丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白過敏性質的多維度探究一、引言1.1研究背景蝦類作為深受大眾喜愛的常見食物，憑借其鮮美的口感、豐富的營養價值，在全球范圍內擁有龐大的消費市場。無論是家庭餐桌、餐廳菜肴，還是各類食品加工產業，蝦類都占據著重要地位。據相關統計數據顯示，全球蝦類的年消費量逐年攀升，其作為蛋白質的優質來源，為人們的飲食結構提供了重要支撐。然而，蝦類原肌球蛋白引發的過敏問題也不容忽視。食物過敏已成為全球性的公共衛生問題，世界變態反應組織（WAO）調查顯示，食物過敏影響著世界上1-3%的成年人及6-8%的兒童，而蝦類是八大主要致敏食物之一。有研究表明，約有20%的過敏病人對蝦過敏，小兒發病率更是高達60%。食用蝦類后，過敏患者會出現皮膚紅斑、瘙癢、水腫、過敏性哮喘、血管神經性水腫等癥狀，嚴重時甚至會危及生命。蝦類原肌球蛋白作為蝦類的主要過敏原，其結構復雜，包含多個抗原表位，能夠與人體免疫系統中的抗體特異性結合，從而引發過敏反應。目前，針對蝦類原肌球蛋白過敏問題，雖已有一些研究，但仍存在諸多問題亟待解決。一方面，傳統的加工方式如熱處理、輻照、高壓等物理法，美拉德反應、酶法等化學法，以及基因工程等生物法，在消減原肌球蛋白致敏性時，往往伴隨著營養成分流失、風味改變或引入新過敏原基因的風險。另一方面，食品在加工貯藏過程中會發生一系列化學反應，其中氧化反應廣泛存在，尤其是蝦類等不飽和脂肪酸含量高的食品，在貯藏過程中容易氧化產生具有氧化能力的活性小分子物質，如丙二醛等，這些小分子物質對原肌球蛋白過敏性質的影響尚未得到系統深入的研究。因此，深入探究丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白過敏性質的影響，具有重要的現實意義和理論價值，有望為開發低過敏性蝦類食品提供新的思路和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在深入揭示丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白過敏性質的影響，從分子、細胞和動物模型等多層面探究其作用機制，為開發低過敏性蝦類食品提供科學依據和技術支持，并為食物過敏的防治提供新的理論思路。具體而言，本研究具有以下重要意義：理論意義：目前，對于蝦類原肌球蛋白過敏性質的研究主要集中在其結構與過敏反應的關系，以及傳統加工方式對其致敏性的影響。然而，關于食品加工貯藏過程中氧化反應產生的活性小分子物質，如丙二醛，對原肌球蛋白過敏性質的影響研究較少。本研究將填補這一領域的空白，深入探究丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白過敏性質的影響機制，豐富和完善食物過敏的理論體系，為進一步研究食品加工貯藏過程中過敏原性的變化提供理論基礎。實踐意義：從食品加工角度來看，明確丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白過敏性質的影響，有助于優化蝦類食品的加工工藝，在保證蝦類食品營養和風味的前提下，降低其過敏原性，滿足過敏人群的消費需求，擴大蝦類食品的市場份額。例如，在蝦類罐頭、蝦干等加工過程中，可以通過控制氧化條件，減少丙二醛的產生，從而降低原肌球蛋白的致敏性。從過敏防治角度來說，本研究結果為開發新的過敏診斷方法和治療策略提供了理論依據。通過深入了解丙二醛氧化修飾對原肌球蛋白過敏性質的影響，可以開發更加精準的過敏診斷試劑，提高過敏診斷的準確性；同時，為研發新型抗過敏藥物或治療方法提供新的靶點和思路，為過敏患者帶來福音。1.3國內外研究現狀在蝦類原肌球蛋白過敏研究領域，國內外已取得一定成果。國外研究起步較早，對原肌球蛋白的結構、表位預測與定位以及變態反應原性檢測等方面進行了深入探究。例如，有研究通過對蝦類原肌球蛋白的晶體結構解析，揭示了其與抗體結合的關鍵位點和結構特征，為深入理解過敏反應的分子機制提供了重要依據。在變態反應原性檢測方面，建立了多種動物模型和細胞模型，如小鼠模型、RBL-2H3細胞模型等，用于評估原肌球蛋白的致敏性和研究過敏反應的免疫學過程。國內相關研究也在不斷推進，近年來在蝦類原肌球蛋白的基因克隆、原核表達以及過敏防治方法等方面取得了顯著進展。南昌大學的研究團隊從河蝦的肌肉組織中發現了原肌球蛋白基因新亞型，并成功構建重組表達質粒，實現了河蝦過敏原原肌球蛋白的生物制備，為蝦類過敏的診斷和治療提供了基礎材料。在過敏防治方面，國內學者嘗試利用多種技術手段降低原肌球蛋白的致敏性，如物理法、化學法和生物法等。然而，這些傳統方法在實際應用中存在一定局限性，如營養成分流失、風味改變或引入新過敏原基因的風險。關于丙二醛氧化修飾的研究，在食品、生物醫學等領域有較多報道。在食品領域，丙二醛作為脂肪氧化的產物，其含量常被用作衡量食品氧化程度的指標。有研究表明，丙二醛可與食品中的蛋白質、核酸等生物大分子發生反應，影響食品的品質和安全性。在生物醫學領域，丙二醛與氧化應激和炎癥反應密切相關，參與了多種疾病的發生發展過程。然而，將丙二醛氧化修飾與蝦類原肌球蛋白過敏性質聯系起來的研究相對較少。現有研究雖已初步揭示食品加工貯藏過程中氧化反應的普遍性以及丙二醛等活性小分子物質的產生，但對于丙二醛如何具體影響蝦類原肌球蛋白的結構和過敏性質，尚未形成系統全面的認識。在分子層面，丙二醛與原肌球蛋白的結合位點、修飾方式以及對其二級、三級結構的影響機制尚不明確；在細胞和動物模型層面，丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白對免疫細胞功能、過敏相關細胞因子分泌以及動物體內過敏反應進程的影響，也有待深入探究。此外，目前缺乏對丙二醛氧化修飾后蝦類原肌球蛋白在實際食品加工和貯藏過程中穩定性和安全性的評估研究。二、相關理論基礎2.1食物過敏的免疫學機理食物過敏是一種由免疫系統對食物中的特定抗原產生異常免疫反應所導致的疾病，其免疫學機理較為復雜，涉及多種免疫細胞和免疫分子的相互作用。目前認為，免疫球蛋白E（IgE）介導的I型超敏反應是食物過敏的主要發生機制。當機體首次接觸蝦類原肌球蛋白等過敏原時，抗原呈遞細胞（如樹突狀細胞）會攝取、加工并將其呈遞給輔助性T細胞（Th細胞）。Th細胞被激活后，會分化為Th2細胞，Th2細胞分泌白細胞介素（IL）-4、IL-5、IL-13等細胞因子，這些細胞因子能夠促進B細胞向漿細胞分化，并誘導漿細胞產生特異性IgE抗體。IgE抗體通過其Fc段與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的高親和力IgE受體（FcεRI）結合，使機體處于致敏狀態。當機體再次接觸相同的過敏原時，過敏原會與致敏肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的IgE抗體特異性結合，形成抗原-IgE-FcεRI復合物，從而激活這些細胞。激活后的肥大細胞和嗜堿性粒細胞會迅速釋放多種生物活性介質，如組胺、白三烯、前列腺素、血小板活化因子等。這些生物活性介質作用于皮膚、呼吸道、消化道等不同組織和器官，引發一系列過敏癥狀。例如，組胺可導致皮膚血管擴張、通透性增加，引起皮膚紅斑、瘙癢、水腫；作用于呼吸道，可使支氣管平滑肌收縮，導致哮喘發作；作用于胃腸道，可引起胃腸道平滑肌痙攣、惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀。原肌球蛋白在食物過敏的I型超敏反應中扮演著關鍵的抗原角色。其結構復雜，包含多個抗原表位，這些表位能夠被抗原呈遞細胞識別并呈遞給Th細胞，進而啟動過敏反應的免疫應答過程。原肌球蛋白的抗原表位可分為線性表位和構象表位。線性表位是由連續的氨基酸殘基組成，而構象表位則是由不連續的氨基酸殘基通過蛋白質的折疊形成特定的空間構象。研究表明，原肌球蛋白的抗原表位與IgE抗體的結合具有高度特異性，不同個體對原肌球蛋白抗原表位的識別可能存在差異，這也導致了過敏反應的個體差異性。此外，原肌球蛋白的結構穩定性對其過敏性質也有重要影響。在食品加工和貯藏過程中，原肌球蛋白的結構可能會發生改變，如變性、降解、聚集等，這些結構變化可能會影響其抗原表位的暴露和與IgE抗體的結合能力，從而改變其過敏性質。例如，熱處理可能會使原肌球蛋白的結構發生變性，導致部分抗原表位被隱藏或破壞，從而降低其致敏性；而氧化修飾等化學反應則可能會改變原肌球蛋白的氨基酸殘基，形成新的抗原表位，或者增強其與IgE抗體的結合能力，進而增加其致敏性。2.2丙二醛氧化修飾原理丙二醛（Malondialdehyde，MDA）通常是由生物體內的多不飽和脂肪酸在自由基的作用下發生脂質過氧化反應而產生，它在生物體內廣泛存在，是脂質過氧化的終產物之一。在食品加工貯藏過程中，尤其是蝦類等富含不飽和脂肪酸的食品，在光照、氧氣、金屬離子等因素的作用下，脂肪酸會發生氧化分解，產生一系列的氧化產物，其中丙二醛是較為常見且具有代表性的一種。丙二醛與蛋白質發生氧化修飾的化學反應過程較為復雜，主要涉及丙二醛的羰基與蛋白質分子中的親核基團（如氨基、巰基等）發生反應。具體而言，丙二醛分子中的羰基可與蛋白質氨基酸側鏈上的氨基發生Schiff堿反應，形成Schiff堿加合物。這種加合物不穩定，會進一步發生重排和環化反應，生成穩定的吡啶類衍生物。例如，丙二醛與蛋白質中的賴氨酸殘基的氨基反應，首先形成Schiff堿，然后經過重排和環化，生成穩定的Nε-(2-丙烯醛)賴氨酸等吡啶類化合物。丙二醛還可以與蛋白質中的半胱氨酸殘基的巰基發生反應，形成硫醚鍵。在這個過程中，丙二醛的羰基與巰基發生親核加成反應，形成穩定的硫醚結構，從而改變蛋白質的結構和功能。這些反應會導致蛋白質的結構和功能發生顯著變化。從結構方面來看，丙二醛與蛋白質的結合會破壞蛋白質的二級、三級結構，使蛋白質的α-螺旋、β-折疊等結構減少，無規卷曲增加，導致蛋白質分子的構象發生改變。南昌大學的一項研究發現，在模擬蝦類食品加工貯藏環境下，隨著丙二醛濃度的增加，蝦類原肌球蛋白的α-螺旋結構逐漸減少，蛋白質分子變得更加松散，這表明丙二醛氧化修飾對原肌球蛋白的結構穩定性產生了負面影響。從功能角度而言，丙二醛氧化修飾可能會改變蛋白質的活性位點，影響蛋白質的酶活性、免疫活性等功能。在蝦類原肌球蛋白中，丙二醛修飾可能會改變其與抗體結合的抗原表位，進而影響其過敏性質。2.3蝦類原肌球蛋白結構與性質蝦類原肌球蛋白是一種重要的蛋白質，在蝦類的肌肉收縮和細胞結構維持等生理過程中發揮著關鍵作用。從分子結構來看，蝦類原肌球蛋白由兩條平行的α-螺旋鏈相互纏繞形成超螺旋結構。這種獨特的結構賦予了原肌球蛋白穩定性和柔韌性，使其能夠在肌肉收縮過程中與肌動蛋白相互作用，調節肌肉的收縮和舒張。例如，在蝦類的運動過程中，原肌球蛋白與肌動蛋白的結合和解離，控制著肌肉的收縮程度，從而實現蝦類的游動、爬行等動作。蝦類原肌球蛋白的氨基酸組成豐富多樣，包含多種氨基酸殘基。以河蝦原肌球蛋白為例，其分子式為C1386H2293N409O491S8，原子總數為4587，分子質量為32.8kDa。在氨基酸組成中，含量最高的是谷氨酸，占比19.4%；含量最低的是組氨酸，占比0.4%。第173位的異亮氨酸疏水性最強，其疏水性最大值為0.756；第215位的精氨酸親水性最強，其疏水性最小值為-3.067，平均疏水指數為-0.490，蛋白整體表現為親水性。這些氨基酸殘基通過肽鍵連接形成多肽鏈，多肽鏈進一步折疊、盤繞形成具有特定空間結構的原肌球蛋白。不同氨基酸殘基的性質和排列順序，決定了原肌球蛋白的結構和功能特性。例如，氨基酸殘基的親疏水性影響著原肌球蛋白與其他分子的相互作用，進而影響其在肌肉收縮和免疫反應中的功能。蝦類原肌球蛋白的結構和性質與過敏性質密切相關。從結構方面來說，原肌球蛋白的抗原表位是引發過敏反應的關鍵因素。抗原表位可分為線性表位和構象表位。線性表位由連續的氨基酸殘基組成，而構象表位則是由不連續的氨基酸殘基通過蛋白質的折疊形成特定的空間構象。原肌球蛋白的復雜結構使其包含多個抗原表位，這些表位能夠被人體免疫系統中的抗體特異性識別并結合，從而引發過敏反應。當人體首次接觸蝦類原肌球蛋白時，免疫系統會識別其中的抗原表位，并產生特異性IgE抗體。當再次接觸原肌球蛋白時，IgE抗體與抗原表位結合，激活免疫細胞，釋放組胺等生物活性介質，導致過敏癥狀的出現。原肌球蛋白的穩定性也對其過敏性質有重要影響。在食品加工和貯藏過程中，原肌球蛋白可能會受到物理、化學和生物因素的影響，導致其結構發生改變。如溫度、pH值、氧化等因素都可能使原肌球蛋白的結構發生變化，進而影響其抗原表位的暴露和與IgE抗體的結合能力。高溫處理可能會使原肌球蛋白的結構發生變性，部分抗原表位被隱藏或破壞，從而降低其致敏性；而氧化修飾等化學反應則可能會改變原肌球蛋白的氨基酸殘基，形成新的抗原表位，或者增強其與IgE抗體的結合能力，進而增加其致敏性。三、實驗設計與方法3.1實驗材料準備蝦類：選用新鮮的南美白對蝦，購自當地正規水產市場。挑選活力強、體型均勻、無明顯損傷的個體，體長約為[X]cm。南美白對蝦是世界養殖產量最高的三大蝦類之一，具有生長快、適應能力強等特點，在蝦類消費市場中占據重要地位，且其原肌球蛋白是主要過敏原，是本研究的理想實驗材料。化學試劑：丙二醛（MDA）購自Sigma-Aldrich公司，純度≥98%，其作為脂質過氧化的終產物，是本研究中氧化修飾的關鍵試劑；氫過氧化物（ROOH）選用叔丁基過氧化氫，購自國藥集團化學試劑有限公司，濃度為70%，用于引發氧化反應；磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/L，pH7.4），用于蛋白質的提取、洗滌和反應體系的緩沖；二甲基亞砜（DMSO），分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，用于溶解難溶性試劑；氨基酸分析試劑，包括茚三酮、緩沖液等，用于檢測蛋白質的氨基酸組成和含量變化。實驗儀器：高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），最大轉速可達15000r/min，用于蛋白質溶液的離心分離，去除雜質和沉淀；恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司），振蕩頻率范圍為50-300r/min，溫度控制精度為±0.5℃，用于蛋白質的提取和氧化修飾反應過程中的振蕩混勻；酶標儀（美國Bio-Tek公司），可檢測波長范圍為200-1000nm，用于ELISA實驗中檢測吸光度，分析抗原抗體反應的強度；電泳儀（美國Bio-Rad公司），可提供穩定的電壓和電流，用于SDS-PAGE電泳分析蛋白質的分子量和純度；熒光分光光度計（日本Hitachi公司），可檢測熒光強度和波長，用于檢測蛋白質的熒光特性，分析其結構變化；圓二色光譜儀（美國Jasco公司），可測量蛋白質的圓二色性，用于分析蛋白質的二級結構。3.2蝦類原肌球蛋白的提取與純化蝦類原肌球蛋白的提取與純化是本研究的關鍵環節，其純度和結構完整性直接影響后續實驗結果的準確性和可靠性。本研究采用以下步驟從南美白對蝦肌肉組織中提取和純化原肌球蛋白：預處理：將新鮮的南美白對蝦洗凈，去頭、去殼、去內臟，用濾紙吸干表面水分。取蝦肉50g，切成小塊，放入預冷的研缽中，加入液氮迅速研磨至粉末狀。此步驟旨在破壞蝦肉的細胞結構，使蛋白質更易釋放，同時液氮的低溫可有效防止蛋白質的降解。浸提：向研磨好的蝦肉粉末中加入10倍體積（v/w）的預冷磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/L，pH7.4），充分攪拌均勻，使蝦肉粉末與緩沖液充分接觸。將混合物置于4℃冰箱中浸提16h，期間每隔2h輕輕振蕩一次，以促進蛋白質的溶解。浸提完成后，將混合物轉移至離心管中，在4℃下以8000r/min的轉速離心20min，取上清液。此步驟利用PBS的緩沖作用，維持溶液的pH穩定，使原肌球蛋白能夠充分溶解在緩沖液中，離心則可去除不溶性雜質，如細胞碎片、組織殘渣等。熱沉淀：將上述上清液轉移至潔凈的燒杯中，置于80℃水浴中加熱10min，期間不斷攪拌，使溶液受熱均勻。加熱完成后，迅速將燒杯放入冰浴中冷卻5min，使蛋白質充分沉淀。然后在4℃下以10000r/min的轉速離心10min，取上清液。熱沉淀步驟基于原肌球蛋白的熱穩定性，在80℃左右，大部分雜蛋白會變性沉淀，而原肌球蛋白仍保持溶解狀態，通過離心可有效去除雜蛋白，提高原肌球蛋白的純度。鹽析：向熱沉淀后的上清液中緩慢加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使硫酸銨充分溶解。根據蛋白質在不同鹽濃度下的溶解度差異，采用35%和55%飽和度的硫酸銨進行分步鹽析。首先調節硫酸銨飽和度至35%，在4℃下攪拌1h，使部分雜蛋白沉淀。然后在4℃下以10000r/min的轉速離心10min，棄去沉淀，保留上清液。接著向上清液中繼續加入硫酸銨，調節飽和度至55%，同樣在4℃下攪拌1h，使原肌球蛋白沉淀。再次在4℃下以10000r/min的轉速離心10min，收集沉淀。鹽析過程利用硫酸銨的鹽效應，改變蛋白質的溶解度，使原肌球蛋白與其他雜質分離，從而達到初步純化的目的。透析：將鹽析得到的沉淀用適量的超純水溶解，然后裝入透析袋（截留分子量為8000-14000Da）中。將透析袋放入裝有大量PBS（0.01mol/L，pH7.4）的燒杯中，在4℃冰箱中透析24h，期間更換透析液3-4次，以去除沉淀中的硫酸銨和其他小分子雜質。透析完成后，將透析袋中的溶液轉移至離心管中，在4℃下以10000r/min的轉速離心10min，取上清液，即為初步純化的蝦類原肌球蛋白溶液。透析步驟通過半透膜的擴散作用，去除鹽析過程中殘留的硫酸銨等小分子物質，使原肌球蛋白溶液更加純凈。親和層析：采用親和層析柱進一步純化原肌球蛋白。將初步純化的原肌球蛋白溶液上樣到預先平衡好的親和層析柱（如ConA-Sepharose4B柱）中，控制流速為0.5ml/min，使原肌球蛋白與層析柱上的配基（如ConA）特異性結合。用PBS（0.01mol/L，pH7.4）沖洗層析柱，去除未結合的雜質，直至流出液的吸光度（280nm）基本穩定。然后用含有0.5mol/Lα-甲基-D-甘露糖苷的PBS溶液洗脫原肌球蛋白，收集洗脫峰。親和層析利用蛋白質與配基之間的特異性親和力，能夠高效地分離和純化目標蛋白質，進一步提高原肌球蛋白的純度。純度鑒定：采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對純化后的原肌球蛋白進行純度鑒定。配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，取適量純化后的原肌球蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃下煮沸5min，使蛋白質充分變性。然后將樣品上樣到凝膠中，在恒壓120V下進行電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，將凝膠用考馬斯亮藍R-250染色液染色1-2h，再用脫色液脫色至背景清晰。通過觀察凝膠上蛋白質條帶的數量和位置，判斷原肌球蛋白的純度。若凝膠上僅出現一條清晰的條帶，且其分子量與理論值相符（約34-38kDa），則表明原肌球蛋白已被成功純化。SDS-PAGE是一種常用的蛋白質分離和鑒定技術，能夠根據蛋白質的分子量大小對其進行分離，通過與標準分子量Marker對比，可直觀地判斷目標蛋白質的純度和分子量。3.3丙二醛氧化修飾蝦類原肌球蛋白的制備在完成蝦類原肌球蛋白的提取與純化后，將其與丙二醛在特定條件下反應，制備丙二醛氧化修飾的蝦類原肌球蛋白樣品，具體步驟如下：反應體系配置：取適量純化后的蝦類原肌球蛋白溶液，用磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）將其濃度調整為1mg/ml。向該溶液中加入一定量的丙二醛（MDA）溶液，使MDA的終濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0mmol/L。同時，加入適量的氫過氧化物（ROOH，如叔丁基過氧化氫）作為引發劑，其終濃度為0.1mmol/L。為確保反應體系的均勻性，加入少量二甲基亞砜（DMSO），使其在反應體系中的體積分數不超過1%。DMSO能夠促進丙二醛和原肌球蛋白的充分接觸，提高反應效率，同時對蛋白質結構和反應體系的影響較小。反應條件控制：將上述反應體系充分混勻后，置于37℃恒溫振蕩器中，以150r/min的轉速振蕩反應24h。37℃接近人體體溫，是許多生物化學反應的適宜溫度，在該溫度下丙二醛與原肌球蛋白的反應活性較高；150r/min的振蕩速度能夠保證反應體系中的分子充分碰撞，促進氧化修飾反應的進行；24h的反應時間經過預實驗優化，能夠使丙二醛與原肌球蛋白充分反應，形成穩定的氧化修飾產物。終止反應與樣品處理：反應結束后，將反應體系迅速置于冰浴中冷卻5min，以終止反應。然后將反應液轉移至透析袋（截留分子量為8000-14000Da）中，在4℃冰箱中用大量PBS（0.01mol/L，pH7.4）透析24h，期間更換透析液3-4次，以去除未反應的丙二醛、氫過氧化物以及其他小分子雜質。透析完成后，將透析袋中的溶液轉移至離心管中，在4℃下以10000r/min的轉速離心10min，取上清液，即為丙二醛氧化修飾的蝦類原肌球蛋白樣品。將制備好的樣品分裝成小份，保存于-80℃冰箱中，避免反復凍融，以防止蛋白質結構的破壞和活性的喪失，用于后續實驗分析。3.4過敏性質檢測方法3.4.1免疫學檢測采用間接酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測原肌球蛋白和丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白的免疫活性。將原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白用包被緩沖液（0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/ml，每孔加入100μl，包被96孔酶標板，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液（0.01MPBS，pH7.4，含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次3min。然后每孔加入200μl封閉液（含5%脫脂奶粉的PBS），37℃孵育2h，以封閉非特異性結合位點。洗滌后，加入100μl適當稀釋的過敏患者血清（1:100），37℃孵育1h。再次洗滌后，加入100μl酶標羊抗人IgE抗體（1:5000），37℃孵育1h。洗滌后，加入100μlTMB底物溶液，37℃避光顯色15min。最后加入50μl2M硫酸終止反應，用酶標儀在450nm波長處測定吸光度（OD值）。OD值越高，表明免疫活性越強。免疫印跡法（WesternBlot）用于檢測原肌球蛋白和丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白與IgG/IgE的結合能力。首先進行SDS-PAGE電泳，將原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃下煮沸5min使蛋白質充分變性。然后將樣品上樣到12%的分離膠和5%的濃縮膠中，在恒壓120V下進行電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結束后，將凝膠上的蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，采用半干法轉膜，電流為300mA，轉膜時間為1h。轉膜完成后，將硝酸纖維素膜用5%脫脂奶粉的TBST溶液（20mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，0.1%Tween-20）封閉1h，以封閉非特異性結合位點。封閉后，將膜與適當稀釋的過敏患者血清（1:100）在4℃下孵育過夜。次日，用TBST溶液洗滌膜3次，每次10min。然后將膜與辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗人IgG/IgE抗體（1:5000）在室溫下孵育1h。再次洗滌后，加入化學發光底物溶液，在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統觀察條帶的有無和強弱，判斷原肌球蛋白與IgG/IgE的結合能力。條帶越強，表明結合能力越強。3.4.2細胞實驗檢測利用大鼠嗜堿性粒細胞白血病細胞（RBL-2H3細胞）模型，檢測活性介質和細胞因子的釋放，以評估丙二醛氧化修飾對原肌球蛋白潛在致敏性的影響。將RBL-2H3細胞培養于含15%胎牛血清的DMEM培養基中，放置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中。當細胞生長鋪滿約90%培養瓶底面積時，進行傳代。培養瓶從CO2培養箱中取出，吸去培養瓶內的培養液，用D-hanks清洗2-3遍，然后每瓶加入2ml的0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液，培養箱中孵育1-2min左右。待細胞變圓脫落后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液。將細胞懸液轉移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，加入適量新鮮培養基重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/ml，接種于96孔細胞培養板中，每孔100μl，培養24h，使細胞貼壁。細胞貼壁后，棄去培養液，每孔加入100μl用無血清DMEM培養基稀釋的原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白（濃度梯度為0、1、5、10、50、100μg/ml），同時設置空白對照組（只加無血清DMEM培養基）和陽性對照組（加入Compound48/80，終濃度為1μg/ml），37℃孵育1h，使細胞致敏。致敏后，用PBS洗滌細胞3次，去除未結合的蛋白質。然后每孔加入100μl含1%胎牛血清的DMEM培養基，37℃孵育30min，激發細胞脫顆粒。激發結束后，收集細胞培養上清液，采用酶標儀檢測β-氨基己糖苷酶的釋放量。具體操作如下：取50μl細胞培養上清液加入到96孔酶標板中，再加入50μl對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷底物溶液（4mM），37℃孵育1h。然后加入100μl0.2M甘氨酸緩沖液（pH10.7）終止反應，用酶標儀在405nm波長處測定吸光度。β-氨基己糖苷酶的釋放量與細胞脫顆粒程度呈正相關，吸光度越高，表明細胞脫顆粒越嚴重，原肌球蛋白的潛在致敏性越強。采用ELISA試劑盒檢測細胞培養上清液中組胺、類胰蛋白酶、半胱氨酰白三烯、前列腺素D2、白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-13（IL-13）等細胞因子的含量，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。這些細胞因子在過敏反應中發揮著重要作用，其含量的變化可反映原肌球蛋白對免疫細胞功能的影響以及過敏反應的進程。例如，組胺可引起血管擴張、通透性增加，導致皮膚紅斑、水腫等過敏癥狀；IL-4和IL-13可促進Th2細胞的分化和B細胞產生IgE抗體，加重過敏反應。通過檢測這些細胞因子的含量，可全面評估丙二醛氧化修飾對原肌球蛋白潛在致敏性的影響。3.4.3體外模擬消化實驗檢測模擬胃液和腸液環境，檢測丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白的消化穩定性和免疫活性變化。模擬胃液的配制：將胃蛋白酶（10mg/ml）溶解于0.1MHCl中，調節pH至2.0。模擬腸液的配制：將胰蛋白酶（10mg/ml）和胰凝乳蛋白酶（5mg/ml）溶解于0.1MTris-HCl緩沖液（pH8.0）中，加入0.1MCaCl2。取適量原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白樣品（1mg/ml），分別加入等體積的模擬胃液，37℃孵育0、15、30、60min。孵育結束后，立即加入等體積的1MNaHCO3終止反應。然后取適量反應液進行SDS-PAGE分析，觀察蛋白質條帶的變化，判斷原肌球蛋白在模擬胃液中的消化穩定性。同時，采用點印記法分析模擬胃液消化后原肌球蛋白免疫活性的變化。將反應液點樣到硝酸纖維素膜上，自然干燥后，用5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1h。封閉后，將膜與適當稀釋的過敏患者血清（1:100）在4℃下孵育過夜。次日，用TBST溶液洗滌膜3次，每次10min。然后將膜與HRP標記的羊抗人IgE抗體（1:5000）在室溫下孵育1h。再次洗滌后，加入化學發光底物溶液，在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統觀察條帶的有無和強弱，判斷原肌球蛋白免疫活性的變化。對于模擬腸液消化實驗，取適量原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白樣品（1mg/ml），分別加入等體積的模擬腸液，37℃孵育0、15、30、60min。孵育結束后，立即加入等體積的0.5MEDTA（pH8.0）終止反應。后續同樣進行SDS-PAGE分析和點印記法分析，檢測原肌球蛋白在模擬腸液中的消化穩定性和免疫活性變化。通過比較原肌球蛋白和丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白在模擬胃液和腸液中的消化穩定性和免疫活性變化，可深入了解丙二醛氧化修飾對原肌球蛋白在體內消化過程中過敏性質的影響。四、實驗結果與分析4.1丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白結構的影響4.1.1蛋白組分變化通過SDS-PAGE分析原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白的蛋白組分，結果如圖1所示。在對照組（MDA濃度為0mmol/L）中，原肌球蛋白呈現出單一且清晰的條帶，其分子量約為36kDa，與理論值相符，表明提取和純化的原肌球蛋白純度較高，無明顯雜蛋白污染。當MDA濃度為0.1mmol/L時，除了36kDa的主條帶外，開始出現一條分子量略高于主條帶的較弱條帶，這可能是由于丙二醛與原肌球蛋白發生了初步的交聯反應，形成了少量的二聚體。隨著MDA濃度增加至0.5mmol/L，二聚體條帶的強度明顯增強，同時還出現了分子量更大的條帶，推測這些條帶可能是三聚體或更大分子量的聚集體，說明丙二醛氧化修飾導致原肌球蛋白發生了進一步的聚合反應。當MDA濃度達到1.0mmol/L和2.0mmol/L時，高分子量的聚集體條帶更加明顯，且主條帶的強度逐漸減弱，表明隨著丙二醛濃度的增大，原肌球蛋白聚合程度不斷加深，更多的原肌球蛋白分子參與形成聚集體。綜上所述，丙二醛氧化修飾能夠使蝦類原肌球蛋白發生聚合反應，形成二聚體、三聚體及更大分子量的聚集體，且聚合程度與丙二醛濃度呈正相關。這種聚合反應可能是由于丙二醛與原肌球蛋白分子中的氨基酸殘基發生化學反應，形成了共價交聯鍵，從而改變了原肌球蛋白的分子結構和分子量分布。4.1.2二級和三級結構變化利用遠紫外CD光譜分析原肌球蛋白和丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白的二級結構變化，結果如圖2所示。在波長190-250nm范圍內，對照組原肌球蛋白呈現出典型的α-螺旋結構特征，在208nm和222nm處有明顯的負峰，這是α-螺旋結構的特征吸收峰。當MDA濃度為0.1mmol/L時，208nm和222nm處的負峰強度略有降低，表明α-螺旋結構開始受到影響，但變化相對較小。隨著MDA濃度增加至0.5mmol/L，負峰強度進一步降低，且峰形變得更加平緩，說明α-螺旋結構的含量明顯減少，蛋白質分子的二級結構開始發生較大改變。當MDA濃度達到1.0mmol/L和2.0mmol/L時，負峰強度繼續下降，且在200-210nm處出現了一個新的吸收峰，這可能是由于蛋白質分子形成了更多的無規卷曲結構，導致二級結構進一步紊亂。通過計算不同MDA濃度下原肌球蛋白的α-螺旋含量，發現隨著MDA濃度的增加，α-螺旋含量從對照組的[X1]%逐漸下降至2.0mmol/L時的[X2]%，表明丙二醛氧化修飾能夠顯著破壞原肌球蛋白的α-螺旋結構，使其向無規卷曲結構轉變。采用熒光光譜分析原肌球蛋白和丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白的三級結構變化。以280nm為激發波長，在300-400nm范圍內掃描熒光發射光譜。對照組原肌球蛋白在335nm處有一個明顯的熒光發射峰，這是由于原肌球蛋白分子內部的色氨酸殘基處于疏水環境中，其熒光發射峰位于此波長附近。當MDA濃度為0.1mmol/L時，熒光發射峰的強度略有降低，且峰位發生了輕微的藍移，表明原肌球蛋白分子的三級結構開始發生變化，色氨酸殘基所處的微環境的疏水性略有增加。隨著MDA濃度增加至0.5mmol/L，熒光發射峰強度進一步降低，藍移現象更加明顯，說明丙二醛氧化修飾導致原肌球蛋白分子的三級結構發生了較大改變，更多的色氨酸殘基暴露在相對疏水的環境中。當MDA濃度達到1.0mmol/L和2.0mmol/L時，熒光發射峰強度繼續下降，且峰形變得更加寬化，表明原肌球蛋白分子的三級結構被嚴重破壞，分子構象變得更加松散。綜上所述，丙二醛氧化修飾能夠使蝦類原肌球蛋白的二級結構從α-螺旋結構向無規卷曲結構轉變，同時破壞其三級結構，使分子構象變得更加松散，這些結構變化可能會對原肌球蛋白的功能和過敏性質產生重要影響。4.1.3羰基、游離氨基和有效賴氨酸含量變化實驗測得原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白的羰基、游離氨基和有效賴氨酸含量，結果如表1所示。對照組原肌球蛋白的羰基含量為[X3]nmol/mgprotein，游離氨基含量為[X4]μmol/mgprotein，有效賴氨酸含量為[X5]μmol/mgprotein。隨著MDA濃度的增加，羰基含量呈現出顯著上升的趨勢。當MDA濃度為0.1mmol/L時，羰基含量增加至[X6]nmol/mgprotein，是對照組的[X7]倍；當MDA濃度達到2.0mmol/L時，羰基含量進一步增加至[X8]nmol/mgprotein，是對照組的[X9]倍。羰基含量的增加表明丙二醛與原肌球蛋白發生了氧化修飾反應，使蛋白質分子中的氨基酸殘基被氧化，形成了羰基。游離氨基含量則隨著MDA濃度的增加而逐漸下降。當MDA濃度為0.1mmol/L時，游離氨基含量下降至[X10]μmol/mgprotein，是對照組的[X11]%；當MDA濃度達到2.0mmol/L時，游離氨基含量降至[X12]μmol/mgprotein，是對照組的[X13]%。游離氨基含量的降低可能是由于丙二醛與原肌球蛋白分子中的游離氨基發生了反應，形成了Schiff堿等加合物，從而導致游離氨基數量減少。有效賴氨酸含量也呈現出類似的下降趨勢。當MDA濃度為0.1mmol/L時，有效賴氨酸含量下降至[X14]μmol/mgprotein，是對照組的[X15]%；當MDA濃度達到2.0mmol/L時，有效賴氨酸含量降至[X16]μmol/mgprotein，是對照組的[X17]%。有效賴氨酸含量的降低可能是因為丙二醛與賴氨酸殘基發生了特異性反應，導致賴氨酸殘基的活性降低或被修飾，從而影響了原肌球蛋白的結構和功能。綜上所述，丙二醛氧化修飾能夠顯著增加蝦類原肌球蛋白的羰基含量，同時降低其游離氨基和有效賴氨酸含量。這些變化會改變原肌球蛋白的化學組成和結構，進而影響其功能和過敏性質。例如，羰基含量的增加可能會導致蛋白質分子的穩定性下降，更容易發生聚集和變性；游離氨基和有效賴氨酸含量的降低可能會影響原肌球蛋白與其他分子的相互作用，如與抗體的結合能力，從而改變其過敏性質。4.2丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白免疫活性的影響4.2.1與IgG/IgE結合能力變化通過免疫印跡法（WesternBlot）檢測原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白與IgG/IgE的結合能力，結果如圖3所示。在對照組（MDA濃度為0mmol/L）中，原肌球蛋白與IgG/IgE抗體結合后，在36kDa處出現明顯的陽性免疫條帶，表明原肌球蛋白能夠與IgG/IgE特異性結合。當MDA濃度為0.1mmol/L時，36kDa處的免疫條帶強度略有減弱，同時在分子量略高于36kDa處出現了一條較弱的條帶，可能是由于丙二醛修飾后的原肌球蛋白二聚體與IgG/IgE結合產生的。隨著MDA濃度增加至0.5mmol/L，36kDa處的免疫條帶強度進一步減弱，二聚體對應的免疫條帶強度增強，且出現了分子量更大的聚集體對應的免疫條帶。當MDA濃度達到1.0mmol/L和2.0mmol/L時，高分子量聚集體對應的免疫條帶更加明顯，而36kDa處的原肌球蛋白單體免疫條帶強度顯著減弱。這些結果表明，丙二醛氧化修飾能夠改變蝦類原肌球蛋白與IgG/IgE的結合能力。隨著丙二醛濃度的增加，原肌球蛋白形成的聚集體增多，這些聚集體能夠被IgG/IgE識別并結合，但結合能力有所變化。聚集體的形成可能改變了原肌球蛋白的抗原表位結構，影響了其與IgG/IgE的結合親和力。原肌球蛋白單體與IgG/IgE的結合能力隨著氧化修飾程度的加深而減弱，這可能是由于丙二醛修飾導致原肌球蛋白分子結構發生改變，使部分抗原表位被遮蔽或破壞，從而降低了其與IgG/IgE的結合能力。這種結合能力的變化可能會對過敏反應的發生和發展產生重要影響。在過敏反應中，原肌球蛋白與IgG/IgE的結合是啟動免疫應答的關鍵步驟，結合能力的改變可能會影響免疫細胞的激活和生物活性介質的釋放，進而影響過敏癥狀的嚴重程度。4.2.2過敏原活性變化采用間接酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白的過敏原活性，結果如圖4所示。以未修飾的原肌球蛋白作為對照，其OD值設為100%。隨著丙二醛濃度的增加，修飾后的原肌球蛋白的OD值逐漸降低。當MDA濃度為0.1mmol/L時，OD值下降至[X18]%，與對照組相比差異顯著（P<0.05）；當MDA濃度增加至0.5mmol/L時，OD值進一步下降至[X19]%；當MDA濃度達到1.0mmol/L和2.0mmol/L時，OD值分別下降至[X20]%和[X21]%。這些數據表明，丙二醛氧化修飾能夠顯著降低蝦類原肌球蛋白的過敏原活性，且降低程度與丙二醛濃度呈正相關。丙二醛與原肌球蛋白發生氧化修飾反應，改變了原肌球蛋白的結構和抗原表位，從而降低了其與過敏患者血清中IgE抗體的結合能力，使過敏原活性下降。原肌球蛋白分子的聚合和結構變化可能導致部分抗原表位被包裹在聚集體內部，無法與IgE抗體充分接觸，進一步降低了其過敏原活性。這種過敏原活性的降低可能會減輕過敏患者對蝦類原肌球蛋白的過敏反應程度，為開發低過敏性蝦類食品提供了理論依據。4.3丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白潛在致敏性的影響4.3.1活性介質釋放變化通過RBL-2H3細胞實驗，檢測原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白刺激細胞釋放β-氨基己糖苷酶、組胺、類胰蛋白酶、半胱氨酰白三烯和前列腺素D2等活性介質的情況，結果如表2所示。對照組（MDA濃度為0mmol/L）原肌球蛋白刺激RBL-2H3細胞釋放β-氨基己糖苷酶的量為[X22]nmol/106cells，組胺的釋放量為[X23]ng/106cells，類胰蛋白酶的釋放量為[X24]ng/106cells，半胱氨酰白三烯的釋放量為[X25]pg/106cells，前列腺素D2的釋放量為[X26]pg/106cells。當MDA濃度為0.1mmol/L時，β-氨基己糖苷酶的釋放量下降至[X27]nmol/106cells，與對照組相比差異顯著（P<0.05），組胺、類胰蛋白酶、半胱氨酰白三烯和前列腺素D2的釋放量也分別下降至[X28]ng/106cells、[X29]ng/106cells、[X30]pg/106cells和[X31]pg/106cells，均有不同程度的降低。隨著MDA濃度增加至0.5mmol/L，活性介質的釋放量進一步下降，β-氨基己糖苷酶的釋放量降至[X32]nmol/106cells，組胺的釋放量降至[X33]ng/106cells，類胰蛋白酶的釋放量降至[X34]ng/106cells，半胱氨酰白三烯的釋放量降至[X35]pg/106cells，前列腺素D2的釋放量降至[X36]pg/106cells。當MDA濃度達到1.0mmol/L和2.0mmol/L時，活性介質的釋放量依然保持較低水平，且與0.5mmol/L組相比無顯著差異（P>0.05）。這些結果表明，丙二醛氧化修飾能夠顯著抑制蝦類原肌球蛋白激發RBL-2H3細胞釋放活性介質的能力，且抑制作用隨著丙二醛濃度的增加而增強。活性介質的釋放是過敏反應中的關鍵環節，β-氨基己糖苷酶、組胺等活性介質能夠引起血管擴張、通透性增加、平滑肌收縮等一系列生理反應，導致過敏癥狀的出現。丙二醛氧化修飾后原肌球蛋白激發細胞釋放活性介質能力的降低，說明其潛在致敏性下降，這可能是由于丙二醛氧化修飾改變了原肌球蛋白的結構和免疫活性，使其難以激活RBL-2H3細胞，從而減少了活性介質的釋放。4.3.2細胞因子釋放變化利用ELISA試劑盒檢測原肌球蛋白和不同丙二醛濃度修飾后的原肌球蛋白刺激RBL-2H3細胞釋放白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-13（IL-13）等細胞因子的含量，結果如圖5所示。除患者血清P1對IL-4影響不顯著外，其他患者血清均顯示出明顯變化。在對照組（MDA濃度為0mmol/L）中，原肌球蛋白刺激RBL-2H3細胞釋放IL-4的量為[X37]pg/106cells，釋放IL-13的量為[X38]pg/106cells。當MDA濃度為0.1mmol/L時，除患者血清P1外，其他患者血清中IL-4的釋放量下降至[X39]pg/106cells，IL-13的釋放量下降至[X40]pg/106cells，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。隨著MDA濃度增加至0.5mmol/L，IL-4和IL-13的釋放量進一步下降，分別降至[X41]pg/106cells和[X42]pg/106cells。當MDA濃度達到1.0mmol/L和2.0mmol/L時，IL-4和IL-13的釋放量依然維持在較低水平，且與0.5mmol/L組相比無顯著差異（P>0.05）。IL-4和IL-13在過敏反應中發揮著重要作用，它們能夠促進Th2細胞的分化和B細胞產生IgE抗體，加重過敏反應。丙二醛氧化修飾后原肌球蛋白刺激細胞釋放IL-4和IL-13的能力顯著下降，說明其對過敏反應的促進作用減弱，潛在致敏性降低。這可能是因為丙二醛氧化修飾改變了原肌球蛋白的抗原表位，使其與免疫細胞表面的受體結合能力下降，從而影響了免疫細胞的活化和細胞因子的分泌。綜合活性介質和細胞因子釋放的結果，丙二醛氧化修飾能夠在細胞水平上降低蝦類原肌球蛋白的潛在致敏性，為開發低過敏性蝦類食品提供了重要的細胞水平證據。4.4丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白消化穩定性的影響4.4.1模擬胃液消化結果為探究丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白在模擬胃液中消化穩定性的影響，進行SDS-PAGE分析，結果如圖6A所示。在模擬胃液消化0min時，對照組原肌球蛋白呈現出清晰的36kDa條帶，而隨著丙二醛濃度的增加，除36kDa主條帶外，還出現了高分子量的聚集體條帶，且聚集體條帶強度隨丙二醛濃度升高而增強，這與之前丙二醛氧化修飾對原肌球蛋白蛋白組分影響的結果一致。當消化時間延長至15min時，對照組原肌球蛋白條帶明顯變弱，表明其開始被胃蛋白酶消化。而丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白，尤其是高濃度丙二醛修飾組（1.0mmol/L和2.0mmol/L），36kDa條帶和聚集體條帶減弱程度相對較小，說明其對胃蛋白酶的消化具有一定抗性。消化30min和60min時，對照組原肌球蛋白條帶幾乎消失，而丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白仍有部分條帶殘留，且聚集體條帶依然可見，進一步證明丙二醛氧化修飾使原肌球蛋白相對耐胃酶消化。采用點印記法分析模擬胃液消化后原肌球蛋白免疫活性的變化，結果如圖6B所示。在消化0min時，原肌球蛋白和丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白均能與IgE抗體結合產生明顯條帶。隨著消化時間的延長，對照組原肌球蛋白的免疫活性條帶迅速減弱，在消化60min時幾乎消失。而丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白免疫活性條帶在消化過程中雖有減弱，但減弱程度相對較小。尤其是在高濃度丙二醛修飾組，消化60min后仍能檢測到較清晰的免疫活性條帶。這表明丙二醛氧化修飾在一定程度上保護了原肌球蛋白的免疫活性，使其在模擬胃液消化過程中不易被破壞。丙二醛氧化使原肌球蛋白相對耐胃酶消化，可能是由于隨著氧化程度的加劇，原肌球蛋白形成的聚集體疏水性增加，空間結構發生變化，相應的結構被包裹入蛋白內部，使得胃蛋白酶難以作用于這些結構，從而抑制了消化速率。酸性的胃蛋白酶環境可能使氧化后的原肌球蛋白樣品趨向穩定，進一步增強了其對胃酶消化的抗性。這種相對耐胃酶消化的特性，使得丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白在進入胃部后，能夠保持一定的完整性和免疫活性，可能會增加其在腸道內引發過敏反應的風險。4.4.2模擬腸液消化結果對原肌球蛋白和丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白進行模擬腸液消化實驗，SDS-PAGE分析結果如圖7A所示。在模擬腸液消化0min時，與模擬胃液消化結果類似，對照組原肌球蛋白呈現36kDa條帶，丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白有高分子量聚集體條帶。當消化時間為15min時，對照組原肌球蛋白條帶明顯變弱，同時出現了一些低分子量的降解條帶，表明其開始被腸液中的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化。丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白條帶也開始減弱，且聚集體條帶逐漸減少，說明其同樣被腸液中的酶所作用。消化30min和60min時，對照組原肌球蛋白條帶幾乎消失，只剩下一些低分子量的降解產物條帶。丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白條帶也基本消失，降解產物條帶更加明顯，表明其在模擬腸液中也能被較快地消化。通過點印記法分析模擬腸液消化后原肌球蛋白免疫活性的變化，結果如圖7B所示。在消化0min時，原肌球蛋白和丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白均能與IgE抗體結合產生明顯條帶。隨著消化時間的延長，對照組原肌球蛋白的免疫活性條帶迅速減弱，消化60min時幾乎消失。丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白免疫活性條帶也逐漸減弱，但在消化60min時仍能檢測到較弱的條帶，表明其免疫活性雖有降低，但仍有部分保留。原肌球蛋白在模擬腸液中極易被胰蛋白酶等酶消化，這是因為腸液中的酶能夠識別并作用于原肌球蛋白的特定氨基酸序列，使其發生降解。丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白雖然在模擬腸液中也能被消化，但由于其結構的改變，在消化過程中免疫活性的降低速度相對較慢。隨著蛋白去折疊，更多的消化位點被暴露，蛋白被酶解后，聚集體的構象也隨之改變，導致免疫活性有一定程度的降低。然而，與對照組相比，丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白在消化后期仍保留了一定的免疫活性，這可能會對其在腸道內引發過敏反應的程度產生影響。在腸道內，即使原肌球蛋白被部分消化，只要其免疫活性存在，就有可能與腸道內的免疫細胞相互作用，激活免疫反應，從而引發過敏癥狀。五、討論5.1丙二醛氧化修飾影響蝦類原肌球蛋白過敏性質的機制探討綜合上述實驗結果，丙二醛氧化修飾對蝦類原肌球蛋白過敏性質的影響是多方面的，其作用機制涉及結構變化、免疫反應以及消化穩定性等多個角度。從結構變化角度來看，丙二醛氧化修飾使蝦類原肌球蛋白的結構發生顯著改變。通過SDS-PAGE分析發現，隨著丙二醛濃度的增加，原肌球蛋白形成二聚體、三聚體及更大分子量的聚集體。這是由于丙二醛與原肌球蛋白分子中的氨基酸殘基發生化學反應，形成了共價交聯鍵，從而導致蛋白質分子之間相互連接，聚合程度不斷加深。圓二色光譜和熒光光譜分析結果表明，丙二醛氧化修飾破壞了原肌球蛋白的二級結構，使α-螺旋結構向無規卷曲結構轉變，同時改變了其三級結構，使分子構象變得更加松散。這是因為丙二醛與原肌球蛋白中的氨基、巰基等親核基團反應，改變了蛋白質分子內的氫鍵、疏水相互作用等非共價相互作用，進而破壞了蛋白質的空間結構。原肌球蛋白結構的這些變化對其過敏性質產生了重要影響。一方面，聚合體的形成和結構的松散可能導致部分抗原表位被遮蔽或破壞，從而降低了原肌球蛋白與IgG/IgE的結合能力，使免疫活性下降。從免疫印跡實驗結果可以看出，隨著丙二醛濃度增加，原肌球蛋白單體與IgG/IgE的結合條帶強度減弱，而聚集體對應的條帶強度雖有變化，但結合能力也有所改變。另一方面，結構的改變可能會暴露出新的抗原表位，然而這些新表位與IgG/IgE的結合親和力可能與原表位不同，進一步影響了原肌球蛋白的免疫活性。在免疫反應方面，丙二醛氧化修飾改變了原肌球蛋白的免疫活性和潛在致敏性。ELISA實驗結果顯示，丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白與過敏患者血清中IgE抗體的結合能力下降，過敏原活性降低。這可能是由于結構變化導致抗原表位的改變，使得IgE抗體難以識別和結合原肌球蛋白。RBL-2H3細胞實驗表明，丙二醛氧化修飾能夠抑制原肌球蛋白激發細胞釋放活性介質和細胞因子的能力，從而降低其潛在致敏性。這是因為原肌球蛋白結構和免疫活性的改變，使其難以激活RBL-2H3細胞，抑制了細胞的脫顆粒反應和細胞因子的分泌。活性介質如β-氨基己糖苷酶、組胺等的釋放減少，可減輕過敏反應中的血管擴張、通透性增加、平滑肌收縮等癥狀；細胞因子如IL-4和IL-13的分泌降低，可抑制Th2細胞的分化和B細胞產生IgE抗體，從而減輕過敏反應的程度。消化穩定性也是丙二醛氧化修飾影響原肌球蛋白過敏性質的重要方面。模擬胃液消化實驗表明，丙二醛氧化修飾使原肌球蛋白相對耐胃酶消化，在消化過程中免疫活性的降低速度較慢。這可能是由于丙二醛氧化修飾導致原肌球蛋白形成聚集體，其疏水性增加，空間結構發生變化，使得胃蛋白酶難以作用于這些結構，從而抑制了消化速率。酸性的胃蛋白酶環境可能使氧化后的原肌球蛋白樣品趨向穩定，進一步增強了其對胃酶消化的抗性。這種相對耐胃酶消化的特性，使得丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白在進入胃部后，能夠保持一定的完整性和免疫活性，可能會增加其在腸道內引發過敏反應的風險。在模擬腸液消化實驗中，原肌球蛋白雖能被較快地消化，但丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白在消化后期仍保留了一定的免疫活性。隨著蛋白去折疊，更多的消化位點被暴露，蛋白被酶解后，聚集體的構象也隨之改變，導致免疫活性有一定程度的降低。然而，與對照組相比，其免疫活性的降低速度相對較慢，這可能會對其在腸道內引發過敏反應的程度產生影響。在腸道內，即使原肌球蛋白被部分消化，只要其免疫活性存在，就有可能與腸道內的免疫細胞相互作用，激活免疫反應，從而引發過敏癥狀。5.2研究結果對蝦類食品加工和過敏防治的啟示本研究結果對蝦類食品加工和過敏防治具有重要的啟示意義。在蝦類食品加工方面，為了降低原肌球蛋白的過敏原性，可采取以下措施：在加工過程中，應盡量減少丙二醛等氧化產物的產生，控制加工環境中的氧氣、光照和金屬離子等因素，以減緩脂質過氧化反應。可以采用真空包裝、充氮包裝等方式減少氧氣接觸，避免過度加熱和光照，同時使用抗氧化劑如維生素C、維生素E等，抑制丙二醛的生成，從而降低原肌球蛋白的氧化修飾程度，保持其較低的過敏原性。利用丙二醛氧化修飾降低原肌球蛋白過敏原性的特性，開發新型低敏蝦類食品。在加工過程中，可通過控制丙二醛的添加量和反應條件，對原肌球蛋白進行適度的氧化修飾，使其過敏原性降低，同時盡量減少對食品營養和風味的影響。例如，在蝦類罐頭加工中，可在特定階段添加適量的丙二醛，然后通過后續的處理工藝，使丙二醛與原肌球蛋白充分反應，形成低敏的氧化修飾產物。在開發低敏蝦類食品時，還需綜合考慮食品的安全性、穩定性和口感等因素，確保低敏食品符合消費者的需求和食品安全標準。在過敏防治領域，本研究結果為過敏診斷和治療提供了新的思路。在過敏診斷方面，深入研究丙二醛氧化修飾后的原肌球蛋白與IgG/IgE的結合特性，開發更加精準的過敏診斷方法。通過檢測患者血清中針對丙二醛氧化修飾原肌球蛋白的特異性IgE抗體，能夠更準確地評估患者的過敏風險和過敏程度。利用蛋白質組學和免疫學技術，進一步篩選和鑒定丙二醛氧化修飾后原肌球蛋白的特異性抗原表位，為開發高靈敏度和特異性的過敏診斷試劑提供基礎。從治療角度來看，基于丙二醛氧化修飾對原肌球蛋白過敏性質的影響機制，研發新型的抗過敏藥物或治療方法。可以設計小分子化合物或生物制劑，干預丙二醛與原肌球蛋白的反應過程，或者調節免疫細胞對氧化修飾原肌球蛋白的應答，從而減輕過敏反應。例如，研發能夠抑制丙二醛與原肌球蛋白結合的抑制劑，阻斷氧化修飾的發生，減少過敏原性的改變；或者開發調節Th1/Th2細胞平衡的藥物，抑制Th2細胞的過度活化，降低IgE抗體的產生，減輕過敏癥狀。還可以通過免疫耐受誘導的方法，利用丙二醛氧化修飾后的低敏原肌球蛋白，誘導過敏患者產生免疫耐受，達到治療過敏的目的。5.3研究的局限性與未來展望本研究雖取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在實驗條件方面，本研究主要在實驗室模擬環境下進行，與實際蝦類食品加工和貯藏過程存在一定差異。實際加工和貯藏過程中，溫度、濕度、氧氣含量等因素更為復雜多變，且可能存在多種氧化產物和其他化學反應的相互作用，這些因素對丙二醛氧化修飾原肌球蛋白過敏性質的影響尚未得到充分研究。在研究范圍上，僅選取了丙二醛這一種