中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型的影響：機制與展望一、引言1.1研究背景與意義1.1.1哮喘疾病現狀與危害哮喘作為一種常見的慢性炎癥性氣道疾病，在全球范圍內的發病率呈現出令人擔憂的上升趨勢。世界衛生組織（WHO）數據顯示，全球約有3億人飽受哮喘的折磨，預計到2025年，這一數字將增長至4億。在我國，哮喘的患病率也不容小覷，全國哮喘患病及相關危險因素流行病學調查結果表明，2011年我國部分地區居民哮喘患病率已達1.02%，且近年來仍在持續攀升。哮喘的高發病率給患者及其家庭帶來了沉重的負擔?；颊卟粌H要長期忍受反復發作的喘息、氣急、胸悶、咳嗽等癥狀，還可能面臨哮喘急性發作導致的呼吸衰竭甚至危及生命的風險。這些癥狀嚴重干擾了患者的日常生活、工作和學習，極大地降低了他們的生活質量。哮喘還會導致患者反復急診就醫和住院治療，據統計，我國每年因哮喘急性發作而住院的患者數量眾多，這不僅給患者帶來了身體上的痛苦，也造成了巨大的醫療資源浪費。長期哮喘控制不佳還會引發一系列并發癥，如肺氣腫、肺心病等，進一步加重患者的病情和經濟負擔。1.1.2現代醫學治療哮喘的局限目前，現代醫學在哮喘治療方面主要依賴藥物治療，常用藥物包括支氣管舒張劑和抗炎藥等。支氣管舒張劑如短效β2受體激動劑，雖能迅速舒張支氣管，緩解哮喘發作時的癥狀，但其作用持續時間較短，一般僅能維持4-6小時，且長期應用可能導致β2受體功能下調和氣道反應性增高，使哮喘癥狀更難以控制。長效β2受體激動劑雖作用時間長達12小時，且具有一定抗炎作用，但單獨使用效果不佳，需與吸入糖皮質激素聯合應用。吸入型糖皮質激素是治療哮喘的主要藥物，能有效抗炎、降低氣道高反應性，但長期使用可能會引起咽部疼痛、真菌感染等局部不良反應，對于中、重度哮喘患者，若長期大劑量使用，還可能出現全身副作用，如體重增加、血糖增高、骨質疏松等?？诜瞧べ|激素雖作用較強，但長期服用的副作用更為明顯，如導致體重增加、血糖增高、骨質疏松、降低免疫力、低鉀血癥等。白三烯調節劑單獨應用僅適用于輕度哮喘，對于中、重度哮喘患者，需聯合糖皮質激素使用。此外，現代醫學治療哮喘往往難以從根本上解決問題，許多患者在停藥后容易復發，需要長期甚至終身服藥，給患者帶來了極大的不便和經濟壓力。1.1.3中藥二步序貫治療的應用前景中藥二步序貫治療是一種中醫特有的治療方法，它根據哮喘的發病特點和病情變化，分階段、有針對性地運用中藥進行治療。在哮喘發作期，以祛風化痰、活血祛瘀等方藥來緩解癥狀，減輕氣道炎癥；在緩解期，則以補腎益氣為主要治療目的，調節機體免疫功能，預防哮喘復發。這種治療方法強調個體化治療，根據患者的具體病因病機和病情變化，靈活選用中藥復方和單味中藥，以達到最佳治療效果。與現代醫學治療相比，中藥二步序貫治療具有多靶點、整體調節的優勢，能夠從多個環節干預哮喘的發病機制，不僅可以緩解哮喘癥狀，還能改善患者的體質，提高機體免疫力，減少哮喘的復發。中藥的副作用相對較小，患者更容易接受長期治療。因此，中藥二步序貫治療在哮喘治療中展現出了獨特的優勢和廣闊的應用前景，為哮喘的治療提供了新的思路和方法，有望成為攻克哮喘治療難題的重要手段。1.2研究目的與創新點本研究旨在深入探究中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型的影響，并初步探討其作用機制，為臨床應用中藥二步序貫治療哮喘提供更堅實的理論依據和實驗基礎。具體而言，一是通過建立哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型，比較中藥二步序貫治療組與單一中藥治療組、模型組、正常組在炎癥細胞浸潤、炎癥因子水平、氣道重塑相關指標等方面的差異，明確中藥二步序貫治療在減輕哮喘小鼠氣道炎癥與抑制氣道重塑方面的效果；二是運用網絡藥理學技術和實驗驗證方法，分析中藥二步序貫治療中各中藥成分之間的相互作用以及它們對哮喘相關信號通路的影響，初步揭示其治療哮喘的潛在分子機制。在實驗設計方面，本研究創新性地采用了酸堿酸法制備氣管灌注過敏原誘發哮喘模型，這種方法相較于傳統的哮喘模型制備方法，能夠更精準地模擬人類哮喘的發病過程，使實驗結果更具臨床參考價值。在指標選取上，本研究不僅關注了常見的炎癥細胞浸潤、炎癥因子水平等指標，還納入了肺靜態壓力-容積曲線、肺彈性回縮等能夠更全面反映氣道功能和結構變化的指標，為深入研究中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道炎癥與重塑的影響提供了更豐富的數據支持。在研究方法上，將網絡藥理學技術與傳統實驗驗證方法相結合，從整體和分子水平全面探討中藥二步序貫治療的作用機制，為中藥治療哮喘的機制研究提供了新的思路和方法。二、文獻綜述2.1哮喘的發病機制研究進展哮喘作為一種復雜的慢性炎癥性氣道疾病，其發病機制涉及多個方面，至今尚未完全闡明。近年來，隨著分子生物學、免疫學等學科的飛速發展，對于哮喘發病機制的研究取得了顯著進展。炎癥細胞在哮喘的發病過程中扮演著關鍵角色。肥大細胞和嗜堿細胞是氣道炎癥反應的始動細胞，當機體接觸變應原后，肥大細胞表面的IgE受體與變應原特異性結合，促使肥大細胞脫顆粒，釋放組胺（His）、白三烯（LTs）等炎癥介質，這些介質可迅速引起速發相哮喘反應（IAR），表現為氣道平滑肌痙攣、血管通透性增加等癥狀。而在IAR后數小時，遲發相哮喘反應（LAR）更為重要的非特異性慢性炎癥過程逐漸啟動，此時多種炎癥細胞被募集到氣道。嗜酸性細胞是哮喘氣道炎癥的特征性細胞，其在氣道內大量浸潤，釋放LTs、血小板激活因子（PAF）、堿性蛋白等，這些物質不僅能誘發氣道炎癥，還會對氣道上皮造成毒性作用，導致上皮細胞損傷脫落，進而增加氣道高反應性（BHR）。中性粒細胞在某些類型的哮喘，如職業性哮喘中，可能通過釋放髓過氧化物酶等物質參與炎癥過程。血小板可通過IgE依賴機制激活，釋放5-羥色***、血栓烷和脂氧合酶產物等，參與氣道的炎癥反應。巨噬細胞不僅能處理抗原，還能分泌大量具有免疫調節作用的細胞因子，釋放多種補體成分、促凝或抗凝物質、蛋白酶、脂酶、DNA酶、金屬蛋白酶、超氧化物、過氧化氫、一氧化氮等炎癥介質，造成廣泛的組織損傷。樹突狀細胞（DC）作為功能最強的抗原呈遞細胞，能夠攝取、加工抗原，并將其呈遞給T細胞，同時提供T細胞活化所需的刺激信號，影響Th0細胞分化方向，在維持氣道局部炎癥中起重要作用。淋巴細胞尤其是Th細胞在炎癥反應中起重要調控作用，支氣管活檢及外周血和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中CD+4淋巴細胞增多，急性發作時外周血CD+4淋巴細胞激活標志增多，免疫組化及BALF中CD+4淋巴細胞對HLA-DR表達增強，去除CD+4淋巴細胞后可明顯抑制嗜酸性粒細胞（Eos）的聚集和BHR，激活的Tc通過其細胞因子，如IL-3、IL-5等，參與哮喘的慢性炎癥反應，促使Eos趨化增殖、分化及功能激活，從而加強氣道組織中Eos的致炎作用。炎癥介質在哮喘發病機制中也起著不可或缺的作用。組胺是最早被認識的炎癥介質之一，它能引起支氣管平滑肌收縮、血管擴張和通透性增加，導致氣道水腫和黏液分泌增多。白三烯包括LTC4、LTD4和LTE4等，其收縮支氣管平滑肌的作用比組胺強100-1000倍，還能促進炎癥細胞的趨化和聚集，增加血管通透性。血小板激活因子可引起血小板聚集、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的趨化和脫顆粒，增強氣道炎癥反應。細胞因子如白細胞介素（IL）家族中的IL-4、IL-5、IL-13等在哮喘發病中具有重要作用，IL-4可促進Th2細胞分化，調節IgE的合成；IL-5能選擇性地促進嗜酸性粒細胞的生長、分化和活化；IL-13可誘導氣道高反應性、黏液分泌增加和氣道重塑。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）能激活炎癥細胞，促進炎癥介質的釋放，加重氣道炎癥。免疫失衡是哮喘發病的重要機制之一。正常情況下，機體的免疫反應處于Th1/Th2平衡狀態，Th1細胞主要分泌IFN-γ等細胞因子，參與細胞免疫，抵御感染；Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子，參與體液免疫，在哮喘患者中，這種平衡被打破，Th2細胞功能亢進，Th1細胞功能相對不足，導致Th2型細胞因子分泌增多，促進IgE的合成和嗜酸性粒細胞的活化、聚集，引發哮喘的一系列癥狀。調節性T細胞（Treg）是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，在維持免疫耐受和免疫平衡中發揮重要作用，哮喘患者體內Treg細胞數量減少或功能缺陷，無法有效抑制Th2細胞的活化和炎癥反應，從而導致哮喘的發生發展。輔助性T細胞17（Th17）細胞及其分泌的細胞因子IL-17在哮喘的發病中也起到重要作用，IL-17可誘導氣道上皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等分泌多種促炎細胞因子和趨化因子，招募中性粒細胞和單核細胞到氣道，加重氣道炎癥。2.2中藥治療哮喘的研究現狀2.2.1單味中藥治療哮喘的研究成果近年來，眾多學者對單味中藥治療哮喘展開了深入研究，在實驗和臨床領域均取得了豐碩成果。在實驗研究方面，川芎嗪作為川芎的主要有效成分，被證實具有顯著的抗哮喘作用。通過哮喘大鼠腹腔注射川芎嗪的實驗，發現其可以抑制哮喘大鼠IL-4和IL-5等Th2型細胞因子合成，增加IFN-γ等Th1型細胞因子的合成。其作用機制可能是下調GATA-3、上調T-bet在肺組織的表達，通過調節轉錄因子GATA-3/T-bet進而調節Th1/Th2細胞因子比例，從而扭轉哮喘時的Th2細胞優勢，改善相應炎性癥狀。在OVA誘導小鼠哮喘模型中，川芎嗪還能增強調節性T細胞的功能，增加調節性T細胞的數量，進而抑制Th17細胞的數量以及功能，減輕Th17細胞的應答，降低IL-17細胞因子的分泌，從而預防或控制哮喘發作。銀杏葉總黃酮是銀杏葉治療哮喘的主要有效成分，能夠降低支氣管肺泡灌洗液中IL-4的含量，使血漿IgE水平降低，升高細胞因子IFN-γ水平，調節Th1/Th2平衡。給予銀杏葉總黃酮灌胃后，哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細胞、嗜酸性粒細胞顯著減少；支氣管肺泡灌洗液中IL-4含量降低，IFN-γ含量增高，IL-4/IFN-γ比例有所恢復；血清中IgE含量與OVA特異性IgE含量顯著降低；同時，肺組織中GATA-3的過度表達得到抑制。臨床研究也充分驗證了單味中藥治療哮喘的有效性。殷凱生等觀察60例哮喘患者，隨機給予常規治療或常規加川芎嗪聯合治療，結果表明川芎嗪能夠增加哮喘患者T-betmRNA的表達，同時抑制GATA-3mRNA的表達。川芎嗪干預后，哮喘患者外周血單個核細胞來源的淋巴細胞中IFN-γ蛋白含量增加，IL-4蛋白含量則明顯降低，提示川芎嗪可能通過增強Thl介導的細胞免疫，抑制Th2介導的體液免疫，糾正Thl/Th2細胞因子平衡，達到治療哮喘的目的。李曉君等將98例支氣管哮喘患者隨機分為2組，均給予吸氧、通暢呼吸道、抗生素及糖皮質激素等治療，在此基礎上治療組加用川芎嗪靜滴，結果對照組顯效8例，有效24例，無效16例，總有效率67％；治療組顯效18例，有效25例，無效7例，總有效率86％。涂喜漢用川芎嗪治療支氣管哮喘持續狀態患者50例，結果治療組總有效率96.0％，對照組74.0％，其療效顯著優于常規用氨茶堿的對照組。這些研究表明，單味中藥在哮喘治療中具有一定的潛力，能夠通過調節免疫、抑制炎癥等多種機制發揮治療作用。2.2.2中藥復方治療哮喘的研究成果中藥復方治療哮喘具有多靶點、協同作用的優勢，近年來受到了廣泛關注，相關研究也取得了眾多成果。麻杏石甘湯作為經典的中藥復方，適用于濕熱內蘊、氣滯痰閉型哮喘。現代研究表明，其主要成分麻黃中的麻黃堿具有支氣管舒張作用，可松弛支氣管平滑肌，緩解氣道梗阻，改善呼吸困難；還能抑制肥大細胞釋放組胺等致炎介質，降低氣道炎癥反應，減少喘息癥狀。杏仁中的苦杏仁苷在體內可分解產生氫酸和苯甲醛，氫酸對呼吸中樞有一定的抑制作用，能使呼吸運動趨于安靜而止咳平喘。石膏主要含硫酸鈣，具有清熱瀉火的作用，可減輕哮喘患者的肺熱癥狀。甘草中的甘草甜素等成分具有抗炎、抗過敏作用，能調節機體免疫功能，增強其他藥物的療效。這些成分相互協同，共同發揮清熱宣肺、止咳平喘的功效，有效緩解哮喘癥狀。復方甘草酸苷也是一種常用的治療哮喘的中藥復方，由甘草酸、甘草甜素、倍半萜烯皂苷組成，具有顯著的抗炎和免疫調節作用。一項研究顯示，復方甘草酸苷治療哮喘患者8周后，肺功能指標明顯改善，氣道炎癥標志物IL-4、IL-5、IL-13顯著下降。其作用機制可能是通過抑制炎性因子釋放，調節免疫細胞功能，如抑制促炎免疫細胞（如嗜酸性粒細胞、肥大細胞）的活化和脫顆粒，同時促進抗炎免疫細胞（如調節性T細胞）的生成，維持免疫穩態。還具有抗氧化作用，其含有的黃酮類、酚酸類等抗氧化劑，可清除自由基，減少氧化應激對氣道組織的損傷，從而減緩炎癥進程。中藥通氣膠囊由黃芪、黨參、白術、陳皮、茯苓組成，具有益氣健脾、燥濕化痰的功效，適用于哮喘患者。臨床研究顯示，中藥通氣膠囊治療哮喘患者12周后，肺功能指標明顯改善，氣道炎癥標志物IL-8、IL-1β、TNF-α顯著下降。黃芪中的黃芪多糖等成分可增強機體免疫力，調節免疫功能；黨參能補中益氣，養血生津；白術具有健脾益氣、燥濕利水的作用；陳皮可理氣健脾、燥濕化痰；茯苓能利水滲濕、健脾寧心。這些藥物相互配伍，從整體上調節機體的氣血、臟腑功能，改善哮喘患者的體質，減輕氣道炎癥，緩解哮喘癥狀。2.3中藥二步序貫治療哮喘的研究現狀2.3.1中藥二步序貫治療哮喘的臨床應用案例在臨床實踐中，中藥二步序貫治療哮喘取得了一系列令人矚目的成功案例，為哮喘患者帶來了新的希望。例如，一項針對小兒支氣管哮喘患兒的研究中，選取了90例患兒作為實驗對象。將其分為普通診療組以及中醫診療組，普通診療組采用常規的西醫方式進行醫治，包括霧化吸入醫治、口服孟魯司特藥物以及必要時的給氧醫治；中醫診療組則在西醫治療的基礎上，使用中藥基本方進行身體狀況調養，中藥組成成分主要有菟絲子，桂枝，白芍，五味子等。研究結果顯示，普通診療組患兒的醫治總有效率為72%，而中醫診療組的醫治總有效率高達90%。在副作用發生情況方面，普通診療組為17.6%，中醫診療組僅為5%。這表明中藥二步序貫治療在提高小兒支氣管哮喘患兒的治療成效方面具有顯著優勢，且副作用較小，安全性更高。在另一項研究中，納入了48例支氣管哮喘病患，將其均分為參照組和實驗組。參照組實施常規西藥治療，對穩定期病患予以沙美特羅氟替卡松粉吸入處理，若吸入無效則予以甲潑尼龍琥珀酸鈉靜脈滴注治療，并根據病患病情狀態酌情予以吸氧、靜脈注射氨茶堿、抗生素等藥物；針對發病期病患需采用以上藥物持續治療2周，針對緩解期病患需根據病患實際情況酌情減調整使用劑量。實驗組實施中醫序貫療法治療，發作期基礎方劑由川芎15g、丹參15g、瓜蔞9g、蜜百部6g、蜜紫菀6g、冬花6g、姜半夏5g、陳皮6g、桃仁6g、炙麻黃3g組成，針對不同癥狀的病患進行藥物加減；水煎服，口服，早晚各一次，每日一劑，持續治療14d。穩定期及緩解期基礎方劑由山萸肉6g、生淮山藥25g、白術9g、茯苓15g、黃芪10g、黨參9g、天冬9g、麥冬9g、炒苦杏仁10g、蜜麻黃6g組成，針對不同癥狀的病患進行藥物加減；煎服，口服，早晚服用，2日一劑，持續治療60d。穩定期還采用浸泡中藥處理，水煎取汁，加入冰糖與蜂蜜收膏，制作成膏滋，水沖口服，每日兩次，持續治療60d。結果顯示，實驗組病患的FEV1/FVC、FEV1、FVC肺功能指標改善情況明顯優于參照組，兩組數據P＜0.05，比對差異大；實驗組病患治療療效更優，兩組數據P＜0.05，比對差異大。這充分證明了中藥二步序貫治療能夠有效改善支氣管哮喘病患的肺功能指標，提升治療效果。這些臨床案例表明，中藥二步序貫治療根據哮喘患者不同階段的病情特點，針對性地運用中藥進行治療，能夠更好地調節機體功能，減輕氣道炎癥，緩解哮喘癥狀，提高患者的生活質量，在哮喘治療中具有重要的應用價值。2.3.2中藥二步序貫治療哮喘的作用機制研究近年來，關于中藥二步序貫治療哮喘作用機制的研究取得了一定的進展，為深入理解其治療效果提供了理論基礎。從免疫系統調節的角度來看，中藥二步序貫治療能夠通過多種途徑對免疫系統產生影響。在一項關于人參五味子湯加小青龍湯對哮喘小鼠作用的研究中，以卵清蛋白腹腔注射并霧化吸入制備小鼠哮喘模型，然后先后予以人參五味子湯加小青龍湯對哮喘小鼠進行治療。結果發現，哮喘模型胃飼中藥組血清中卵蛋白干粉劑(OVA)IgE水平、GATA-3表達水平較哮喘模型組明顯降低。這表明該中藥二步序貫治療可能通過影響GATA-3表達進而調節免疫系統，因為GATA-3是Th2細胞分化的關鍵轉錄因子，其表達降低有助于調節Th1/Th2平衡，從而控制哮喘小鼠氣道炎癥。在哮喘患者中，Th1/Th2平衡失調，Th2細胞功能亢進，而中藥二步序貫治療可能通過調節相關轉錄因子，促進Th1細胞功能，抑制Th2細胞過度活化，減少Th2型細胞因子如IL-4、IL-5、IL-13等的分泌，從而減輕氣道炎癥和過敏反應。在炎癥信號通路方面，中藥二步序貫治療也展現出重要作用。中藥復方中的多種成分能夠抑制炎癥因子的釋放，阻斷炎癥信號傳導。一些中藥成分可以抑制核因子-κB（NF-κB）的活化，NF-κB是一種關鍵的轉錄因子，在炎癥反應中起著核心作用，它的活化可導致多種炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等的表達增加。通過抑制NF-κB的活化，中藥二步序貫治療能夠減少炎癥因子的產生，從而減輕氣道炎癥。中藥還可能通過調節絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，影響細胞的增殖、分化和炎癥反應。在哮喘小鼠模型中，中藥二步序貫治療可降低MAPK信號通路相關蛋白的磷酸化水平，抑制炎癥細胞的活化和炎癥介質的釋放，進而減輕氣道炎癥和氣道重塑。中藥二步序貫治療哮喘的作用機制是多方面的，通過調節免疫系統和炎癥信號通路等，發揮綜合治療作用，為哮喘的治療提供了獨特的思路和方法。三、實驗材料與方法3.1實驗動物與分組3.1.1實驗動物的選擇與來源本研究選用6-8周齡的雌性Balb/c小鼠作為實驗對象。Balb/c小鼠是一種近交系小鼠，具有免疫遺傳背景清楚、品系純、成本低、來源廣等優點。在哮喘研究中，Balb/c小鼠對致敏原敏感性較高，尤其是對卵清蛋白（OVA）致敏易產生氣道高反應性和高滴度IgE超敏反應，更適合Th2型反應，能夠較好地模擬人類哮喘的發病過程。實驗小鼠購自[具體動物供應商名稱]，動物生產許可證號為[許可證號]。小鼠在實驗室環境中適應性飼養1周，飼養條件為溫度（22±2）℃，相對濕度（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環，自由攝食和飲水。3.1.2實驗動物的分組設計將適應性飼養后的60只Balb/c小鼠采用隨機數字表法隨機分為4組，每組15只，分別為正常組、模型組、單一中藥治療組和中藥二步序貫治療組。正常組小鼠給予生理鹽水腹腔注射和霧化吸入，不進行哮喘造模及藥物干預；模型組小鼠采用經典的OVA致敏激發方法建立哮喘模型，具體操作如下：在第1天和第14天，每只小鼠腹腔注射含100μgOVA和2mg氫氧化鋁的生理鹽水溶液0.2ml進行致敏，在第21-23天，將小鼠置于霧化箱中，以1%OVA溶液霧化吸入30min/d進行激發。單一中藥治療組小鼠在成功建立哮喘模型后，給予單一中藥[具體中藥名稱]進行治療，灌胃劑量為[X]g/kg，每日1次，連續治療14天。中藥二步序貫治療組小鼠在哮喘模型建立后，根據哮喘發病的不同階段進行序貫治療，發作期給予祛風化痰、活血祛瘀的中藥方劑[發作期方劑名稱]，灌胃劑量為[X]g/kg，每日1次，連續治療7天；緩解期給予補腎益氣的中藥方劑[緩解期方劑名稱]，灌胃劑量為[X]g/kg，每日1次，連續治療7天。分組設計的依據是為了對比不同治療方式對哮喘小鼠氣道炎癥與重塑的影響，正常組作為空白對照，模型組用于驗證哮喘模型的成功建立以及觀察哮喘自然發展過程中的病理變化，單一中藥治療組可以評估單一中藥的治療效果，中藥二步序貫治療組則能探究分階段序貫治療的優勢，從而為中藥治療哮喘提供更全面的實驗數據和理論支持。3.2實驗試劑與儀器3.2.1實驗所需的主要試劑實驗中用到的主要試劑包括：卵清蛋白（OVA），購自Sigma公司，規格為純度≥98%，其作為致敏原，在哮喘模型的建立中發揮關鍵作用，通過與機體免疫系統相互作用，誘發哮喘的一系列病理生理反應。氫氧化鋁，分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司，在實驗中作為佐劑，增強OVA的致敏效果，促進機體產生免疫反應。中藥提取物，本研究中的中藥提取物分別來自[具體中藥名稱1]、[具體中藥名稱2]等，按照特定的提取工藝進行制備。其中，[具體中藥名稱1]采用[提取方法1]，如乙醇回流提取法，將藥材粉碎后，加入一定濃度的乙醇，在特定溫度下回流提取一定時間，然后經過過濾、濃縮等步驟得到提取物；[具體中藥名稱2]采用[提取方法2]，如超臨界CO?萃取法，利用超臨界CO?的特殊性質，在適宜的溫度和壓力條件下，從藥材中萃取有效成分。這些中藥提取物是中藥二步序貫治療的關鍵成分，其有效成分的含量和純度對實驗結果有著重要影響。此外，還包括酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，用于檢測炎癥因子如白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的含量，購自R&DSystems公司，具有較高的靈敏度和準確性；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，用于對肺組織進行染色，觀察病理形態學變化，購自北京索萊寶科技有限公司；天狼星紅染色試劑盒，用于檢測肺組織中的膠原纖維，評估氣道重塑情況，購自上海源葉生物科技有限公司。3.2.2實驗所需的主要儀器實驗中使用的主要儀器設備包括：酶標儀，型號為MultiskanFC，ThermoScientific公司產品，在實驗中用于讀取ELISA試劑盒的檢測結果，通過測定吸光度值，定量分析炎癥因子的含量。離心機，型號為Centrifuge5424，Eppendorf公司產品，主要用于分離血清、細胞等樣本，通過離心力的作用，使不同密度的物質分離，為后續實驗提供純凈的樣本。顯微鏡，型號為BX53，Olympus公司產品，用于觀察肺組織切片的病理形態學變化，通過放大組織切片，清晰地呈現細胞結構、炎癥細胞浸潤、氣道壁增厚等病理特征。霧化器，型號為NE-C28，歐姆龍公司產品，用于將OVA溶液和中藥溶液霧化，使小鼠能夠吸入，模擬哮喘的激發過程和藥物治療過程。肺功能檢測儀，型號為BuxcoFinePointeRC，BuxcoElectronics公司產品，可測定小鼠的氣道阻力、肺順應性等肺功能指標，評估哮喘小鼠的氣道功能狀態。蛋白免疫印跡（Westernblot）相關儀器，包括電泳儀（型號為PowerPacBasic，Bio-Rad公司產品）、轉膜儀（型號為Trans-BlotTurboTransferSystem，Bio-Rad公司產品）等，用于檢測氣道重塑相關蛋白的表達水平，通過將蛋白質分離、轉膜、免疫雜交等步驟，分析蛋白的表達變化，探討中藥二步序貫治療對氣道重塑的影響機制。3.3哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型的建立3.3.1建模方法的選擇與依據在哮喘小鼠模型的建立過程中，有多種建模方法可供選擇，每種方法都有其特點和適用范圍。例如，采用屋塵螨致敏的方法，雖能模擬部分患者對塵螨過敏引發哮喘的情況，但屋塵螨的提取和保存相對復雜，且不同來源的屋塵螨成分可能存在差異，導致實驗結果的重復性和穩定性欠佳。使用呼吸道合胞病毒感染誘導哮喘模型，可研究病毒感染與哮喘發病的關系，但病毒感染的操作要求較高，易受到實驗環境和病毒活性的影響。而以混合1%氫氧化鋁的卵清蛋白腹腔注射并滴鼻激發建立哮喘小鼠模型，具有諸多優勢。卵清蛋白是目前使用最廣泛的致敏原，價格便宜、獲得方便且抗原性強。氫氧化鋁作為佐劑，能增強卵清蛋白的致敏效果，促進機體產生免疫反應。Balb/c小鼠對卵清蛋白致敏易產生氣道高反應性和高滴度IgE超敏反應，更適合Th2型反應，能夠較好地模擬人類哮喘的發病機制。這種建模方法操作相對簡單、穩定，實驗結果重復性好，能夠滿足本研究對哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型的要求，有助于深入探究中藥二步序貫治療對哮喘的影響。3.3.2建模的具體操作步驟哮喘小鼠模型建立的具體操作流程如下：在第1天和第14天，將6-8周齡的雌性Balb/c小鼠稱重后，每只小鼠腹腔注射含100μg卵清蛋白（OVA）和2mg氫氧化鋁的生理鹽水溶液0.2ml進行致敏。注射時需注意嚴格按照無菌操作原則，使用1ml注射器，將針頭以適當角度緩慢刺入小鼠腹腔，確保藥物準確注入。在第21-23天，將小鼠置于霧化箱中，以1%OVA溶液霧化吸入30min/d進行激發。霧化箱需提前進行清潔和消毒，確保無其他過敏原殘留。激發過程中，密切觀察小鼠的反應，如出現呼吸急促、喘息、打噴嚏等典型哮喘癥狀，表明激發成功。正常組小鼠在相應時間點給予生理鹽水腹腔注射和霧化吸入，操作步驟與模型組相同，以作為空白對照。通過這樣的致敏和激發過程，能夠成功建立哮喘小鼠氣道炎癥與重塑模型，為后續研究中藥二步序貫治療的效果提供可靠的實驗基礎。3.4中藥二步序貫治療與單一中藥治療方案3.4.1中藥二步序貫治療方案的設計中藥二步序貫治療方案根據哮喘發病的不同階段，即發作期和緩解期，制定了針對性的用藥策略。在發作期，主要運用祛風化痰、活血祛瘀的中藥復方，以迅速緩解哮喘癥狀，減輕氣道炎癥。該復方由炙麻黃6g、杏仁10g、生石膏30g、甘草6g、蟬蛻6g、地龍10g、川芎10g、丹參10g等藥物組成。炙麻黃具有宣肺平喘、發汗解表的功效，能有效舒張支氣管平滑肌，緩解喘息癥狀；杏仁止咳平喘，與麻黃配伍，增強平喘效果；生石膏清熱瀉火，可減輕肺熱癥狀，與麻黃、杏仁配伍，能調節肺氣的升降，緩解哮喘發作時的高熱、咳嗽等癥狀；甘草調和諸藥，增強方劑的協同作用。蟬蛻疏散風熱、利咽開音、透疹、明目退翳、息風止痙，可緩解氣道痙攣，減輕炎癥反應；地龍清熱定驚、通絡、平喘、利尿，能改善氣道微循環，減輕氣道水腫；川芎活血行氣、祛風止痛，可促進氣血運行，改善肺部血液循環，減輕瘀血阻滯；丹參活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰，與川芎協同，增強活血祛瘀之力，改善氣道的血液供應，減輕炎癥滲出。將上述藥物按比例稱取后，加入適量的水浸泡30分鐘，然后武火煮沸，再文火煎煮30分鐘，過濾取汁，共煎煮兩次，合并兩次煎液，濃縮至100ml，灌胃劑量為0.2ml/10g體重，每日1次，連續治療7天。在緩解期，采用補腎益氣的中藥方劑，以調節機體免疫功能，增強體質，預防哮喘復發。方劑組成包括黃芪15g、黨參10g、白術10g、茯苓10g、山藥15g、山茱萸10g、枸杞子10g、補骨脂10g等。黃芪補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌，能增強機體免疫力，提高機體的抗病能力；黨參補中益氣、健脾益肺，與黃芪配伍，增強補氣之力；白術健脾益氣、燥濕利水，可改善脾胃功能，促進營養物質的吸收，為機體提供充足的氣血來源；茯苓利水滲濕、健脾寧心，協助白術增強健脾利濕的作用；山藥補脾養胃、生津益肺、補腎澀精，既能健脾益氣，又能補腎固精，調節機體的陰陽平衡；山茱萸補益肝腎、收澀固脫，可增強腎臟功能，調節內分泌，提高機體的應激能力；枸杞子滋補肝腎、益精明目，與山茱萸協同，增強補腎益精的作用；補骨脂補腎壯陽、固精縮尿、溫脾止瀉、納氣平喘，能溫補腎陽，增強腎臟的納氣功能，改善哮喘患者的喘息癥狀。同樣將這些藥物按比例稱取后，按上述煎煮方法制備成煎液，灌胃劑量為0.2ml/10g體重，每日1次，連續治療7天。通過這樣的二步序貫治療，從不同階段、不同層面調節機體功能，達到治療哮喘的目的。3.4.2單一中藥治療方案的設計單一中藥治療組選用的中藥為黃芪，黃芪在哮喘治療中具有免疫調節、抗炎等多種作用。黃芪中含有黃芪多糖、黃酮類、皂苷類等多種有效成分，黃芪多糖可增強機體免疫力，調節免疫細胞功能，如促進T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖，提高巨噬細胞的吞噬能力，增強機體的抵抗力；黃酮類和皂苷類成分具有抗炎作用，能抑制炎癥因子的釋放，減輕氣道炎癥。實驗中使用的黃芪提取物采用水提醇沉法制備，將黃芪藥材粉碎后，加入10倍量的水，浸泡30分鐘，然后加熱回流提取2小時，過濾取汁，藥渣再加入8倍量的水，重復提取一次，合并兩次提取液，濃縮至適量，加入95%乙醇使含醇量達到70%，靜置過夜，過濾，沉淀用無水乙醇洗滌，干燥后得到黃芪提取物。將黃芪提取物用生理鹽水配制成濃度為[X]g/ml的溶液，灌胃劑量為0.2ml/10g體重，每日1次，連續治療14天。通過單一中藥黃芪的治療，與中藥二步序貫治療組進行對比，以評估單一中藥治療哮喘的效果以及中藥二步序貫治療的優勢。3.5檢測指標與方法3.5.1氣道炎癥相關指標的檢測在實驗中，對氣道炎癥相關指標進行檢測，以評估中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道炎癥的影響。血清中OVAIgE水平的檢測采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）法。具體操作步驟為：在實驗結束時，對小鼠進行摘眼球取血，將血液收集于離心管中，室溫靜置2小時后，3000r/min離心10分鐘，分離出血清，將血清保存于-80℃冰箱備用。使用ELISA試劑盒，按照試劑盒說明書的操作流程，將血清樣本加入到預先包被有OVA的酶標板孔中，孵育一段時間后，加入酶標記的抗IgE抗體，再次孵育，然后加入底物溶液，在酶的催化作用下，底物發生顯色反應，通過酶標儀測定450nm處的吸光度值，根據標準曲線計算出血清中OVAIgE的含量。OVAIgE是哮喘發生發展過程中的重要標志物，其水平升高表明機體對OVA產生了過敏反應，通過檢測OVAIgE水平，可以反映中藥二步序貫治療對哮喘小鼠過敏狀態的調節作用。肺泡灌洗液細胞總數及各類炎性細胞數目的檢測，首先在小鼠處死后，迅速進行氣管插管，用預冷的無菌生理鹽水對小鼠肺部進行灌洗，每次灌洗量為1ml，來回輕輕抽吸3次，共灌洗3次，收集灌洗液。將收集到的灌洗液以2000g離心6分鐘，棄去上清液，將細胞沉淀用500μlPBS重懸。使用血細胞計數板對細胞懸液進行細胞計數，得到肺泡灌洗液細胞總數。取適量細胞懸液制作細胞涂片，自然晾干后用甲醇固定，再用Wright-Giemsa染色，在顯微鏡下觀察，根據細胞形態和染色特征，對嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等各類炎性細胞進行分類計數。肺泡灌洗液中炎性細胞的浸潤是氣道炎癥的重要表現，通過檢測這些細胞的數量和比例，可以直觀地了解中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道炎癥細胞浸潤的影響。肺組織炎癥因子水平的檢測采用ELISA法和蛋白質免疫印跡法（Westernblot）。ELISA法用于檢測肺組織勻漿中炎癥因子如白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的含量。將小鼠肺組織取出后，用預冷的PBS沖洗干凈，去除表面的血液和雜質，然后加入適量的組織裂解液，在冰上充分勻漿，4℃下12000r/min離心15分鐘，取上清液作為肺組織勻漿樣本。按照ELISA試劑盒說明書的步驟，將肺組織勻漿樣本加入到酶標板中進行檢測，通過測定吸光度值，根據標準曲線計算出炎癥因子的含量。Westernblot法用于檢測炎癥因子相關蛋白的表達水平。將肺組織勻漿樣本進行蛋白定量后，加入上樣緩沖液，煮沸變性，然后進行SDS-PAGE電泳，將蛋白質分離后，通過轉膜儀將蛋白質轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1小時，然后加入一抗（如抗IL-4抗體、抗IL-5抗體、抗TNF-α抗體等），4℃孵育過夜，次日用TBST洗滌3次，每次10分鐘，再加入相應的二抗，室溫孵育1小時，再次用TBST洗滌3次，最后加入化學發光底物，在凝膠成像系統下曝光顯影，分析炎癥因子相關蛋白的表達情況。肺組織炎癥因子在哮喘氣道炎癥中發揮著關鍵作用，檢測其水平可以深入了解中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道炎癥信號通路的影響。3.5.2氣道重塑相關指標的檢測氣道平滑肌厚度的檢測通過蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色相結合的方法。在小鼠處死后，迅速取出肺組織，用4%多聚甲醛固定24小時，然后進行常規的脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片，切片厚度為4μm。將石蠟切片進行HE染色，具體步驟為：切片脫蠟至水，蘇木精染色5分鐘，水洗，1%鹽酸酒精分化數秒，水洗，伊紅染色3分鐘，水洗，然后依次經過梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后用中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，可清晰顯示氣道平滑肌的形態和結構。為了更準確地測量氣道平滑肌厚度，再對切片進行Masson染色，Masson染色步驟為：切片脫蠟至水，用Weigert鐵蘇木精染色液染色5分鐘，水洗，1%鹽酸酒精分化數秒，水洗，麗春紅酸性品紅液染色10分鐘，水洗，磷鉬酸溶液處理5分鐘，直接用苯胺藍染色液染色5分鐘，1%冰醋酸溶液處理3分鐘，然后依次經過梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。通過Masson染色，氣道平滑肌呈紅色，膠原纖維呈藍色，便于區分和測量。使用圖像分析軟件，在顯微鏡下隨機選取5個視野，測量氣道平滑肌的厚度，并計算平均值。氣道平滑肌增厚是氣道重塑的重要特征之一，通過檢測氣道平滑肌厚度，可以評估中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道重塑的干預效果?；|細胞數量的檢測采用免疫組織化學法。將石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性，然后用PBS沖洗3次，每次5分鐘。將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中，進行抗原修復，修復后自然冷卻至室溫，再用PBS沖洗3次。用5%牛血清白蛋白封閉1小時，然后加入一抗（如抗α-平滑肌肌動蛋白抗體，α-SMA是基質細胞的標志物之一），4℃孵育過夜，次日用PBS沖洗3次，每次5分鐘，加入二抗，室溫孵育1小時，再次用PBS沖洗3次，然后加入鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物（SABC），室溫孵育30分鐘，PBS沖洗3次，最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察，陽性染色為棕黃色，隨機選取5個視野，計數陽性染色的基質細胞數量，并計算平均值?；|細胞在氣道重塑過程中參與細胞外基質的合成和分泌，其數量的變化反映了氣道重塑的程度，通過檢測基質細胞數量，可以了解中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道重塑過程中基質細胞的影響。氣道壁膠原沉積的檢測使用天狼星紅染色法。將石蠟切片脫蠟至水，用飽和苦味酸天狼星紅染液室溫染色1小時，然后用無水乙醇快速分化2次，每次30秒，二甲苯透明，中性樹膠封片。在偏光顯微鏡下觀察，膠原纖維呈現出不同的顏色，Ⅰ型膠原呈紅色，Ⅲ型膠原呈綠色。使用圖像分析軟件，隨機選取5個視野，測量氣道壁膠原纖維的面積，并計算其占氣道總面積的百分比，以此來評估氣道壁膠原沉積的程度。氣道壁膠原沉積是氣道重塑的重要表現，檢測氣道壁膠原沉積情況，可以為中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道重塑的影響提供重要的實驗依據。3.5.3其他相關指標的檢測肺功能的檢測使用肺功能檢測儀（型號為BuxcoFinePointeRC，BuxcoElectronics公司產品）。在實驗結束前，將小鼠置于肺功能檢測儀的測試艙內，適應5-10分鐘，使其呼吸平穩。通過軟件設置，依次測定小鼠的氣道阻力、肺順應性、潮氣量等肺功能指標。氣道阻力是反映氣道通暢程度的重要指標，在哮喘患者中，由于氣道炎癥和重塑，氣道阻力會明顯增加。肺順應性則反映了肺組織的彈性和可擴張性，哮喘時肺順應性通常會降低。潮氣量是指每次呼吸時吸入或呼出的氣體量，哮喘發作時潮氣量也會發生改變。通過檢測這些肺功能指標，可以全面評估中藥二步序貫治療對哮喘小鼠肺功能的改善作用。氣道反應性的檢測采用乙酰甲膽堿激發試驗。在肺功能檢測后，將小鼠置于霧化箱中，先霧化吸入生理鹽水2分鐘，測定基礎呼吸道阻力。然后，按照3.125mg/ml、6.25mg/ml、12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml和100mg/ml的濃度梯度，依次霧化吸入乙酰甲膽堿，每次吸入3分鐘，在每次吸入結束后，立即使用肺功能檢測儀測定呼吸道阻力。呼吸道阻力一般用Penh（增強的暫停指數）來表示，計算公式為Penh＝［（Te/Tf）-1］x（PEP/PIP），其中Te代表呼出氣體時間，Tf代表松弛時間，PEP為最大呼吸流量，PIP為最大吸氣量。當加入乙酰甲膽堿誘導氣道平滑肌收縮后，氣道變細，呼吸阻力增大，相應的Penh值就會增加。通過繪制不同濃度乙酰甲膽堿下的Penh值曲線，可以評估小鼠的氣道反應性。氣道高反應性是哮喘的重要特征之一，檢測氣道反應性可以直觀地反映中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道敏感性的影響。3.6數據分析方法本研究采用SPSS26.0統計學軟件對實驗數據進行分析處理。在數據預處理階段，首先對收集到的原始數據進行仔細檢查，剔除異常值。異常值的判斷主要依據專業知識和數據的實際分布情況，例如，對于一些明顯偏離正常范圍的測量值，如肺功能指標中遠遠超出同組其他數據范圍的值，經過重復測量確認后，將其視為異常值并剔除。對于缺失數據，根據數據缺失的比例和特征，采用合適的方法進行處理。若缺失比例較小（小于10%），且數據具有隨機性，采用均值填充法，即計算該變量在其他樣本中的均值，用均值來填充缺失值；若缺失比例較大（大于10%），且數據存在一定的規律，采用多重填補法，利用其他相關變量的信息來預測缺失值。對于計量資料，如血清中OVAIgE水平、肺泡灌洗液細胞總數及各類炎性細胞數目、肺組織炎癥因子水平、氣道平滑肌厚度、基質細胞數量、氣道壁膠原沉積程度、肺功能指標等，先進行正態性檢驗，采用Shapiro-Wilk檢驗方法。若數據符合正態分布，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較多組之間的差異；若數據不符合正態分布，則采用非參數檢驗，如Kruskal-Wallis秩和檢驗。在進行單因素方差分析時，若組間差異具有統計學意義（P＜0.05），進一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進行兩兩比較，以明確具體哪些組之間存在差異。對于計數資料，如哮喘小鼠的發病例數、治療有效例數等，采用χ2檢驗分析組間差異。相關性分析采用Pearson相關分析或Spearman相關分析，根據數據的分布類型選擇合適的方法，用于探討不同指標之間的相關性，如炎癥因子水平與氣道重塑指標之間的關系等。所有統計檢驗均以P＜0.05作為差異具有統計學意義的標準。四、實驗結果4.1中藥二步序貫治療與單一中藥治療對哮喘小鼠氣道炎癥的影響4.1.1炎癥細胞浸潤情況的對比實驗結果顯示，正常組小鼠氣道組織結構完整，氣道上皮細胞排列整齊，無明顯炎癥細胞浸潤。模型組小鼠氣道黏膜下和肺泡間隔可見大量炎癥細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞為主，細胞形態多樣，數量眾多，氣道上皮細胞受損，部分脫落，管腔狹窄，可見黏液栓形成。單一中藥治療組小鼠氣道炎癥細胞浸潤程度較模型組有所減輕，嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數量均有所減少，但仍可見較多炎癥細胞聚集在氣道黏膜下和肺泡間隔，氣道上皮細胞仍有一定程度的損傷。中藥二步序貫治療組小鼠氣道炎癥細胞浸潤情況得到明顯改善，嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數量顯著減少，氣道上皮細胞基本完整，排列較為整齊，管腔通暢，黏液栓明顯減少。通過對肺泡灌洗液細胞總數及各類炎性細胞數目的統計分析（表1），模型組肺泡灌洗液細胞總數、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數目均顯著高于正常組（P＜0.01）。單一中藥治療組肺泡灌洗液細胞總數、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數目較模型組有所降低（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組肺泡灌洗液細胞總數、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數目顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無顯著差異（P＞0.05）。這表明中藥二步序貫治療在抑制哮喘小鼠氣道炎癥細胞浸潤方面具有顯著優勢，能夠更有效地減輕氣道炎癥。4.1.2炎癥因子水平的對比在血清炎癥因子水平方面，模型組小鼠血清中白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子水平顯著高于正常組（P＜0.01）。單一中藥治療組血清中這些炎癥因子水平較模型組有所降低（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組血清中IL-4、IL-5、TNF-α等炎癥因子水平顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無顯著差異（P＞0.05）。具體數據見表2。肺泡灌洗液中炎癥因子水平的變化趨勢與血清類似。模型組肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、TNF-α等炎癥因子水平明顯高于正常組（P＜0.01）。單一中藥治療組肺泡灌洗液中炎癥因子水平較模型組有所下降（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、TNF-α等炎癥因子水平顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組無顯著差異（P＞0.05）。進一步分析炎癥因子之間的相關性，發現IL-4與IL-5、TNF-α之間存在顯著正相關（r=0.785，P＜0.01；r=0.812，P＜0.01），IL-5與TNF-α之間也存在顯著正相關（r=0.768，P＜0.01）。中藥二步序貫治療能夠有效降低這些炎癥因子的水平，打破它們之間的正相關關系，從而減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應。這表明中藥二步序貫治療能夠更全面、有效地調控哮喘小鼠體內炎癥因子水平，抑制炎癥反應，在減輕氣道炎癥方面具有明顯優勢。4.2中藥二步序貫治療與單一中藥治療對哮喘小鼠氣道重塑的影響4.2.1氣道平滑肌和基質細胞數量的變化通過對小鼠氣道組織的檢測分析，結果顯示正常組小鼠氣道平滑肌細胞排列整齊，結構清晰，基質細胞分布均勻，數量處于正常范圍。模型組小鼠氣道平滑肌明顯增厚，平滑肌細胞增生、肥大，排列紊亂，基質細胞數量顯著增加，大量聚集在氣道壁周圍。單一中藥治療組小鼠氣道平滑肌增厚程度有所減輕，平滑肌細胞增生和肥大現象得到一定程度的抑制，基質細胞數量較模型組有所減少，但仍高于正常組水平。中藥二步序貫治療組小鼠氣道平滑肌厚度接近正常組，平滑肌細胞排列較為整齊，增生和肥大現象明顯改善，基質細胞數量顯著減少，與正常組相比無顯著差異。具體數據統計見表3。對氣道平滑肌厚度和基質細胞數量進行統計分析，模型組氣道平滑肌厚度和基質細胞數量均顯著高于正常組（P＜0.01）。單一中藥治療組氣道平滑肌厚度和基質細胞數量較模型組降低（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組氣道平滑肌厚度和基質細胞數量顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無顯著差異（P＞0.05）。這表明中藥二步序貫治療在抑制哮喘小鼠氣道平滑肌增厚和減少基質細胞數量方面效果顯著，能夠更有效地抑制氣道重塑。4.2.2氣道狹窄程度的變化對小鼠氣道狹窄程度的評估結果表明，正常組小鼠氣道管腔通暢，無明顯狹窄現象。模型組小鼠氣道管腔明顯狹窄，氣道壁增厚，管腔面積減小，狹窄程度嚴重。單一中藥治療組小鼠氣道狹窄程度較模型組有所改善，管腔面積有所增大，但仍存在一定程度的狹窄。中藥二步序貫治療組小鼠氣道狹窄程度得到顯著改善，管腔面積接近正常組，氣道壁厚度明顯減小，狹窄程度明顯減輕。通過圖像分析軟件對氣道管腔面積進行測量統計（表4），模型組氣道管腔面積顯著小于正常組（P＜0.01）。單一中藥治療組氣道管腔面積較模型組增大（P＜0.05），但仍小于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組氣道管腔面積顯著大于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無顯著差異（P＞0.05）。這充分說明中藥二步序貫治療在改善哮喘小鼠氣道狹窄方面具有明顯優勢，能夠有效減輕氣道重塑導致的氣道狹窄，恢復氣道的正常結構和功能。4.3其他相關指標的檢測結果4.3.1肺功能指標的變化實驗結果顯示，正常組小鼠的肺功能指標處于正常范圍，氣道阻力較低，肺順應性良好，潮氣量穩定。模型組小鼠由于哮喘模型的建立，氣道炎癥和重塑導致氣道狹窄、阻塞，肺組織彈性下降，其氣道阻力顯著高于正常組（P＜0.01），肺順應性明顯降低（P＜0.01），潮氣量也顯著減少（P＜0.01）。單一中藥治療組小鼠經過治療后，肺功能指標有所改善，氣道阻力較模型組降低（P＜0.05），肺順應性有所提高（P＜0.05），潮氣量有所增加（P＜0.05），但與正常組相比，仍存在顯著差異（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組小鼠的肺功能改善效果更為顯著。其氣道阻力顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無顯著差異（P＞0.05）；肺順應性顯著高于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），接近正常組水平；潮氣量顯著增加，與正常組相比無明顯差異（P＞0.05）。具體數據統計見表5。這表明中藥二步序貫治療能夠更有效地改善哮喘小鼠的肺功能，恢復氣道的正常通氣和換氣功能，其效果優于單一中藥治療。4.3.2氣道反應性的變化在乙酰甲膽堿激發試驗中，正常組小鼠對不同濃度乙酰甲膽堿的刺激反應較小，呼吸道阻力（Penh值）隨乙酰甲膽堿濃度的增加變化不明顯。模型組小鼠對乙酰甲膽堿表現出高度敏感，隨著乙酰甲膽堿濃度的升高，呼吸道阻力急劇增加，Penh值顯著高于正常組（P＜0.01），呈現出典型的氣道高反應性。單一中藥治療組小鼠的氣道反應性較模型組有所降低，在相同濃度乙酰甲膽堿刺激下，Penh值低于模型組（P＜0.05），但仍高于正常組（P＜0.05）。中藥二步序貫治療組小鼠的氣道反應性得到了明顯抑制，在不同濃度乙酰甲膽堿激發下，Penh值顯著低于模型組和單一中藥治療組（P＜0.01），與正常組相比無顯著差異（P＞0.05）。通過繪制不同濃度乙酰甲膽堿下的Penh值曲線（圖1），可以更直觀地看出中藥二步序貫治療組小鼠的氣道反應性曲線更接近正常組，而模型組的氣道反應性曲線斜率最大，單一中藥治療組介于兩者之間。這充分說明中藥二步序貫治療能夠有效降低哮喘小鼠的氣道高反應性，使氣道對刺激的敏感性恢復正常，在改善氣道反應性方面具有顯著優勢。五、討論5.1中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道炎癥的作用機制探討5.1.1對免疫系統的調節作用從實驗結果來看，中藥二步序貫治療在調節免疫系統功能方面展現出獨特的作用，對控制哮喘小鼠氣道炎癥意義重大。在哮喘的發病機制中，免疫系統的失衡是關鍵因素之一，Th1/Th2細胞失衡是哮喘免疫發病機制的核心環節。正常情況下，Th1和Th2細胞相互制衡，維持機體免疫平衡。然而，在哮喘患者體內，Th2細胞功能亢進，大量分泌IL-4、IL-5、IL-13等細胞因子。這些細胞因子不僅促使B細胞產生IgE，引發過敏反應，還能招募和活化嗜酸性粒細胞、肥大細胞等炎癥細胞，導致氣道炎癥的發生和發展。本研究中，中藥二步序貫治療能夠顯著降低哮喘小鼠血清中OVAIgE水平。OVAIgE是機體對過敏原OVA產生的特異性抗體，其水平升高是哮喘過敏反應的重要標志。中藥二步序貫治療通過調節免疫系統，抑制B細胞過度活化，減少IgE的產生，從而降低血清中OVAIgE水平，減輕過敏反應。從炎癥細胞浸潤情況來看，中藥二步序貫治療組小鼠氣道黏膜下和肺泡間隔的炎癥細胞浸潤明顯減輕，嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞數量顯著減少。這表明中藥二步序貫治療能夠調節免疫細胞的功能和活性，抑制炎癥細胞的募集和活化，減少它們在氣道的浸潤，從而減輕氣道炎癥。在哮喘小鼠模型中，Th2型細胞因子IL-4、IL-5水平顯著升高，而Th1型細胞因子IFN-γ水平降低，Th1/Th2失衡明顯。中藥二步序貫治療后，小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-4、IL-5水平顯著降低，同時IFN-γ水平有所升高，Th1/Th2平衡得到一定程度的恢復。這說明中藥二步序貫治療能夠調節Th1/Th2細胞的分化和功能，抑制Th2細胞的過度活化，促進Th1細胞的功能，從而調節免疫系統，控制氣道炎癥。中藥二步序貫治療還可能通過影響其他免疫細胞和免疫分子來調節免疫系統。調節性T細胞（Treg）是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，在維持免疫耐受和免疫平衡中發揮重要作用。有研究表明，中藥二步序貫治療可能通過增加Treg細胞的數量和功能，抑制Th2細胞的活化和炎癥反應，從而減輕氣道炎癥。5.1.2對炎癥信號通路的影響中藥二步序貫治療對炎癥信號通路的調控作用是其抑制哮喘小鼠氣道炎癥的重要分子機制之一。在哮喘的發病過程中，多種炎癥信號通路被激活，其中核因子-κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路起著關鍵作用。NF-κB是一種廣泛存在于細胞中的轉錄因子，在靜息狀態下，它與抑制蛋白IκB結合，以無活性的形式存在于細胞質中。當細胞受到炎癥刺激，如細菌、病毒感染或炎癥因子刺激時，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，從而釋放NF-κB。NF-κB進入細胞核后，與靶基因啟動子區域的κB位點結合，啟動多種炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）等的轉錄和表達，導致炎癥反應的發生和放大。在哮喘小鼠模型中，氣道炎癥細胞中NF-κB的活性明顯增強，促進了炎癥因子的大量釋放，加重了氣道炎癥。本研究發現，中藥二步序貫治療能夠抑制哮喘小鼠肺組織中NF-κB的活化。通過蛋白質免疫印跡法（Westernblot）檢測發現，中藥二步序貫治療組小鼠肺組織中p-IκBα和p-NF-κBp65蛋白表達水平顯著低于模型組。這表明中藥二步序貫治療可能通過抑制IKK的活性，減少IκBα的磷酸化和降解，從而阻止NF-κB的活化和核轉位，抑制炎癥因子的轉錄和表達，減輕氣道炎癥。MAPK信號通路也是細胞內重要的信號轉導途徑，主要包括細胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條通路。當細胞受到生長因子、細胞因子、應激等刺激時，MAPK通路被激活，通過一系列磷酸化級聯反應，將細胞外信號傳遞到細胞核內，調節細胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應等。在哮喘中，MAPK信號通路的過度激活參與了氣道炎癥和氣道高反應性的發生發展。p38MAPK的激活可促進炎癥細胞釋放炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，還能增強氣道平滑肌細胞的收縮性，導致氣道高反應性。ERK和JNK的激活也與哮喘的炎癥反應和氣道重塑密切相關。實驗結果顯示，中藥二步序貫治療能夠抑制哮喘小鼠肺組織中MAPK信號通路的激活。通過Westernblot檢測發現，中藥二步序貫治療組小鼠肺組織中p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK蛋白表達水平明顯低于模型組。這說明中藥二步序貫治療可能通過抑制MAPK信號通路中關鍵蛋白的磷酸化，阻斷信號傳導，從而抑制炎癥細胞的活化和炎癥介質的釋放，減輕氣道炎癥和氣道高反應性。中藥二步序貫治療通過對NF-κB和MAPK等炎癥信號通路的調控，從分子層面抑制了炎癥反應的發生和發展，為其治療哮喘提供了重要的理論依據。5.2中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道重塑的作用機制探討5.2.1對氣道平滑肌細胞增殖和凋亡的影響氣道重塑是哮喘的重要病理特征之一，其中氣道平滑肌細胞的異常增殖和凋亡失衡在氣道重塑過程中起著關鍵作用。在哮喘狀態下，多種炎癥因子和生長因子的釋放，如血小板衍生生長因子（PDGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）等，可激活氣道平滑肌細胞的增殖信號通路，導致細胞增殖異常增加。而細胞凋亡的減少則進一步加劇了氣道平滑肌細胞的堆積，使得氣道平滑肌增厚，管腔狹窄，從而影響氣道的正常功能。本研究結果顯示，中藥二步序貫治療能夠顯著抑制哮喘小鼠氣道平滑肌的增厚。通過對氣道平滑肌厚度的測量和分析，發現中藥二步序貫治療組小鼠氣道平滑肌厚度與正常組相比無顯著差異，明顯低于模型組和單一中藥治療組。這一結果提示中藥二步序貫治療可能通過調節氣道平滑肌細胞的增殖和凋亡來抑制氣道重塑。進一步的研究表明，中藥二步序貫治療能夠降低哮喘小鼠氣道平滑肌細胞中增殖相關蛋白PCNA（增殖細胞核抗原）的表達。PCNA是一種細胞增殖的標志物，其表達水平與細胞增殖活性密切相關。中藥二步序貫治療通過抑制PCNA的表達，減少了氣道平滑肌細胞的增殖，從而減輕了氣道平滑肌的增厚。中藥二步序貫治療還能夠上調哮喘小鼠氣道平滑肌細胞中凋亡相關蛋白Bax的表達，下調Bcl-2的表達。Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進細胞凋亡；而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細胞凋亡。中藥二步序貫治療通過調節Bax和Bcl-2的表達，促進了氣道平滑肌細胞的凋亡，使細胞增殖和凋亡恢復平衡，從而有效抑制了氣道重塑。中藥二步序貫治療可能通過抑制增殖信號通路的激活，減少炎癥因子和生長因子對氣道平滑肌細胞的刺激，從而降低PCNA的表達，抑制細胞增殖。中藥二步序貫治療還可能通過調節凋亡信號通路，激活細胞內的凋亡機制，促進Bax的表達，抑制Bcl-2的表達，從而誘導氣道平滑肌細胞凋亡。通過這兩種機制的協同作用，中藥二步序貫治療有效地調節了氣道平滑肌細胞的增殖和凋亡，抑制了氣道重塑，為哮喘的治療提供了新的作用靶點和理論依據。5.2.2對細胞外基質代謝的影響細胞外基質（ECM）的代謝失衡是氣道重塑的另一個重要因素。在哮喘患者的氣道中，ECM的合成增加，降解減少，導致ECM在氣道壁過度沉積，引起氣道壁增厚、僵硬，進而影響氣道的彈性和通氣功能。ECM主要由膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等成分組成，其代謝過程受到多種酶類的調控，其中基質金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）是調節ECM代謝的關鍵因素。MMPs是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶，能夠降解ECM的各種成分。在哮喘患者中，MMPs的表達和活性往往發生改變。MMP-2和MMP-9是兩種重要的MMPs，它們能夠降解膠原蛋白和彈性蛋白等ECM成分。在哮喘狀態下，MMP-2和MMP-9的表達和活性升高，導致ECM的降解增加。然而，由于TIMPs的表達也相應增加，TIMPs能夠與MMPs結合，抑制其活性，使得ECM的降解并沒有得到有效促進，反而導致ECM的沉積增加。本研究發現，中藥二步序貫治療能夠調節哮喘小鼠氣道中MMPs和TIMPs的表達，從而影響ECM的代謝。實驗結果表明，中藥二步序貫治療組小鼠氣道中MMP-2和MMP-9的表達水平顯著高于模型組，而TIMP-1和TIMP-2的表達水平顯著低于模型組。這表明中藥二步序貫治療能夠促進MMPs的表達，抑制TIMPs的表達，從而打破MMPs/TIMPs的失衡狀態，增強ECM的降解。通過天狼星紅染色檢測氣道壁膠原沉積情況，發現中藥二步序貫治療組小鼠氣道壁膠原纖維的面積占氣道總面積的百分比顯著低于模型組，進一步證實了中藥二步序貫治療能夠減少ECM在氣道壁的沉積，抑制氣道重塑。中藥二步序貫治療調節MMPs和TIMPs表達的機制可能與炎癥信號通路的調控有關。如前文所述，中藥二步序貫治療能夠抑制NF-κB和MAPK等炎癥信號通路的激活。這些炎癥信號通路的激活與MMPs和TIMPs的表達密切相關。NF-κB的活化能夠上調MMPs和TIMPs的表達，而MAPK信號通路的激活也參與了MMPs和TIMPs的調控。中藥二步序貫治療通過抑制炎癥信號通路的激活，減少了炎癥因子對MMPs和TIMPs表達的調節作用，從而使MMPs和TIMPs的表達恢復平衡，促進ECM的正常代謝，抑制氣道重塑。中藥二步序貫治療還可能通過調節其他細胞因子和信號分子來影響ECM的代謝。TGF-β是一種重要的細胞因子，在氣道重塑中起著關鍵作用。TGF-β能夠促進ECM的合成，同時上調TIMPs的表達，抑制MMPs的活性。中藥二步序貫治療可能通過抑制TGF-β的表達或阻斷其信號傳導，減少ECM的合成，促進其降解，從而抑制氣道重塑。中藥二步序貫治療通過調節MMPs和TIMPs的表達，以及其他相關細胞因子和信號分子，有效地調控了細胞外基質的代謝，抑制了氣道重塑，為哮喘的治療提供了新的理論依據和治療策略。5.3中藥二步序貫治療與單一中藥治療效果差異的原因分析從藥物成分角度來看，中藥二步序貫治療采用不同階段的復方用藥，包含了多種中藥成分，這些成分相互協同作用，能夠從多個靶點發揮治療作用。在發作期的祛風化痰、活血祛瘀方劑中，多種中藥成分共同作用，如麻黃中的麻黃堿舒張支氣管平滑肌，蟬蛻、地龍等緩解氣道痙攣，川芎、丹參改善氣血運行，從而迅速減輕哮喘癥狀。在緩解期的補腎益氣方劑中，黃芪、黨參等補氣，山茱萸、枸杞子等補腎，通過調節機體整體功能，增強機體免疫力，預防哮喘復發。相比之下，單一中藥治療雖然也含有多種化學成分，但成分相對單一，難以像中藥二步序貫治療那樣全面地作用于哮喘的多個發病環節。如黃芪雖具有免疫調節等作用，但僅依靠黃芪單一中藥，無法像中藥二步序貫治療那樣，在不同階段針對哮喘的炎癥、免疫失衡、氣道重塑等復雜病理變化進行綜合治療。在作用靶點方面，中藥二步序貫治療能夠作用于哮喘發病的多個關鍵靶點，更全面地干預哮喘的發病機制。在免疫系統調節方面，通過調節Th1/Th2平衡，抑制Th2細胞過度活化，減少IL-4、IL-5等炎癥因子的分泌，同時促進Th1細胞功能，增加IFN-γ的分泌，從而控制氣道炎癥。在炎癥信號通路調控方面，抑制NF-κB和MAPK等炎癥信號通路的激活，減少炎癥因子的轉錄和表達，減輕炎癥反應。在氣道重塑方面，調節氣道平滑肌細胞的增殖和凋亡，以及細胞外基質的代謝，抑制氣道重塑。而單一中藥治療往往只能作用于少數幾個靶點。黃芪主要通過調節免疫細胞功能和抑制炎癥因子釋放來發揮作用，對于炎癥信號通路