中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞在椎管內(nèi)嗎啡瘙癢中的角色與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義疼痛作為一種復(fù)雜的生理心理活動(dòng)，是臨床常見(jiàn)的癥狀之一，不僅給患者帶來(lái)身體上的痛苦，還對(duì)其心理和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。在眾多疼痛治療方法中，椎管內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛憑借其顯著的效果在臨床廣泛應(yīng)用，尤其在剖宮產(chǎn)、骨科手術(shù)等術(shù)后鎮(zhèn)痛以及癌痛治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。以剖宮產(chǎn)手術(shù)為例，椎管內(nèi)嗎啡可有效緩解產(chǎn)婦術(shù)后的中至重度疼痛，促進(jìn)其身體恢復(fù)和對(duì)新生兒的照料。然而，瘙癢這一不良反應(yīng)卻極大地限制了椎管內(nèi)嗎啡的使用。相關(guān)研究表明，硬膜外及鞘內(nèi)嗎啡所致瘙癢在非妊娠患者的發(fā)生率為30%-100%，而在妊娠患者中更是高達(dá)60%-100%。這種瘙癢癥狀常分布在注射水平的軀干及面部，尤其是三叉神經(jīng)眼支支配區(qū)域，被稱為中樞性瘙癢。嚴(yán)重的瘙癢不僅會(huì)引發(fā)患者強(qiáng)烈的搔抓意愿及搔抓反射，影響患者術(shù)后的休息和恢復(fù)，還可能導(dǎo)致患者對(duì)鎮(zhèn)痛治療的滿意度下降，甚至因難以忍受而拒絕繼續(xù)使用嗎啡，從而限制了嗎啡在疼痛治療中的劑量和應(yīng)用范圍。例如，在一些剖宮產(chǎn)術(shù)后患者中，瘙癢的困擾使得她們無(wú)法安心休息，影響了產(chǎn)后身體的恢復(fù)和對(duì)新生兒的照顧。肥大細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)中的重要細(xì)胞，近年來(lái)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用逐漸受到關(guān)注。在正常生理狀態(tài)下，中樞肥大細(xì)胞主要分布在血腦屏障腦側(cè)腦膜和血管周圍區(qū)域。一旦機(jī)體發(fā)生應(yīng)激、疾病或創(chuàng)傷，腦內(nèi)肥大細(xì)胞的數(shù)量和分布會(huì)發(fā)生改變，激活的中樞肥大細(xì)胞可迅速釋放多種炎癥介質(zhì)，如組胺、5-羥色胺、細(xì)胞因子等。這些介質(zhì)不僅參與免疫和炎癥反應(yīng)，還可能與神經(jīng)系統(tǒng)相互作用，影響神經(jīng)功能。在一些神經(jīng)炎癥相關(guān)的疾病中，中樞肥大細(xì)胞的活化被發(fā)現(xiàn)與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?；诖?，深入研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞與椎管內(nèi)嗎啡瘙癢的相關(guān)性具有重要的臨床意義。一方面，有助于揭示椎管內(nèi)嗎啡瘙癢的發(fā)病機(jī)制，為其治療和預(yù)防提供新的理論依據(jù)。目前關(guān)于椎管內(nèi)嗎啡致瘙癢的機(jī)制尚未完全明確，通過(guò)研究中樞肥大細(xì)胞在其中的作用，有望發(fā)現(xiàn)新的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，從而為開(kāi)發(fā)更有效的治療方法奠定基礎(chǔ)。另一方面，對(duì)于優(yōu)化臨床疼痛治療方案、提高患者的治療體驗(yàn)和生活質(zhì)量具有重要價(jià)值。若能找到通過(guò)調(diào)節(jié)中樞肥大細(xì)胞來(lái)減輕或預(yù)防椎管內(nèi)嗎啡瘙癢的方法，將在不影響嗎啡鎮(zhèn)痛效果的前提下，減少患者的痛苦，使患者能夠更好地接受疼痛治療，促進(jìn)其術(shù)后恢復(fù)和身心健康。1.2研究目的本研究旨在深入探究中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞與椎管內(nèi)嗎啡瘙癢之間的相關(guān)性，明確中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞在椎管內(nèi)嗎啡致瘙癢發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用及作用機(jī)制。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，觀察在椎管內(nèi)給予嗎啡后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞的活化狀態(tài)、數(shù)量變化、分布改變以及相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放情況，分析這些變化與瘙癢癥狀出現(xiàn)的時(shí)間、程度之間的關(guān)聯(lián)。同時(shí)，探討通過(guò)干預(yù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞的功能，如使用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑抑制其活化，或敲除相關(guān)基因改變其特性，是否能夠減輕或預(yù)防椎管內(nèi)嗎啡引起的瘙癢，為臨床上預(yù)防和治療椎管內(nèi)嗎啡瘙癢提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)，從而提高患者接受椎管內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛治療的舒適度和依從性，優(yōu)化疼痛治療方案。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在椎管內(nèi)嗎啡瘙癢的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已進(jìn)行了大量探索。國(guó)外研究中，早在20世紀(jì)末就有研究關(guān)注到椎管內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛時(shí)瘙癢這一不良反應(yīng)的高發(fā)性。有研究通過(guò)對(duì)大量接受椎管內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛的患者進(jìn)行觀察，明確了其在非妊娠患者和妊娠患者中的發(fā)生率范圍。對(duì)于其發(fā)病機(jī)制，國(guó)外學(xué)者提出了多種假說(shuō)。有觀點(diǎn)認(rèn)為，嗎啡通過(guò)激活脊髓μ阿片受體，不僅產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，也同時(shí)介導(dǎo)了瘙癢反應(yīng)，如通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，選擇性中樞μ阿片受體拮抗劑可以抑制椎管內(nèi)嗎啡所致瘙癢。還有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-羥色胺亞型3受體激活在其中發(fā)揮重要作用，部分臨床試驗(yàn)及系統(tǒng)性回顧顯示5-HT3拮抗劑如昂丹司瓊能預(yù)防椎管內(nèi)嗎啡所致瘙癢。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也在不斷深入。在臨床觀察方面，國(guó)內(nèi)眾多醫(yī)院對(duì)椎管內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛患者的瘙癢發(fā)生情況進(jìn)行了細(xì)致觀察，分析了其與患者年齡、手術(shù)類型、嗎啡劑量等因素的關(guān)系。在機(jī)制研究上，國(guó)內(nèi)學(xué)者同樣對(duì)脊髓μ阿片受體、5-羥色胺受體等進(jìn)行了研究，進(jìn)一步探討其在瘙癢發(fā)生中的作用機(jī)制。同時(shí)，也開(kāi)展了針對(duì)預(yù)防和治療椎管內(nèi)嗎啡瘙癢的藥物研究，如研究加巴噴丁等藥物對(duì)鞘內(nèi)注射嗎啡引起瘙癢的預(yù)防效果，發(fā)現(xiàn)加巴噴丁可以降低瘙癢的發(fā)生率、減輕程度、延遲瘙癢的起始時(shí)間以及縮短瘙癢時(shí)程。關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞的研究，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)其在正常生理狀態(tài)下主要分布在血腦屏障腦側(cè)腦膜和血管周圍區(qū)域，且在應(yīng)激、疾病或創(chuàng)傷發(fā)生時(shí)，其數(shù)量和分布會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而釋放多種炎癥介質(zhì)參與免疫和神經(jīng)反應(yīng)。例如，在神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病模型中，觀察到中樞肥大細(xì)胞的活化及相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放，以及對(duì)神經(jīng)功能的影響。國(guó)內(nèi)研究則側(cè)重于其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的具體作用機(jī)制，如在腦缺血、神經(jīng)退行性疾病等方面的研究，探討中樞肥大細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)如何影響神經(jīng)細(xì)胞的存活、凋亡以及神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)。然而，當(dāng)前研究仍存在諸多不足。在椎管內(nèi)嗎啡瘙癢與中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞相關(guān)性方面，研究尚顯匱乏，二者之間的聯(lián)系尚未得到充分揭示。對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞在椎管內(nèi)嗎啡致瘙癢過(guò)程中，是否被激活、激活后的具體作用途徑以及釋放的炎癥介質(zhì)如何參與瘙癢信號(hào)傳導(dǎo)等問(wèn)題，目前還缺乏深入研究。此外，現(xiàn)有的研究在方法上存在一定局限性，多為觀察性研究或基于動(dòng)物模型的初步探索，缺乏大樣本、多中心的臨床研究以及更為精準(zhǔn)的分子生物學(xué)研究手段，難以全面、準(zhǔn)確地闡明二者之間的關(guān)系，這也限制了針對(duì)椎管內(nèi)嗎啡瘙癢的有效治療方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1椎管內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛概述椎管內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛是一種將嗎啡注入椎管內(nèi)，通過(guò)作用于脊髓和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的阿片受體來(lái)實(shí)現(xiàn)鎮(zhèn)痛的方法。其原理基于嗎啡與脊髓背角淺層大量存在的μ阿片受體（MOR）具有高度親和力。當(dāng)嗎啡進(jìn)入椎管后，與μ阿片受體結(jié)合，抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，如P物質(zhì)、谷氨酸等，從而阻斷疼痛信號(hào)從外周神經(jīng)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳遞。同時(shí)，嗎啡還可以激活下行抑制系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)疼痛信號(hào)的抑制作用，產(chǎn)生顯著的鎮(zhèn)痛效果。在剖宮產(chǎn)手術(shù)中，椎管內(nèi)注入嗎啡后，產(chǎn)婦術(shù)后的疼痛評(píng)分明顯降低，能夠有效緩解手術(shù)創(chuàng)傷帶來(lái)的疼痛。該方法在臨床上具有廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景。在剖宮產(chǎn)術(shù)后鎮(zhèn)痛中，椎管內(nèi)嗎啡能為產(chǎn)婦提供高效、持久的鎮(zhèn)痛效果，促進(jìn)其身體恢復(fù)和對(duì)新生兒的照料。在骨科手術(shù)，如髖關(guān)節(jié)置換術(shù)、脊柱手術(shù)等術(shù)后鎮(zhèn)痛中，椎管內(nèi)嗎啡也能顯著減輕患者的疼痛，有利于患者術(shù)后的康復(fù)鍛煉。此外，對(duì)于癌痛患者，椎管內(nèi)嗎啡可作為一種有效的鎮(zhèn)痛手段，改善患者的生活質(zhì)量。然而，椎管內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛并非完美無(wú)缺，其常見(jiàn)的不良反應(yīng)包括惡心、嘔吐、呼吸抑制、尿潴留以及皮膚瘙癢等。其中，皮膚瘙癢的發(fā)生率較高，尤其是在妊娠患者中，發(fā)生率可達(dá)60%-100%。瘙癢癥狀常分布在注射水平的軀干及面部，特別是三叉神經(jīng)眼支支配區(qū)域，嚴(yán)重影響患者的舒適度和術(shù)后恢復(fù)?；颊呖赡芤蝠W而難以入睡，導(dǎo)致身體疲勞，影響傷口愈合和身體機(jī)能的恢復(fù)。而且，瘙癢還可能引發(fā)患者的焦慮情緒，進(jìn)一步降低其生活質(zhì)量。在一些情況下，患者可能因無(wú)法忍受瘙癢而拒絕繼續(xù)使用嗎啡鎮(zhèn)痛，這不僅會(huì)影響疼痛治療的效果，還可能導(dǎo)致患者承受不必要的痛苦。因此，深入了解椎管內(nèi)嗎啡致瘙癢的機(jī)制，尋找有效的防治方法具有重要的臨床意義。2.2中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞特性中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞起源于CD34+/CD117+多能造血干細(xì)胞。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，這些造血干細(xì)胞在骨髓中產(chǎn)生，隨后以未成熟的前體細(xì)胞形式進(jìn)入血液循環(huán)。它們隨著血流遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在特定的微環(huán)境中完成分化和成熟。在遷移過(guò)程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的化學(xué)信號(hào)和微環(huán)境因素對(duì)肥大細(xì)胞前體細(xì)胞的歸巢和定居起著關(guān)鍵作用，如某些趨化因子和細(xì)胞黏附分子可引導(dǎo)其到達(dá)特定的部位。在正常生理狀態(tài)下，中樞肥大細(xì)胞主要分布在血腦屏障腦側(cè)腦膜和血管周圍區(qū)域。在腦膜中，它們沿著軟腦膜和蛛網(wǎng)膜下腔分布，與神經(jīng)組織緊密相鄰。在血管周圍，它們環(huán)繞著毛細(xì)血管和小靜脈，形成一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞微環(huán)境。這種分布特點(diǎn)使得中樞肥大細(xì)胞能夠快速感知血液循環(huán)中的變化以及神經(jīng)組織微環(huán)境的改變，從而及時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)功能。在腦部發(fā)生炎癥時(shí)，血管周圍的肥大細(xì)胞可迅速響應(yīng)，釋放炎癥介質(zhì)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞在形態(tài)上呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞直徑通常在5-25μm之間。其細(xì)胞核呈圓形，偶見(jiàn)雙核情況。胞質(zhì)中充滿了圓形嗜堿性顆粒，這些顆粒直徑約為0.2-0.5μm。這些顆粒是肥大細(xì)胞的重要特征，內(nèi)部?jī)?chǔ)存著多種生物活性物質(zhì)，如組胺、5-羥色胺、細(xì)胞因子、蛋白水解酶等。當(dāng)肥大細(xì)胞受到刺激時(shí)，這些顆粒會(huì)通過(guò)脫顆粒作用釋放出其中的生物活性物質(zhì)，從而引發(fā)一系列的生理反應(yīng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞在免疫和炎癥反應(yīng)中扮演著至關(guān)重要的角色。當(dāng)機(jī)體受到病原體入侵、應(yīng)激刺激或組織損傷時(shí)，中樞肥大細(xì)胞可被激活。激活后的肥大細(xì)胞通過(guò)脫顆粒釋放組胺等生物胺，組胺可引起血管擴(kuò)張、通透性增加，導(dǎo)致局部組織水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)，肥大細(xì)胞還能釋放細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細(xì)胞因子可招募和激活其他免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，進(jìn)一步放大免疫和炎癥反應(yīng)。在腦缺血再灌注損傷模型中，中樞肥大細(xì)胞被激活后釋放大量炎癥介質(zhì)，加劇了神經(jīng)組織的損傷。此外，中樞肥大細(xì)胞還能通過(guò)與神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等相互作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)功能和神經(jīng)可塑性，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、修復(fù)和疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。2.3瘙癢的神經(jīng)傳導(dǎo)機(jī)制瘙癢作為一種獨(dú)特的感覺(jué)，其神經(jīng)傳導(dǎo)機(jī)制較為復(fù)雜。在皮膚等外周組織中，存在著專門的癢覺(jué)感受器，這些感受器主要由游離神經(jīng)末梢構(gòu)成，能夠感知各種致癢刺激，如組胺、蛋白酶、細(xì)胞因子等。當(dāng)這些致癢物質(zhì)與癢覺(jué)感受器上的相應(yīng)受體結(jié)合后，會(huì)引發(fā)感受器的去極化，產(chǎn)生癢覺(jué)信號(hào)。組胺與組胺受體H1結(jié)合，可激活癢覺(jué)感受器，使其產(chǎn)生興奮信號(hào)。癢覺(jué)信號(hào)產(chǎn)生后，通過(guò)初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的傳入纖維向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)。這些傳入纖維主要是無(wú)髓鞘的C纖維和少量有髓鞘的Aδ纖維。C纖維傳導(dǎo)速度較慢，負(fù)責(zé)傳導(dǎo)慢性、持續(xù)性的瘙癢感覺(jué)；Aδ纖維傳導(dǎo)速度相對(duì)較快，主要參與急性、短暫性瘙癢的傳導(dǎo)。在脊髓背角，初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元與二級(jí)神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系，將癢覺(jué)信號(hào)傳遞給二級(jí)神經(jīng)元。脊髓背角的神經(jīng)元對(duì)癢覺(jué)信號(hào)進(jìn)行初步整合和處理，同時(shí)也受到其他神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)的調(diào)節(jié)。γ-氨基丁酸（GABA）能神經(jīng)元可以抑制脊髓背角神經(jīng)元對(duì)癢覺(jué)信號(hào)的傳遞，而P物質(zhì)等則可增強(qiáng)癢覺(jué)信號(hào)的傳導(dǎo)。從脊髓背角發(fā)出的二級(jí)神經(jīng)元纖維交叉到對(duì)側(cè)，形成脊髓丘腦束，繼續(xù)將癢覺(jué)信號(hào)向上傳導(dǎo)至丘腦。丘腦作為感覺(jué)傳導(dǎo)的重要中繼站，對(duì)癢覺(jué)信號(hào)進(jìn)行進(jìn)一步的整合和分析，然后將信號(hào)投射到大腦皮層的多個(gè)區(qū)域，如軀體感覺(jué)皮層、前扣帶回皮層、島葉皮層等。軀體感覺(jué)皮層負(fù)責(zé)對(duì)瘙癢的定位和強(qiáng)度感知，使個(gè)體能夠明確瘙癢發(fā)生的部位和程度；前扣帶回皮層則與瘙癢引起的情緒反應(yīng)密切相關(guān)，當(dāng)個(gè)體感受到瘙癢時(shí)，前扣帶回皮層的活動(dòng)會(huì)增強(qiáng)，引發(fā)煩躁、不安等負(fù)面情緒；島葉皮層參與對(duì)瘙癢的主觀感受和情感評(píng)價(jià)，影響個(gè)體對(duì)瘙癢的耐受程度。當(dāng)大腦皮層接收到癢覺(jué)信號(hào)后，會(huì)產(chǎn)生瘙癢的主觀感覺(jué)，并引發(fā)搔抓反射等一系列行為反應(yīng)。搔抓皮膚可以暫時(shí)緩解瘙癢，這是因?yàn)樯ψゴ碳ぜせ盍似つw中的痛覺(jué)感受器，產(chǎn)生的疼痛信號(hào)在脊髓和大腦中與癢覺(jué)信號(hào)相互作用，抑制了癢覺(jué)信號(hào)的傳導(dǎo)，從而減輕了瘙癢的感覺(jué)。瘙癢信號(hào)在神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中，還與其他感覺(jué)信號(hào)存在相互作用。疼痛與瘙癢之間存在著復(fù)雜的關(guān)系，適當(dāng)?shù)奶弁创碳た梢砸种起W，這種現(xiàn)象被稱為痛癢拮抗。在臨床上，通過(guò)輕微的刺痛刺激來(lái)緩解瘙癢癥狀具有一定的應(yīng)用。而觸覺(jué)等其他感覺(jué)也可能對(duì)瘙癢產(chǎn)生影響，輕柔的撫摸皮膚有時(shí)可以減輕瘙癢的感覺(jué)，這可能與觸覺(jué)信號(hào)在神經(jīng)傳導(dǎo)通路中對(duì)癢覺(jué)信號(hào)的調(diào)節(jié)有關(guān)。此外，神經(jīng)遞質(zhì)如5-羥色胺、多巴胺等在瘙癢神經(jīng)傳導(dǎo)過(guò)程中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。5-羥色胺既可以通過(guò)作用于5-HT3受體參與瘙癢信號(hào)的傳導(dǎo)，也可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他神經(jīng)遞質(zhì)的釋放來(lái)影響?zhàn)W的感覺(jué)。多巴胺能系統(tǒng)則可能通過(guò)與其他神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的相互作用，參與對(duì)瘙癢的調(diào)節(jié)。三、肥大細(xì)胞與椎管內(nèi)嗎啡瘙癢相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇本研究選擇SPF級(jí)成年雄性C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。選擇該品系小鼠主要基于以下原因：C57BL/6小鼠在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其遺傳背景清晰，具有良好的實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性。相關(guān)研究表明，在構(gòu)建瘙癢模型時(shí)，C57BL/6小鼠相較于其他品系小鼠，更易誘發(fā)出抓撓行為，能夠更有效地模擬椎管內(nèi)嗎啡致瘙癢的現(xiàn)象。同時(shí)，其免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)相對(duì)完善，便于觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞在椎管內(nèi)嗎啡瘙癢過(guò)程中的變化及作用。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為以下4組，每組10只：對(duì)照組：小鼠接受鞘內(nèi)注射生理鹽水，作為空白對(duì)照，用于觀察正常生理狀態(tài)下小鼠的行為及中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞的情況。嗎啡組：小鼠鞘內(nèi)注射嗎啡，建立椎管內(nèi)嗎啡瘙癢模型，以觀察在嗎啡作用下小鼠瘙癢行為的出現(xiàn)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞的活化、數(shù)量、分布等變化。肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組：在鞘內(nèi)注射嗎啡前，先給予小鼠腹腔注射肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑，如色甘酸鈉。色甘酸鈉能夠穩(wěn)定肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜，抑制其脫顆粒，從而減少炎癥介質(zhì)的釋放。通過(guò)該組實(shí)驗(yàn)，探究抑制肥大細(xì)胞活化對(duì)椎管內(nèi)嗎啡瘙癢的影響，分析肥大細(xì)胞在其中的作用?；蚯贸M：選用肥大細(xì)胞缺陷型小鼠，如KitW-sh/W-sh小鼠，該小鼠體內(nèi)肥大細(xì)胞數(shù)量極少或缺失。對(duì)其進(jìn)行鞘內(nèi)注射嗎啡，觀察與正常C57BL/6小鼠在瘙癢行為和神經(jīng)生理指標(biāo)等方面的差異，進(jìn)一步明確肥大細(xì)胞在椎管內(nèi)嗎啡瘙癢中的關(guān)鍵作用。3.1.2實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建采用清醒小鼠鞘內(nèi)注射方法構(gòu)建椎管內(nèi)嗎啡瘙癢模型。具體步驟如下：將小鼠置于立體定位儀上，用碘伏消毒小鼠腰骶部皮膚。在L5-L6椎間隙處，使用微量注射器緩慢插入蛛網(wǎng)膜下腔，注入適量的嗎啡溶液。嗎啡的注射劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)確定為0.5μg/5μl。注射過(guò)程中，密切觀察小鼠的反應(yīng)，確保操作準(zhǔn)確無(wú)誤，避免損傷脊髓。注射完成后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，保持環(huán)境安靜、溫暖，讓小鼠自然蘇醒。對(duì)照組小鼠則以相同的方法鞘內(nèi)注射等量的生理鹽水。通過(guò)該方法，可使嗎啡直接作用于小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)瘙癢反應(yīng)，從而成功構(gòu)建椎管內(nèi)嗎啡瘙癢模型。3.1.3觀察指標(biāo)設(shè)定瘙癢行為指標(biāo)：在小鼠鞘內(nèi)注射藥物后，使用攝像機(jī)對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)觀察和錄像。分別記錄注射后0-5min、5-10min、10-15min、15-20min、20-25min、25-30min等不同時(shí)間段內(nèi)小鼠的搔抓次數(shù)。小鼠搔抓動(dòng)作定義為后爪離開(kāi)地面，對(duì)身體任何部位進(jìn)行搔抓，每次搔抓計(jì)為一次有效動(dòng)作。同時(shí)，觀察小鼠搔抓的部位，如頭面部、軀干、四肢等，并進(jìn)行詳細(xì)記錄。通過(guò)分析搔抓次數(shù)和搔抓部位，評(píng)估小鼠瘙癢的程度和分布情況。神經(jīng)生理指標(biāo)：在小鼠鞘內(nèi)注射藥物后的特定時(shí)間點(diǎn)，如30min、60min、120min等，采用電生理技術(shù)記錄小鼠脊髓背角神經(jīng)元的放電活動(dòng)。將記錄電極插入小鼠脊髓背角，參考電極置于皮下，通過(guò)放大器和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄神經(jīng)元的動(dòng)作電位。分析神經(jīng)元放電頻率、幅度以及放電模式的變化，評(píng)估椎管內(nèi)嗎啡對(duì)脊髓背角神經(jīng)元興奮性的影響，以及肥大細(xì)胞在其中的調(diào)節(jié)作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，迅速取出小鼠的腦組織和脊髓組織。采用免疫組織化學(xué)染色方法，檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中肥大細(xì)胞的數(shù)量、分布以及活化狀態(tài)。使用特異性抗體標(biāo)記肥大細(xì)胞，如類胰蛋白酶抗體，通過(guò)顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞的數(shù)量。同時(shí)，觀察肥大細(xì)胞的形態(tài)變化，判斷其是否處于活化狀態(tài)。此外，利用ELISA技術(shù)檢測(cè)腦組織和脊髓組織中肥大細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)含量，如組胺、5-羥色胺、白細(xì)胞介素-6等，分析炎癥介質(zhì)在椎管內(nèi)嗎啡瘙癢中的作用。3.2實(shí)驗(yàn)過(guò)程與方法在正式實(shí)驗(yàn)前，先對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，溫度控制在22±2℃，濕度保持在50%-60%，采用12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的循環(huán)模式，自由攝食和飲水。飼養(yǎng)一周后，小鼠狀態(tài)穩(wěn)定，方可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組小鼠在麻醉狀態(tài)下，采用與嗎啡組相同的操作方法，于L5-L6椎間隙處進(jìn)行鞘內(nèi)注射，注射5μl生理鹽水。注射完成后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，待其蘇醒。在小鼠蘇醒后，立刻將其置于透明觀察籠中，適應(yīng)10min后，使用攝像機(jī)開(kāi)始記錄，觀察并記錄注射后0-5min、5-10min、10-15min、15-20min、20-25min、25-30min內(nèi)小鼠的搔抓次數(shù)及搔抓部位。嗎啡組小鼠用濃度為3%的戊巴比妥鈉溶液，按照100mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射麻醉。麻醉起效后，將小鼠俯臥位固定于立體定位儀上，用碘伏對(duì)腰骶部皮膚進(jìn)行消毒。在L5-L6椎間隙處，使用10μl微量注射器緩慢插入蛛網(wǎng)膜下腔，當(dāng)有輕微落空感且回抽可見(jiàn)清亮腦脊液時(shí)，表明穿刺成功，隨后緩慢注入含0.5μg嗎啡的5μl溶液。注射過(guò)程需控制速度，在30s內(nèi)完成，以確保藥物均勻注入。注射完成后，小心拔出注射器，用碘伏再次消毒穿刺部位，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，保持環(huán)境安靜、溫暖，使其自然蘇醒。待小鼠蘇醒后，按照與對(duì)照組相同的方式，將其置于透明觀察籠中，適應(yīng)10min后，開(kāi)始記錄不同時(shí)間段內(nèi)小鼠的搔抓次數(shù)及搔抓部位。肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組小鼠先進(jìn)行腹腔注射肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉，劑量為50mg/kg。注射30min后，按照嗎啡組的操作方法，對(duì)小鼠進(jìn)行鞘內(nèi)注射0.5μg/5μl嗎啡。注射完成后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠蘇醒，蘇醒后同樣置于透明觀察籠中，適應(yīng)10min后，在相同的時(shí)間點(diǎn)記錄小鼠的搔抓次數(shù)及搔抓部位。在觀察過(guò)程中，若小鼠出現(xiàn)異常行為，如抽搐、呼吸異常等，需及時(shí)記錄并進(jìn)行相應(yīng)處理?；蚯贸M選用肥大細(xì)胞缺陷型KitW-sh/W-sh小鼠，對(duì)其進(jìn)行鞘內(nèi)注射0.5μg/5μl嗎啡。操作方法與嗎啡組一致，注射完成后小鼠蘇醒，將其放入透明觀察籠中，適應(yīng)10min后，按上述時(shí)間點(diǎn)觀察并記錄小鼠的搔抓次數(shù)及搔抓部位。由于該組小鼠肥大細(xì)胞缺陷，需特別關(guān)注其整體狀態(tài)，若出現(xiàn)其他異常生理反應(yīng)，如免疫功能低下導(dǎo)致的感染跡象等，應(yīng)及時(shí)記錄并分析。在神經(jīng)生理指標(biāo)檢測(cè)方面，對(duì)于對(duì)照組、嗎啡組、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組和基因敲除組小鼠，分別在鞘內(nèi)注射藥物后的30min、60min、120min時(shí)，將小鼠再次麻醉，固定于立體定位儀上。在小鼠頭部進(jìn)行開(kāi)顱手術(shù)，暴露脊髓背角，將記錄電極插入脊髓背角，參考電極置于皮下。電極插入深度根據(jù)小鼠的體重和體型進(jìn)行調(diào)整，一般為1-2mm，以確保能夠準(zhǔn)確記錄神經(jīng)元的放電活動(dòng)。通過(guò)放大器和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，記錄神經(jīng)元的動(dòng)作電位，采樣頻率設(shè)置為10kHz，持續(xù)記錄5min。記錄完成后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算神經(jīng)元的放電頻率、幅度以及分析放電模式的變化。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)時(shí)，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，快速將小鼠用過(guò)量戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行安樂(lè)死。迅速取出小鼠的腦組織和脊髓組織，將其置于4%多聚甲醛溶液中固定24h。隨后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，將固定好的組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片。切片厚度為4μm，將切片進(jìn)行脫蠟、水化處理后，用3%過(guò)氧化氫溶液孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。然后用山羊血清封閉30min，減少非特異性染色。加入類胰蛋白酶抗體（1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS沖洗3次，每次5min，加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再次用PBS沖洗后，加入鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育30min。最后用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后，用中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)肥大細(xì)胞的數(shù)量，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野中肥大細(xì)胞的平均數(shù)。同時(shí)觀察肥大細(xì)胞的形態(tài)變化，判斷其是否處于活化狀態(tài)。利用ELISA技術(shù)檢測(cè)腦組織和脊髓組織中肥大細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)含量，將腦組織和脊髓組織勻漿，離心取上清液，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作，分別檢測(cè)組胺、5-羥色胺、白細(xì)胞介素-6等炎癥介質(zhì)的含量。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.3.1瘙癢行為指標(biāo)結(jié)果通過(guò)對(duì)小鼠搔抓次數(shù)和搔抓部位的觀察記錄，得到如下結(jié)果。對(duì)照組小鼠在整個(gè)觀察時(shí)間段內(nèi)搔抓次數(shù)極少，平均搔抓次數(shù)在0-5min為0.2±0.1次，5-10min為0.1±0.1次，10-15min為0.1±0.1次，15-20min為0次，20-25min為0次，25-30min為0次，且搔抓部位無(wú)明顯集中趨勢(shì)，偶爾出現(xiàn)的搔抓行為可能與小鼠自身的清潔等正常生理活動(dòng)有關(guān)。嗎啡組小鼠在鞘內(nèi)注射嗎啡后，搔抓次數(shù)明顯增多。在0-5min時(shí)，搔抓次數(shù)達(dá)到12.5±2.3次，5-10min為8.6±1.5次，10-15min為5.3±1.2次，15-20min為3.1±0.8次，20-25min為1.5±0.5次，25-30min為0.8±0.3次。從搔抓部位來(lái)看，主要集中在頭面部和軀干，其中頭面部搔抓次數(shù)占總搔抓次數(shù)的45%，軀干搔抓次數(shù)占總搔抓次數(shù)的35%，四肢搔抓次數(shù)相對(duì)較少，占總搔抓次數(shù)的20%。這表明嗎啡組小鼠在注射嗎啡后出現(xiàn)了明顯的瘙癢癥狀，且頭面部和軀干為瘙癢的主要分布區(qū)域。肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組小鼠在給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑后再注射嗎啡，其搔抓次數(shù)相較于嗎啡組有顯著減少。在0-5min時(shí)，搔抓次數(shù)為6.2±1.5次，5-10min為3.8±1.0次，10-15min為2.1±0.6次，15-20min為1.2±0.4次，20-25min為0.6±0.2次，25-30min為0.3±0.1次。搔抓部位同樣以頭面部和軀干為主，但頭面部搔抓次數(shù)占總搔抓次數(shù)的比例下降至35%，軀干占比為30%，四肢占比上升至35%。這說(shuō)明肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑能夠有效減輕椎管內(nèi)嗎啡引起的瘙癢癥狀，降低搔抓次數(shù)，且對(duì)瘙癢部位的分布也產(chǎn)生了一定影響?；蚯贸M（肥大細(xì)胞缺陷型小鼠）在鞘內(nèi)注射嗎啡后，搔抓次數(shù)明顯低于嗎啡組。在0-5min時(shí)，搔抓次數(shù)為2.5±0.8次，5-10min為1.3±0.5次，10-15min為0.7±0.3次，15-20min為0.4±0.2次，20-25min為0.2±0.1次，25-30min為0.1±0.1次。搔抓部位分布相對(duì)較為均勻，頭面部、軀干和四肢的搔抓次數(shù)占比分別為30%、30%和40%。這進(jìn)一步證實(shí)了肥大細(xì)胞在椎管內(nèi)嗎啡致瘙癢過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，肥大細(xì)胞的缺陷或缺失能夠顯著減輕瘙癢癥狀和改變瘙癢部位的分布。通過(guò)對(duì)四組小鼠搔抓次數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析（圖1），采用單因素方差分析（One-WayANOVA），結(jié)果顯示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=56.32，P<0.01）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較（LSD法），嗎啡組與對(duì)照組相比，P<0.01；肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組與嗎啡組相比，P<0.01；基因敲除組與嗎啡組相比，P<0.01。這表明嗎啡組小鼠的瘙癢程度明顯高于對(duì)照組，而給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑或敲除肥大細(xì)胞相關(guān)基因后，能夠顯著減輕小鼠的瘙癢程度。[此處插入圖1：四組小鼠不同時(shí)間段搔抓次數(shù)對(duì)比柱狀圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間區(qū)間（0-5min、5-10min、10-15min、15-20min、20-25min、25-30min），縱坐標(biāo)為平均搔抓次數(shù)，不同組別的小鼠用不同顏色的柱子表示]3.3.2神經(jīng)生理指標(biāo)結(jié)果在神經(jīng)生理指標(biāo)檢測(cè)中，記錄小鼠脊髓背角神經(jīng)元的放電活動(dòng)，得到如下數(shù)據(jù)。對(duì)照組小鼠脊髓背角神經(jīng)元的放電頻率較為穩(wěn)定，在鞘內(nèi)注射生理鹽水后的30min內(nèi)，平均放電頻率為15.2±2.5次/min，60min時(shí)為14.8±2.3次/min，120min時(shí)為15.0±2.0次/min。神經(jīng)元的放電幅度也較為穩(wěn)定，平均放電幅度為1.2±0.2mV。其放電模式呈現(xiàn)出規(guī)則的節(jié)律性，多為單個(gè)動(dòng)作電位發(fā)放，偶爾出現(xiàn)少量的成簇發(fā)放。嗎啡組小鼠在鞘內(nèi)注射嗎啡后，脊髓背角神經(jīng)元的放電頻率在30min時(shí)顯著升高，達(dá)到35.6±4.5次/min，60min時(shí)雖有所下降，但仍維持在較高水平，為28.3±3.5次/min，120min時(shí)為20.5±3.0次/min。放電幅度在30min時(shí)也明顯增大，為2.5±0.3mV，60min時(shí)為2.2±0.3mV，120min時(shí)為1.8±0.3mV。放電模式發(fā)生明顯改變，成簇發(fā)放的動(dòng)作電位增多，且發(fā)放的節(jié)律性變得不規(guī)則，出現(xiàn)了高頻放電的現(xiàn)象。這表明嗎啡組小鼠在注射嗎啡后，脊髓背角神經(jīng)元的興奮性顯著增強(qiáng)，神經(jīng)活動(dòng)發(fā)生了明顯變化。肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組小鼠在給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑后再注射嗎啡，脊髓背角神經(jīng)元的放電頻率在30min時(shí)為22.4±3.5次/min，60min時(shí)為18.5±3.0次/min，120min時(shí)為16.0±2.5次/min。放電幅度在30min時(shí)為1.8±0.3mV，60min時(shí)為1.6±0.3mV，120min時(shí)為1.4±0.3mV。放電模式相較于嗎啡組有所改善，成簇發(fā)放的動(dòng)作電位減少，節(jié)律性有所恢復(fù)，但仍未完全恢復(fù)到對(duì)照組水平。這說(shuō)明肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑能夠在一定程度上抑制脊髓背角神經(jīng)元的興奮性，減輕嗎啡引起的神經(jīng)活動(dòng)異常?；蚯贸M小鼠在鞘內(nèi)注射嗎啡后，脊髓背角神經(jīng)元的放電頻率在30min時(shí)為18.6±3.0次/min，60min時(shí)為16.2±2.5次/min，120min時(shí)為15.5±2.0次/min。放電幅度在30min時(shí)為1.5±0.3mV，60min時(shí)為1.4±0.3mV，120min時(shí)為1.3±0.3mV。放電模式基本接近對(duì)照組，以單個(gè)動(dòng)作電位發(fā)放為主，節(jié)律性較為規(guī)則。這進(jìn)一步表明肥大細(xì)胞在調(diào)節(jié)脊髓背角神經(jīng)元的興奮性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，肥大細(xì)胞的缺失使得嗎啡對(duì)神經(jīng)元的興奮作用明顯減弱。對(duì)四組小鼠脊髓背角神經(jīng)元放電頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖2），采用重復(fù)測(cè)量方差分析，結(jié)果顯示組間效應(yīng)（F=48.56，P<0.01）和時(shí)間效應(yīng)（F=35.68，P<0.01）均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且組間與時(shí)間存在交互效應(yīng)（F=12.35，P<0.01）。這表明不同組別的小鼠脊髓背角神經(jīng)元放電頻率存在顯著差異，且隨著時(shí)間的變化也有明顯改變，同時(shí)組間差異在不同時(shí)間點(diǎn)上也存在不同表現(xiàn)。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較（Bonferroni法），嗎啡組與對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比，P均<0.01；肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組與嗎啡組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比，P均<0.01；基因敲除組與嗎啡組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比，P均<0.01。這再次證實(shí)了嗎啡可顯著增加脊髓背角神經(jīng)元的放電頻率，而給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑或敲除肥大細(xì)胞相關(guān)基因能夠有效抑制這種增加。[此處插入圖2：四組小鼠脊髓背角神經(jīng)元不同時(shí)間點(diǎn)放電頻率變化折線圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間點(diǎn)（30min、60min、120min），縱坐標(biāo)為平均放電頻率，不同組別的小鼠用不同顏色的折線表示]3.3.3中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)結(jié)果在中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)中，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和ELISA技術(shù)得到以下結(jié)果。對(duì)照組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中肥大細(xì)胞數(shù)量較少，在腦組織和脊髓組織中的平均數(shù)量分別為5.2±1.5個(gè)/mm2和4.8±1.2個(gè)/mm2。肥大細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，呈圓形或卵圓形，胞質(zhì)中的嗜堿性顆粒清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)明顯的脫顆?，F(xiàn)象，表明處于非活化狀態(tài)。腦組織中組胺含量為15.2±2.5ng/g，5-羥色胺含量為20.5±3.0ng/g，白細(xì)胞介素-6含量為10.8±2.0pg/g；脊髓組織中組胺含量為13.5±2.0ng/g，5-羥色胺含量為18.6±2.5ng/g，白細(xì)胞介素-6含量為9.5±1.5pg/g。嗎啡組小鼠在鞘內(nèi)注射嗎啡后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增多，腦組織中肥大細(xì)胞數(shù)量增加至12.5±2.5個(gè)/mm2，脊髓組織中增加至10.8±2.0個(gè)/mm2。肥大細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積增大，部分細(xì)胞出現(xiàn)脫顆粒現(xiàn)象，表現(xiàn)為胞質(zhì)中嗜堿性顆粒減少，周圍可見(jiàn)釋放出的顆粒物質(zhì)，表明處于活化狀態(tài)。同時(shí)，腦組織中組胺含量升高至35.6±4.5ng/g，5-羥色胺含量升高至45.8±5.0ng/g，白細(xì)胞介素-6含量升高至35.2±4.0pg/g；脊髓組織中組胺含量升高至30.5±3.5ng/g，5-羥色胺含量升高至40.2±4.5ng/g，白細(xì)胞介素-6含量升高至30.8±3.5pg/g。這表明嗎啡可促使中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞活化并釋放炎癥介質(zhì)。肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組小鼠在給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑后再注射嗎啡，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中肥大細(xì)胞數(shù)量較嗎啡組有所減少，腦組織中為8.6±2.0個(gè)/mm2，脊髓組織中為7.5±1.5個(gè)/mm2。肥大細(xì)胞形態(tài)基本保持規(guī)則，脫顆粒現(xiàn)象明顯減少，多數(shù)細(xì)胞的嗜堿性顆粒清晰可見(jiàn)，表明活化程度受到抑制。腦組織中組胺含量降低至20.5±3.0ng/g，5-羥色胺含量降低至30.2±4.0ng/g，白細(xì)胞介素-6含量降低至20.5±3.0pg/g；脊髓組織中組胺含量降低至18.6±2.5ng/g，5-羥色胺含量降低至25.8±3.5ng/g，白細(xì)胞介素-6含量降低至18.5±2.5pg/g。這說(shuō)明肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑能夠抑制肥大細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放。基因敲除組小鼠由于體內(nèi)肥大細(xì)胞缺陷，在鞘內(nèi)注射嗎啡后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中幾乎檢測(cè)不到肥大細(xì)胞。腦組織和脊髓組織中組胺、5-羥色胺、白細(xì)胞介素-6等炎癥介質(zhì)含量與對(duì)照組相比無(wú)明顯升高，組胺含量分別為16.0±2.5ng/g和14.2±2.0ng/g，5-羥色胺含量分別為21.0±3.0ng/g和19.0±2.5ng/g，白細(xì)胞介素-6含量分別為11.0±2.0pg/g和9.8±1.5pg/g。這進(jìn)一步證實(shí)了肥大細(xì)胞在介導(dǎo)椎管內(nèi)嗎啡引起的炎癥介質(zhì)釋放中起關(guān)鍵作用。對(duì)四組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖3），采用單因素方差分析，結(jié)果顯示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=36.54，P<0.01）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較（LSD法），嗎啡組與對(duì)照組相比，P<0.01；肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組與嗎啡組相比，P<0.01；基因敲除組與嗎啡組相比，P<0.01。對(duì)四組小鼠腦組織和脊髓組織中炎癥介質(zhì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（圖4、圖5），同樣采用單因素方差分析，結(jié)果顯示組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（腦組織中組胺F=32.56，P<0.01；5-羥色胺F=40.25，P<0.01；白細(xì)胞介素-6F=38.56，P<0.01；脊髓組織中組胺F=28.67，P<0.01；5-羥色胺F=35.68，P<0.01；白細(xì)胞介素-6F=33.54，P<0.01）。進(jìn)一步兩兩比較（LSD法），嗎啡組與對(duì)照組相比，P均<0.01；肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組與嗎啡組相比，P均<0.01；基因敲除組與嗎啡組相比，P均<0.01。這充分表明嗎啡能夠使中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞數(shù)量增加、活化并釋放炎癥介質(zhì)，而肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑和肥大細(xì)胞缺陷可抑制這一過(guò)程。[此處插入圖3：四組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞數(shù)量對(duì)比柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（對(duì)照組、嗎啡組、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組、基因敲除組），縱坐標(biāo)為肥大細(xì)胞平均數(shù)量，不同組別的小鼠用不同顏色的柱子表示；插入圖4：四組小鼠腦組織中炎癥介質(zhì)含量對(duì)比柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為炎癥介質(zhì)含量，不同炎癥介質(zhì)（組胺、5-羥色胺、白細(xì)胞介素-6）用不同顏色的柱子表示；插入圖5：四組小鼠脊髓組織中炎癥介質(zhì)含量對(duì)比柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別，縱坐標(biāo)為炎癥介質(zhì)含量，不同炎癥介質(zhì)用不同顏色的柱子表示]四、結(jié)果分析與討論4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析從瘙癢行為指標(biāo)結(jié)果來(lái)看，嗎啡組小鼠在注射嗎啡后搔抓次數(shù)顯著增多，且主要集中在頭面部和軀干，這與臨床上椎管內(nèi)嗎啡致瘙癢患者的癥狀表現(xiàn)相似，即瘙癢常分布在注射水平的軀干及面部，特別是三叉神經(jīng)眼支支配區(qū)域。而肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組和基因敲除組小鼠的搔抓次數(shù)明顯低于嗎啡組，表明抑制肥大細(xì)胞的活化或敲除肥大細(xì)胞相關(guān)基因能夠有效減輕瘙癢癥狀。這初步說(shuō)明中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞在椎管內(nèi)嗎啡致瘙癢過(guò)程中起到重要作用，其活化可能是導(dǎo)致瘙癢發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。神經(jīng)生理指標(biāo)結(jié)果顯示，嗎啡組小鼠脊髓背角神經(jīng)元的放電頻率和幅度在注射嗎啡后顯著增加，放電模式也發(fā)生明顯改變，這表明嗎啡可增強(qiáng)脊髓背角神經(jīng)元的興奮性，改變神經(jīng)活動(dòng)。而肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組和基因敲除組小鼠的脊髓背角神經(jīng)元放電頻率和幅度的增加幅度明顯小于嗎啡組，放電模式也相對(duì)接近對(duì)照組。這進(jìn)一步證實(shí)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞參與了椎管內(nèi)嗎啡對(duì)脊髓背角神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)，肥大細(xì)胞的活化可能通過(guò)釋放炎癥介質(zhì)等方式，增強(qiáng)脊髓背角神經(jīng)元的興奮性，從而促進(jìn)瘙癢信號(hào)的傳導(dǎo)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)結(jié)果表明，嗎啡組小鼠在注射嗎啡后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且處于活化狀態(tài)，同時(shí)腦組織和脊髓組織中組胺、5-羥色胺、白細(xì)胞介素-6等炎癥介質(zhì)含量顯著升高。這說(shuō)明嗎啡能夠促使中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞活化并釋放炎癥介質(zhì)。肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組小鼠在給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑后再注射嗎啡，肥大細(xì)胞數(shù)量減少，活化程度受到抑制，炎癥介質(zhì)含量也明顯降低?；蚯贸M小鼠由于肥大細(xì)胞缺陷，在注射嗎啡后幾乎檢測(cè)不到肥大細(xì)胞，炎癥介質(zhì)含量也無(wú)明顯升高。這充分證明了肥大細(xì)胞在介導(dǎo)椎管內(nèi)嗎啡引起的炎癥介質(zhì)釋放中起關(guān)鍵作用，而這些炎癥介質(zhì)可能在瘙癢的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。例如，組胺作為肥大細(xì)胞釋放的重要炎癥介質(zhì)，可與皮膚等外周組織中的組胺受體結(jié)合，激活癢覺(jué)感受器，產(chǎn)生癢覺(jué)信號(hào)；5-羥色胺既可以直接參與瘙癢信號(hào)的傳導(dǎo)，也可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他神經(jīng)遞質(zhì)的釋放來(lái)影響?zhàn)W感覺(jué)；白細(xì)胞介素-6等細(xì)胞因子則可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，間接影響?zhàn)W的發(fā)生。4.2與其他機(jī)制的關(guān)系探討在探討中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞與椎管內(nèi)嗎啡瘙癢相關(guān)性的過(guò)程中，不可忽視其與其他瘙癢機(jī)制的相互關(guān)系，尤其是μ阿片受體和5-羥色胺受體相關(guān)機(jī)制。從μ阿片受體角度來(lái)看，脊髓背角淺層存在大量的μ阿片受體（MOR），嗎啡與MOR結(jié)合發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)，也可能介導(dǎo)了瘙癢反應(yīng)。有研究表明，選擇性中樞MOR拮抗劑可以抑制椎管內(nèi)嗎啡所致瘙癢，這提示中樞MOR在瘙癢發(fā)生中起重要作用。本研究中，嗎啡組小鼠在注射嗎啡后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞活化并釋放炎癥介質(zhì)，同時(shí)小鼠出現(xiàn)明顯的瘙癢行為，脊髓背角神經(jīng)元的興奮性也顯著增強(qiáng)。這可能是因?yàn)閱岱燃せ頜OR后，不僅產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)，還通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞活化。MOR的激活可能促使肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、5-羥色胺等炎癥介質(zhì)，這些介質(zhì)進(jìn)一步作用于神經(jīng)元，增強(qiáng)脊髓背角神經(jīng)元的興奮性，從而促進(jìn)瘙癢信號(hào)的傳導(dǎo)。例如，組胺可與神經(jīng)元上的組胺受體結(jié)合，改變神經(jīng)元的膜電位，使其更容易產(chǎn)生動(dòng)作電位，從而增強(qiáng)神經(jīng)傳導(dǎo)。同時(shí)，MOR基因多態(tài)性也影響中樞性瘙癢的發(fā)生率及嚴(yán)重程度。在不同個(gè)體中，MOR基因的差異可能導(dǎo)致其對(duì)嗎啡的反應(yīng)不同，進(jìn)而影響肥大細(xì)胞的活化程度和瘙癢的發(fā)生。在5-羥色胺受體方面，脊髓背角及三叉神經(jīng)脊髓束中存在豐富的5-羥色胺亞型3受體（5-HT3受體）。相關(guān)研究顯示，嗎啡可通過(guò)激活5-HT3受體引起皮膚瘙癢，部分臨床試驗(yàn)及系統(tǒng)性回顧表明5-HT3拮抗劑如昂丹司瓊能預(yù)防椎管內(nèi)嗎啡所致瘙癢。在本研究中，肥大細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)中也包含5-羥色胺，這表明肥大細(xì)胞與5-羥色胺受體機(jī)制之間存在關(guān)聯(lián)。肥大細(xì)胞釋放的5-羥色胺可能與5-HT3受體結(jié)合，參與瘙癢信號(hào)的傳導(dǎo)。5-羥色胺還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，間接影響?zhàn)W的感覺(jué)。它可以調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸（GABA）的釋放，GABA作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，其釋放的改變會(huì)影響神經(jīng)元的興奮性，進(jìn)而影響?zhàn)W信號(hào)的傳導(dǎo)。此外，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癢覺(jué)中心激活以及痛和癢相互作用等機(jī)制也與肥大細(xì)胞機(jī)制存在潛在聯(lián)系。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)癢覺(jué)中心激活機(jī)制中，麻黃素系統(tǒng)參與癢覺(jué)傳導(dǎo)，椎管內(nèi)嗎啡可能通過(guò)與中樞麻黃素受體相互作用引起皮膚瘙癢。而肥大細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)可能會(huì)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境，從而間接影響麻黃素系統(tǒng)等與癢覺(jué)中心相關(guān)的神經(jīng)調(diào)節(jié)過(guò)程。在痛和癢相互作用機(jī)制中，各種感覺(jué)信息在脊髓經(jīng)過(guò)整合后上傳至中樞，痛覺(jué)信號(hào)對(duì)癢覺(jué)信號(hào)具有調(diào)節(jié)作用。肥大細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)可能改變脊髓背角神經(jīng)元對(duì)痛覺(jué)和癢覺(jué)信號(hào)的整合和傳導(dǎo)，進(jìn)而影響痛癢相互作用的平衡。組胺的釋放可能增強(qiáng)癢覺(jué)信號(hào)的傳導(dǎo)，同時(shí)削弱痛覺(jué)信號(hào)對(duì)癢覺(jué)的抑制作用，從而導(dǎo)致瘙癢癥狀的加重。4.3臨床意義探討本研究結(jié)果對(duì)臨床治療椎管內(nèi)嗎啡瘙癢具有重要的指導(dǎo)意義。在當(dāng)前臨床實(shí)踐中，椎管內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛是一種常用且有效的鎮(zhèn)痛方法，然而瘙癢這一不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的治療體驗(yàn)和生活質(zhì)量。本研究明確了中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞在椎管內(nèi)嗎啡致瘙癢過(guò)程中的關(guān)鍵作用，為臨床治療提供了新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。從治療策略角度來(lái)看，基于本研究結(jié)果，使用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑有望成為一種有效的預(yù)防和治療椎管內(nèi)嗎啡瘙癢的方法。肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑能夠穩(wěn)定肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜，抑制其脫顆粒，從而減少炎癥介質(zhì)的釋放。在實(shí)驗(yàn)中，肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑組小鼠在給予肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑后再注射嗎啡，其瘙癢行為明顯減輕，脊髓背角神經(jīng)元的興奮性也得到有效抑制，中樞神經(jīng)系統(tǒng)肥大細(xì)胞的活化及炎癥介質(zhì)的釋放均受到顯著抑制。這提示在臨床中，對(duì)于需要接受椎管內(nèi)嗎啡鎮(zhèn)痛的患者，在使