第2節(jié)

基因工程的基本操作程序【本節(jié)聚焦】1.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個(gè)步驟？2.基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？第1課時(shí)從社會(huì)中來思考：1.你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機(jī)制是什么嗎？2.培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟呢？轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與普通棉花蘇云金桿菌與載體拼接普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取導(dǎo)入抗蟲基因（Bt抗蟲蛋白基因）重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測(cè)與鑒定(含抗蟲基因）（含有并表達(dá)抗蟲基因）從社會(huì)中來知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)基因1基因2基因3DNA片段放大基因通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段；能編碼特定的蛋白質(zhì)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步編碼（翻譯）出蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段不能轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的mRNA，不能編碼蛋白質(zhì)的區(qū)段獲取目的基因一般獲取哪一部分的DNA片段？基因編碼區(qū)知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA啟動(dòng)子終止子本質(zhì)：位置：作用：是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；位于基因上游；也是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段；位于基因下游；終止轉(zhuǎn)錄本質(zhì)：位置：作用：?jiǎn)?dòng)子終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子外顯子：內(nèi)含子：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列。能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，但卻不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，然后在翻譯前就被剪切掉。真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)知識(shí)拓展：基因的結(jié)構(gòu)【總結(jié)】原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較不能編碼蛋白質(zhì)的序列=

非編碼區(qū)原核生物的基因：不能編碼蛋白質(zhì)的序列真核生物的基因：=非編碼區(qū)+內(nèi)含子原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的

和具有調(diào)控作用的

區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼一、目的基因的篩選與獲取(1)概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。(2)實(shí)例：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。1.目的基因資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。科學(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因那么，如何篩選目的基因呢？一、目的基因的篩選與獲取2.目的基因的篩選：蘇云金桿菌制成殺蟲劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結(jié)構(gòu)防治棉花害蟲發(fā)現(xiàn)殺蟲作用與Bt基因有關(guān)掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物(Bt抗蟲蛋白)如何掌握？抗蟲原理？

當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。思考：Bt抗蟲蛋白會(huì)不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體。Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因怎么獲得？一、目的基因的篩選與獲取測(cè)序技術(shù)序列數(shù)據(jù)庫序列比對(duì)工具利用測(cè)序技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）、序列對(duì)比工具（如BLAST）等，找到合適的目的基因DNA測(cè)序儀核苷酸序列比對(duì)氨基酸序列比對(duì)美國(guó)國(guó)家生物信息中心測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)序列以堿基順序或氨基酸殘基順序?yàn)榛緝?nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較的工具。通過比對(duì)識(shí)別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能。拓展：掌握基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法3、獲取目的基因常用的方法①從生物組織中直接獲取②人工合成③從基因文庫中獲取④利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成基因組文庫（某生物全部基因）部分基因文庫（主要是cDNA文庫）前提：方法：一、目的基因的篩選與獲取DNA合成儀4、從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。基因組文庫部分基因文庫（包含一種生物的所有基因）（cDNA文庫）（包含一種生物的一部分基因）一、目的基因的篩選與獲取（1）基因文庫概念（2）基因文庫類型基因組DNA限制酶切基因組文庫mRNA逆轉(zhuǎn)錄得cDNA,酶切cDNA文庫拼接質(zhì)粒，導(dǎo)入細(xì)菌中保存為文庫一、目的基因的篩選與獲取（3）基因文庫的構(gòu)建

先對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增獲取一個(gè)Bt基因之后，是否就該立即開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)基因操作？

抗蟲基因快速獲得大量抗蟲基因蘇云金桿菌提取一、目的基因的篩選與獲取5.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR是

的縮寫。它是一項(xiàng)根據(jù)＿＿＿＿＿的原理，在

提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)

的技術(shù)。（1）PCR的概念：中文全稱原理操作環(huán)境目的PCR擴(kuò)增儀聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。離心管一、目的基因的篩選與獲取(2)原理：DNA半保留復(fù)制，即在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。5.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一、目的基因的篩選與獲取DNA復(fù)制的條件:原則:③能量：親代DNA的兩條鏈4種游離的脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶、DNA連接酶等由細(xì)胞代謝提供的ATP①模板：②原料：④酶：

堿基互補(bǔ)配對(duì)原則從子鏈的5'端向3'端延伸方向:特點(diǎn):邊解旋邊復(fù)制、半保留復(fù)制

、多起點(diǎn)雙向復(fù)制體外復(fù)制怎么改進(jìn)體外用高溫代替體外需用耐高溫的DNA聚合酶子鏈合成需要引物

引物為DNA聚合酶提供了游離的3′端，使DNA聚合酶從3′端延伸子鏈。(DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能)5.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一、目的基因的篩選與獲取引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2引物可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈，體內(nèi)的DNA復(fù)制通常以RNA單鏈為引物體外（PCR）一般以DNA單鏈為引物用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20~30個(gè)核苷酸。引物結(jié)合在模板鏈的3’端一、目的基因的篩選與獲取體內(nèi)DNA復(fù)制參與的組分在DNA復(fù)制中的作用PCR中參與的組分解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常為小的單鏈RNA）無需解旋酶，用高溫代替DNA（目的基因）模板4種脫氧核苷酸(dNTP)耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常與兩條模板鏈結(jié)合的2種為小的單鏈DNA）反應(yīng)還需要其它條件，如緩沖液（一般添加Mg2+）、和控溫設(shè)備打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸(3)PCR的進(jìn)行需要的條件5.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因dNTP和ATP類似,不但可以提供原料還可以提供能量，無需添加ATP。一、目的基因的篩選與獲取當(dāng)溫度超過_____以上時(shí)，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA待擴(kuò)增的DNA片段(1)變性：變性90℃3’3’5’5’3’5’3’5’不需要解旋酶思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個(gè)溫度范圍，而不是95℃？因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時(shí)，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時(shí)，所需溫度也就越低。(4)PCR反應(yīng)的過程5.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因一、目的基因的篩選與獲取(4)PCR反應(yīng)的過程5.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因當(dāng)溫度下降

到左右時(shí)，

種引物通過

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

3’5’3’5’堿基互補(bǔ)配對(duì)引物15’3’引物25’3’(2)復(fù)性：50℃兩由于DNA雙鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模孕枰獌煞N引物思考：為什么需要引物？引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因?yàn)門aq酶不能從0開始添加核苷酸。②引物結(jié)合在DNA模板鏈

3'端位置，引導(dǎo)子鏈從5'端→3'端方向復(fù)制。一、目的基因的篩選與獲取(4)PCR反應(yīng)的過程5.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因當(dāng)溫度上升到____左右時(shí)，溶液中的4種_________在耐高溫的_______________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。

脫氧核苷酸DNA聚合酶72℃(3)延伸：(Taq酶)3’5’3’5’引物15’3’引物25’3’Taq酶3’Taq酶3’思考1：為什么溫度要上升至72℃？思考2：Taq酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？72℃是Taq酶的最適溫度Taq酶結(jié)合在引物的3’端一、目的基因的篩選與獲取耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶）4種脫氧核苷酸（dNTP）引物待擴(kuò)增的DNA片段（模板）5’5’

變性

復(fù)性

延伸溫度上升到90℃以上，雙鏈DNA解聚為單鏈當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA鏈。長(zhǎng)度相同但C-G含量高的引物需要設(shè)定的復(fù)性溫度較高(4)PCR反應(yīng)的過程一、目的基因的篩選與獲取(4)PCR反應(yīng)的過程一、目的基因的篩選與獲取①DNA分子有_____個(gè)②總鏈數(shù)_____條③不含引物的鏈數(shù)：___④含引物的鏈數(shù)_____⑤含引物1或2的鏈數(shù)：______⑥僅含引物1的DNA數(shù)：______⑦僅含引物2的DNA數(shù)：______⑧引物1、2均含有的DNA數(shù)：_____⑨不含引物的DNA數(shù)：______⑩需要引物的總數(shù)：______2n2n+122n+1-2循環(huán)n次：2n-1112n-202n+1-2★(4)PCR反應(yīng)的過程一、目的基因的篩選與獲取用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。1.逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA一、目的基因的篩選與獲取

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段(即出現(xiàn)完整的目的基因)？5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’一、目的基因的篩選與獲取(5)PCR產(chǎn)物鑒定PCR過程可以在

中自動(dòng)完成，完成以后，常采用

來鑒定PCR的產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增儀探究?實(shí)踐——DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理：一、實(shí)驗(yàn)原理(1)PCR利用了

原理，通過調(diào)節(jié)

來控制DNA雙鏈的

，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器。(2)PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了

的原理。一次PCR一般要經(jīng)歷

次循環(huán)。DNA的熱變性溫度解聚與結(jié)合DNA半保留復(fù)制305’--3’3’--5’3’--5’5’--3’5’--3’-5’5’-3’--5’5’--3’-5’5’-3’--5’3’--3’高溫變性延伸復(fù)性低溫中溫1次循環(huán)一.實(shí)驗(yàn)原理2、DNA片段電泳鑒定的原理DNA分子具有______________，在一定的____下，這些基團(tuán)可以帶上________________，在_________的作用下，這些___________會(huì)向著____________________的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是_____。可解離的基團(tuán)pH正電荷或負(fù)電荷帶電分子電泳與它所帶電荷相反電場(chǎng)在凝膠中DNA分子的遷移速率與_____________、_________________和_______等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過_____，可以在波長(zhǎng)為________的________下被檢測(cè)出來。凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象探究?實(shí)踐——DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定探究?實(shí)踐——DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）PCR儀電泳裝置⑤電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）微量離心管推動(dòng)桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭（注意：加不同樣品時(shí)，需要更換槍頭）二、材料用具1.儀器:探究?實(shí)踐——DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定二、材料用具2.試劑:(1)4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水。10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μLPCR反應(yīng)體系的配方為保證加入反應(yīng)體系中的各試劑體積的準(zhǔn)確性，建議按照加入體積的大小，由大到小依次加入各試劑，即先加入無菌水。為保護(hù)酶的活性，一般最后加入DNA聚合酶。探究?實(shí)踐——DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定(1)DNA片段的擴(kuò)增①移液：用微量移液器依次將各組分加入微量離心管中。（注意：酶和緩沖液要在冰塊上緩慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和緩沖液一般分裝成小份，避免反復(fù)融化導(dǎo)致活性降低甚至失活）②離心：待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）③反應(yīng)：參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min

使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合預(yù)變性：三、實(shí)驗(yàn)步驟探究?實(shí)踐——DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定①熔化：電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%～1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。②倒模:將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞撸⒉迦牒线m大小的梳子，以形成加樣孔。③凝固:待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。（2）制備凝膠三、實(shí)驗(yàn)步驟探究?實(shí)踐——DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定（3）進(jìn)行電泳①加液：將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。②加樣：擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。③電泳：接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳④觀察鑒定:取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相。三、實(shí)驗(yàn)步驟探究?實(shí)踐——DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定三、實(shí)驗(yàn)步驟注意：1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲(chǔ)存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。探究?實(shí)踐——DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析評(píng)價(jià)[思考1]你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？

以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶。[思考2]你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因。①如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：

漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取＂谌绻麛U(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：

引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；復(fù)性溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好；模板DNA出現(xiàn)污染；Mg2＋濃度過高等。耐高溫的DNA聚合酶失活；引物出現(xiàn)質(zhì)量問題；變性時(shí)溫度低，變性時(shí)間短;Mg2+濃度過低③未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶可能的原因有：拓展：PCR引物設(shè)計(jì)DNA復(fù)制為何需要引物？

不能從頭合成：DNA聚合酶無法在沒有游離羥基（3'-OH）的情況下從頭開始合成新鏈。它只能將核苷酸添加到已有的核酸鏈的3'-OH末端上。引物的作用:使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。合成引物的前提:要有一段已知目的基因的核苷酸序列。5’--3’-5’3’-引物子鏈延伸5’-3’引物子鏈延伸引物是決定PCR特異性的關(guān)鍵。3’--5’【典例1】對(duì)人干擾素基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)需要一對(duì)引物，應(yīng)從下圖中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取__________（填字母）作為引物。B、C1、引物需位于目的基因的兩側(cè)、且能順利擴(kuò)增出目的基因2、引物只能與模板鏈的3’端結(jié)合，引導(dǎo)子鏈從5’端向3’端延伸拓展：PCR引物設(shè)計(jì)1、引物的選擇總結(jié)：【典例2】(2023·山東，25節(jié)選)科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J－V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物____________________。F2和R1或F1和R2拓展：PCR引物設(shè)計(jì)1、引物的選擇總結(jié):用PCR擴(kuò)增分析法確定重組質(zhì)粒中目的基因插入方向是否正確時(shí)，設(shè)計(jì)的一對(duì)引物的特點(diǎn)是：一個(gè)引物與目的基因序列互補(bǔ)，另一個(gè)引物與質(zhì)粒序列互補(bǔ)，兩引物延伸方向相對(duì)。拓展：PCR引物設(shè)計(jì)2、引物的設(shè)計(jì)原則【典例3】(2017·江蘇)設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物（只標(biāo)注了部分堿基序列）都不合理（見圖），請(qǐng)分別說明理由。(1)第1組：

。(2)第2組：

。引物Ⅰ′自身折疊后互補(bǔ)配對(duì)而失效引物Ⅰ與引物Ⅱ局部互補(bǔ)配對(duì)而失效5'3'5'3'3'5'【典例4】(2020·江蘇，33節(jié)選)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖：若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號(hào))拓展：PCR引物設(shè)計(jì)2、引物的設(shè)計(jì)原則②和④總結(jié):1.

若待擴(kuò)增序列的兩端已知，則所用兩條引物的方向_____（相對(duì)或相反）2.若DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時(shí)，則所選引物應(yīng)朝向已知序列的_______（外側(cè)或內(nèi)側(cè)）（即反向PCR技術(shù)）相對(duì)外側(cè)拓展：PCR引物設(shè)計(jì)3、引物的修飾為了使PCR產(chǎn)物能連接到載體上，可以在擴(kuò)增過程中添加限制酶識(shí)別位點(diǎn)。可在引物的

端添加限制酶識(shí)別位點(diǎn).5′目的基因兩側(cè)無限制酶切位點(diǎn)？【典例5】研究者利用圖中質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子并導(dǎo)入大腸桿菌，獲得生產(chǎn)胰島素的工程菌，成為生產(chǎn)胰島素的“活工廠”。已知胰島素基因的α鏈為轉(zhuǎn)錄模板，據(jù)圖分析，利用PCR擴(kuò)增胰島素基因時(shí)，需對(duì)引物

進(jìn)行特殊處理，處理方式為

。3′5′mRNA3′5′3′5′強(qiáng)啟動(dòng)子BamHⅠSalⅠ②和③在引物③的5’端添加BamHⅠ識(shí)別序列和強(qiáng)啟動(dòng)子在引物②的5’端添加SalⅠ識(shí)別序列(1)據(jù)圖分析，應(yīng)選用

酶切割質(zhì)粒，以保證質(zhì)粒與目的基因高效重組。【典例6】

鎘(Cd)作為一種重金屬元素，會(huì)嚴(yán)重威脅人體健康。科研人員將Cd響應(yīng)啟動(dòng)子CadR與綠色熒光蛋白基因(EGFP)組合在一起導(dǎo)入大腸桿菌，構(gòu)建能夠檢測(cè)環(huán)境中Cd污染的生物傳感器。已知LacZ基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色。相關(guān)信息如圖所示，其中P1、P2、P3表示引物。MunI和XhoI

(2)已知EGFP基因轉(zhuǎn)錄得到的RNA中缺乏起始密碼子AUG。利用PCR技術(shù)獲取EGFP基因時(shí)，為保證EGFP基因能正確插入載體且可以正常表達(dá)，除選擇引物P1外，還需要選擇引物

,并在其

5'端增加堿基序列

5'

3'。【典例6】

鎘(Cd)作為一種重金屬元素，會(huì)嚴(yán)重威脅人體健康。科研人員將Cd響應(yīng)啟動(dòng)子CadR與綠色熒光蛋白基因(EGFP)組合在一起導(dǎo)入大腸桿菌，構(gòu)建能夠檢測(cè)環(huán)境中Cd污染的生物傳感器。已知LacZ基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色。相關(guān)信息如圖所示，其中P1、P2、P3表示引物。P2GAATTCATG

歸納總結(jié)：PCR引物設(shè)計(jì)原則擴(kuò)增特異性擴(kuò)增高效性引物拓展：PCR引物設(shè)計(jì)①引物與一段已知目的基因的核苷酸序列互補(bǔ)配對(duì)②引物__________________不應(yīng)存在互補(bǔ)序列③引物_______可以修飾，______不可修飾④引物_______要適宜⑤引物__________要適宜長(zhǎng)度GC含量3'端5'端自身及引物之間通常20-30bp45-55%課堂練習(xí)PCR無需解旋酶，用高溫代替1.下列有關(guān)體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR技術(shù)比較的敘述，錯(cuò)誤的是A.二者子鏈的延伸方向相同，均為5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破壞氫鍵來實(shí)現(xiàn)解旋C.體內(nèi)DNA復(fù)制需要能量，PCR反應(yīng)也需要能量D.二者遵循的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則相同√課堂練習(xí)7/82.下圖表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的部分過程，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。下列敘述錯(cuò)誤的是A.耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端B.在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段C.引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，則不能有效擴(kuò)增目的基因D.從理論上推測(cè)，第三輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段占3/4√思考：能不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，為什么？如果不能，如何避免該結(jié)果的發(fā)生呢？

①游離的DNA進(jìn)入細(xì)胞后，一般會(huì)直接被分解。

②就算沒有被破壞且能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，游離的DNA也無法跟著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中不再含有目的基因。核心工作——基因表達(dá)載體構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1.目的：2.基因表達(dá)載體的組成：（1）使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。思考：各個(gè)元件有什么作用？二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因：能控制表達(dá)所需要的特殊性狀啟動(dòng)子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。復(fù)制原點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)終止子：位置：基因的下游功能：終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：便于重組DNA分子的篩選。2.基因表達(dá)載體的組成：（啟動(dòng)子=起始密碼?）（終止子=終止密碼?）二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)位置功能DNA片段DNA片段mRNA上三個(gè)相鄰的堿基mRNA上三個(gè)相鄰的堿基目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(hào)（編碼氨基酸）翻譯的結(jié)束信號(hào)（不編碼氨基酸）二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因應(yīng)該插入什么位置？

目的基因插入位點(diǎn)不是隨意的：基因表達(dá)載體需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入

，若目的基因插入啟動(dòng)子部位，啟動(dòng)子將失去原功能。啟動(dòng)子和終止子之間的部位誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子誘導(dǎo)物作用激活或抑制目的基因表達(dá)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程:DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種載體（質(zhì)粒）二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割（單酶切），是否只會(huì)得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接反向連接11’22’122’1’22’1’1選擇兩種不同的限制酶同時(shí)對(duì)目的