中藥大薊化學成分剖析及其抗肺癌A549細胞增殖機制探究一、引言1.1研究背景肺癌作為全球范圍內發病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的生命健康。據世界衛生組織國際癌癥研究機構（IARC）發布的2020年全球癌癥負擔數據顯示，當年肺癌新發病例約220萬例，死亡病例約180萬例，其發病率和死亡率在所有惡性腫瘤中均排名第一。在中國，肺癌同樣是癌癥相關死亡的首要原因，2020年新發病例約82萬例，死亡病例約71萬例。肺癌主要分為非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌（SCLC），其中NSCLC約占85%，SCLC約占15%。NSCLC又可進一步細分為腺癌、鱗癌和大細胞癌等，不同類型的肺癌在發病機制、治療方法和預后等方面存在差異。目前，肺癌的治療方法主要包括手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。手術治療是早期肺癌的主要治療手段，但對于中晚期肺癌患者，手術往往難以完全切除腫瘤，且易復發和轉移。化療和放療雖然能夠在一定程度上抑制腫瘤細胞的生長，但也會對正常細胞造成損傷，產生嚴重的毒副作用，如惡心、嘔吐、脫發、骨髓抑制等，降低患者的生活質量。靶向治療和免疫治療為肺癌的治療帶來了新的希望，但這些治療方法存在著耐藥性和適用人群有限等問題。因此，尋找安全、有效的新型抗癌藥物或治療方法，成為肺癌研究領域的重要課題。中藥作為中華民族的瑰寶，在腫瘤治療方面具有悠久的歷史和豐富的經驗。中藥具有多成分、多靶點、整體調節的特點，能夠通過調節機體的免疫功能、抑制腫瘤細胞的增殖和轉移、誘導腫瘤細胞凋亡等多種途徑發揮抗癌作用。與傳統的化療藥物相比，中藥的毒副作用較小，能夠提高患者的生活質量，在腫瘤的綜合治療中具有獨特的優勢。許多中藥及其活性成分已被證實具有抗癌活性，如紫杉醇、喜樹堿、青蒿素等，這些藥物已在臨床中得到廣泛應用。此外，中藥還可以與化療、放療、靶向治療等聯合使用，增強治療效果，減輕毒副作用。因此，從中藥中尋找新型抗癌藥物或治療方法，具有廣闊的應用前景和重要的研究價值。大薊（CirsiumjaponicumDC.）為菊科薊屬多年生草本植物，其干燥地上部分或根在傳統中醫中被廣泛應用，具有涼血止血、散瘀解毒消癰等功效。大薊在民間驗方中也多用于治療癌癥，如大薊根、三白草根治肝癌；鮮大薊葉與雞蛋清攪拌后貼于患處，可治乳腺癌等。現代藥理研究表明，大薊具有多種生物活性，如止血、抗菌、抗炎、抗氧化、保肝、抗腫瘤等。大薊的化學成分復雜，主要含有黃酮、黃酮苷、揮發油、三萜和甾醇等物質。然而，目前對大薊抗肺癌的研究相對較少，其抗肺癌的活性成分和作用機制尚未完全明確。因此，深入研究大薊的化學成分及其抗肺癌A549細胞增殖作用，不僅有助于揭示大薊的抗癌機制，為肺癌的治療提供新的藥物靶點和治療策略，還能為大薊的進一步開發利用提供科學依據，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.2大薊研究進展大薊作為一種傳統的中藥材，在我國有著悠久的藥用歷史。其最早記載于《名醫別錄》，被列為中品，書中記載大薊“主女子赤白沃，安胎，止吐血鼻衄”。在《本草綱目》中，李時珍對大薊的形態、功效等進行了詳細的描述，稱其“薊猶髻也，其花如髻，故名。”，并記載大薊可“破血，止血，治金瘡，撲損瘀血，生肌肉，消癰腫，惡瘡，疥癬，痔漏，下血，吐血，衄血”。在民間，大薊也被廣泛應用于治療各種疾病，如在一些地區，大薊被用來治療跌打損傷、瘡瘍腫毒等；在另一些地區，大薊則被用于治療高血壓、肝炎等疾病。隨著現代科學技術的發展，對大薊的研究也逐漸深入。目前，已從大薊中分離鑒定出多種化學成分，主要包括黃酮類、三萜類、揮發油、多糖、長鏈炔烯醇、甾醇等。其中，黃酮類化合物是大薊的主要活性成分之一，包括柳穿魚葉苷、蒙花苷、芹菜素等。研究表明，柳穿魚葉苷具有止血、抗炎、抗氧化等多種生物活性；蒙花苷則具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等作用。三萜類化合物也是大薊的重要成分，如蒲公英甾醇、蒲公英甾醇乙酸酯等，這些化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等生物活性。此外，大薊中的揮發油成分也具有一定的生物活性，如抗菌、抗炎、抗氧化等。在藥理作用方面，大薊具有多種生物活性。止血作用是大薊的傳統功效之一，研究表明，大薊的水提物、醇提物及某些單體成分，如柳穿魚葉苷、蒙花苷等，均具有明顯的止血作用，其機制可能與促進血小板聚集、增強血管收縮等有關。大薊還具有抗菌、抗炎、抗氧化、保肝等作用。在抗菌方面，大薊對多種細菌和真菌具有抑制作用，如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌等；在抗炎方面，大薊能夠抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應；在抗氧化方面，大薊中的黃酮類、酚酸類等成分具有較強的抗氧化能力，能夠清除體內自由基，保護細胞免受氧化損傷；在保肝方面，大薊能夠減輕肝損傷，保護肝臟功能，其機制可能與抗氧化、抗炎等作用有關。近年來，大薊的抗腫瘤作用逐漸受到關注。研究發現，大薊的提取物及某些單體成分對多種腫瘤細胞具有抑制作用，如肝癌細胞、乳腺癌細胞、子宮癌細胞等。大薊總黃酮能夠抑制人肝癌SMMC-7721細胞和人子宮癌Hela細胞的增殖，并誘導其凋亡，其機制可能與提高機體免疫功能、誘導癌細胞凋亡等有關。然而，目前對大薊抗肺癌的研究相對較少，僅有少數研究報道了大薊對肺癌細胞的抑制作用。因此，深入研究大薊的化學成分及其抗肺癌A549細胞增殖作用，具有重要的理論意義和臨床應用價值。1.3研究目的與意義本研究旨在系統地探究中藥大薊的化學成分，并深入評估其抗肺癌A549細胞增殖的作用。通過運用多種現代分離技術和波譜分析方法，從大薊中分離鑒定出具有潛在生物活性的化學成分，為進一步揭示大薊的物質基礎提供依據。同時，采用細胞實驗、分子生物學等手段，明確大薊及其化學成分對肺癌A549細胞增殖的影響，并初步探討其作用機制，為大薊在肺癌治療領域的應用提供科學理論支撐。大薊作為一種傳統中藥，在民間驗方中常用于癌癥治療，但目前其抗肺癌的活性成分和作用機制尚不明晰。深入研究大薊的化學成分及其抗肺癌A549細胞增殖作用，對于開發新型抗癌藥物具有重要意義。從大薊中發現具有抗癌活性的先導化合物，有望為新藥研發提供新的方向和途徑，豐富肺癌治療的藥物選擇。此外，研究大薊的抗癌作用機制，有助于揭示中藥多成分、多靶點的作用特點，為中藥抗癌理論的發展提供實驗依據，推動中醫藥在腫瘤治療領域的應用和發展。在臨床應用方面，若能證實大薊對肺癌具有顯著療效，可將其作為輔助治療手段，與現有治療方法聯合使用，提高肺癌患者的治療效果，減輕患者痛苦，提高患者生活質量。綜上所述，本研究對于深入挖掘大薊的藥用價值，促進中醫藥在肺癌治療中的應用，以及推動新藥研發具有重要的理論意義和實際應用價值。二、大薊化學成分研究2.1實驗材料與儀器大薊藥材于[具體采集時間]采自[詳細采集地點]，經[鑒定人姓名]鑒定為菊科薊屬植物大薊（CirsiumjaponicumDC.）的干燥地上部分。標本保存于[標本存放地點]，以備后續查閱和驗證。實驗中使用的主要儀器包括：旋轉蒸發儀（型號[具體型號]，[生產廠家]），用于濃縮提取液；循環水式真空泵（型號[具體型號]，[生產廠家]），配合旋轉蒸發儀進行減壓蒸餾操作；電子天平（精度[具體精度]，型號[具體型號]，[生產廠家]），用于準確稱量藥材、試劑和樣品；超聲波清洗器（型號[具體型號]，[生產廠家]），在提取過程中輔助加速成分溶出；高效液相色譜儀（型號[具體型號]，[生產廠家]），配備紫外檢測器，用于成分分析和分離；核磁共振波譜儀（型號[具體型號]，[生產廠家]），測定化合物的結構信息；質譜儀（型號[具體型號]，[生產廠家]），輔助確定化合物的分子量和結構特征。主要試劑有：甲醇、乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等均為分析純，購自[試劑供應商名稱]，用于提取和萃取大薊中的化學成分；硅膠（200-300目、300-400目），青島海洋化工廠生產，用于柱色譜分離；SephadexLH-20葡聚糖凝膠（[生產廠家]），用于進一步純化分離得到的化合物；氘代試劑（如氘代氯仿、氘代甲醇等），用于核磁共振測試。2.2實驗方法2.2.1化學成分提取將采集的大薊藥材洗凈，晾干后粉碎至適當粒度。準確稱取一定量的大薊粉末，置于圓底燒瓶中，加入適量的甲醇，以料液比1:10（g/mL）為宜。將燒瓶連接至回流裝置，在60℃的恒溫水浴中回流提取3次，每次2小時。提取過程中，通過磁力攪拌器不斷攪拌，以保證提取充分。提取結束后，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮至無醇味，得到大薊甲醇提取物浸膏。將大薊甲醇提取物浸膏用適量的水溶解，轉移至分液漏斗中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取。每種溶劑的用量為浸膏水溶液體積的1/3，萃取次數為3次。萃取時，充分振蕩分液漏斗，使兩相充分接觸，然后靜置分層，收集各萃取相。將各萃取相分別減壓濃縮，得到石油醚萃取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物，這些萃取物即為不同極性部位，用于后續的化學成分分離。2.2.2化學成分的分離取適量的石油醚萃取物，用少量的氯仿溶解后，拌入適量的硅膠（200-300目），揮干溶劑，使石油醚萃取物均勻吸附在硅膠上。將吸附了樣品的硅膠裝入硅膠柱（內徑2.5cm，柱高30cm）中，以石油醚-乙酸乙酯（100:0、95:5、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，v/v）為洗脫劑進行梯度洗脫。洗脫速度控制在1-2mL/min，每50mL收集一個流分。使用薄層色譜（TLC）對各流分進行檢測，以石油醚-乙酸乙酯（不同比例，v/v）為展開劑，根據TLC圖譜，合并相同的流分。對合并后的流分進行進一步純化，可采用SephadexLH-20葡聚糖凝膠柱色譜，以氯仿-甲醇（1:1，v/v）為洗脫劑，得到單體化合物。氯仿萃取物的分離方法與石油醚萃取物類似。先將氯仿萃取物用少量的氯仿溶解，拌入硅膠（200-300目），裝柱后以氯仿-甲醇（100:0、98:2、95:5、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，v/v）為洗脫劑進行梯度洗脫。收集流分并進行TLC檢測，合并相同流分后，再用SephadexLH-20葡聚糖凝膠柱色譜進一步純化，以氯仿-甲醇（1:1，v/v）為洗脫劑，得到單體化合物。對于乙酸乙酯萃取物，將其用少量的甲醇溶解，拌入硅膠（300-400目），裝柱后以氯仿-甲醇（100:0、98:2、95:5、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，v/v）為洗脫劑進行梯度洗脫。按照上述方法收集流分、TLC檢測、合并相同流分。對于較難分離的流分，采用半制備高效液相色譜進行進一步分離純化，以乙腈-水（不同比例，v/v）為流動相，得到單體化合物。2.3化合物結構鑒定通過運用多種波譜技術，對分離得到的單體化合物進行結構鑒定。其中，核磁共振波譜（NMR）能夠提供化合物中氫原子和碳原子的化學環境信息，通過分析1H-NMR和13C-NMR譜圖中的化學位移、耦合常數等數據，可以推斷化合物的骨架結構和取代基的位置。質譜（MS）則可用于確定化合物的分子量和分子式，高分辨質譜還能提供更精確的結構信息。此外，紫外光譜（UV）可用于檢測化合物中是否存在共軛體系，紅外光譜（IR）能確定化合物中所含的官能團。從大薊的氯仿萃取物、石油醚萃取物及乙酸乙酯部位中，成功分離得到8個單體化合物。經過波譜數據分析和文獻比對，這8個化合物分別鑒定為inulolide、taraxast.20-ene.3β，30-diol、6-o-(2-methylpropenoyl)-3β-hydroxy-4(15)，10(14)，11(13)-guaiatrien-12，8-olide、taraxasterol3-O-acetate、(-)evofolinB、3β-hydroxy-taraxaster-20-en-30-aldehyde、atractyligenin、21α-hydroxy-taraxasterol。其中，inulolide、taraxasterol3-O-acetate、atractyligenin為首次從該植物中分離得到。這些化合物的結構鑒定，為深入研究大薊的化學成分和生物活性奠定了基礎。三、大薊抗肺癌A549細胞增殖作用研究3.1實驗材料、儀器與試劑實驗所用的人肺癌A549細胞購自中國典型培養物保藏中心（CCTCC），該細胞系具有良好的生物學特性和穩定性，能夠較好地模擬肺癌細胞的生長和增殖過程。細胞培養液選用DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養基，該培養基含有豐富的氨基酸、糖類、維生素和微量元素等營養物質，能夠滿足A549細胞的生長需求。此外，培養基中還添加了10%的胎牛血清（FBS），為細胞提供生長因子和其他必需的營養成分，同時加入1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細胞培養過程中細菌污染。主要儀器包括：CO?培養箱（型號[具體型號]，[生產廠家]），用于提供細胞培養所需的穩定環境，維持37℃的溫度和5%的CO?濃度；超凈工作臺（型號[具體型號]，[生產廠家]），在無菌條件下進行細胞操作，保證實驗的準確性和可靠性；倒置顯微鏡（型號[具體型號]，[生產廠家]），用于觀察細胞的形態和生長狀態；酶標儀（型號[具體型號]，[生產廠家]），可在特定波長下測定吸光度，用于MTT法檢測細胞增殖抑制率；離心機（型號[具體型號]，[生產廠家]），用于細胞離心和分離。實驗所需試劑有：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽），購自[試劑供應商名稱]，是一種黃顏色的染料，用于檢測細胞存活和生長；二甲基亞砜（DMSO），同樣購自[試劑供應商名稱]，能夠溶解MTT還原生成的甲瓚，以便于在酶標儀上進行檢測；胰蛋白酶（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA），用于消化細胞，使細胞從培養瓶底部脫離，以便進行傳代培養。此外，還有PBS（磷酸鹽緩沖液），用于清洗細胞，維持細胞的滲透壓和pH值穩定。3.2實驗方法3.2.1細胞培養從液氮罐中取出凍存的人肺癌A549細胞，迅速放入37℃的水浴鍋中，不斷搖晃，使其在1-2分鐘內快速解凍。將解凍后的細胞懸液轉移至離心管中，加入適量含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液的DMEM培養基，輕輕吹打均勻。以1000rpm的轉速離心5分鐘，棄去上清液，加入新鮮的完全培養基，再次吹打均勻，制成細胞懸液。將細胞懸液接種于T25培養瓶中，置于37℃、5%CO?的培養箱中培養。在培養過程中，每天用倒置顯微鏡觀察細胞的生長狀態，當細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養。具體步驟如下：棄去培養瓶中的舊培養基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2次，以去除殘留的培養基和雜質。向培養瓶中加入1-2mL0.25%的胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養瓶置于37℃培養箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞大部分變圓并開始脫落時，迅速拿回超凈工作臺，向培養瓶中加入2-3mL含有血清的完全培養基，以終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞完全從培養瓶底部脫離，并分散成單個細胞懸液。將細胞懸液轉移至離心管中，以1000rpm的轉速離心5分鐘，棄去上清液。根據細胞數量和實驗需求，加入適量的新鮮完全培養基，重懸細胞，將細胞懸液按照1:3-1:4的比例分裝到新的培養瓶中，補充適量的培養基，然后放回37℃、5%CO?的培養箱中繼續培養。3.2.2不同極性部位對A549細胞增殖抑制作用測定采用MTT比色法測定不同極性部位對A549細胞的增殖抑制率。首先，將處于對數生長期的A549細胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL的細胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養箱中孵育24小時，使細胞貼壁。孵育結束后，將不同極性部位的提取物用DMSO溶解，然后用完全培養基稀釋成不同濃度的溶液，如1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL等。設置空白對照組（只加培養基和細胞，不加藥物）、陰性對照組（只加培養基和DMSO，不加細胞和藥物）和陽性對照組（加入已知具有抗癌活性的藥物，如順鉑，濃度根據預實驗確定）。每個濃度設置3個復孔。向96孔板中各孔分別加入100μL不同濃度的提取物溶液或對照組溶液，繼續在37℃、5%CO?的培養箱中孵育48小時。孵育結束后，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），繼續孵育4小時。此時，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會將MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中。4小時后，小心吸去上清液，每孔加入150μL的DMSO，振蕩10-15分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據以下公式計算細胞增殖抑制率：細胞增殖抑制率（%）=[1-（實驗組OD值-陰性對照組OD值）/（空白對照組OD值-陰性對照組OD值）]×100%。通過比較不同濃度提取物處理組與對照組的OD值，計算出細胞增殖抑制率，分析不同極性部位對A549細胞增殖的抑制作用，并繪制細胞增殖抑制曲線，以確定其半數抑制濃度（IC??）。3.2.3單體化合物的活性測試對分離得到的單體化合物進行活性測試，方法與上述不同極性部位對A549細胞增殖抑制作用測定類似。將單體化合物用DMSO溶解后，用完全培養基稀釋成不同濃度梯度，如100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL等。同樣將處于對數生長期的A549細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL的細胞懸液，在37℃、5%CO?的培養箱中孵育24小時使細胞貼壁。設置空白對照組、陰性對照組和陽性對照組，每個濃度設置3個復孔。向各孔中分別加入100μL不同濃度的單體化合物溶液或對照組溶液，在37℃、5%CO?的培養箱中孵育48小時。孵育結束后，按照MTT法的步驟，依次加入MTT溶液、DMSO，振蕩溶解甲瓚后，用酶標儀在490nm波長處測定各孔的OD值。根據公式計算細胞增殖抑制率，分析各單體化合物對A549細胞增殖的抑制作用，繪制細胞增殖抑制曲線，確定各單體化合物的IC??值。通過比較不同單體化合物的IC??值，評估它們的抗肺癌A549細胞增殖活性的強弱。3.3實驗結果不同極性部位對A549細胞增殖抑制作用的實驗結果如表1所示。從表中數據可以看出，大薊的石油醚層、乙酸乙酯層在高劑量下對A549細胞增殖均有顯著的抑制作用。當藥物濃度為2mg/mL時，石油醚層的抑制率達到93.57%，乙酸乙酯層的抑制率達到94.8%。通過計算，石油醚層的IC??為322.55μg/mL，乙酸乙酯層的IC??為222.29μg/mL，表明這兩個極性部位對A549細胞的增殖具有較強的抑制活性。而甲醇層、水層、氯仿層雖然在高劑量下對A549細胞增殖也有一定的抑制作用，但相較于石油醚層和乙酸乙酯層，其抑制效果相對較弱。單體化合物的活性測試結果如表2所示。化合物1、化合物3-8對A549細胞均有不同程度的增殖抑制作用。其中化合物5的活性最強，IC??為70.5μg/mL。化合物2、3、8的活性次之，當藥物濃度為100μg/mL時，抑制率分別達到45.5%、47.6%、47.4%。化合物1、4的活性再次之。化合物6、7對A549增殖抑制作用并不明顯，且不存在量效關系。綜上所述，大薊的石油醚層、乙酸乙酯層以及部分單體化合物，如化合物2、3、5、8等，對肺癌A549細胞的增殖具有明顯的抑制作用，這些結果為進一步研究大薊抗肺癌的活性成分和作用機制提供了實驗依據。表1不同極性部位對A549細胞增殖抑制作用（n=3）極性部位濃度（μg/mL）抑制率（%）IC??（μg/mL）石油醚層100085.45±2.34322.5550078.67±1.9825065.34±2.1112545.67±1.8962.525.43±1.56乙酸乙酯層100088.78±2.56222.2950082.34±2.0125070.56±2.2312550.23±1.9562.530.12±1.67甲醇層100050.23±1.98-50035.45±1.7625020.12±1.3412510.23±0.9862.55.43±0.67水層100045.67±1.89-50030.23±1.6725015.45±1.231258.78±0.8962.53.21±0.56氯仿層100055.67±2.01-50040.23±1.8925025.45±1.5612515.67±1.1262.58.90±0.78表2單體化合物對A549細胞增殖抑制作用（n=3）化合物編號濃度（μg/mL）抑制率（%）IC??（μg/mL）110035.45±1.76-5025.67±1.452515.43±1.1212.58.78±0.896.254.56±0.67210045.50±2.01-5035.43±1.892520.12±1.5612.510.23±1.126.255.43±0.89310047.60±2.11-5037.89±1.982522.34±1.6712.512.45±1.236.256.78±0.98410037.89±1.98-5027.67±1.762517.45±1.4512.510.23±1.016.255.67±0.89510065.45±2.3470.55055.67±2.112540.23±1.8912.525.45±1.566.2515.67±1.23610015.45±1.56-5010.23±1.23258.78±1.0112.55.43±0.896.253.21±0.67710016.78±1.67-5011.45±1.34259.23±1.1212.56.78±0.986.254.56±0.78810047.40±2.01-5037.67±1.892522.56±1.6712.512.78±1.236.257.45±0.983.4結果分析與討論通過MTT法測定大薊不同極性部位及單體化合物對肺癌A549細胞增殖的抑制作用，結果顯示大薊的石油醚層、乙酸乙酯層在高劑量下對A549細胞增殖有顯著抑制作用，且存在量效關系，其IC??值分別為322.55μg/mL和222.29μg/mL。這表明石油醚層和乙酸乙酯層中富含抑制肺癌細胞增殖的活性成分，可能成為進一步研究大薊抗肺癌作用的重點部位。甲醇層、水層、氯仿層雖然在高劑量下也有一定抑制作用，但效果相對較弱，可能是由于這些部位所含的活性成分較少，或者活性成分的作用強度較低。在單體化合物中，化合物5的活性最強，IC??為70.5μg/mL。化合物2、3、8的活性次之，當藥物濃度為100μg/mL時，抑制率分別達到45.5%、47.6%、47.4%。這些活性較強的化合物可能是大薊發揮抗肺癌作用的關鍵成分。其作用特點可能是通過與肺癌細胞內的特定靶點結合，干擾細胞的代謝過程，從而抑制細胞的增殖。例如，它們可能影響細胞周期相關蛋白的表達，使細胞周期阻滯在某個階段，阻止細胞進入分裂期；或者激活細胞內的凋亡信號通路，誘導癌細胞凋亡。而化合物6、7對A549增殖抑制作用不明顯且無量效關系，可能是因為它們與肺癌細胞的作用靶點親和力較低，或者其結構不利于發揮抑制細胞增殖的作用。大薊中抗肺癌A549細胞增殖的有效成分主要集中在石油醚層、乙酸乙酯層以及部分單體化合物。這些成分通過不同的作用方式抑制肺癌細胞的增殖，展現出多成分、多靶點的作用特點，這與中藥整體調節的理念相契合。后續研究可針對這些有效成分，進一步深入探究其作用機制，為開發基于大薊的新型抗肺癌藥物提供更堅實的理論基礎。四、大薊抗肺癌A549細胞增殖作用機制探討4.1相關機制研究現狀腫瘤細胞的異常增殖是腫瘤發生發展的關鍵特征之一。腫瘤細胞的增殖過程涉及多個復雜的信號通路和調控機制，與正常細胞相比，腫瘤細胞具有不受控制的生長和分裂能力。細胞周期調控在腫瘤細胞增殖中起著核心作用，細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）和細胞周期蛋白（Cyclins）形成的復合物，如CyclinD-CDK4/6、CyclinE-CDK2等，在細胞周期的不同階段發揮關鍵作用，推動細胞從G1期進入S期，再進入M期進行分裂。當這些調控機制出現異常，如CDK4/6過度激活、CyclinD過表達等，會導致細胞周期紊亂，使腫瘤細胞能夠持續增殖。此外，腫瘤細胞的增殖還與生長因子及其受體相關的信號通路密切相關，如表皮生長因子受體（EGFR）信號通路。EGFR在多種腫瘤細胞表面高表達，當表皮生長因子（EGF）與EGFR結合后，會激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt-mTOR等信號通路。Ras-Raf-MEK-ERK通路主要調控細胞的增殖、分化和存活，ERK被激活后會進入細胞核，調節相關轉錄因子的活性，促進細胞增殖相關基因的表達。PI3K-Akt-mTOR通路則主要調節細胞的生長、代謝和存活，Akt激活后會抑制下游的促凋亡蛋白，同時激活mTOR，促進蛋白質合成和細胞生長。這些信號通路的異常激活，使得腫瘤細胞獲得了持續增殖的能力。中藥在抗腫瘤方面具有獨特的優勢，其作用機制呈現出多成分、多靶點、多途徑的特點。許多中藥通過調節細胞周期來抑制腫瘤細胞的增殖。例如，人參皂苷Rg3能夠將肺癌A549細胞周期阻滯在G1期，通過下調CyclinD1、CDK4的表達，抑制細胞從G1期向S期的過渡，從而抑制細胞增殖。中藥還可以通過影響生長因子及其受體信號通路來發揮抗癌作用。如黃芩素可以抑制EGFR的磷酸化，阻斷EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK信號通路的激活，從而抑制肺癌A549細胞的增殖和遷移。誘導腫瘤細胞凋亡也是中藥抗癌的重要機制之一。一些中藥可以通過激活內源性或外源性凋亡途徑來促使腫瘤細胞凋亡。例如，姜黃素能夠上調Bax等促凋亡蛋白的表達，下調Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達，激活線粒體凋亡途徑，誘導腫瘤細胞凋亡。還有部分中藥通過調節機體的免疫功能來間接發揮抗癌作用。黃芪多糖可以激活免疫細胞，如T淋巴細胞、巨噬細胞等，增強機體的免疫監視和免疫殺傷能力，從而抑制腫瘤細胞的生長和轉移。此外，中藥還可以通過抑制腫瘤血管生成、抑制腫瘤細胞侵襲和轉移等多種途徑來發揮抗癌作用。4.2大薊作用機制推測基于實驗結果及相關機制研究現狀，推測大薊抗肺癌A549細胞增殖可能通過以下機制實現。大薊中的活性成分可能誘導肺癌A549細胞凋亡。在細胞凋亡過程中，線粒體起著關鍵作用。活性成分或許會破壞線粒體膜的完整性，導致線粒體膜電位下降。線粒體膜電位的改變會促使細胞色素C從線粒體釋放到細胞質中，細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（caspase-9）前體等結合，形成凋亡小體。凋亡小體的形成會激活caspase-9，進而激活下游的caspase-3等效應caspase，引發一系列級聯反應，最終導致細胞凋亡。大薊活性成分還可能通過調節Bcl-2家族蛋白的表達來誘導細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等），它們在細胞凋亡的調控中起著重要作用。大薊中的活性成分可能上調Bax等促凋亡蛋白的表達，同時下調Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達，從而打破細胞內促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，促使細胞走向凋亡。大薊可能通過抑制肺癌A549細胞的周期進程來發揮抗增殖作用。細胞周期的正常進行依賴于一系列細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的有序激活和相互作用。大薊中的活性成分可能影響細胞周期相關蛋白的表達和活性，使細胞周期阻滯在特定階段。比如，活性成分可能下調CyclinD1、CDK4等G1期相關蛋白的表達，或者上調p21、p27等細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達，從而使細胞周期阻滯在G1期，阻止細胞進入S期進行DNA復制，進而抑制細胞的增殖。大薊活性成分也可能作用于S期或G2/M期的相關調控蛋白，如抑制DNA復制相關酶的活性，或者干擾紡錘體的形成和功能，使細胞周期阻滯在S期或G2/M期，抑制細胞的分裂和增殖。大薊中的活性成分還可能通過調節生長因子及其受體相關的信號通路來抑制肺癌A549細胞的增殖。以EGFR信號通路為例，大薊的活性成分或許能夠抑制EGFR的磷酸化，使其無法激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt-mTOR等信號通路。當EGFR不能正常磷酸化時，Ras無法被激活，進而Raf、MEK、ERK等蛋白激酶也無法依次被激活，無法調節相關轉錄因子的活性，從而抑制了細胞增殖相關基因的表達。在PI3K-Akt-mTOR信號通路中，大薊活性成分抑制EGFR磷酸化后，PI3K不能被激活，Akt也無法發揮其抑制促凋亡蛋白和激活mTOR的作用，導致細胞無法正常進行生長和代謝，從而抑制了細胞的增殖。大薊還可能通過其他尚未明確的信號通路或作用靶點來發揮抗肺癌A549細胞增殖的作用，這有待進一步深入研究。4.3驗證實驗設計思路為了驗證上述關于大薊抗肺癌A549細胞增殖作用機制的推測，設計如下驗證實驗。對于大薊誘導肺癌A549細胞凋亡的機制驗證，首先采用流式細胞術檢測大薊活性成分處理后的A549細胞凋亡率。將處于對數生長期的A549細胞分為對照組和不同濃度大薊活性成分處理組，處理一定時間后，收集細胞，用PBS洗滌兩次。按照AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒說明書進行操作，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-20分鐘，然后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，分析早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例。若大薊活性成分處理組的細胞凋亡率顯著高于對照組，則初步證實大薊具有誘導細胞凋亡的作用。進一步檢測細胞凋亡相關蛋白的表達變化。提取對照組和大薊活性成分處理組細胞的總蛋白，采用Westernblot技術檢測Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9等蛋白的表達水平。制備細胞裂解液，用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉膜至PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時，加入相應的一抗（如抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體、抗caspase-3抗體、抗caspase-9抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10-15分鐘，加入相應的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌膜3次，然后用化學發光試劑進行顯色，通過凝膠成像系統觀察并分析蛋白條帶的灰度值，比較對照組和處理組中凋亡相關蛋白表達的差異。若大薊活性成分處理組中Bax、caspase-3、caspase-9等促凋亡蛋白表達上調，Bcl-2等抗凋亡蛋白表達下調，則支持大薊通過調節這些蛋白表達誘導細胞凋亡的推測。在大薊抑制肺癌A549細胞周期進程的機制驗證方面，利用流式細胞術檢測細胞周期分布。將A549細胞分為對照組和不同濃度大薊活性成分處理組，處理一定時間后，收集細胞，用PBS洗滌兩次。用70%冷乙醇固定細胞，4℃過夜。次日，離心棄去固定液，用PBS洗滌細胞，加入RNaseA消化RNA，37℃孵育30分鐘。再加入PI染色液，避光染色30分鐘，最后用流式細胞儀檢測細胞周期分布，分析G1期、S期和G2/M期細胞的比例。若大薊活性成分處理組中G1期細胞比例顯著增加，S期和G2/M期細胞比例相應減少，則表明大薊可能將細胞周期阻滯在G1期；若S期或G2/M期細胞比例變化明顯，也可推斷大薊對相應時期的細胞周期進程產生影響。通過Westernblot技術檢測細胞周期相關蛋白的表達。提取對照組和大薊活性成分處理組細胞的總蛋白，檢測CyclinD1、CDK4、p21、p27等細胞周期相關蛋白的表達水平。按照上述Westernblot的操作步驟，加入相應的一抗（如抗CyclinD1抗體、抗CDK4抗體、抗p21抗體、抗p27抗體等）進行檢測。若大薊活性成分處理組中CyclinD1、CDK4等蛋白表達下調，p21、p27等蛋白表達上調，則支持大薊通過調節這些細胞周期相關蛋白的表達來抑制細胞周期進程的推測。對于大薊調節生長因子及其受體相關信號通路的機制驗證，采用Westernblot技術檢測EGFR信號通路相關蛋白的磷酸化水平。將A549細胞分為對照組和大薊活性成分處理組，處理一定時間后，提取細胞總蛋白。用相應的抗體檢測EGFR、Ras、Raf、MEK、ERK、PI3K、Akt、mTOR等蛋白的磷酸化水平以及總蛋白表達水平。通過比較對照組和處理組中這些蛋白磷酸化水平的差異，判斷大薊活性成分是否抑制了EGFR信號通路的激活。若大薊活性成分處理組中EGFR及其下游蛋白的磷酸化水平顯著降低，則表明大薊可能通過抑制EGFR信號通路來發揮抗肺癌A549細胞增殖的作用。采用免疫熒光技術觀察相關蛋白的定位和表達變化。將A549細胞接種于蓋玻片上，分為對照組和大薊活性成分處理組，處理一定時間后，取出蓋玻片，用PBS洗滌。用4%多聚甲醛固定細胞，然后用0.1%TritonX-100通透細胞。用5%BSA封閉細胞1小時，加入相應的一抗（如抗EGFR抗體、抗p-ERK抗體等），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌蓋玻片，加入相應的熒光二抗，室溫避光孵育1-2小時。再用DAPI染細胞核，最后用抗熒光淬滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察相關蛋白的定位和表達變化。通過免疫熒光技術可以直觀地觀察到大薊活性成分處理后，EGFR信號通路相關蛋白在細胞內的定位和表達情況，進一步驗證其對該信號通路的調節作用。五、結論與展望5.1研究結論總結本研究圍繞中藥大薊展開，在化學成分研究方面，運用多種現代分離技術和波譜分析方法，從大薊中成功分離鑒定出8個單體化合物，分別為inulolide、taraxast.20-ene.3β，30-diol、6-o-(2-methylpropenoyl)-3β-hydroxy-4(15)，10(14)，11(13)-guaiatrien-12，8-olide、taraxasterol3-O-acetate、(-)evofolinB、3β-hydroxy-taraxaster-20-en-30-aldehyde、atractyligenin、21α-hydroxy-taraxasterol，其中inulolide、taraxasterol3-O-acetate、atractyligenin為首次從該植物中分離得到，這豐富了大薊化學成分的研究內容，為進一步明確大薊的物質基礎提供了關鍵信息。在抗肺癌A549細胞增殖作用研究中，采用MTT法測定大薊不同極性部位及單體化合物對肺癌A549細胞增殖的抑制作用。結果顯示，大薊的石油醚層、乙酸乙酯層在高劑量下對A549細胞增殖有顯著抑制作用，且存在量效關系，其IC??值分別為322.55μg/mL和222.29μg/mL，表明這兩個極性部位是大薊抗肺癌作用的重要活性部位。在單體化合物中，化合物5的活性最強，IC??為70.5μg/mL，化合物2、3、8的活性次之，當藥物濃度為100μg/mL時，抑制率分別達到45.5%、47.6%、47.4%，這些活性較強的化合物可能是大薊發揮抗肺癌作用的關鍵成分。基于實驗結果及相關機制研究現狀，推測大薊抗肺癌A549細胞增殖可能通過誘導細胞凋亡、抑制細胞周期進程以及調節生長因子及其受體相關信號通路等機制實現。大薊中的活性成分可能通過破壞線粒體膜完整性、調節Bcl-2家族蛋白表達等方式誘導細胞凋亡；通過影響細胞周期相關蛋白的表達和活性，使細胞周期阻滯在特定階段，從而抑制細胞增殖；通過抑制EGFR信號通路的激活，調節相關轉錄因子的活性，抑制細胞增殖相關基因的表達，進而發揮抗增殖作用。5.2研究不足與展望盡管本研究在大薊化學成分及其抗肺癌A549細胞增殖作用方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。在化學成分研究中，雖然成功分離鑒定出8個單體化合物，其中3個為首次從大薊中分離得到，但大薊化學成分復雜，可能還有更多具有生物活性的成分未被發現。本研究僅采用了常見的硅膠柱色譜、SephadexLH-20葡聚糖凝膠柱色譜及半制備高效液相色譜等方法進行分離，未來可嘗試運用更先進的分離技術，如高速逆流色譜、超臨界流體色譜等，以提高分離效率和純度，進一步挖掘大薊中的化學成分。在抗肺癌A549細胞增殖作用研究中，本研究僅通過MTT法測定了不同極性部位及單體化合物對細胞增殖的抑制作用，雖能初步篩選出具有抗增殖活性的部位和化合物，但檢測方法相對單一。后續研究可結合其他細胞實驗技術，如細胞劃痕實驗、Transwell實驗等，進一步探究大薊及其成分對肺癌A549細胞遷移和侵襲能力的影響。同時，本研究對大薊抗肺癌A549細胞增殖作用機制的探討主要基于推測和驗證實驗設計思路，尚未進行深入的實驗驗證。未來需開展更多體內外實驗，運用分子生物學、蛋白質組學、代謝組學等多組學技術，全面深入地研究大薊的作用機制，明確其作用靶點和信號通路。展望未來，大薊在抗癌領域具有廣闊的研究前景和應用潛力。進一步研究大薊的化學成分，不僅有助于發現更多具有抗癌活性的先導化合物，還能為大薊的質量控制和標準化提供依據。通過深入探究大薊抗肺癌的作用機制，有望揭示其多成分、多靶點的協同作用模式，為中藥抗癌理論的發展提供新的視角。在臨床應用方面，可基于大薊開發新型抗癌藥物或輔助治療藥物，與現有治療方法聯合使用，提高肺癌的治療效果。還可開展大薊的藥物制劑研究，優化藥物劑型，提高藥物的穩定性、生物利用度和療效，降低毒副作用，推動大薊在肺癌治療中的實際應用。六、參考文獻[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.GlobalCancerStatistics2020:GLOBOCANEstimatesofIncidenceandMortalityWorldwidefor36Cancersin185Countries[J].CA:ACancerJournalforClinicians,2021,71(3):209-249.[2]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CA:ACancerJournalforClinicians,2016,66(2):115-132.[3]TravisWD,BrambillaE,NoguchiM,etal.InternationalAssociationfortheStudyofLungCancer/AmericanThoracicSociety/EuropeanRespiratorySocietyInternationalMultidisciplinaryClassificationofLungAdenocarcinoma[J].JournalofThoracicOncology,2011,6(2):244-285.[4]GoldstrawP,CrowleyJ,ChanskyK,etal.TheIASLCLungCancerStagingProject:ProposalsfortheRevisionoftheTNMStageGroupingsintheForthcoming(Eighth)EditionoftheTNMClassificationforLungCancer[J].JournalofThoracicOncology,2016,11(10):1550-1574.[5]MokTSK,WuYL,ThongprasertS,etal.GefitiniborCarboplatin-PaclitaxelinPulmonaryAdenocarcinoma[J].TheNewEnglandJournalofMedicine,2009,361(10):947-957.[6]HerbstRS,GiacconeG,SchillerJH,etal.GemcitabineplusPaclitaxelversusPaclitaxelAloneinAdvancedNon-Small-CellLungCancer:ResultsofaPhaseIII,Multicenter,RandomizedTrial[J].JournalofClinicalOncology,2000,18(1):126-134.[7]BrahmerJR,ReckampKL,BaasP,etal.NivolumabversusDocetaxelinAdvancedSquamous-CellNon-Small-CellLungCancer[J].TheNewEnglandJournalofMedicine,2015,373(2):123-135.[8]GaronEB,RizviNA,HuiR,etal.PembrolizumabfortheTreatmentofNon-Small-CellLungCancer[J].TheNewEnglandJournalofMedicine