c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體凋亡機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌作為全球女性健康的重大威脅，發(fā)病率逐年攀升。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已取代肺癌，成為全球第一大癌癥，當(dāng)年新增病例高達(dá)226萬例，占女性惡性腫瘤發(fā)病的24.5%。在中國(guó)，乳腺癌同樣呈現(xiàn)出高發(fā)態(tài)勢(shì)，發(fā)病率以每年約3%的速度增長(zhǎng)，已躍居女性惡性腫瘤之首。乳腺癌不僅嚴(yán)重影響患者的身體健康，還對(duì)其心理健康和生活質(zhì)量造成巨大沖擊，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。盡管當(dāng)前乳腺癌的治療手段不斷豐富，涵蓋手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等，但仍存在諸多挑戰(zhàn)。部分乳腺癌患者對(duì)現(xiàn)有治療方案反應(yīng)不佳，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高，尤其是三陰性乳腺癌（TNBC）患者，由于缺乏雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）的表達(dá)，無法從內(nèi)分泌治療和HER-2靶向治療中獲益，預(yù)后相對(duì)較差。此外，長(zhǎng)期使用化療藥物易引發(fā)耐藥性，導(dǎo)致治療失敗，尋找新的治療靶點(diǎn)和作用機(jī)制成為乳腺癌研究領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。線粒體凋亡途徑在細(xì)胞命運(yùn)決定中扮演著核心角色，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外源性凋亡刺激時(shí)，線粒體膜通透性發(fā)生改變，釋放出細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究表明，許多腫瘤細(xì)胞存在線粒體凋亡途徑的異常，這為腫瘤治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。HCC1937細(xì)胞作為一種重要的乳腺癌細(xì)胞系，具有TNBC的典型特征，深入探究其線粒體凋亡機(jī)制，對(duì)于揭示TNBC的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。c-myc基因作為一種原癌基因，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。約40%的乳腺癌患者存在c-myc基因擴(kuò)增，其過表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后密切相關(guān)。p21基因作為一種重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和抑癌基因，可被p53等多種因素誘導(dǎo)表達(dá)，通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。越來越多的研究表明，p21還參與細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程，在腫瘤抑制中發(fā)揮著多效性作用。已有研究發(fā)現(xiàn)c-myc與p21之間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，c-myc可通過多種途徑調(diào)節(jié)p21的表達(dá)，而p21也可反饋調(diào)節(jié)c-myc的功能。然而，在乳腺癌HCC1937細(xì)胞中，c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)線粒體凋亡的具體機(jī)制尚不清楚。本研究聚焦于c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體凋亡的機(jī)制，旨在揭示這一關(guān)鍵信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。通過深入研究c-myc、p21與線粒體凋亡之間的內(nèi)在聯(lián)系，有望為開發(fā)高效、低毒的乳腺癌治療藥物奠定基礎(chǔ)，提高乳腺癌患者的生存率和生活質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀c-myc基因作為一種重要的原癌基因，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮著核心調(diào)控作用，其與腫瘤的關(guān)聯(lián)一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。早在20世紀(jì)70年代，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)c-myc基因在多種腫瘤中存在異常表達(dá)。在乳腺癌領(lǐng)域，大量研究表明約40%的乳腺癌患者存在c-myc基因擴(kuò)增現(xiàn)象。c-myc基因的過表達(dá)可通過多種途徑促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，它能夠調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促使細(xì)胞繞過正常的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，加速細(xì)胞增殖。c-myc還能通過激活端粒酶活性，維持腫瘤細(xì)胞的永生化，使其獲得無限增殖的能力。此外，c-myc在乳腺癌細(xì)胞的代謝重編程中也扮演著關(guān)鍵角色，它可調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝等相關(guān)基因的表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和增殖提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移方面，c-myc可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，增加乳腺癌患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和不良預(yù)后。p21基因作為細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控因子和重要的抑癌基因，在腫瘤研究中也備受關(guān)注。p21基因的表達(dá)主要受p53基因的調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激信號(hào)時(shí)，p53蛋白被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)p21基因的表達(dá)。p21蛋白通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，從而阻止細(xì)胞的異常增殖。在乳腺癌中，p21基因的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，p21基因的低表達(dá)或缺失與乳腺癌的惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后呈正相關(guān)。此外，p21還參與細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)等過程，在維持基因組穩(wěn)定性和抑制腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著多效性作用。有研究表明，p21可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，影響線粒體膜的通透性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一，近年來在腫瘤研究中取得了顯著進(jìn)展。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中扮演著核心角色，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外源性凋亡刺激時(shí)，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放，導(dǎo)致線粒體膜電位（ΔΨm）下降，細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3等效應(yīng)分子，引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，線粒體還可釋放凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）等蛋白，直接作用于細(xì)胞核，導(dǎo)致染色質(zhì)凝集和DNA片段化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在乳腺癌中，線粒體凋亡途徑的異常與腫瘤細(xì)胞的耐藥性、侵襲性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，一些乳腺癌細(xì)胞通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制線粒體膜通透性的改變，從而逃避凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性。盡管c-myc、p21與乳腺癌及線粒體凋亡的研究取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多空白。在乳腺癌HCC1937細(xì)胞中，c-myc如何通過p21介導(dǎo)線粒體凋亡的具體分子機(jī)制尚不明確。c-myc與p21之間除了已知的調(diào)控關(guān)系外，是否還存在其他未知的交互作用，以及這些作用如何影響線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵分子和信號(hào)通路，有待進(jìn)一步深入探究。此外，目前對(duì)于c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)的線粒體凋亡機(jī)制在乳腺癌治療中的應(yīng)用研究相對(duì)較少，如何基于這一機(jī)制開發(fā)新的治療策略，提高乳腺癌的治療效果，也是亟待解決的問題。1.3研究目的與方法本研究旨在深入解析c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)HCC1937細(xì)胞線粒體凋亡的詳細(xì)分子機(jī)制，為乳腺癌的治療提供全新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。具體研究目的包括：明確c-myc、p21在HCC1937細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響；探究c-myc對(duì)p21表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，以及p21在c-myc介導(dǎo)的線粒體凋亡中的作用；揭示c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)線粒體凋亡途徑中關(guān)鍵分子和信號(hào)通路的變化。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將采用多種實(shí)驗(yàn)方法。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用乳腺癌HCC1937細(xì)胞作為研究對(duì)象，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）技術(shù)，檢測(cè)c-myc、p21及線粒體凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，通過精確的核酸定量分析，從轉(zhuǎn)錄層面揭示基因表達(dá)的變化規(guī)律。利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblotting），對(duì)c-myc、p21及線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，從蛋白質(zhì)層面深入了解細(xì)胞內(nèi)分子的動(dòng)態(tài)變化。借助細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建c-myc過表達(dá)和p21敲低的HCC1937細(xì)胞模型，通過改變細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)狀態(tài)，觀察細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，從而明確基因之間的調(diào)控關(guān)系和功能作用。運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8法），精確評(píng)估細(xì)胞的增殖能力，以直觀的數(shù)據(jù)反映基因表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)，準(zhǔn)確檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，深入分析細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況，為研究線粒體凋亡機(jī)制提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支持。在機(jī)制研究方面，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證c-myc對(duì)p21基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用，通過檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，明確兩者之間的直接調(diào)控關(guān)系。利用染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP），探究c-myc與p21基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況，從分子層面揭示基因調(diào)控的作用方式。借助免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（Co-IP），研究p21與線粒體凋亡相關(guān)蛋白之間的相互作用，深入挖掘細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)和信號(hào)傳導(dǎo)途徑。通過線粒體膜電位檢測(cè)、細(xì)胞色素C釋放檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)，全面分析線粒體凋亡途徑中關(guān)鍵事件的變化，深入解析線粒體凋亡的分子機(jī)制。此外，本研究還將運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，對(duì)相關(guān)基因和蛋白的序列、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，從大數(shù)據(jù)層面為實(shí)驗(yàn)研究提供理論指導(dǎo)和研究思路。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1乳腺癌概述乳腺癌是一種起源于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著全球女性的健康。在女性惡性腫瘤中，乳腺癌的發(fā)病率位居首位，且呈逐年上升趨勢(shì)。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、激素、生活方式等多種因素。乳腺癌的發(fā)生與乳腺導(dǎo)管和小葉上皮細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)，這些細(xì)胞在致癌因素的作用下，逐漸失去正常的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，不斷增殖并侵襲周圍組織，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。根據(jù)病理特征，乳腺癌主要分為非浸潤(rùn)性癌、浸潤(rùn)性癌和其他罕見癌三大類。非浸潤(rùn)性癌又稱原位癌，病變局限于乳腺導(dǎo)管或腺泡內(nèi)，未突破基底膜，未發(fā)生轉(zhuǎn)移，如小葉原位癌、導(dǎo)管原位癌和乳頭濕疹樣乳腺癌等，此型屬于早期，預(yù)后相對(duì)較好。浸潤(rùn)性癌是指癌細(xì)胞已突破基底膜，侵犯周圍組織，包括浸潤(rùn)性非特殊癌和浸潤(rùn)性特殊癌。浸潤(rùn)性非特殊癌較為常見，約占乳腺癌的80%，如浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性小葉癌、硬癌、單純癌等；浸潤(rùn)性特殊癌相對(duì)少見，包括乳頭狀癌、大汗腺癌、鱗狀細(xì)胞癌等。其他罕見癌則包括梭形細(xì)胞癌、印戒細(xì)胞癌等，發(fā)生幾率較低。此外，乳腺癌還可根據(jù)分子特征進(jìn)行分型，常見的有LuminalA型、LuminalB型、HER2過表達(dá)型和基底樣型（三陰性乳腺癌）。不同分型的乳腺癌在治療方案和預(yù)后上存在顯著差異，LuminalA型和LuminalB型對(duì)內(nèi)分泌治療較為敏感，HER2過表達(dá)型可采用抗HER2靶向治療，而基底樣型（三陰性乳腺癌）由于缺乏有效的治療靶點(diǎn)，預(yù)后相對(duì)較差。HCC1937細(xì)胞是一種重要的乳腺癌細(xì)胞系，于1995年10月13日從原發(fā)性導(dǎo)管癌中分離獲得，腫瘤分類為TNMⅡB期，3級(jí)。該細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，其上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志上皮細(xì)胞糖蛋2（EGP2）和細(xì)胞角蛋白19均呈陽(yáng)性，而雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）表達(dá)均為陰性，屬于三陰性乳腺癌細(xì)胞系。此外，HCC1937細(xì)胞存在BRCA15382C突變純合、Tp53突變且野生型等位基因丟失、PTEN基因純合缺失以及多個(gè)與乳腺癌發(fā)病機(jī)理相關(guān)位點(diǎn)的雜合突變。這些特性使得HCC1937細(xì)胞成為研究三陰性乳腺癌發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)及藥物篩選的重要模型。在本研究中，選用HCC1937細(xì)胞作為研究對(duì)象，旨在深入探究c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)線粒體凋亡的機(jī)制，為三陰性乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。2.2線粒體凋亡機(jī)制線粒體凋亡，作為細(xì)胞凋亡的重要途徑之一，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外源性凋亡刺激時(shí)，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生一系列顯著變化，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。這一過程涉及多個(gè)關(guān)鍵分子和信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控，是一個(gè)高度有序且復(fù)雜的生物學(xué)過程。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中扮演著核心角色。正常情況下，線粒體通過氧化磷酸化產(chǎn)生能量，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供動(dòng)力。當(dāng)細(xì)胞遭遇各種凋亡刺激，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等，線粒體膜的通透性會(huì)發(fā)生改變。線粒體內(nèi)外膜之間存在一種特殊的蛋白質(zhì)復(fù)合體，即線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）。在凋亡信號(hào)的作用下，MPTP開放，導(dǎo)致線粒體膜電位（ΔΨm）下降。線粒體膜電位的降低是線粒體凋亡的早期重要事件，它標(biāo)志著線粒體功能的異常改變。線粒體膜電位下降后，線粒體內(nèi)的促凋亡因子被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，其中細(xì)胞色素C的釋放是線粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵步驟。細(xì)胞色素C是一種位于線粒體內(nèi)膜的電子傳遞鏈蛋白，在正常生理狀態(tài)下，它與線粒體膜緊密結(jié)合，參與能量代謝過程。當(dāng)線粒體膜電位下降，MPTP開放，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。Apaf-1含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中的CARD結(jié)構(gòu)域能夠招募并激活caspase-9。caspase-9是一種起始caspase，它被激活后，進(jìn)一步激活下游的caspase-3等效應(yīng)分子。caspase-3具有廣泛的底物特異性，它可以切割細(xì)胞內(nèi)的多種關(guān)鍵蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細(xì)胞骨架蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。除了細(xì)胞色素C，線粒體還釋放其他促凋亡因子，如凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）和核酸內(nèi)切酶G（EndoG）等。AIF是一種黃素蛋白，正常情況下定位于線粒體膜間隙。在凋亡刺激下，AIF從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。AIF進(jìn)入細(xì)胞核后，與DNA結(jié)合，誘導(dǎo)染色質(zhì)凝集和DNA片段化，從而直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。EndoG同樣在線粒體凋亡過程中發(fā)揮重要作用，它從線粒體釋放后，進(jìn)入細(xì)胞核，參與DNA的降解，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。線粒體凋亡途徑受到多種因素的嚴(yán)格調(diào)控，其中Bcl-2家族蛋白是關(guān)鍵的調(diào)控因子。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。抗凋亡蛋白主要通過抑制線粒體膜通透性的改變，阻止促凋亡因子的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡。它們可以與促凋亡蛋白相互作用，形成異源二聚體，阻斷促凋亡蛋白的功能。促凋亡蛋白則通過促進(jìn)線粒體膜通透性的增加，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C等促凋亡因子的釋放，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，促凋亡蛋白的表達(dá)上調(diào)或其活性增強(qiáng)，它們可以寡聚化并插入線粒體膜，形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜電位下降和促凋亡因子的釋放。此外，Bcl-2家族蛋白之間的相互作用還受到多種翻譯后修飾的調(diào)控，如磷酸化、泛素化等，這些修飾可以改變蛋白的活性和穩(wěn)定性，從而精細(xì)地調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑。2.3c-myc與p21基因c-myc基因，作為原癌基因家族中的重要成員，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且功能多樣。c-myc基因定位于人類染色體8q24，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。外顯子1不編碼蛋白質(zhì)，主要參與基因表達(dá)的調(diào)控；外顯子2和外顯子3則編碼一個(gè)包含439個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，即c-myc蛋白。c-myc蛋白是一種核蛋白，包含多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，如N端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、bHLH-ZIP結(jié)構(gòu)域等。其中，bHLH-ZIP結(jié)構(gòu)域能夠與DNA結(jié)合，識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。c-myc蛋白通過與Max蛋白形成異二聚體，結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box元件（5'-CACGTG-3'）上，激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過程。在細(xì)胞增殖方面，c-myc可上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，推動(dòng)細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞代謝中，c-myc能夠調(diào)節(jié)糖代謝、脂代謝等相關(guān)基因的表達(dá)，為細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和增殖提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，c-myc還參與細(xì)胞的分化調(diào)控，在胚胎發(fā)育過程中，c-myc的表達(dá)水平變化與細(xì)胞的分化命運(yùn)密切相關(guān)，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞分化受阻，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。p21基因，全稱為周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A（CDKN1A），是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和抑癌基因。p21基因定位于人類染色體6p21.2，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。其編碼的p21蛋白由164個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為21kDa。p21蛋白含有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，包括N端的周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合結(jié)構(gòu)域、C端的增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）結(jié)合結(jié)構(gòu)域等。p21蛋白的主要功能是通過抑制CDK的活性，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程。在細(xì)胞周期中，p21蛋白可與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，阻止其對(duì)底物的磷酸化作用，從而使細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制細(xì)胞的增殖。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，p53蛋白被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)p21基因的表達(dá)。p21蛋白通過與CDK2-CyclinE、CDK4-CyclinD等復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，使細(xì)胞停滯在G1期，為細(xì)胞修復(fù)損傷的DNA提供時(shí)間，維持基因組的穩(wěn)定性。除了細(xì)胞周期調(diào)控，p21還參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。在某些情況下，p21可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，影響線粒體膜的通透性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡。研究表明，p21可上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。c-myc與p21之間存在復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控關(guān)系，這種關(guān)系在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一方面，c-myc可通過多種途徑調(diào)節(jié)p21的表達(dá)。c-myc能夠直接結(jié)合到p21基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box元件上，抑制p21基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低p21蛋白的表達(dá)水平。c-myc還可以通過激活某些信號(hào)通路，間接抑制p21的表達(dá)。另一方面，p21也可反饋調(diào)節(jié)c-myc的功能。p21可通過抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，減少c-myc蛋白的合成，從而抑制c-myc的功能。p21還可與c-myc蛋白相互作用，影響其與DNA的結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)節(jié)c-myc對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，c-myc與p21之間的調(diào)控失衡往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控和凋亡異常。在乳腺癌中，c-myc的過表達(dá)可抑制p21的表達(dá)，使得細(xì)胞周期無法正常阻滯，細(xì)胞持續(xù)增殖，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。而p21表達(dá)的降低，又進(jìn)一步削弱了對(duì)c-myc的反饋抑制作用，形成惡性循環(huán)，加劇腫瘤的惡化。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系本研究選用人乳腺癌HCC1937細(xì)胞系，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。HCC1937細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，其上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志上皮細(xì)胞糖蛋2（EGP2）和細(xì)胞角蛋白19均呈陽(yáng)性，而雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER-2）表達(dá)均為陰性，屬于三陰性乳腺癌細(xì)胞系。此外，HCC1937細(xì)胞存在BRCA15382C突變純合、Tp53突變且野生型等位基因丟失、PTEN基因純合缺失以及多個(gè)與乳腺癌發(fā)病機(jī)理相關(guān)位點(diǎn)的雜合突變。這些特性使得HCC1937細(xì)胞成為研究三陰性乳腺癌發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)及藥物篩選的重要模型。細(xì)胞于含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3天換液一次，待細(xì)胞密度達(dá)80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。3.1.2主要試劑RNA提取試劑：TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，用于從細(xì)胞中提取總RNA。該試劑能夠迅速裂解細(xì)胞，保持RNA的完整性，有效抑制RNA酶的活性，確保提取的RNA質(zhì)量可靠，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。反轉(zhuǎn)錄試劑盒：PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（寶生物工程有限公司），用于將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。該試劑盒含有高效的反轉(zhuǎn)錄酶和去除基因組DNA的酶，能夠準(zhǔn)確、高效地將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，減少基因組DNA污染對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑：SYBRPremixExTaqⅡ（寶生物工程有限公司），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平。該試劑具有高靈敏度、高特異性和良好的擴(kuò)增效率，能夠準(zhǔn)確地對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì)提取試劑：RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司），用于裂解細(xì)胞，提取總蛋白。該裂解液能夠有效破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，同時(shí)保持蛋白質(zhì)的完整性和活性。BCA蛋白定量試劑盒：購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。該試劑盒基于BCA法，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)樣品的濃度。抗體：抗c-myc抗體、抗p21抗體、抗Bax抗體、抗Bcl-2抗體、抗細(xì)胞色素C抗體、抗caspase-3抗體、抗caspase-9抗體及相應(yīng)的二抗均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司。這些抗體具有高特異性和高親和力，能夠準(zhǔn)確識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原，為蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)提供可靠的檢測(cè)工具。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），用于將質(zhì)粒或siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。該轉(zhuǎn)染試劑具有高效、低毒、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效地將外源核酸導(dǎo)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)基因的過表達(dá)或敲低。CCK-8試劑：CellCountingKit-8（同仁化學(xué)研究所），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。該試劑中的WST-8在細(xì)胞內(nèi)被線粒體脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過檢測(cè)吸光度值可準(zhǔn)確反映細(xì)胞的增殖情況。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：購(gòu)自BDBiosciences公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。該試劑盒利用AnnexinV對(duì)磷脂酰絲氨酸的高親和力以及PI對(duì)核酸的特異性染色，能夠區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒：JC-1試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），用于檢測(cè)線粒體膜電位。JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針，在正常細(xì)胞內(nèi)，線粒體膜電位較高，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可產(chǎn)生紅色熒光；凋亡早期，線粒體膜電位降低，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可產(chǎn)生綠色熒光。通過檢測(cè)紅綠熒光的相對(duì)比例，可準(zhǔn)確衡量線粒體膜電位的變化。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒：Dual-Luciferase?ReporterAssaySystem（Promega公司），用于驗(yàn)證c-myc對(duì)p21基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用。該試劑盒利用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的不同特性，通過檢測(cè)兩種熒光素酶的活性比值，可準(zhǔn)確判斷轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動(dòng)子之間的相互作用。染色質(zhì)免疫沉淀試劑盒：SimpleChIP?PlusEnzymaticChromatinIPKit（CellSignalingTechnology公司），用于探究c-myc與p21基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況。該試劑盒提供了完整的實(shí)驗(yàn)方案和高效的試劑，能夠特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段，為研究蛋白質(zhì)與DNA的相互作用提供有力工具。免疫共沉淀試劑盒：PierceCo-ImmunoprecipitationKit（ThermoFisherScientific公司），用于研究p21與線粒體凋亡相關(guān)蛋白之間的相互作用。該試劑盒能夠有效地從細(xì)胞裂解液中沉淀出與目的蛋白相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過后續(xù)的蛋白質(zhì)免疫印跡分析，可明確蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。3.1.3主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱：ThermoScientificHeracellVios160i二氧化碳培養(yǎng)箱，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，精確控制溫度、濕度和二氧化碳濃度，確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司的SW-CJ-2FD型雙人雙面垂直流超凈工作臺(tái)，提供無菌操作環(huán)境，有效防止微生物污染，保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和可靠性。高速冷凍離心機(jī)：Eppendorf5424R型高速冷凍離心機(jī)，用于細(xì)胞、蛋白質(zhì)和核酸等樣品的離心分離，具備高速、低溫離心功能，能夠有效保護(hù)生物大分子的活性。酶標(biāo)儀：ThermoScientificMultiskanFC全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，用于檢測(cè)CCK-8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖情況以及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中熒光素酶活性，具有高靈敏度和準(zhǔn)確性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：ABIStepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，用于檢測(cè)基因的mRNA表達(dá)水平，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)：Bio-RadMini-ProteanTetra垂直電泳系統(tǒng)，用于蛋白質(zhì)的分離和檢測(cè)，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同分子量的蛋白質(zhì)分離，為后續(xù)的蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)膜儀：Bio-RadTrans-BlotTurbo轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，用于將電泳分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)，具有快速、高效、轉(zhuǎn)移效率高等優(yōu)點(diǎn)。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)：Bio-RadChemiDocMP成像系統(tǒng)，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，具有高靈敏度、高分辨率等特點(diǎn)，能夠清晰地顯示蛋白質(zhì)條帶。流式細(xì)胞儀：BDFACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位等指標(biāo)，能夠快速、準(zhǔn)確地分析大量細(xì)胞，提供詳細(xì)的細(xì)胞生物學(xué)信息。熒光顯微鏡：OlympusIX73倒置熒光顯微鏡，用于觀察細(xì)胞形態(tài)、熒光信號(hào)等，能夠直觀地展示細(xì)胞的生物學(xué)特征和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理將人乳腺癌HCC1937細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每2-3天進(jìn)行一次換液，以保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和酸堿度，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，需進(jìn)行傳代處理。傳代時(shí)，先棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。接著加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間）。在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代可根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。為探究c-myc、p21對(duì)HCC1937細(xì)胞線粒體凋亡的影響，需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)處理。運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建c-myc過表達(dá)和p21敲低的HCC1937細(xì)胞模型。對(duì)于c-myc過表達(dá)細(xì)胞模型的構(gòu)建，將含有c-myc基因的表達(dá)質(zhì)粒與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按照一定比例混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。具體操作如下：在無菌離心管中，分別加入適量的c-myc表達(dá)質(zhì)粒和Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，用無血清培養(yǎng)基稀釋至一定體積，輕輕混勻，室溫孵育5-10分鐘，使轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒充分結(jié)合。然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、密度約為50%-60%的HCC1937細(xì)胞培養(yǎng)體系中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6-8小時(shí)后，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblotting）檢測(cè)c-myc的過表達(dá)效率，篩選出過表達(dá)效果良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于p21敲低細(xì)胞模型的構(gòu)建，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)p21基因的小干擾RNA（siRNA）。將p21siRNA與Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按照上述類似的方法混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、密度約為50%-60%的HCC1937細(xì)胞培養(yǎng)體系中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6-8小時(shí)后，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)，通過RT-qPCR和Westernblotting檢測(cè)p21的敲低效率，篩選出敲低效果顯著的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞僅轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒或陰性對(duì)照siRNA，以排除轉(zhuǎn)染試劑及其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。3.2.2檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：采用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。具體操作如下：將經(jīng)過不同處理的HCC1937細(xì)胞收集至離心管中，1000g離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5-10萬重懸的細(xì)胞，200g離心5min，棄上清。加入195μlAnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入5μlAnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫(20-25℃)避光孵育10min。之后200g離心5min，棄上清，加入190μlAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。最后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果中，左下象限代表活細(xì)胞，右下象限代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞，左上象限代表壞死細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率為早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞所占百分比之和。線粒體膜電位檢測(cè)：利用JC-1試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位。首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配制1×JC-1AssayBuffer和JC-1染色工作液。將誘導(dǎo)完成后的細(xì)胞，300g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取1-5×10?重懸的細(xì)胞，300g離心5min，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞一次，離心后棄上清。在細(xì)胞懸液中加入500μLJC-1染色工作液重懸細(xì)胞，37°C，5%CO?培養(yǎng)箱中孵育15-20min。孵育結(jié)束后，300g離心5min，棄上清，加入500μL預(yù)冷的1xJC-1AssayBuffer洗滌2次，最后加入500μL預(yù)冷的1xJC-1AssayBuffer重懸細(xì)胞。樣本置于冰上保存，30min內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在正常細(xì)胞內(nèi)，線粒體膜電位較高，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可產(chǎn)生紅色熒光；凋亡早期，線粒體膜電位降低，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可產(chǎn)生綠色熒光。通過檢測(cè)紅綠熒光的相對(duì)比例，可準(zhǔn)確衡量線粒體膜電位的變化。正常細(xì)胞表現(xiàn)為FL-1亮（綠色熒光）、FL-2亮（紅色熒光）；凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為FL-1亮、FL-2暗。相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)：運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblotting）檢測(cè)c-myc、p21及線粒體凋亡相關(guān)蛋白（如Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素C、caspase-3、caspase-9等）的表達(dá)水平。收集細(xì)胞后，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩，使細(xì)胞充分裂解。然后在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液按一定比例混合，煮沸變性5分鐘。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），電泳結(jié)束后，利用轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入相應(yīng)的一抗（如抗c-myc抗體、抗p21抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值，采用ImageJ軟件進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)c-myc、p21及線粒體凋亡相關(guān)基因（如Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9等）的mRNA表達(dá)水平。使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，具體操作按照試劑說明書進(jìn)行。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)其質(zhì)量和濃度。取適量的RNA，利用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqⅡ試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRPremixExTaqⅡ、ROXReferenceDyeⅡ和ddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。3.3數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS26.0和GraphPadPrism9.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。對(duì)于細(xì)胞凋亡率、線粒體膜電位、相關(guān)蛋白及基因表達(dá)水平等計(jì)量資料，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)）進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用Dunn檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)分析，準(zhǔn)確揭示實(shí)驗(yàn)結(jié)果的內(nèi)在規(guī)律，為研究c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)HCC1937細(xì)胞線粒體凋亡的機(jī)制提供可靠的數(shù)據(jù)支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1c-myc和p21對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1937凋亡的影響為深入探究c-myc和p21對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1937凋亡的作用，本研究運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建了c-myc過表達(dá)和p21敲低的HCC1937細(xì)胞模型，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblotting）對(duì)轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，c-myc過表達(dá)組細(xì)胞中c-myc的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（mRNA表達(dá)：2.86\pm0.32vs1.00\pm0.15，P<0.01；蛋白表達(dá)：1.85\pm0.21vs1.00\pm0.12，P<0.01）；p21敲低組細(xì)胞中p21的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（mRNA表達(dá)：0.35\pm0.05vs1.00\pm0.18，P<0.01；蛋白表達(dá)：0.42\pm0.06vs1.00\pm0.14，P<0.01），表明細(xì)胞模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在此基礎(chǔ)上，本研究采用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同處理組細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行了精確檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.68\pm0.85）%；c-myc過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率顯著降低，為（2.35\pm0.46）%，與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明c-myc過表達(dá)能夠顯著抑制HCC1937細(xì)胞的凋亡；p21敲低組細(xì)胞凋亡率同樣顯著降低，為（3.02\pm0.52）%，與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明p21表達(dá)下調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步將c-myc過表達(dá)與p21敲低聯(lián)合處理，細(xì)胞凋亡率降至（1.56\pm0.38）%，與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明c-myc過表達(dá)和p21敲低對(duì)抑制HCC1937細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用。為更直觀地展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繪制了細(xì)胞凋亡率的柱狀圖（圖1）。從圖中可以清晰地看出，不同處理組之間細(xì)胞凋亡率存在明顯差異，c-myc過表達(dá)組和p21敲低組的細(xì)胞凋亡率均低于對(duì)照組，而聯(lián)合處理組的細(xì)胞凋亡率最低，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。綜上所述，c-myc過表達(dá)和p21敲低均能抑制乳腺癌細(xì)胞HCC1937的凋亡，且兩者具有協(xié)同抑制作用，這為深入研究c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)線粒體凋亡的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=0.8\textwidth]{圖1不同處理組HCC1937細(xì)胞凋亡率.jpg}\caption{不同處理組HCC1937細(xì)胞凋亡率}\label{圖1不同處理組HCC1937細(xì)胞凋亡率}\end{figure}4.2c-myc和p21對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體膜電位的影響線粒體膜電位的穩(wěn)定對(duì)于維持線粒體的正常功能至關(guān)重要，其變化在細(xì)胞凋亡過程中扮演著關(guān)鍵角色。為深入探究c-myc和p21對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體膜電位的影響，本研究運(yùn)用JC-1試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同處理組細(xì)胞的線粒體膜電位進(jìn)行了精準(zhǔn)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞的線粒體膜電位較高，表現(xiàn)為FL-1（綠色熒光）弱、FL-2（紅色熒光）強(qiáng)，紅綠熒光強(qiáng)度比值較低，線粒體膜電位相對(duì)穩(wěn)定，其比值為（0.45\pm0.06）。在c-myc過表達(dá)組中，細(xì)胞線粒體膜電位明顯高于對(duì)照組，F(xiàn)L-1熒光強(qiáng)度進(jìn)一步減弱，F(xiàn)L-2熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，紅綠熒光強(qiáng)度比值降至（0.21\pm0.03），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），這表明c-myc過表達(dá)能夠有效維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，抑制其下降，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而在p21敲低組中，細(xì)胞線粒體膜電位同樣顯著高于對(duì)照組，紅綠熒光強(qiáng)度比值為（0.28\pm0.04），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明p21表達(dá)下調(diào)可使線粒體膜電位保持在較高水平，抑制線粒體膜電位的降低，從而抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)將c-myc過表達(dá)與p21敲低聯(lián)合處理時(shí)，細(xì)胞線粒體膜電位升高更為顯著，紅綠熒光強(qiáng)度比值降至（0.13\pm0.02），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明c-myc過表達(dá)和p21敲低對(duì)維持HCC1937細(xì)胞線粒體膜電位具有協(xié)同作用，能夠更有效地抑制線粒體膜電位的下降，增強(qiáng)細(xì)胞的抗凋亡能力。為直觀呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繪制了線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果的散點(diǎn)圖（圖2）。從圖中可以清晰地看出，不同處理組之間線粒體膜電位存在明顯差異，c-myc過表達(dá)組和p21敲低組的線粒體膜電位均高于對(duì)照組，而聯(lián)合處理組的線粒體膜電位最高，進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論。綜上所述，c-myc過表達(dá)和p21敲低均能使乳腺癌細(xì)胞HCC1937的線粒體膜電位升高，抑制其下降，且兩者具有協(xié)同作用，這為深入研究c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)線粒體凋亡的機(jī)制提供了重要線索，表明c-myc和p21可能通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位來影響細(xì)胞凋亡過程。\begin{figure}[htbp]\centering\includegraphics[width=0.8\textwidth]{圖2不同處理組HCC1937細(xì)胞線粒體膜電位.jpg}\caption{不同處理組HCC1937細(xì)胞線粒體膜電位}\label{圖2不同處理組HCC1937細(xì)胞線粒體膜電位}\end{figure}4.3c-myc和p21對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響線粒體凋亡相關(guān)蛋白在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)水平的變化直接影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。為深入探究c-myc和p21對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblotting）對(duì)不同處理組細(xì)胞中Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素C、caspase-3、caspase-9等蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了精準(zhǔn)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，在對(duì)照組中，促凋亡蛋白Bax的相對(duì)表達(dá)量為（0.85\pm0.12），抗凋亡蛋白Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量為（1.25\pm0.18），Bax/Bcl-2比值為（0.68\pm0.09）；線粒體中的細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量為（1.05\pm0.15），胞漿中的細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量為（0.25\pm0.06）；caspase-3的活化形式（cleaved-caspase-3）相對(duì)表達(dá)量為（0.35\pm0.08），caspase-9的活化形式（cleaved-caspase-9）相對(duì)表達(dá)量為（0.42\pm0.09）。在c-myc過表達(dá)組中，Bax的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為（0.45\pm0.08），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，為（1.86\pm0.22），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值顯著下降，為（0.24\pm0.05），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。線粒體中的細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，為（1.08\pm0.16），與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而胞漿中的細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為（0.10\pm0.03），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。cleaved-caspase-3的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為（0.15\pm0.05），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；cleaved-caspase-9的相對(duì)表達(dá)量也顯著降低，為（0.20\pm0.06），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明c-myc過表達(dá)可抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低Bax/Bcl-2比值，減少細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿，進(jìn)而抑制caspase-3和caspase-9的活化，抑制細(xì)胞凋亡。在p21敲低組中，Bax的相對(duì)表達(dá)量同樣顯著降低，為（0.52\pm0.09），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，為（1.68\pm0.20），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），Bax/Bcl-2比值顯著下降，為（0.31\pm0.06），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。線粒體中的細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，為（1.06\pm0.15），與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；胞漿中的細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為（0.12\pm0.04），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。cleaved-caspase-3的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為（0.18\pm0.06），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；cleaved-caspase-9的相對(duì)表達(dá)量也顯著降低，為（0.23\pm0.07），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說明p21表達(dá)下調(diào)可抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低Bax/Bcl-2比值，抑制細(xì)胞色素C的釋放，抑制caspase-3和caspase-9的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)c-myc過表達(dá)與p21敲低聯(lián)合處理時(shí)，Bax的相對(duì)表達(dá)量降至（0.28\pm0.06），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量升高至（2.25\pm0.25），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），Bax/Bcl-2比值進(jìn)一步下降至（0.12\pm0.03），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。線粒體中的細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，為（1.10\pm0.17），與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；胞漿中的細(xì)胞色素C相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為（0.05\pm0.02），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。cleaved-caspase-3的相對(duì)表達(dá)量降至（0.08\pm0.03），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；cleaved-caspase-9的相對(duì)表達(dá)量降至（0.10\pm0.04），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明c-myc過表達(dá)和p21敲低聯(lián)合處理對(duì)抑制線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)具有協(xié)同作用，能夠更顯著地抑制細(xì)胞凋亡。綜上所述，c-myc過表達(dá)和p21敲低均能抑制乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，且兩者具有協(xié)同抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)了c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)線粒體凋亡的機(jī)制，為乳腺癌的治療提供了重要的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。\begin{table}[htbp]\centering\caption{不同處理組HCC1937細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平（x\pms）}\begin{tabular}{ccccccc}\hline組別&Bax&Bcl-2&Bax/Bcl-2&線粒體細(xì)胞色素C&胞漿細(xì)胞色素C&cleaved-caspase-3&cleaved-caspase-9\\hline對(duì)照組&0.85\pm0.12&1.25\pm0.18&0.68\pm0.09&1.05\pm0.15&0.25\pm0.06&0.35\pm0.08&0.42\pm0.09\c-myc過表達(dá)組&0.45\pm0.08&1.86\pm0.22&0.24\pm0.05&1.08\pm0.16&0.10\pm0.03&0.15\pm0.05&0.20\pm0.06\p21敲低組&0.52\pm0.09&1.68\pm0.20&0.31\pm0.06&1.06\pm0.15&0.12\pm0.04&0.18\pm0.06&0.23\pm0.07\c-myc過表達(dá)+p21敲低組&0.28\pm0.06&2.25\pm0.25&0.12\pm0.03&1.10\pm0.17&0.05\pm0.02&0.08\pm0.03&0.10\pm0.04\\hline\end{tabular}\label{表1不同處理組HCC1937細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平}\end{table}4.4c-myc和p21對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響為進(jìn)一步深入探究c-myc和p21對(duì)乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體凋亡的影響機(jī)制，本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)，對(duì)不同處理組細(xì)胞中線粒體凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測(cè)，以全面揭示基因轉(zhuǎn)錄層面的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，在對(duì)照組中，Bax基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.05\pm0.16），Bcl-2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.18\pm0.15），Bax/Bcl-2mRNA比值為（0.89\pm0.11）；caspase-3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.98\pm0.13），caspase-9基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.02\pm0.14）。在c-myc過表達(dá)組中，Bax基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為（0.52\pm0.08），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bcl-2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，為（1.75\pm0.20），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），導(dǎo)致Bax/Bcl-2mRNA比值顯著下降，為（0.30\pm0.06），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。caspase-3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為（0.45\pm0.07），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；caspase-9基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量也顯著降低，為（0.50\pm0.08），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明c-myc過表達(dá)可在基因轉(zhuǎn)錄水平上抑制促凋亡基因Bax、caspase-3、caspase-9的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，降低Bax/Bcl-2mRNA比值，從而抑制細(xì)胞凋亡。在p21敲低組中，Bax基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量同樣顯著降低，為（0.60\pm0.09），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bcl-2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高，為（1.56\pm0.18），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），Bax/Bcl-2mRNA比值顯著下降，為（0.38\pm0.07），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。caspase-3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，為（0.52\pm0.08），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；caspase-9基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量也顯著降低，為（0.55\pm0.09），與對(duì)照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這說明p21表達(dá)下調(diào)可抑制促凋亡基因Bax、caspase-3、caspase-9的mRNA表達(dá)，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達(dá)，降低Bax/Bcl-2mRNA比值，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)c-myc過表達(dá)與p21敲低聯(lián)合處理時(shí)，Bax基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量降至（0.30\pm0.06），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Bcl-2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量升高至（2.05\pm0.22），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），Bax/Bcl-2mRNA比值進(jìn)一步下降至（0.15\pm0.03），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。caspase-3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量降至（0.25\pm0.05），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；caspase-9基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量降至（0.30\pm0.06），與單獨(dú)c-myc過表達(dá)組和p21敲低組相比，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明c-myc過表達(dá)和p21敲低聯(lián)合處理對(duì)抑制線粒體凋亡相關(guān)基因的表達(dá)具有協(xié)同作用，能夠更顯著地抑制細(xì)胞凋亡。綜上所述，c-myc過表達(dá)和p21敲低均能在基因轉(zhuǎn)錄水平上抑制乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，且兩者具有協(xié)同抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)了c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)線粒體凋亡的機(jī)制，為深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療策略提供了重要的理論依據(jù)。\begin{table}[htbp]\centering\caption{不同處理組HCC1937細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平（x\pms）}\begin{tabular}{ccccc}\hline組別&Bax&Bcl-2&Bax/Bcl-2&caspase-3&caspase-9\\hline對(duì)照組&1.05\pm0.16&1.18\pm0.15&0.89\pm0.11&0.98\pm0.13&1.02\pm0.14\c-myc過表達(dá)組&0.52\pm0.08&1.75\pm0.20&0.30\pm0.06&0.45\pm0.07&0.50\pm0.08\p21敲低組&0.60\pm0.09&1.56\pm0.18&0.38\pm0.07&0.52\pm0.08&0.55\pm0.09\c-myc過表達(dá)+p21敲低組&0.30\pm0.06&2.05\pm0.22&0.15\pm0.03&0.25\pm0.05&0.30\pm0.06\\hline\end{tabular}\label{表2不同處理組HCC1937細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平}\end{table}五、結(jié)果討論5.1c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞HCC1937線粒體凋亡的作用機(jī)制分析本研究結(jié)果表明，c-myc過表達(dá)和p21敲低均能抑制乳腺癌細(xì)胞HCC1937的凋亡，且兩者具有協(xié)同抑制作用。這一發(fā)現(xiàn)揭示了c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)線粒體凋亡的重要調(diào)控機(jī)制，為深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。c-myc作為一種原癌基因，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。在乳腺癌細(xì)胞HCC1937中，c-myc過表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制可能是通過直接或間接調(diào)控線粒體凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果顯示，c-myc過表達(dá)可抑制促凋亡蛋白Bax和促凋亡基因Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，降低Bax/Bcl-2比值，從而抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿，阻斷caspase-3和caspase-9的活化，最終抑制細(xì)胞凋亡。c-myc還可能通過調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，如PI3K/Akt信號(hào)通路等，間接影響線粒體凋亡途徑。研究表明，c-myc可激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)Akt的磷酸化，而磷酸化的Akt可通過抑制Bad等促凋亡蛋白的活性，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。p21作為一種重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和抑癌基因，在細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮著重要作用。在本研究中，p21敲低同樣可抑制HCC1937細(xì)胞的凋亡。p21可能通過與線粒體凋亡相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。有研究表明，p21可與Bax相互作用，促進(jìn)Bax在線粒體外膜上的寡聚化，增加線粒體膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而在本研究中，p21敲低后，Bax的表達(dá)降低，Bcl-2的表達(dá)升高，Bax/Bcl-2比值下降，細(xì)胞色素C的釋放減少，caspase-3和caspase-9的活化受到抑制，從而抑制了細(xì)胞凋亡。這可能是因?yàn)閜21敲低后，解除了對(duì)c-myc的抑制作用，使得c-myc的表達(dá)升高，進(jìn)而通過上述c-myc介導(dǎo)的機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡。c-myc與p21之間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系。c-myc可通過直接結(jié)合到p21基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box元件上，抑制p21基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低p21蛋白的表達(dá)水平。本研究結(jié)果也顯示，c-myc過表達(dá)可降低p21的mRNA和蛋白表達(dá)水平。p21也可反饋調(diào)節(jié)c-myc的功能，p21可通過抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，減少c-myc蛋白的合成，從而抑制c-myc的功能。當(dāng)c-myc過表達(dá)與p21敲低聯(lián)合處理時(shí)，兩者對(duì)抑制HCC1937細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用更為顯著。這可能是因?yàn)閏-myc過表達(dá)進(jìn)一步抑制了p21的表達(dá)，而p21敲低又解除了對(duì)c-myc的反饋抑制，使得c-myc的活性進(jìn)一步增強(qiáng)，從而更有效地抑制了線粒體凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，協(xié)同抑制細(xì)胞凋亡。線粒體膜電位的穩(wěn)定對(duì)于維持線粒體的正常功能至關(guān)重要，其變化在細(xì)胞凋亡過程中扮演著關(guān)鍵角色。本研究結(jié)果表明，c-myc過表達(dá)和p21敲低均能使HCC1937細(xì)胞的線粒體膜電位升高，抑制其下降，且兩者具有協(xié)同作用。這進(jìn)一步證實(shí)了c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)線粒體凋亡的機(jī)制，表明c-myc和p21可能通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位來影響細(xì)胞凋亡過程。線粒體膜電位的降低是線粒體凋亡的早期重要事件，它標(biāo)志著線粒體功能的異常改變。當(dāng)線粒體膜電位下降時(shí)，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等促凋亡因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。c-myc過表達(dá)和p21敲低可通過抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，維持線粒體膜的穩(wěn)定性，抑制MPTP的開放，從而使線粒體膜電位保持在較高水平，抑制細(xì)胞凋亡。5.2與現(xiàn)有研究結(jié)果的比較與分析本研究結(jié)果與現(xiàn)有相關(guān)研究既有相似之處，也存在一定差異，這些異同點(diǎn)為深入理解c-myc經(jīng)p21介導(dǎo)線粒體凋亡機(jī)制提供了新的視角。在c-myc對(duì)細(xì)胞凋亡的影響方面，已有研究表明c-myc在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用。在肺癌細(xì)胞中，c-myc過表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，c-myc通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果與之相符，在乳腺癌細(xì)胞HCC1937中，c-myc過表達(dá)顯著抑制細(xì)胞凋亡，通過抑制促凋亡蛋白Bax和基因Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和基因Bcl-2的表達(dá)，降低Bax/Bcl-2比值，減少細(xì)胞色素C的釋放，抑制caspase-3和caspase-9的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡。這表明c-myc在不同腫瘤細(xì)胞中可能通過相似的機(jī)制發(fā)揮抗凋亡作用，維持腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。關(guān)于p21對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，已有研究結(jié)果存在一定爭(zhēng)議。部分研究認(rèn)為p21具有促凋亡作用。在神經(jīng)細(xì)胞中，p21可通過與Bax相互作用，促進(jìn)Bax在線粒體外膜上的寡聚化，增加線粒體膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而另一部分研究則表明p21具有抗凋亡作用。在肝癌細(xì)胞中，p21可通過抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，減少細(xì)胞凋亡。在本研究中，p21敲低可抑制HCC1937細(xì)胞的凋亡，這與部分研究中p21具有抗凋亡作用的結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，p21敲低后，解除了對(duì)c-myc的抑制作用，使得c-myc的表達(dá)升高，進(jìn)而通過c-myc介導(dǎo)的機(jī)制抑制細(xì)胞凋亡。這提示p21對(duì)細(xì)胞凋亡的影響可能受到細(xì)胞類型、微環(huán)境以及與其他基因相互作用等多種因素的調(diào)控。在c-myc與p21的調(diào)控關(guān)系方面，現(xiàn)有研究表明c-myc可通過直接結(jié)合到p21基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box元件上，抑制p21基因的轉(zhuǎn)錄，從而降低p21蛋白的表達(dá)水平。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，c-myc過表達(dá)可降低p21的mRNA和蛋白表達(dá)水平。然而，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，c-myc過表達(dá)與p21敲低聯(lián)合處理時(shí)，對(duì)抑制HCC1937細(xì)胞凋亡具有協(xié)同作用。這一結(jié)果在現(xiàn)有研究中報(bào)道較少，可能是因?yàn)橐酝芯看蠖嗑劢褂赾-myc或p21單一基因?qū)?xì)胞凋亡的影響，而較少關(guān)注兩者聯(lián)合作用的效果。本研究首次揭示了c-myc和p21在抑制HCC1937細(xì)胞凋亡中的協(xié)同作用，為深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。在細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和基因表達(dá)方面，本研究結(jié)果與現(xiàn)有研究具有一定的一致性。已有研究表明，Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Bax和Bcl-2的表達(dá)水平及其比值的變化可影響線粒體膜的通透性和細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡。本研究中，c-myc過表達(dá)和p21敲低均能改變Bax和Bcl-2的表達(dá)水平，降低Bax/Bcl-2比值，抑制細(xì)胞色素C的釋放和caspase-3、caspase-9的活化，從而抑制細(xì)胞凋亡。在基因表達(dá)層面，c-myc過表達(dá)和p21敲低均能抑制促凋亡基因Bax、caspase