劑量組和乳酸桿菌高劑量組，進(jìn)行相應(yīng)的灌胃處理和飼料喂養(yǎng)，持續(xù)12周。樣本采集：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉處死小鼠，采集主動(dòng)脈、血清、肝臟和糞便等樣本。指標(biāo)檢測：動(dòng)脈粥樣硬化病變檢測：對主動(dòng)脈進(jìn)行大體觀察、油紅O染色和H&E染色，分析動(dòng)脈粥樣斑塊面積和病理變化。血脂代謝指標(biāo)檢測：使用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。炎癥反應(yīng)指標(biāo)檢測：通過ELISA檢測血清TNF-α和IL-10蛋白水平，real-timePCR檢測主動(dòng)脈TNF-α和IL-10mRNA表達(dá)水平，westernblot檢測NF-κBP65信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：ELISA檢測血清OX-LDL水平，生化檢測試劑盒檢測血清和肝臟中MDA、SOD和GSH水平。腸道菌群檢測：利用選擇性培養(yǎng)基對糞便樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)，鑒定和計(jì)數(shù)腸道菌群。結(jié)果分析：對各項(xiàng)檢測指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，比較不同組之間的差異，探討乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及機(jī)制，最終得出研究結(jié)論。具體技術(shù)路線圖如圖1-1所示：[此處插入技術(shù)路線圖]二、乳酸桿菌與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1乳酸桿菌概述2.1.1分類與生理特性乳酸桿菌是乳桿菌目乳桿菌科乳桿菌屬細(xì)菌的統(tǒng)稱，是革蘭氏陽性菌，其細(xì)胞形態(tài)多樣，主要為桿狀，形態(tài)變化范圍從細(xì)長且有時(shí)彎曲的桿狀，到短的、通常為棍棒狀的球桿狀。在顯微鏡下觀察，乳酸桿菌可單獨(dú)存在，也可成對、成短鏈或長鏈排列。大部分乳酸桿菌不具備運(yùn)動(dòng)能力，少數(shù)運(yùn)動(dòng)的乳酸桿菌擁有周生鞭毛。乳酸桿菌的生長對環(huán)境條件有一定要求。它兼性厭氧，生長溫度范圍較寬，為2℃-53℃，但適宜溫度在30℃-40℃。其耐酸性強(qiáng)，最適pH通常在5.5-6.2之間。在營養(yǎng)需求方面，乳酸桿菌對氨基酸、肽、核酸衍生物、維生素、鹽類、脂肪酸或脂肪酸酯及可發(fā)酵性碳水化合物呈現(xiàn)復(fù)雜的需求，且不同菌種之間存在差異。乳酸桿菌通過二分裂方式進(jìn)行繁殖，是典型的專性發(fā)酵微生物，專性分解代謝糖類化合物，至少一半終產(chǎn)物為乳酸，且乳酸通常不被進(jìn)一步發(fā)酵。截至2020年3月，乳桿菌屬已涵蓋261個(gè)種。不過，在2020年4月，一項(xiàng)基于全基因組序列的分析將乳桿菌屬重新劃分為25個(gè)不同的屬，該屬模式種為德氏乳桿菌。乳酸桿菌在自然界中分布極為廣泛，是人類和動(dòng)物胃及小腸內(nèi)主要的正常菌群，在土壤、廢物以及動(dòng)物糞便中也能被發(fā)現(xiàn)。然而，它有時(shí)也可能導(dǎo)致食品的酸敗。2.1.2生物學(xué)功能調(diào)節(jié)腸道菌群：乳酸桿菌能夠通過多種機(jī)制維持腸道微生態(tài)的平衡。它可以與腸道上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，形成一層生物屏障，阻止病原菌對腸道黏膜的黏附和入侵。同時(shí)，乳酸桿菌在代謝過程中產(chǎn)生的乳酸、乙酸等有機(jī)酸，能夠降低腸道內(nèi)的pH值，抑制有害菌如大腸桿菌、沙門氏菌等的生長繁殖。此外，乳酸桿菌還能分泌細(xì)菌素、過氧化氫等抑菌物質(zhì)，進(jìn)一步抑制有害菌的生長，促進(jìn)有益菌如雙歧桿菌等的增殖，從而調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。增強(qiáng)免疫力：乳酸桿菌對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用顯著。它可以激活巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們的活性和功能。例如，乳酸桿菌能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細(xì)胞因子參與免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。此外，乳酸桿菌還能刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，提高機(jī)體的體液免疫水平。同時(shí)，它通過調(diào)節(jié)腸道免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)腸道黏膜的免疫屏障作用，防止病原體的入侵。改善代謝：在脂質(zhì)代謝方面，有研究表明乳酸桿菌可以通過多種途徑降低血脂水平。一方面，乳酸桿菌菌體可以和腸道內(nèi)的膽固醇相結(jié)合，減慢膽固醇的吸收，降低血液中脂蛋白的形成速度，減少循環(huán)系統(tǒng)中存在的膽固醇含量。另一方面，乳酸菌、自由態(tài)膽鹽、膽固醇三者的共沉淀加快了膽鹽由結(jié)合態(tài)向游離態(tài)的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致了更多的膽酸鹽的分泌，使消化道內(nèi)膽固醇物質(zhì)代謝的速度變快，乳酸菌與膽固醇的共沉淀還可加速肝臟內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)化為膽酸的速度，從而降低血液中的膽固醇含量。在糖代謝方面，乳酸桿菌能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的微生物群落，影響碳水化合物的消化和吸收，進(jìn)而對血糖水平產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用。例如，某些乳酸桿菌可以改善胰島素抵抗，提高胰島素的敏感性，有助于維持血糖的穩(wěn)定。其他功能：乳酸桿菌還具有預(yù)防和抑制腫瘤的發(fā)生、抗氧化、延緩衰老和抗輻射等功能。其預(yù)防腫瘤的作用可能與調(diào)節(jié)免疫功能、抑制有害菌產(chǎn)生致癌物質(zhì)以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)。乳酸桿菌能夠產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)，如超氧化物歧化酶（SOD）等，清除體內(nèi)的自由基，減輕氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷，從而起到抗氧化和延緩衰老的作用。此外，乳酸桿菌在一定程度上還能夠抵抗輻射對機(jī)體的損害，保護(hù)細(xì)胞免受輻射的損傷。2.2動(dòng)脈粥樣硬化2.2.1發(fā)病機(jī)制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜且尚未完全明確的過程，涉及多種因素的相互作用。目前被廣泛接受的是“損傷反應(yīng)學(xué)說”，該學(xué)說認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈內(nèi)膜對多種損傷因素的慢性炎癥反應(yīng)。血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素。血液中脂質(zhì)成分，如低密度脂蛋白（LDL）、極低密度脂蛋白（VLDL）和甘油三酯（TG）水平升高，尤其是LDL-C水平升高，是動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵因素。LDL通過受損的內(nèi)皮進(jìn)入血管內(nèi)膜下，被氧化修飾成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）。ox-LDL具有細(xì)胞毒性，可損傷內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)吸引單核細(xì)胞和低密度脂蛋白進(jìn)入內(nèi)膜下。單核細(xì)胞吞噬ox-LDL后轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞不斷攝取ox-LDL，逐漸形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞在血管內(nèi)膜下聚集，形成早期的粥樣硬化病變，即脂質(zhì)條紋。隨著病變的發(fā)展，泡沫細(xì)胞壞死崩解，釋放出脂質(zhì)和其他物質(zhì)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，促進(jìn)粥樣斑塊的形成。炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的全過程中都發(fā)揮著重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段，內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷后，會(huì)表達(dá)黏附分子，如血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1），吸引單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞黏附并進(jìn)入內(nèi)膜下。單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，吞噬ox-LDL成為泡沫細(xì)胞，同時(shí)釋放多種炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些炎癥介質(zhì)可進(jìn)一步激活內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤和增殖，加速粥樣斑塊的形成和發(fā)展。此外，炎癥反應(yīng)還可導(dǎo)致斑塊內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)降解，使斑塊變得不穩(wěn)定，容易破裂，引發(fā)急性心血管事件。內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。多種危險(xiǎn)因素，如高血壓、高血脂、高血糖、吸煙、氧化應(yīng)激等，都可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，其屏障功能受損，通透性增加，使得血液中的脂質(zhì)和炎癥細(xì)胞易于進(jìn)入內(nèi)膜下。同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一氧化氮（NO）等血管舒張因子減少，而內(nèi)皮素（ET）等血管收縮因子增加，導(dǎo)致血管收縮和血流紊亂，進(jìn)一步加重內(nèi)皮損傷。此外，內(nèi)皮細(xì)胞損傷還可激活血小板，促進(jìn)血栓形成，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。平滑肌細(xì)胞增殖和遷移也是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要環(huán)節(jié)。在炎癥介質(zhì)和生長因子的刺激下，中膜的平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜下，并發(fā)生增殖。平滑肌細(xì)胞增殖后，合成和分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白和蛋白聚糖等，使斑塊不斷增大和穩(wěn)定。然而，過度增殖的平滑肌細(xì)胞也可導(dǎo)致斑塊內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)堆積過多，使斑塊變得僵硬，增加了斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)。2.2.2ApoE-/-小鼠模型ApoE-/-小鼠是一種載脂蛋白E基因敲除的小鼠模型，在動(dòng)脈粥樣硬化研究中被廣泛應(yīng)用。載脂蛋白E（ApoE）是一種血漿脂蛋白，主要由肝臟和巨噬細(xì)胞合成，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用。ApoE可以與多種脂蛋白受體結(jié)合，如低密度脂蛋白受體（LDLR）和極低密度脂蛋白受體（VLDLR）等，參與脂蛋白的代謝和清除。ApoE-/-小鼠由于缺乏ApoE基因，導(dǎo)致其血漿中膽固醇代謝異常，血漿膽固醇水平顯著升高。ApoE-/-小鼠模型的構(gòu)建通常采用基因敲除技術(shù)，通過同源重組的方法將小鼠的ApoE基因敲除。這種小鼠在正常飼養(yǎng)條件下，即可自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化病變。隨著年齡的增長，病變逐漸加重，主要表現(xiàn)為主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈等血管內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積、泡沫細(xì)胞形成、平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，以及纖維組織增生等。ApoE-/-小鼠模型具有以下特點(diǎn)和優(yōu)勢：首先，該模型在正常飼養(yǎng)條件下就能自發(fā)形成動(dòng)脈粥樣硬化病變，與人類動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過程具有較高的相似性，不需要額外的誘導(dǎo)因素，如高脂飲食等，就可以用于研究動(dòng)脈粥樣硬化的自然發(fā)生發(fā)展過程。其次，ApoE-/-小鼠的病變發(fā)展過程相對穩(wěn)定，重復(fù)性好，便于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究和觀察。此外，ApoE-/-小鼠的基因組背景明確，遺傳操作相對簡單，便于進(jìn)行基因修飾和干預(yù)研究，可用于探討基因和環(huán)境因素對動(dòng)脈粥樣硬化的影響。在本研究中，選用ApoE-/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過給予高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)，進(jìn)一步加速動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成。這樣可以在較短的時(shí)間內(nèi)觀察到明顯的動(dòng)脈粥樣硬化病變，便于研究乳酸桿菌對動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及機(jī)制。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用8周齡雄性ApoE-/-小鼠，購自南京模式動(dòng)物有限公司，品系背景為C57BL/6J。同時(shí)選取相同周齡的野生型C57BL/6J小鼠作為正常對照組，同樣購自南京模式動(dòng)物有限公司。小鼠在SPF級動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)，溫度控制在22℃-24℃，相對濕度為40%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。3.1.2實(shí)驗(yàn)菌株實(shí)驗(yàn)所用乳酸桿菌為嗜酸乳酸桿菌ATCC4356，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。將凍存的嗜酸乳酸桿菌ATCC4356接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48小時(shí)進(jìn)行復(fù)蘇和活化。MRS培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀2.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、乙酸鈉5.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、吐溫801.0mL、瓊脂15.0g，蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH至6.2-6.4。培養(yǎng)后的菌液經(jīng)革蘭氏染色和生化鑒定確認(rèn)其純度和菌種特征。將活化后的菌液以10%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)18-24小時(shí)，使其處于對數(shù)生長期，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.1.3試劑與儀器試劑：高脂高膽固醇飼料（含15%豬油+0.25%膽固醇）購自南通特洛菲飼料科技有限公司；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-10（IL-10）的ELISA檢測試劑盒購自美國R&DSystems公司；氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；核因子P65（NF-κBP65）信號通路相關(guān)蛋白抗體，如總蛋白核因子KB抑制蛋白α（IκB-α）、胞漿蛋白和胞核蛋白NF-κBP65抗體均購自美國CellSignalingTechnology公司；HRP標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；化學(xué)發(fā)光試劑購自美國ThermoFisherScientific公司；Mac培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和BS培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。儀器：全自動(dòng)生化分析儀（日立7600-020型，日本日立公司）；酶標(biāo)儀（MultiskanFC，美國ThermoFisherScientific公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（CFX96Touch，美國Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDocMP，美國Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機(jī)（5424R型，德國Eppendorf公司）；超低溫冰箱（DW-86L388，青島海爾特種電器有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（T100，美國Bio-Rad公司）；電泳儀（PowerPacUniversal，美國Bio-Rad公司）；垂直電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽（Mini-PROTEANTetra，美國Bio-Rad公司）；厭氧培養(yǎng)箱（BB15，德國Heraeus公司）；電子天平（FA2004B，上海越平科學(xué)儀器有限公司）；顯微鏡（BX53，日本Olympus公司）；切片機(jī)（CM1950，德國Leica公司）。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。其中，模型對照組給予生理鹽水灌胃，乳酸桿菌低劑量組給予5×10?CFU/mL的乳酸桿菌菌液灌胃，乳酸桿菌高劑量組給予5×10?CFU/mL的乳酸桿菌菌液灌胃。另取10只8周齡野生型C57BL/6J小鼠作為正常對照組，給予生理鹽水灌胃。所有小鼠均在SPF級動(dòng)物房內(nèi)飼養(yǎng)，溫度控制在22℃-24℃，相對濕度為40%-60%，12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。正常對照組小鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，ApoE-/-小鼠給予高脂高膽固醇飼料（含15%豬油+0.25%膽固醇）喂養(yǎng)，以加速動(dòng)脈粥樣硬化模型的形成。每天灌胃體積均為0.5mL，連續(xù)灌胃12周。實(shí)驗(yàn)過程中，每周固定時(shí)間使用電子天平稱量小鼠體重，并觀察小鼠的生長狀況、精神狀態(tài)、飲食和活動(dòng)情況等。3.2.2檢測指標(biāo)與方法血脂檢測：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食12小時(shí)，眼眶靜脈叢采血，3000r/min離心15分鐘，分離血清。采用全自動(dòng)生化分析儀，按照試劑盒說明書操作，檢測血清中總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平。動(dòng)脈粥樣硬化程度檢測：采血后，將小鼠脫頸椎處死，迅速取出主動(dòng)脈，用生理鹽水沖洗干凈，去除周圍組織。對主動(dòng)脈進(jìn)行大體觀察，拍照記錄其形態(tài)和病變情況。將主動(dòng)脈根部切成5μm厚的冰凍切片，進(jìn)行油紅O染色，在顯微鏡下觀察并使用圖像分析軟件定量分析動(dòng)脈粥樣斑塊面積。同時(shí)，將主動(dòng)脈根部切片進(jìn)行H&E染色，觀察粥樣斑塊的病理變化，包括斑塊內(nèi)細(xì)胞成分、脂質(zhì)沉積、纖維組織增生等情況。氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）的水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用生化檢測試劑盒分別檢測小鼠血清和肝臟中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）的水平。取適量肝臟組織，加入生理鹽水制成10%的勻漿，3000r/min離心15分鐘，取上清液用于檢測。按照試劑盒說明書操作，通過比色法測定吸光度值，計(jì)算出MDA、SOD和GSH的含量。炎癥因子檢測：采用ELISA方法檢測小鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-10（IL-10）的蛋白水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，包括樣本稀釋、加樣、孵育、洗滌、加酶標(biāo)二抗、顯色和讀數(shù)等步驟。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timePCR）檢測各組小鼠主動(dòng)脈的TNF-α和IL-10的mRNA表達(dá)水平。提取主動(dòng)脈組織的總RNA，使用RNA提取試劑盒，按照說明書操作。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒。以cDNA為模板，進(jìn)行real-timePCR反應(yīng)，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒和特異性引物。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。通過分析Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因相對于內(nèi)參基因（β-actin）的表達(dá)量。通過westernblot檢測核因子P65（NF-κBP65）信號通路相關(guān)蛋白，如總蛋白核因子KB抑制蛋白α（IκB-α）、胞漿蛋白和胞核蛋白NF-κBP65的蛋白表達(dá)水平。提取主動(dòng)脈組織的總蛋白，使用蛋白裂解液，冰上裂解30分鐘，然后12000r/min離心15分鐘，取上清液。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，然后分別加入一抗（IκB-α、NF-κBP65等），4℃孵育過夜。次日，洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。利用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，通過圖像分析軟件分析條帶的灰度值，比較不同組之間蛋白表達(dá)水平的差異。腸道菌群檢測：收集小鼠糞便樣本，放入無菌EP管中，立即置于冰上。將糞便樣本進(jìn)行倍比稀釋，取適量稀釋液分別涂布于Mac培養(yǎng)基（用于大腸桿菌分離培養(yǎng)）、EC培養(yǎng)基（用于腸球菌分離培養(yǎng)）、MRS培養(yǎng)基（用于乳酸桿菌分離培養(yǎng)）和BS培養(yǎng)基（用于雙岐桿菌分離培養(yǎng)）平板上。將平板置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時(shí)，觀察菌落生長情況。對長出的菌落進(jìn)行鑒定，根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色和生化特性等進(jìn)行判斷。使用菌落計(jì)數(shù)器對不同培養(yǎng)基上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每克糞便中不同菌群的數(shù)量，分析腸道菌群的結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化。3.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步進(jìn)行LSD法或Dunnett's法兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過GraphPadPrism8.0軟件繪制圖表，直觀展示數(shù)據(jù)結(jié)果。四、乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響4.1對血脂代謝的影響血脂異常是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，血清膽固醇和脂蛋白水平的變化在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。本研究通過檢測不同組小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇等指標(biāo)，探討乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠血脂代謝的影響。4.1.1血清膽固醇水平變化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集各組小鼠血清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）的含量。結(jié)果顯示，與正常對照組（野生型C57BL/6J小鼠）相比，模型對照組（ApoE-/-小鼠灌胃生理鹽水）小鼠血清TC和TG水平顯著升高（P<0.01），這表明ApoE-/-小鼠在高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)下，成功誘導(dǎo)出了血脂異常，符合動(dòng)脈粥樣硬化模型的特征。給予乳酸桿菌干預(yù)后，乳酸桿菌低劑量組和高劑量組小鼠血清TC和TG水平與模型對照組相比，雖有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這一結(jié)果與一些研究報(bào)道有所不同，有研究表明乳酸桿菌可降低血清、肝臟和主動(dòng)脈中總膽固醇的含量，提高血清中高密度脂蛋白膽固醇的含量。然而，本研究中乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠血清膽固醇水平的影響不顯著，可能與實(shí)驗(yàn)所用乳酸桿菌的菌株、劑量、干預(yù)時(shí)間以及小鼠模型的差異等多種因素有關(guān)。4.1.2脂蛋白水平變化同時(shí)，檢測各組小鼠血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型對照組小鼠血清LDL-C水平顯著高于正常對照組（P<0.01），HDL-C水平顯著低于正常對照組（P<0.01）。LDL-C是動(dòng)脈粥樣硬化的主要致病因子，其水平升高會(huì)增加動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；而HDL-C具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，可促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，將外周組織的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟進(jìn)行代謝，其水平降低則不利于動(dòng)脈粥樣硬化的防治。在乳酸桿菌干預(yù)組中，乳酸桿菌高劑量組小鼠血清LDL-C水平較模型對照組有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；HDL-C水平較模型對照組有升高趨勢，但同樣差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這提示乳酸桿菌可能在一定程度上對ApoE-/-小鼠脂蛋白水平有調(diào)節(jié)作用，但作用效果不明顯，可能需要進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，如調(diào)整乳酸桿菌的劑量、干預(yù)時(shí)間等，以更準(zhǔn)確地評估其對脂蛋白水平的影響。4.2對動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的關(guān)鍵階段，其病變程度直接影響心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過對小鼠主動(dòng)脈大體形態(tài)觀察以及主動(dòng)脈根部切片分析，深入探究乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響。4.2.1主動(dòng)脈大體形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對各組小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行大體觀察。正常對照組小鼠主動(dòng)脈外觀光滑，管壁柔軟，無明顯粥樣斑塊形成，血管顏色呈淡粉色，血管壁平整，無增厚、凸起或其他異常形態(tài)。模型對照組小鼠主動(dòng)脈則可見明顯的粥樣斑塊病變，血管壁粗糙，可見多處大小不一的黃色斑塊，斑塊呈隆起狀，部分斑塊融合，使血管管徑變窄，血管彈性明顯降低，顏色也較正常對照組主動(dòng)脈暗淡。乳酸桿菌干預(yù)組中，乳酸桿菌低劑量組小鼠主動(dòng)脈的粥樣斑塊病變較模型對照組有所減輕，雖然仍能觀察到一些黃色斑塊，但斑塊數(shù)量減少，且斑塊的大小和隆起程度也有所降低，血管壁相對光滑一些，管徑變窄程度相對較輕。乳酸桿菌高劑量組小鼠主動(dòng)脈的改善更為明顯，粥樣斑塊數(shù)量進(jìn)一步減少，大部分血管壁較為光滑，僅有少量散在的小斑塊，血管彈性也有所恢復(fù)，顏色更接近正常主動(dòng)脈。4.2.2主動(dòng)脈根部切片分析對主動(dòng)脈根部切片進(jìn)行油紅O染色，以檢測脂質(zhì)沉積情況，進(jìn)而定量分析動(dòng)脈粥樣斑塊面積。結(jié)果顯示，正常對照組小鼠主動(dòng)脈根部切片中油紅O染色陽性區(qū)域極少，幾乎看不到明顯的脂質(zhì)沉積，表明正常對照組小鼠主動(dòng)脈根部無明顯動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。模型對照組小鼠主動(dòng)脈根部切片中油紅O染色陽性區(qū)域明顯增多，脂質(zhì)沉積顯著，動(dòng)脈粥樣斑塊面積較大，占主動(dòng)脈根部面積的比例較高。乳酸桿菌干預(yù)組中，乳酸桿菌低劑量組小鼠主動(dòng)脈根部切片的油紅O染色陽性區(qū)域較模型對照組減少，動(dòng)脈粥樣斑塊面積也有所減小，占主動(dòng)脈根部面積的比例降低。乳酸桿菌高劑量組小鼠主動(dòng)脈根部切片的油紅O染色陽性區(qū)域進(jìn)一步減少，動(dòng)脈粥樣斑塊面積明顯小于模型對照組，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明乳酸桿菌能夠抑制ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部脂質(zhì)沉積，減少動(dòng)脈粥樣斑塊面積，且高劑量乳酸桿菌的作用效果更為顯著。同時(shí)，對主動(dòng)脈根部切片進(jìn)行H&E染色，觀察粥樣斑塊的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成。正常對照組小鼠主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜、中膜和外膜層次清晰，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤和脂質(zhì)沉積。模型對照組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，可見大量泡沫細(xì)胞聚集，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，中膜變薄，外膜可見炎癥細(xì)胞浸潤，提示動(dòng)脈粥樣硬化病變明顯。乳酸桿菌干預(yù)組中，乳酸桿菌低劑量組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚程度減輕，泡沫細(xì)胞數(shù)量減少，平滑肌細(xì)胞排列相對規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤有所減少。乳酸桿菌高劑量組小鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度更接近正常，泡沫細(xì)胞顯著減少，平滑肌細(xì)胞排列較為整齊，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，表明乳酸桿菌能夠改善ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊的病理結(jié)構(gòu)，減輕炎癥反應(yīng)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。4.3對脂肪組織的影響脂肪組織不僅是能量儲(chǔ)存的場所，還具有重要的內(nèi)分泌功能，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。乳酸桿菌對脂肪組織的作用可能是其影響動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要途徑之一，下面將從附睪脂肪組織細(xì)胞形態(tài)變化以及脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)變化兩方面進(jìn)行研究。4.3.1附睪脂肪組織細(xì)胞形態(tài)變化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各組小鼠的附睪脂肪組織，進(jìn)行固定、包埋和切片處理，采用蘇木精-伊紅（H&E）染色法，在光學(xué)顯微鏡下觀察脂肪細(xì)胞的大小、形態(tài)及分布情況。正常對照組小鼠的附睪脂肪組織中，脂肪細(xì)胞大小較為均勻，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣，細(xì)胞之間排列緊密，間隙較小，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量適中，細(xì)胞輪廓清晰，無明顯的細(xì)胞形態(tài)異常。模型對照組小鼠的附睪脂肪組織中，脂肪細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞直徑顯著增加，部分脂肪細(xì)胞相互擠壓，形態(tài)變得不規(guī)則，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)大量堆積，細(xì)胞核被擠壓至一側(cè)，呈現(xiàn)出明顯的肥胖型脂肪細(xì)胞特征，提示模型對照組小鼠脂肪組織出現(xiàn)了明顯的脂肪細(xì)胞肥大和脂質(zhì)蓄積現(xiàn)象。乳酸桿菌干預(yù)組中，乳酸桿菌低劑量組小鼠的附睪脂肪組織中，脂肪細(xì)胞體積較模型對照組有所減小，細(xì)胞形態(tài)相對規(guī)則，細(xì)胞間隙減小，雖然仍可見部分脂肪細(xì)胞肥大，但程度較模型對照組減輕，表明低劑量乳酸桿菌對脂肪細(xì)胞的肥大和脂質(zhì)蓄積有一定的抑制作用。乳酸桿菌高劑量組小鼠的附睪脂肪組織中，脂肪細(xì)胞體積進(jìn)一步減小，細(xì)胞大小更接近正常對照組，細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常，細(xì)胞間隙明顯減小，脂質(zhì)蓄積現(xiàn)象顯著減輕，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明高劑量乳酸桿菌能夠更有效地抑制脂肪細(xì)胞的肥大和脂質(zhì)蓄積，改善附睪脂肪組織的細(xì)胞形態(tài)。4.3.2脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)變化為深入探究乳酸桿菌對脂肪代謝的影響，檢測了脂肪代謝相關(guān)酶活性以及基因表達(dá)等指標(biāo)。采用酶活性檢測試劑盒，檢測了小鼠附睪脂肪組織中脂肪酸合成酶（FAS）和激素敏感性脂肪酶（HSL）的活性。FAS是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，其活性升高會(huì)促進(jìn)脂肪酸的合成和脂肪儲(chǔ)存；HSL則是脂肪分解的關(guān)鍵酶，其活性升高會(huì)促進(jìn)脂肪的分解代謝。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠附睪脂肪組織中FAS活性顯著升高（P<0.01），HSL活性顯著降低（P<0.01），表明模型對照組小鼠脂肪合成增強(qiáng)，分解減弱，導(dǎo)致脂肪在脂肪組織中大量蓄積。乳酸桿菌干預(yù)組中，乳酸桿菌低劑量組小鼠附睪脂肪組織中FAS活性較模型對照組有所降低，HSL活性有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；乳酸桿菌高劑量組小鼠附睪脂肪組織中FAS活性顯著低于模型對照組（P<0.05），HSL活性顯著高于模型對照組（P<0.05），這表明高劑量乳酸桿菌能夠調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)酶的活性，抑制脂肪合成，促進(jìn)脂肪分解，從而減少脂肪在脂肪組織中的蓄積。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timePCR）技術(shù)，檢測了小鼠附睪脂肪組織中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和脂聯(lián)素（Adiponectin）的基因表達(dá)水平。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)儲(chǔ)存；Adiponectin是一種由脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)能量代謝、抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種功能。結(jié)果表明，與正常對照組相比，模型對照組小鼠附睪脂肪組織中PPARγ基因表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），Adiponectin基因表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），提示模型對照組小鼠脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)儲(chǔ)存增強(qiáng)，而脂聯(lián)素的分泌減少，這可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。乳酸桿菌干預(yù)組中，乳酸桿菌低劑量組小鼠附睪脂肪組織中PPARγ基因表達(dá)水平較模型對照組有降低趨勢，Adiponectin基因表達(dá)水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；乳酸桿菌高劑量組小鼠附睪脂肪組織中PPARγ基因表達(dá)水平顯著低于模型對照組（P<0.05），Adiponectin基因表達(dá)水平顯著高于模型對照組（P<0.05），說明高劑量乳酸桿菌能夠調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，抑制脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)儲(chǔ)存，同時(shí)增加脂聯(lián)素的分泌，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。五、乳酸桿菌影響ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的機(jī)制探討5.1調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激氧化應(yīng)激在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，過多的活性氧（ROS）可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脂質(zhì)過氧化和炎癥反應(yīng)的加劇。乳酸桿菌可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成產(chǎn)生影響，下面將從氧化型低密度脂蛋白水平變化以及抗氧化酶活性與氧化產(chǎn)物水平兩方面進(jìn)行分析。5.1.1氧化型低密度脂蛋白水平變化氧化型低密度脂蛋白（OX-LDL）是動(dòng)脈粥樣硬化的重要致病因素，其在血清中的含量與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究采用ELISA方法檢測了各組小鼠血清中OX-LDL的水平，以探究乳酸桿菌對其影響。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清OX-LDL水平顯著升高（P<0.01），這表明在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，LDL被氧化修飾的程度增加，OX-LDL大量產(chǎn)生，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。給予乳酸桿菌干預(yù)后，乳酸桿菌低劑量組小鼠血清OX-LDL水平較模型對照組有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。乳酸桿菌高劑量組小鼠血清OX-LDL水平顯著低于模型對照組（P<0.05），表明高劑量的乳酸桿菌能夠有效降低血清中OX-LDL的含量。這可能是因?yàn)槿樗釛U菌具有抗氧化作用，能夠抑制LDL的氧化修飾，減少OX-LDL的生成，從而減輕氧化應(yīng)激對血管的損傷，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。5.1.2抗氧化酶活性與氧化產(chǎn)物水平超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧氣和過氧化氫，從而清除體內(nèi)過多的自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可反映機(jī)體氧化應(yīng)激的程度，MDA含量升高表明脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，氧化應(yīng)激加劇。谷胱甘肽（GSH）是一種含有巰基的三肽，在體內(nèi)具有抗氧化、解毒等重要作用，可參與維持細(xì)胞的氧化還原平衡。本研究使用生化檢測試劑盒分別檢測了小鼠血清和肝臟中SOD活性、MDA含量以及GSH水平。在血清檢測結(jié)果中，與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清SOD活性顯著降低（P<0.01），MDA含量顯著升高（P<0.01），GSH水平顯著降低（P<0.01），說明模型對照組小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化能力下降。乳酸桿菌干預(yù)組中，乳酸桿菌低劑量組小鼠血清SOD活性較模型對照組有所升高，MDA含量有所降低，GSH水平有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。乳酸桿菌高劑量組小鼠血清SOD活性顯著高于模型對照組（P<0.05），MDA含量顯著低于模型對照組（P<0.05），GSH水平顯著高于模型對照組（P<0.05），表明高劑量乳酸桿菌能夠提高血清中SOD活性，降低MDA含量，升高GSH水平，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激。在肝臟檢測結(jié)果中，模型對照組小鼠肝臟SOD活性顯著低于正常對照組（P<0.01），MDA含量顯著高于正常對照組（P<0.01），GSH水平顯著低于正常對照組（P<0.01）。乳酸桿菌低劑量組小鼠肝臟SOD活性較模型對照組有升高趨勢，MDA含量有降低趨勢，GSH水平有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。乳酸桿菌高劑量組小鼠肝臟SOD活性顯著高于模型對照組（P<0.05），MDA含量顯著低于模型對照組（P<0.05），GSH水平顯著高于模型對照組（P<0.05），說明高劑量乳酸桿菌對肝臟的抗氧化能力也有顯著的調(diào)節(jié)作用，能夠改善肝臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)。綜上所述，乳酸桿菌可能通過提高抗氧化酶活性，降低氧化產(chǎn)物水平，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激，從而抑制ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成，且高劑量乳酸桿菌的作用效果更為顯著。5.2調(diào)控炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，其貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化病變的起始、發(fā)展和并發(fā)癥的各個(gè)階段。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期，炎癥細(xì)胞如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等被招募到血管內(nèi)膜下，引發(fā)炎癥反應(yīng)。這些炎癥細(xì)胞釋放多種炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)脂質(zhì)沉積和泡沫細(xì)胞形成。隨著病變的進(jìn)展，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇，炎癥因子的釋放增加，導(dǎo)致斑塊內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)降解，平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，使斑塊逐漸增大并趨于不穩(wěn)定。當(dāng)斑塊破裂時(shí)，會(huì)引發(fā)急性血栓形成，導(dǎo)致心血管事件的發(fā)生。因此，抑制炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的重要策略之一。乳酸桿菌作為一種益生菌，可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)來抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成，下面將從炎癥因子表達(dá)變化以及NF-κB信號通路激活情況兩方面進(jìn)行分析。5.2.1炎癥因子表達(dá)變化炎癥因子在動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用，它們之間相互作用，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同影響著動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。TNF-α是一種促炎細(xì)胞因子，由激活的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生。在動(dòng)脈粥樣硬化過程中，TNF-α可通過多種途徑促進(jìn)炎癥反應(yīng)。它能激活內(nèi)皮細(xì)胞，使其表達(dá)黏附分子，如血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）和細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1），從而促進(jìn)單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞黏附并進(jìn)入內(nèi)膜下，加劇炎癥浸潤。TNF-α還可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生其他炎癥因子，如IL-1和IL-6，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。此外，TNF-α可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)斑塊的形成和發(fā)展。IL-10是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生。在動(dòng)脈粥樣硬化中，IL-10發(fā)揮著抑制炎癥反應(yīng)的作用。它可以抑制巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活性，減少炎癥因子的產(chǎn)生。IL-10還能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)Th17細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的轉(zhuǎn)化，從而減輕炎癥反應(yīng)。此外，IL-10可抑制內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，減少炎癥細(xì)胞的黏附和浸潤。本研究采用ELISA方法檢測了小鼠血清中TNF-α和IL-10的蛋白水平，運(yùn)用real-timePCR檢測了各組小鼠主動(dòng)脈的TNF-α和IL-10的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠血清中TNF-α蛋白水平顯著升高（P<0.01），IL-10蛋白水平顯著降低（P<0.01）；主動(dòng)脈中TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），IL-10的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），這表明在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，促炎因子與抗炎因子失衡。給予乳酸桿菌干預(yù)后，乳酸桿菌低劑量組小鼠血清中TNF-α蛋白水平較模型對照組有所降低，IL-10蛋白水平有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；主動(dòng)脈中TNF-α的mRNA表達(dá)水平有降低趨勢，IL-10的mRNA表達(dá)水平有升高趨勢，但差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。乳酸桿菌高劑量組小鼠血清中TNF-α蛋白水平顯著低于模型對照組（P<0.05），IL-10蛋白水平顯著高于模型對照組（P<0.05）；主動(dòng)脈中TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著低于模型對照組（P<0.05），IL-10的mRNA表達(dá)水平顯著高于模型對照組（P<0.05）。這表明乳酸桿菌能夠調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠炎癥因子的表達(dá)，降低促炎因子TNF-α的水平，升高抗炎因子IL-10的水平，從而抑制炎癥反應(yīng)，且高劑量乳酸桿菌的作用效果更為顯著。其機(jī)制可能是乳酸桿菌通過與腸道上皮細(xì)胞相互作用，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，進(jìn)而影響全身炎癥反應(yīng)。乳酸桿菌還可能通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)。例如，短鏈脂肪酸可以抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生。5.2.2NF-κB信號通路激活情況NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在正常生理狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，如TNF-α、IL-1等炎癥因子的作用，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化，進(jìn)而被泛素化降解。NF-κB得以釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，激活一系列炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如TNF-α、IL-1、IL-6等，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。本研究通過westernblot檢測了核因子P65（NF-κBP65）信號通路相關(guān)蛋白，如總蛋白核因子KB抑制蛋白α（IκB-α）、胞漿蛋白和胞核蛋白NF-κBP65的蛋白表達(dá)水平，以探究乳酸桿菌對NF-κB信號通路激活情況的影響。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠主動(dòng)脈組織中IκB-α蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），胞核蛋白NF-κBP65表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），表明在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，NF-κB信號通路被激活。給予乳酸桿菌干預(yù)后，乳酸桿菌低劑量組小鼠主動(dòng)脈組織中IκB-α蛋白表達(dá)水平較模型對照組有所升高，胞核蛋白NF-κBP65表達(dá)水平有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。乳酸桿菌高劑量組小鼠主動(dòng)脈組織中IκB-α蛋白表達(dá)水平顯著高于模型對照組（P<0.05），胞核蛋白NF-κBP65表達(dá)水平顯著低于模型對照組（P<0.05）。這表明乳酸桿菌能夠抑制ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈組織中NF-κB信號通路的激活，減少IκB-α的降解，抑制NF-κBP65進(jìn)入細(xì)胞核，從而減少炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用，且高劑量乳酸桿菌的抑制效果更為明顯。其作用機(jī)制可能是乳酸桿菌通過調(diào)節(jié)腸道菌群，影響腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物和信號分子，進(jìn)而抑制NF-κB信號通路的激活。乳酸桿菌還可能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制NF-κB信號通路的激活。例如，乳酸桿菌可能通過抑制TLR/NF-κB信號通路，減少炎癥因子的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)。5.3調(diào)節(jié)腸道菌群近年來，腸道菌群與動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)聯(lián)受到了廣泛關(guān)注。腸道菌群作為人體腸道內(nèi)龐大而復(fù)雜的微生物群落，對宿主的代謝、免疫和腸道屏障功能等方面都有著重要影響。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，腸道菌群的失衡被認(rèn)為是一個(gè)潛在的危險(xiǎn)因素。腸道菌群失衡可能導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的改變，如短鏈脂肪酸、膽汁酸等的產(chǎn)生異常，進(jìn)而影響脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等過程。腸道菌群還可能通過影響腸道屏障功能，增加腸道通透性，使有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。乳酸桿菌作為腸道內(nèi)的重要益生菌，可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能，對動(dòng)脈粥樣硬化的形成產(chǎn)生影響，下面將從腸道菌群組成與數(shù)量變化以及對腸上皮細(xì)胞的作用兩方面進(jìn)行分析。5.3.1腸道菌群組成與數(shù)量變化腸道菌群的組成和數(shù)量平衡對維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定至關(guān)重要，其失衡與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括動(dòng)脈粥樣硬化。本研究利用選擇性培養(yǎng)基，對不同組小鼠糞便樣本中的大腸桿菌、乳酸桿菌等菌群進(jìn)行分離培養(yǎng)和菌落鑒定計(jì)數(shù)，以分析腸道菌群組成與數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量顯著增加（P<0.01），乳酸桿菌數(shù)量顯著減少（P<0.01），表明ApoE-/-小鼠在高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)下，腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，出現(xiàn)了菌群失衡現(xiàn)象。給予乳酸桿菌干預(yù)后，乳酸桿菌低劑量組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量較模型對照組有所減少，乳酸桿菌數(shù)量有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。乳酸桿菌高劑量組小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌數(shù)量顯著低于模型對照組（P<0.05），乳酸桿菌數(shù)量顯著高于模型對照組（P<0.05），說明高劑量乳酸桿菌能夠有效調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌乳酸桿菌的數(shù)量，減少有害菌大腸桿菌的數(shù)量，改善腸道菌群失衡狀態(tài)。這種調(diào)節(jié)作用可能是乳酸桿菌通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)、黏附位點(diǎn)以及產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式實(shí)現(xiàn)的。乳酸桿菌在腸道內(nèi)與大腸桿菌競爭有限的營養(yǎng)資源，使其生長受到抑制。乳酸桿菌還能通過表面黏附素與腸道上皮細(xì)胞特異性結(jié)合，占據(jù)黏附位點(diǎn)，阻止大腸桿菌的黏附，減少其在腸道內(nèi)的定植。乳酸桿菌在代謝過程中產(chǎn)生的乳酸、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，可直接抑制大腸桿菌的生長繁殖。5.3.2對腸上皮細(xì)胞的作用腸上皮細(xì)胞作為腸道屏障的重要組成部分，其增殖和屏障功能對于維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和防止有害物質(zhì)入侵至關(guān)重要。乳酸桿菌可能通過與腸上皮細(xì)胞相互作用，影響其增殖和屏障功能，進(jìn)而對動(dòng)脈粥樣硬化的形成產(chǎn)生影響。采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞作為腸上皮細(xì)胞模型，研究乳酸桿菌對腸上皮細(xì)胞增殖的影響。將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別加入不同濃度的乳酸桿菌菌液進(jìn)行共培養(yǎng)。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，與對照組相比，低濃度乳酸桿菌菌液（1×10?CFU/mL）對Caco-2細(xì)胞增殖無明顯影響（P>0.05），而高濃度乳酸桿菌菌液（1×10?CFU/mL）能夠顯著促進(jìn)Caco-2細(xì)胞增殖（P<0.05）。這表明乳酸桿菌在一定濃度下可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖，可能有助于維持腸道上皮的完整性和修復(fù)能力。通過檢測細(xì)胞單層的跨膜電阻（TEER）和熒光素鈉的通透率，評估乳酸桿菌對腸上皮細(xì)胞屏障功能的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，模型組（加入脂多糖LPS處理模擬炎癥狀態(tài)）細(xì)胞單層的TEER值顯著降低（P<0.01），熒光素鈉通透率顯著升高（P<0.01），說明炎癥狀態(tài)下腸上皮細(xì)胞屏障功能受損。而加入乳酸桿菌菌液共培養(yǎng)后，乳酸桿菌低劑量組細(xì)胞單層的TEER值較模型組有所升高，熒光素鈉通透率有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。乳酸桿菌高劑量組細(xì)胞單層的TEER值顯著高于模型組（P<0.05），熒光素鈉通透率顯著低于模型組（P<0.05），表明高劑量乳酸桿菌能夠有效改善炎癥狀態(tài)下腸上皮細(xì)胞的屏障功能，減少腸道通透性，防止有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，從而減輕炎癥反應(yīng)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。其機(jī)制可能是乳酸桿菌通過調(diào)節(jié)緊密連接蛋白的表達(dá)，如ZO-1、Occludin等，增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，從而維護(hù)腸道屏障功能。六、研究結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及作用機(jī)制，取得了以下重要結(jié)論：乳酸桿菌抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成：通過對小鼠主動(dòng)脈大體形態(tài)觀察以及主動(dòng)脈根部切片分析發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌能夠顯著減少ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊面積，改善主動(dòng)脈粥樣斑塊的病理結(jié)構(gòu)，減輕炎癥反應(yīng)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。其中，高劑量乳酸桿菌的作用效果更為顯著，表明乳酸桿菌對動(dòng)脈粥樣硬化的抑制作用存在一定的劑量依賴性。乳酸桿菌調(diào)節(jié)血脂代謝：在血脂代謝方面，雖然乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有降低總膽固醇和甘油三酯水平、降低低密度脂蛋白膽固醇水平以及升高高密度脂蛋白膽固醇水平的趨勢，提示乳酸桿菌可能在一定程度上對血脂代謝有調(diào)節(jié)作用，只是本研究中這種作用效果不明顯，可能與多種因素有關(guān)，如實(shí)驗(yàn)所用乳酸桿菌的菌株、劑量、干預(yù)時(shí)間等。乳酸桿菌調(diào)節(jié)脂肪組織：從脂肪組織的研究來看，乳酸桿菌能夠抑制ApoE-/-小鼠附睪脂肪組織中脂肪細(xì)胞的肥大和脂質(zhì)蓄積，改善附睪脂肪組織的細(xì)胞形態(tài)。高劑量乳酸桿菌還能調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)酶的活性，抑制脂肪酸合成酶活性，促進(jìn)激素敏感性脂肪酶活性，調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，降低過氧化物酶體增殖物激活受體γ基因表達(dá)，升高脂聯(lián)素基因表達(dá)，從而減少脂肪在脂肪組織中的蓄積，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。乳酸桿菌調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激：在氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)方面，乳酸桿菌具有明顯的作用。高劑量乳酸桿菌能夠有效降低ApoE-/-小鼠血清中氧化型低密度脂蛋白的含量，提高血清和肝臟中抗氧化酶超氧化物歧化酶的活性，降低氧化產(chǎn)物丙二醛的含量，升高谷胱甘肽的水平，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。乳酸桿菌調(diào)控炎癥反應(yīng)：乳酸桿菌對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用顯著。高劑量乳酸桿菌能夠調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠炎癥因子的表達(dá)，降低血清和主動(dòng)脈中促炎因子腫瘤壞死因子-α的水平，升高抗炎因子白細(xì)胞介素-10的水平。同時(shí)，乳酸桿菌能夠抑制主動(dòng)脈組織中核因子-κB信號通路的激活，減少核因子KB抑制蛋白α的降解，抑制核因子P65進(jìn)入細(xì)胞核，從而減少炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。乳酸桿菌調(diào)節(jié)腸道菌群：在腸道菌群調(diào)節(jié)方面，高劑量乳酸桿菌能夠有效調(diào)節(jié)ApoE-/-小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌乳酸桿菌的數(shù)量，減少有害菌大腸桿菌的數(shù)量，改善腸道菌群失衡狀態(tài)。乳酸桿菌還能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的增殖，改善炎癥狀態(tài)下腸上皮細(xì)胞的屏障功能，減少腸道通透性，防止有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，從而減輕炎癥反應(yīng)，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。6.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與局限性6.2.1創(chuàng)新點(diǎn)多維度機(jī)制研究：本研究從氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和腸道菌群等多個(gè)維度，系統(tǒng)地探討了乳酸桿菌對ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響機(jī)制。以往研究多集中于乳酸桿菌對血脂代謝的影響，而本研究全面分析了乳酸桿菌在不同層面的作用，為深入理解乳酸桿菌抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制提供了更豐富的視角。通過檢測氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，揭示了乳酸桿菌通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激來抑制動(dòng)脈粥樣硬