第02講微生物的培養技術及應用【學習目標】1.學會如何配置培養基，明確培養基的成分及分類；掌握無菌技術中消毒與滅菌的運用；熟悉微生物酵母菌的純培養過程。2.通過對滅菌技術及實驗步驟的學習，辨認實驗器具，提高實驗操作能力。3.通過學習微生物的基本培養技術，了解微生物的培養條件，更加透徹地理解生物實驗，從而喜歡上這門學科。4.學會如何配置選擇培養基；掌握稀釋涂布平板法的操作細節；熟悉土壤中分解尿素的細菌的分離計數過程。5.學會操作涂布器分離細菌；理解對細菌計數的算法。6.通過學習微生物的選擇培養和數量測定，了解生物科研工作的價值和意義。【基礎知識】一、培養基1．培養基的配制1．培養基的配制原則(1)目的要明確：配制時應根據微生物的種類、培養目的等確定配制的培養基種類。(2)營養要協調：注意各種營養物質的濃度和比例。(3)pH要適宜：細菌為6.5～7.5，放線菌為7.5～8.5，真菌為5.0～6.0，培養不同微生物所需pH不同。(4)認清不同生物需要的營養物質不同①微生物需要的營養成分有水、無機鹽、碳源、氮源，有些微生物還需要特殊營養物質，如生長因子。②在人和動物中，營養物質包括水、無機鹽、糖類、脂質、蛋白質、維生素六類。③在植物中，營養物質包括礦質元素、水、二氧化碳三類。2．培養基的成分3．培養基的分類特別提醒幾種微生物的營養和能量來源1.目的：獲得純凈的微生物培養物。2.關鍵：防止雜菌污染。3.兩種無菌技術的比較比較項目條件結果常用方法應用范圍消毒較為溫和的物理、化學方法僅殺死物體表面或內部一部分微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高溫的液體化學藥物消毒法操作空間、操作者的衣物和手等紫外線消毒法接種室、接種箱或超凈工作臺滅菌強烈的理化方法殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子濕熱滅菌法培養基、容器等干熱滅菌法玻璃器皿、金屬用具等灼燒滅菌法接種工具等特別提醒：1.消毒和滅菌后避免已經滅菌處理的材料用具與周圍的物品接觸；2.消毒和滅菌的實驗操作都應在超凈工作臺并在酒精燈火焰附近進行。三、培養基的制備1.培養基制備的步驟：計算→稱量→溶化→滅菌→倒平板。歸納總結四、純化培養的兩種接種方法項目平板劃線法稀釋涂布平板法接種操作在接種的固體培養基表面連續劃線一系列的梯度稀釋后進行涂布平板注意事項每次劃線前后均需灼燒接種環稀釋度要足夠高，為確保實驗成功可以增加稀釋度的范圍菌體獲取在具有顯著的菌落特征的區域菌落中挑起菌體從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑去菌體優點可以通過觀察菌落特征，對混合菌進行分離可以計數，可以觀察菌落特征，可以分離混合菌缺點不能計數操作較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延施用范圍適用于好氧菌適用于厭氧菌和兼性厭氧菌特別提醒1.平板劃線操作的注意事項(1)操作第一步即取菌種之前及每次劃線之前都需要對接種環進行火焰灼燒滅菌，劃線操作結束時，仍需灼燒接種環，每次灼燒目的不同：①第一次操作目的是殺死接種環上原有的微生物。②每次劃線之間操作目的是殺死上次劃線后接種環上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直接來源于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數目減少。③劃線結束操作目的是殺死接種環上殘存的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。(2)灼燒接種環，待其冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。(3)第二次及其以后的劃線操作總是從上一次劃線末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終得到由單個細菌繁殖而來的菌落。(4)劃線時最后一區不要與第一區相連。(5)劃線用力大小要適當，防止用力過大將培養基劃破。2.稀釋涂布平板法：10倍系列稀釋操作。①將分別盛有9mL水的6支試管滅菌，并按101～106的順序編號。②進行梯度稀釋時，從菌液開始，每次從前一試管中取1mL溶液注入到下一試管中混勻。(如圖丙)③進行涂布平板操作。(如圖丁)五、接種和分離酵母菌操作步驟操作內容①接種環滅菌將接種環放在酒精燈火焰上灼燒直至燒紅②取菌種a在酒精燈火焰旁冷卻接種環，并打開盛有菌液的試管的棉塞b將試管口通過火焰，以防止試管口雜菌污染c將已冷卻的接種環伸入菌液中，蘸取一環菌液d將試管口通過火焰，并塞上棉塞③平板劃線a左手將皿蓋打開一條縫隙，右手把接種環迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養基b灼燒接種環，冷卻后從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復上述操作，作第三、四、五次劃線。注意不要將最后一次的劃線與第一次的劃線相連特別提醒：培養酵母菌：待菌液被培養基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右的恒溫培養箱中培養24～48h。六、微生物的篩選和計數1．土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(1)分離原理：土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成脲酶，這種物質在把尿素分解成無機物的過程中起到催化作用。(2)統計菌落數目一般用稀釋涂布平板法。①統計菌落數目時，培養基表面生長的1個菌落，來源于樣品稀釋液中1個活菌。為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。②從平板上的菌落數推測出每克樣品中的菌落數的計算方法是(平均菌落數÷涂布的稀釋液體積)×稀釋倍數。③利用稀釋涂布平板法成功統計菌落數目的關鍵是恰當的稀釋度。用稀釋涂布平板法統計的菌落數往往比活菌的實際數目低，這是因為當兩個或多個細胞在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。(3)實驗流程：方法總結用顯微鏡直接計數法計數：血細胞計數板法①結構：常用的是1mm×1mm×0.1mm方格的計數板(如圖)。每個計數板上有兩個計數室，每個計數室上刻有9個大方格，其中只有中間的大方格為計數室，大方格的長和寬各為1mm，深度為0.1mm，其容積為0.1mm3；大方格內分為25中格，每一中格又分為16小格，即大方格是由400個小方格組成。②操作：將清潔干燥的血球計數板的計數室上加蓋專用的蓋玻片，用吸管吸取稀釋后的菌液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養液自行緩緩滲入，充滿計數室。③計數：在顯微鏡下計數4～5個中方格內的菌體數，求出每個小方格所含有的細菌的平均數，按照以下公式計算：每毫升原液含有的菌數＝每小格平均細菌數×400×104×原液被稀釋倍數。七、微生物的篩選與鑒別1．纖維素酶(1)組成：纖維素酶是一種復合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。(2)作用2．菌種篩選(1)方法：剛果紅染色法。(2)原理即：使用以纖維素為唯一碳源的選擇培養基，根據是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。3．篩選流程歸納總結1．微生物的鑒別方法(1)菌落特征鑒別法：根據微生物在固體平板培養基表面形成的菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等特征進行鑒別。(2)指示劑鑒別法：如以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，培養某種微生物后，培養基變紅說明該種微生物能夠分解尿素。(3)染色鑒別法：如利用剛果紅染色法，根據培養基中出現以纖維素分解菌為中心的透明圈來篩選分解纖維素的微生物。2．篩選微生物的三種方法(1)單菌落挑取法：利用平板劃線法或稀釋涂布平板法接種到固體平板培養基表面，直接根據微生物菌落的特征利用單菌落挑取的方法獲得目的微生物。(2)選擇培養法：利用選擇培養基對微生物進行選擇培養，直接獲得目的微生物。(3)鑒定培養法：利用鑒別培養基使目的微生物菌落呈現特有的特征，然后篩選目的微生物。3．選擇培養基四種常見制備方法或實例【考點剖析】考點一：培養基的配制例1．下列關于微生物培養基的敘述，錯誤的是()A．制備固體培養基，一般需在液體培養基中加入瓊脂B．微生物在固體培養基表面生長形成的菌落，可以用肉眼觀察到C．根據微生物對碳源需要的差別，使用不同碳源的培養基D．培養基中的營養物質濃度越高，對微生物的增殖越有利【答案】D【解析】制備固體培養基，一般需在液體培養基中加入適量的凝固劑——瓊脂，A正確；菌落是由微生物在固體培養基表面生長形成的肉眼可見的具有一定形態結構的細胞群體，B正確；大多數微生物培養基都含有水、碳源、氮源和無機鹽等營養物質，自養型微生物的培養基可以沒有碳源，固氮微生物的培養基可以沒有氮源，C正確；培養基中的營養物質濃度過高，微生物會通過滲透作用失水，對微生物的增殖不利，D錯誤?？键c二：無菌技術例2．關于滅菌和消毒的理解，正確的是()A．滅菌是指殺滅物體內外的一切微生物，但不包括芽孢和孢子B．消毒和滅菌實質上是相同的C．常用的滅菌法有灼燒滅菌、干熱滅菌、酒精滅菌D．常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線消毒法、化學藥物法【答案】D【解析】滅菌是指使用強烈的理化方法殺死物體內外所有微生物，包括芽孢和孢子；消毒是指用較為溫和的物理、化學等方法殺死物體表面或內部的部分微生物，它們的本質不同，A、B項錯誤。常用的滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌和濕熱滅菌，C項錯誤。常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外線消毒法或化學藥物消毒法等，D項正確。考點三、微生物的純培養例3．有關平板劃線操作的說法，正確的是()A．使用已滅菌的接種環、培養皿，操作過程中不再滅菌B．打開含菌種的試管需通過火焰滅菌，取出菌種后需馬上塞上棉塞C．要將最后一區的劃線與第一區的劃線相連D．最后將平板倒置，放入培養箱中培養【答案】D【解析】接種環在使用過程中需要多次滅菌，第一次滅菌是為了殺死接種環上原有的微生物，每次劃線結束后需要滅菌是為了殺死上次殘留的菌種，A錯誤。打開含菌種的試管需要通過火焰滅菌，取出菌種后還需要通過火焰滅菌再塞上棉塞，B錯誤。劃線時最后一區的劃線與第一區的劃線不能相連，因為最后一區是細菌最稀少的，而第一區是細菌最致密的，如果連在一起則有可能影響單個菌落的分離效果，C錯誤。最后將平板倒置，防止皿蓋上的水滴落引起污染，D正確?？键c四、微生物的選擇培養例4.隨著手機和網絡的發展，外賣由于其便捷性，廣受普通大眾青睞。為檢測外賣食品的質量狀況，食品監管人員利用稀釋涂布平板法對外賣食品中的微生物進行了調查。在稀釋涂布平板法對微生物進行計數時的錯誤操作是()A．將1mL樣品稀釋10倍，需加入10mL無菌水B．吸取菌液的移液管需要干熱滅菌避免雜菌污染C．將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃D．每一個稀釋度涂布多個平板，計算各組平均值【答案】A【解析】將1mL樣品稀釋10倍，需加入9mL無菌水，A錯誤；吸取菌液的移液管需要干熱滅菌避免雜菌污染，B正確；涂布器滅菌時，將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃，待酒精燃盡、冷卻后再用，C正確；每一個稀釋度涂布多個平板，計算各組平均值，D正確?？键c五、微生物的計數例5.用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為1×106的培養基中，得到以下幾種統計結果，正確的是()A．涂布了一個平板，統計的菌落數是230B．涂布了兩個平板，統計的菌落數是215和260，取平均值238C．涂布了三個平板，統計的菌落數分別是21、212和256，取平均值163D．涂布了三個平板，統計的菌落數分別是210、240和250，取平均值233【答案】D【解析】在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板作為重復組，才能增強實驗結果的說服力與準確性，A、B錯誤。C項雖涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數結果與另兩個相差太遠，說明在操作過程中可能出現了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數值用來求平均值，C錯誤，D正確?？键c六、微生物的接種方法例6.分解尿素的微生物廣泛存在于農田等土壤中，某生物實驗小組嘗試對分解尿素的微生物進行分離與計數。請回答下列問題：(1)分解尿素的微生物含有的酶是________，為篩選出能分解尿素的微生物，配制培養基時應以________作為唯一氮源，因此該培養基屬于________培養基。(2)常用來統計樣品中活菌數目的方法是__________。(3)該小組對分解尿素的微生物進行計數時，在接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先培養一段時間，這樣做的目的是________________________，然后將1mL樣液稀釋10000倍，在3個平板上用涂布法分別涂布0.1mL稀釋液；經適當培養后，統計活菌數目，每隔一個“時間間隔”統計一次菌落數目，最后選取____________作為結果；3個平板的菌落數分別為39、42和45。據此可得出每毫升樣液中分解尿素的微生物活菌數為________個。【答案】(1)脲酶尿素選擇(2)稀釋涂布平板法(3)檢測培養基平板滅菌是否合格菌落數目穩定時的記錄4.2×106【解析】(1)分解尿素的微生物含有脲酶；培養基的成分一般包括水、無機鹽、碳源、氮源等，利用培養基對分解尿素的微生物進行篩選，應該用選擇培養基，配制培養基時應以尿素作為唯一氮源等。(2)常用的微生物接種方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法，其中稀釋涂布平板法可以用于活菌的計數。(3)為了檢測培養基平板滅菌是否合格，應該在接種前隨機取若干滅菌后的空白平板先培養一段時間。在用稀釋涂布平板法計數時，應該選擇菌落數目穩定時的記錄作為結果；3個平板的菌落數的平均值為(39＋42＋45)/3＝42(個)，則每毫升樣液中分解尿素的微生物活菌數為42÷0.1×10000＝4.2×106(個)?！菊骖}演練】1．(2022·遼寧高考，15)為避免航天器在執行載人航天任務時出現微生物污染風險，需要對航天器及潔凈的組裝車間進行環境微生物檢測。下列敘述錯誤的是（）A.航天器上存在適應營養物質匱乏等環境的極端微生物B.細菌形成菌膜粘附于航天器設備表面產生生物腐蝕C.在組裝車間地面和設備表面采集環境微生物樣品D.采用平板劃線法等分離培養微生物，觀察菌落特征【答案】D【解析】嗜極微生物適應極端環境的特性使它們有在空間暴露環境或地外星球環境中存活的可能，因此航天器上存在適應營養物質匱乏等環境的極端微生物，A正確；細菌形成菌膜粘附于航天器設備表面產生生物腐蝕，會腐蝕艙內材料以及設備線路、元器件，B正確；對航天器及潔凈的組裝車間進行環境微生物檢測，需要在組裝車間地面和設備表面采集環境微生物樣品，C正確；航天器及潔凈的組裝車間環境微生物很少，分離培養微生物，觀察菌落特征，不需要采用平板劃線法，D錯誤。2.(2022·江蘇高考，3)下列是某同學分離高產脲酶菌的實驗設計，不合理的是（）A.選擇農田或公園土壤作為樣品分離目的菌株B.在選擇培養基中需添加尿素作為唯一氮源C.適當稀釋樣品是為了在平板上形成單菌落D.可分解酚紅指示劑使其褪色的菌株是產脲酶菌【答案】D【解析】農田或公園土壤中含有較多的含脲酶的微生物，A正確；為了篩選可分解尿素的細菌，配置的培養基應選擇尿素作為唯一氮源，含脲酶的微生物在該培養基上能生長，B正確；當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，C正確；在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會使培養基的pH升高，酚紅指示劑將變紅，因此在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，能對分離的菌種做進一步鑒定，D錯誤。3.(2022·海南高考，12)為探究校內植物園土壤中的細菌種類，某興趣小組采集園內土壤樣本并開展相關實驗。下列有關敘述錯誤的是（）A.采樣時應隨機采集植物園中多個不同地點的土壤樣本B.培養細菌時，可選用牛肉膏蛋白胨固體培養基C.土壤溶液稀釋倍數越低，越容易得到單菌落D.鑒定細菌種類時，除形態學鑒定外，還可借助生物化學的方法【答案】C【解析】采集植物園中土壤樣本的原則之一是要隨機采樣，A正確；牛肉膏蛋白胨固體培養基中含有細菌生長所需的碳源、氮源、水、無機鹽等，可用于細菌的培養，B正確；土壤溶液稀釋倍數足夠高時，才能將聚集的細菌分散開，有助于在培養基表面形成單菌落，C錯誤；不同種類細菌的理化特性一般不同，鑒定細菌種類時，除根據菌落特征進行形態學鑒定外，還可以借助生物化學的方法進行鑒定，D正確。4.(2022·湖北高考,5)滅菌、消毒、無菌操作是生物學實驗中常見的操作。下列敘述正確的是（）A.動、植物細胞DNA的提取必須在無菌條件下進行B.微生物、動物細胞培養基中需添加一定量的抗生素以防止污染C.為防止蛋白質變性，不能用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌D.可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培養瓶等進行滅菌【答案】D【解析】動、植物細胞DNA的提取不需要在無菌條件下進行，A錯誤；動物細胞培養基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保證無菌環境，而微生物的培養不能加入抗生素，B錯誤；一般用濕熱滅菌法對牛肉膏蛋白胨培養基進行滅菌，以防止雜菌污染，C錯誤；可用濕熱滅菌法對實驗中所使用的微量離心管、細胞培養瓶等進行滅菌，以防止雜菌污染，D正確。5.（2022·全國甲卷，37）某同學從被石油污染的土壤中分離得到A和B兩株可以降解石油的細菌，在此基礎上采用平板培養法比較二者降解石油的能力，并分析兩個菌株的其他生理功能。實驗所用的培養基成分如下。培養基Ⅰ：K2HPO4，MgSO4，NH4NO3，石油。培養基Ⅱ：K2HPO4，MgSO4，石油。操作步驟：①將A、B菌株分別接種在兩瓶液體培養基Ⅰ中培養，得到A、B菌液；②液體培養基Ⅰ、Ⅱ口中添加瓊脂，分別制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按圖中所示在平板上打甲、乙兩孔。回答下列問題。（1）實驗所用培養基中作為碳源的成分是____________。培養基中NH4NO3的作用是為菌株的生長提供氮源，氮源在菌體內可以參與合成____________（答出2種即可）等生物大分子。（2）步驟①中，在資源和空間不受限制的階段，若最初接種N0個A細菌，繁殖n代后細菌的數量是____________。（3）為了比較A、B降解石油的能力，某同學利用步驟②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ進行實驗，結果如表所示（“+”表示有透明圈，“+”越多表示透明圈越大，“”表示無透明圈），推測該同學的實驗思路是__________。（4）現有一貧氮且被石油污染的土壤，根據上表所示實驗結果，治理石油污染應選用的菌株是____________，理由是___________?！敬鸢浮浚?）①.石油②.DNA、RNA、蛋白質（2）N0?2n（3）在無菌條件下，將等量等濃度的A菌液和B菌液分別接種到平板Ⅰ的甲和乙兩孔處，平板Ⅱ也進行同樣的操作，在相同且適宜條件下培養一段時間，比較兩個平板的兩孔處的透明圈大小并作記錄，根據透明圈大降解能力強，透明圈小降解能力弱，進而比較A、B降解石油的能力（4）①.A②.A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在沒有添加氮源的培養基中也能生長【解析】（1）培養基的成分有碳源、氮源、無機鹽和水，從組成培養基的物質所含化學元素可知，作為碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白質都含有N元素，故氮源在菌體內可以參與合成這些物質。（2）由題意“資源和空間不受限制”可知，細菌的增殖呈J型曲線增長，由于DNA的半保留復制，細菌每繁殖一代就是上一代的2倍，根據公式Nt=N0?λt，λ=2，繁殖n代后細菌的數量是N0?2n。（3）分析表格數據可知，實驗的結果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根據實驗的單一變量和對照原則，推測該同學的思路是：在無菌條件下，將等量等濃度的A菌液和B菌液分別接種到平板Ⅰ的甲和乙兩孔處，平板Ⅱ也進行同樣的操作，在相同且適宜條件下培養一段時間，比較兩個平板的兩孔處的透明圈大小并作記錄。（4）由表格數據可知，在平板Ⅱ（無氮源的培養基）上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理貧氮且被石油污染的土壤，應該選用A菌株，因為A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且不需要在培養基中添加氮源也能生長。6.（2022·全國乙卷,37）化合物S被廣泛應用于醫藥、食品和化工工業、用菌株C可生產S，S的產量與菌株C培養所利用的碳源關系密切。為此，某小組通過實驗比較不同碳源對菌體生長和S產量的影響，結果見表。回答下列問題。（1）通常在實驗室培養微生物時，需要對所需玻璃器皿進行滅菌，滅菌的方法有______（答出2點即可）。（2）由實驗結果可知，菌株C生長的最適碳源是______；用菌株C生產S的最適碳源是______。菌株C的生長除需要碳源外，還需要______（答出2點即可）等營養物質。（3）由實驗結果可知，碳源為淀粉時菌株C不能生長，其原因是______。（4）若以制糖廢液作為碳源，為進一步確定生產S的最適碳源濃度，某同學進行了相關實驗。請簡要寫出實驗思路：______。（5）利用制糖廢液生產S可以實驗廢物利用，其意義是______（答出1點即可）?！敬鸢浮浚?）高壓蒸汽滅菌、干熱滅菌（2）①.葡萄糖②.制糖廢液③.氮源、無機鹽、生長因子（3）缺少淀粉酶（4）分別配制一系列不同濃度梯度的以制糖廢液為唯一碳源的培養基，培養菌株C，其他條件相同且適宜，一段時間后，測定并比較不同濃度制糖廢液中的S的產量，S產量最高時對應的制糖廢液濃度（5）減少污染、節省原料、降低生產成本【解析】（1）通常在實驗室培養微生物時，為防止實驗用的玻璃器皿等物品中原有的微生物污染培養物，需要使用強烈的理化因素殺死物體內外一切微生物的細胞、芽孢和孢子，即對所需的玻璃器皿進行滅菌，玻璃器皿常用的滅菌的方法有干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌等。（2）由實驗結果可知，與以制糖廢液為碳源相比，以葡萄糖為碳源時菌株C的細胞干重最大，說明最適于菌株C生長的碳源是葡萄糖；而以制糖廢液為碳源時，用菌株C生產S的產量高于以葡萄糖為碳源時的產量，說明最適于生產S的碳源是制糖廢液。微生物的生長一般都需要水、碳源、氮源和無機鹽，還需要滿足微生物生長對pH、氧氣以及特殊營養物質的要求，故菌株C的生長除需要碳源外，還需要氮源、無機鹽、生長因子等營養物質。（3）分析題圖表格可以看出在以淀粉為碳源的培養基中，菌株C不能生長，原因可能是菌株C中缺少分解淀粉的酶，不能利用淀粉。（4）要測定生產S的最適制糖廢液為碳源的濃度，實驗自變量為制糖廢液的濃度，可分別配制一系列不同濃度梯度的以制糖廢液為唯一碳源的培養基，培養菌株C，其他條件相同且適宜，一段時間后，測定并比較不同濃度制糖廢液中的S的產量，S產量最高時對應的制糖廢液濃度，即為生產S的最適碳源濃度。（5）利用制糖廢液生產S可以實驗廢物利用，既有利于減少污染、節省原料，又能降低生產成本。7.(2022·廣東高考,21)研究深海獨特的生態環境對于開發海洋資源具有重要意義。近期在“科學號”考察船對南中國?？瓶贾校袊茖W家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉積物樣品，分離、鑒定得到新的微生物菌株并進一步研究了其生物學特性。回答下列問題：（1）研究者先制備富集培養基，然后采用________________法滅菌，冷卻后再接入沉積物樣品，28℃厭氧培養一段時間后，獲得了含擬桿菌的混合培養物，為了獲得純種培養，除了稀釋涂布平板法，還可采用________________法。據圖分析，擬桿菌新菌株在以________________為碳源時生長狀況最好。（2）研究發現，將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍有很多微生物不能被分離篩選出來，推測其原因可能是________________。（答一點即可）（3）藻類細胞解體后難度解多糖物質，通常會聚集形成碎屑沉降到深海底部。從生態系繪組成成分的角度考慮，擬桿菌對深海生態系統碳循環的作用可能是________________。（4）深海冷泉環境特殊，推測此環境下生存的擬桿菌所分泌物各種多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能還有________________。【答案】（1）①.高壓蒸汽滅菌②.平板劃線③.纖維素（2）某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物質才能生存（或需要在深海冷泉的特定環境中才能存活）（3）擬桿菌作為分解者，將沉降到深海底部的難降解多糖物質分解為無機物，歸還到無機環境中，有利于碳循環的順利進行（4）耐低溫【解析】（1）培養基通常采用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。可以采用稀釋涂布平板法或平板劃線法，將單個微生物分散在固體培養基上，經過培養得到單菌落，從而獲得純凈培養物。分析圖12可知，在以纖維素為碳源的培養基中，細胞數量最多，可推知擬桿菌新菌株在以纖維素為碳源時生長狀況最好。（2）深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物質才能生存（或需要在深海冷泉的特定環境中才能存活），故將采集的樣品置于各種培養基中培養，仍可能有很多微生物不能被分離篩選出來。（3）擬桿菌為異養生物，作為該生態系統的分解者，能將沉降到深海底部的難降解多糖物質分解為無機物，歸還到無機環境中，有利于碳循環的順利進行。（4）深海冷泉溫度較低，故生活在其中的擬桿菌所分泌的各種多糖降解酶，應具有耐低溫的特性，才能高效降解多糖，保證擬桿菌的正常生命活動所需。8.(2022·浙江6月選考,29)回答下列（一）、（二）小題：（一）回答與產淀粉酶的枯草桿菌育種有關的問題：（1）為快速分離產淀粉酶的枯草桿菌，可將土樣用___________制成懸液，再將含有懸液的三角瓶置于80℃的___________中保溫一段時間，其目的是___________。（2）為提高篩選效率，可將菌種的___________過程與菌種的產酶性能測定一起進行：將上述懸液稀釋后涂布于淀粉為唯一碳源的固體培養基上培養，采用___________顯色方法，根據透明圈與菌落直徑比值的大小，可粗略估計出菌株是否產酶及產酶性能。（3）為了獲得高產淀粉酶的枯草桿菌，可利用現有菌種，通過___________后再篩選獲得，或利用轉基因、___________等技術獲得?！敬鸢浮浚?）①.無菌水②.水?、?殺死不耐熱微生物（2）①.分離②.KII2（3）①.人工誘變②.原生質體融合【解析】（1）產生淀粉酶的枯草桿菌的最適溫度為5075℃，要快速分離枯草桿菌，先將土樣加入無菌水制成枯草桿菌懸液，再將含有懸液的三角瓶置于80℃的水浴中保溫一段時間，殺死不耐熱的微生物。（2）將菌種的分離過程與菌種的產酶性能測定同時進行可以提高篩選效率。用稀釋涂布平板法可以分離枯草桿菌，在培養基中添加淀粉作為唯一碳源，并且在培養基中添加KII2，能合成淀粉酶的枯草桿菌因為能利用淀粉而存活，同時淀粉由于被分解在菌落周圍會出現透明圈，比較透明圈與菌落直徑比值的大小，比值大的說明該菌株產酶性能較高。（3）要獲得高產淀粉酶的枯草桿菌，可利用誘變育種，由于變異的不定向性，人工誘變后還需要再篩選才能獲得高產淀粉酶的枯草桿菌。也可以利用轉基因、原生質體融合等技術，從其他生物那里獲得與高產淀粉酶有關的基因，進而獲得相應的高產性狀。9.(2022·湖南高考,21)黃酒源于中國，與啤酒、葡萄酒并稱世界三大發酵酒。發酵酒的釀造過程中除了產生乙醇外，也產生不利于人體健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素與乙醇反應形成，各國對酒中的EC含量有嚴格的限量標準。回答下列問題:（1）某黃酒釀制工藝流程如圖所示，圖中加入的菌種a是_______，工藝b是_______（填“消毒”或“滅菌”），采用工藝b的目的是____________________。（2）以尿素為唯一氮源的培養基中加入________指示劑，根據顏色變化，可以初步鑒定分解尿素的細菌。尿素分解菌產生的脲酶可用于降解黃酒中的尿素，脲酶固定化后穩定性和利用效率提高，固定化方法有_________________________（答出兩種即可）。（3）研究人員利用脲酶基因構建基因工程菌L，在不同條件下分批發酵生產脲酶，結果如圖所示。推測________是決定工程菌L高脲酶活力的關鍵因素，理由是__________________。（4）某公司開發了一種新的黃酒產品，發現EC含量超標。簡要寫出利用微生物降低該黃酒中EC含量的思路_____________________________?！敬鸢浮浚?）①.酵母菌②.消毒③.殺死啤酒中部分微生物，防止雜菌污染，延長其保存期（2）①.酚紅指示劑②.化學結合法、包埋法、物理吸附法（3）①.pH②.隨著培養時間延長，兩圖形中脲酶活力變化曲線基本一致，當pH從6.5降為4.5時，酶活力逐漸下降后保持相對穩定（4）獲取含有酸性脲酶菌樣品，經過酸性培養基的初篩后，在添加酚紅的培養基上進行復篩，挑選目標菌株接種培養，從酸性脲酶菌中提取脲酶純化后制備成固定化酶，加入發酵環節。【解析】（1）制造果酒利用的是酵母菌的無氧呼吸，加入的菌種a是酵母菌。過濾能除去啤酒中部分微生物，工藝b是消毒，消毒能殺死啤酒中部分微生物，防止雜菌污染，延長其保存期。（2）由于細菌分解尿素的過程中合成脲酶，脲酶將尿素分解成氨，會使培養基堿性增強，pH升高，所以可以用檢測pH的變化的方法來判斷尿素是否被分解，故在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑可以鑒別尿素分解菌。固定化酶實質上是將相應酶固定在不溶于水的載體上，實現酶的反復利用，并提高酶穩定性，酶的各項特性（如高效性、專一性和作用條件的溫和性）依然保持。固定化酶的方法包括化學結合法、包埋法、物理吸附法等。（3）對比兩坐標曲線，隨著培養時間延長，兩圖形中脲酶活力先增加后保持相對穩定，兩者變化曲線基本一致，所以培養時間不是決定決定工程菌L高脲酶活力的關鍵因素。左圖中當pH從6.5降為4.5時，酶活力由1.6逐漸下降后相對穩定，右圖中當pH為6.5時，酶活力可以達到5.0并保持不變，故pH值是決定工程菌L高脲酶活力的關鍵因素。（4）從坐標圖形看，利用酸性脲酶消除其前體物質尿素可降低該黃酒中EC含量。該實驗的實驗思路為：獲取含有酸性脲酶菌樣品，擴大培養，經過酸性培養基的初篩后，在添加酚紅的培養基上進行復篩，挑選目標菌株接種培養，從酸性脲酶菌中提取脲酶純化后制備成固定化酶，加入發酵環節達到降解尿素的目的。10.(2022·河北高考,23)番茄灰霉病菌嚴重影響番茄生產，枯草芽孢桿菌可以產生對多種病原菌具有抑制作用的蛋白質。為探究枯草芽孢桿菌能否用于番茄灰霉病的生物防治，研究者設計了相關實驗?；卮鹣铝袉栴}：（1）檢測枯草芽孢桿菌對番茄灰霉病菌的抑制作用時，取適量________菌液涂布于固體培養基上，將無菌濾紙片（直徑5mm）在________菌液中浸泡后覆蓋于固體培養基中心，數秒后取出濾紙片，培養皿倒置培養后測量________大小以判定抑菌效果。（2）枯草芽孢桿菌為好氧微生物，液體培養時應采用________（填“靜置”或“搖床震蕩”）培養。培養過程中抽樣檢測活菌數量時，應采用________（填“稀釋涂布平板法”或“顯微鏡直接計數法”），其原因是________。（3）電泳分離蛋白質混合樣品的原理是________。利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定枯草芽孢桿菌的抗菌蛋白分子量時，SDS的作用是________。（4）枯草芽孢桿菌長期保藏時，常以其________作為保藏對象?！敬鸢浮浚?）①.番茄灰霉病菌②.枯草芽孢桿菌③.透明圈（2）①.搖床震蕩②.稀釋涂布平板法③.用稀釋涂布平板法在培養基上看到的每一個菌落都來自一個活細胞，而顯微鏡直接計數法會將死亡的酵母菌也計算在內（3）①.利用待分離樣品中各種分子帶電性質的差異及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離②.SDS帶有大量的負電荷，且能使蛋白質變性成為肽鏈，使蛋白質的遷移速率只與蛋白質的相對分子質量有關，而與所帶電荷性質無關（4）菌液【解析】（1）分析題意，要檢測枯草芽孢桿菌對番茄灰霉病菌的抑制作用，先把適量的番茄灰霉病菌菌液涂布于固體培養基上，將無菌濾紙片在枯草芽孢桿菌菌液中浸泡后覆蓋于固體培養基中心，若對番茄灰霉病菌有抑制作用，被覆蓋的位置的番茄灰霉病菌就會被殺死，培養皿倒置培養后會出現透明圈，測量透明圈大小以判定抑菌效果強弱。（2）枯草芽孢桿菌為好氧微生物，采用搖床震蕩培養可增大培養液的溶氧量，有利于枯草芽孢桿菌的生長繁殖。培養過程中要抽樣檢測活菌數量，應該采用稀釋涂布平板法，用稀釋涂布平板法在培養基上看到的每一個菌落都來自一個活細胞，而顯微鏡直接計數法會將死亡的酵母菌也計算在內。（3）電泳分離蛋白質混合樣品的原理是：利用待分離樣品中各種分子帶電性質的差異及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而實現樣品中各種分子的分離。SDS帶有大量的負電荷，且能使蛋白質變性成為肽鏈，使蛋白質的遷移速率只與蛋白質的相對分子質量有關，而與所帶電荷性質無關。（4）長期保藏枯草芽孢桿菌，應該將培養的菌液轉移到滅菌好的甘油瓶中，與甘油充分混合，放在20℃的冷凍箱中保存。【過關檢測】1．培養基、培養皿、接種環、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶，上述內容所采用的滅菌或消毒方法依次是（

）①化學藥物消毒

②灼燒滅菌

③干熱滅菌

④紫外線消毒

⑤高壓蒸汽滅菌

⑥巴氏消毒法A．⑤②③①④⑥ B．③④②①⑥⑤ C．⑤③②①④⑥ D．⑥②③④①⑤【答案】C【解析】培養基需用濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌）；培養皿能耐高溫，需用干熱滅菌；接種環可用灼燒滅菌達到迅速徹底的滅菌效果；實驗操作者的雙手可用化學藥劑進行消毒，如用酒精擦拭雙手；空氣可用紫外線消毒；為不破壞其營養成分，對牛奶可采用巴氏消毒法。2．不同的微生物對營養物質的需求各不相同。下列有關一種以CO2為唯一碳源的自養微生物營養的描述中，不正確的是（

）A．氮源物質為該微生物提供必要的氮元素B．碳源物質也是該微生物的能源物質C．無機鹽是該微生物不可缺少的營養物質D．為制成固體培養基往往需要加入瓊脂作為凝固劑【答案】B【解析】氮源物質為該微生物提供必要的氮素，A正確；該碳源是二氧化碳，屬于無機物，不能作為微生物的能源物質，B錯誤；無機鹽是該微生物不可缺少的營養物質，C正確；瓊脂的作用是在固體及半固體培養基中充當凝固劑，D正確。3．下列關于微生物純化培養的敘述，錯誤的是（

）A．涂布平板時應先將培養皿蓋置于實驗操作臺上B．微生物的純化培養包括配制培養基、滅菌、接種、分離和培養等步驟C．用平板劃線法和稀釋涂布平板法都能在固體培養基上得到單菌落D．倒平板操作應等培養基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近進行【答案】A【解析】涂布平板時不能完全掀開培養皿蓋，將其置于實驗操作臺上，只需要打開一條縫隙，A錯誤；微生物的純化培養包括配制培養基、滅菌、接種、分離和培養等步驟，B正確；用平板劃線法和稀釋涂布平板法都能在固體培養基上得到單菌落，C正確；倒平板操作應等培養基冷卻至50℃左右時，在酒精燈火焰附近進行，D正確。4．在稀釋涂布平板法對微生物進行計數時的錯誤操作是（

）A．將1mL樣品稀釋10倍，需加入10mL無菌水B．吸取菌液的移液管需要干熱滅菌避免雜菌污染C．將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃D．稀釋涂布平板法既能分離純化微生物，又能計數【答案】A【解析】將1mL樣品稀釋10倍，需加入9mL無菌水，A錯誤；吸取菌液的移液管需要干熱滅菌避免雜菌污染，B正確；將沾有少量酒精的涂布器在酒精燈火焰上引燃，將涂布器滅菌，C正確；稀釋涂布平板法既能分離純化微生物，又能計數，D正確。5．下列關于滅菌和消毒的敘述，正確的是（

）A．滅菌和消毒均可以殺死環境中的一切微生物，包括芽孢和孢子B．無菌操作時，需要對實驗操作的空間、操作者的衣物和手進行滅菌C．灼燒法滅菌的對象是金屬器具，不可以是玻璃器具D．常用滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌等【答案】D【解析】滅菌可以殺死環境中的一切微生物，包括芽孢和孢子，消毒是殺死部分微生物，不包括芽孢和孢子，A錯誤：無菌操作時，需要對實驗操作的空間、操作者的衣物和手進行消毒，B錯誤；灼燒法滅菌的對象是金屬器具，也可以是部分玻璃器具，如涂布器，C錯誤；常用滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌等，D正確。6．下列關于微生物培養的敘述，正確的是（

）A．配制培養基時，一般先調pH再滅菌B．培養微生物用到的接種環、培養皿、培養基等都用干熱滅菌法滅菌C．培養乳酸菌時，除了基本的碳源、氮源、水和無機鹽，還需要添加抗生素D．用平板劃線法和稀釋涂布平板法進行微生物的計數時，所得數據往往比實際數據偏小【答案】A【解析】配制培養基時，一般先調pH再滅菌，這樣可以避免在調pH時有雜菌污染培養基，A正確；培養微生物用到的接種環、培養皿可以用干熱滅菌法滅菌，培養基用高壓蒸汽滅菌法滅菌，B錯誤；培養乳酸菌時，不能添加抗生素，因為抗生素會殺死乳酸菌，C錯誤；因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，故用稀釋涂布平板法進行微生物的計數時，所得數據往往比實際數據偏小，但用平板劃線法不能對微生物計數，D錯誤。7．高中生物學實驗中，在接種時不進行嚴格無菌操作對實驗結果影響最大的一項是（

）A．將少許干酵母加入到新鮮的葡萄汁中B．將毛霉菌液接種在切成小塊的鮮豆腐上C．將分解尿素的細菌接種到無菌培養基上，進行分離和計數D．將土壤浸出液涂布在無菌的選擇培養基上【答案】C【解析】不進行嚴格的滅菌對葡萄酒制作的影響不大，因為多數微生物不能在缺氧、酸性和含糖較高的環境中生存，A錯誤；不進行嚴格的滅菌對腐乳制作的影響不大，因為腐乳制作時還需在其中放入酒精、鹽和香辛料等，這些都具有殺菌作用，B錯誤；植物組織培養要求嚴格的無菌環境，如果滅菌不徹底，會造成培養的幼苗生長緩慢甚至培育失敗，C正確；選擇培養基是根據要培養的微生物的代謝特點制備的，一般的雜菌在其上面也很難生存，D錯誤。8．某種物質X（一種含有C、H、O、N的有機物）難以降解，會對環境造成污染，只有某些細菌能降解X。研究人員按照下圖所示流程從淤泥中分離得到能高效降解X的細菌菌株。實驗過程中需要甲、乙兩種培養基，甲的組分為無機鹽、水和X，乙的組分為無機鹽、水、X和Y。下列相關敘述中不正確的是（

）A．甲、乙培養基均屬于選擇培養基，乙培養基組分中的Y物質是瓊脂B．若要篩選高效降解X的細菌菌株，甲、乙培養基中X是唯一的碳源C．步驟⑤的篩選過程中，根據對照原則各培養瓶中X溶液的濃度不同D．步驟⑤的篩選過程中，若X濃度過高，某菌株對X的降解量可能下降【答案】C【解析】甲、乙培養基均只含有機物X，屬于選擇培養基，乙培養基組分中除了X外，還加入了Y物質瓊脂，獲得固體培養基，從而分離出所需的菌種，A正確；若要篩選高效降解X的細菌菌株，需要甲、乙培養基中的X是唯一提供碳源的有機物，不能利用物質X的微生物不能在該培養基上生長，從而篩選出高效降解X的細菌菌株，B正確；步驟⑤中自變量是挑取的不同的菌落，各培養瓶中的X溶液的濃度應該是一致的，因為X溶液的濃度屬于無關變量，需要保持相同，C錯誤；步驟⑤的篩選過程中，若培養基中的X濃度過高，可能會導致菌體失水影響菌體的正常生長，因此某菌株對X的降解量可能下降，D正確。9．如表所示為某培養基的配方，下列敘述錯誤的是（

）成分NaNO3K2HPO4MgSO4·7H2O（CH2O）蒸餾水青霉素含量3g1g0．5g30g定容至1000mL0．1萬單位A．根據物理性質劃分，該培養基屬于液體培養基B．根據功能劃分，該培養基屬于選擇培養基C．根據培養基的配方可知，該培養基可培養異養型微生物D．該培養基可以用于培養細菌【答案】D【解析】液體培養基中加入凝固劑（如瓊脂）可形成固體培養基，題表所示的培養基配方中沒有加凝固劑，因此屬于液體培養基，A正確；該培養基中的加入了青霉素，可以分離得到真菌，屬于選擇培養基，B正確；該培養基中的（CH2O）可作為有機碳源，因此其培養的微生物的同化作用類型是異養型，C正確；該培養基中含有青霉素，其能抑制細菌的生長，因此不能用于培養細菌，D錯誤。10．硝化細菌是一種好氧菌，可有效凈化水體中銨鹽，降低對蝦的死亡率?？蒲腥藛T擬從當地對蝦養殖池塘中篩選出對銨鹽降解率高且穩定的硝化細菌菌株，操作流程如下圖所示。下列敘述錯誤的是（

）A．純化菌種時，可以采用圖中所示的接種方法接種B．選擇培養基中應加入銨鹽作為唯一氮源C．已知硝化細菌是好氧性細菌，擴大培養時需要振蕩的目的是增加硝化細菌與營養物質、溶解氧的充分接觸D．用細菌計數板統計的硝化細菌數為活菌數【答案】D【解析】根據圖示培養皿中菌落特點，可判斷接種方法為平板劃線法，在劃線的最后區域，可得到單菌落，從而起到純化菌種的目的，A正確；硝化細菌是一類能降解銨鹽的自養型細菌，為了篩選出硝化細菌，在配制選擇培養基時，需要以銨鹽為唯一氮源，B正確；硝化細菌是好氧性細菌，擴大培養時一般需振蕩，振蕩的目的是：增加培養液中溶氧量，并有利于硝化細菌與營養物質接觸，C正確；使用細菌計數板對純化培養后的硝化細菌直接計數，不管死菌還是活菌都會計數，D錯誤。11．孔雀石綠（簡稱MG）是廣泛使用的有機染料，在自然環境中極難降解，容易引起土壤污染，進而危害人體健康。因此從土壤中分離和篩選出高效的MG降解菌有非常重要的意義。已知MG在水中溶解度低，含過量MG的固體培養基不透明。(1)培養基的配制：MG降解菌富集培養基需含有NaH2PO4、KH2PO4、NaCl、NH4Cl、CaCl2、MgSO4、水等，再加_____作為唯一碳源。配制好的培養基，需用_____法進行滅菌。(2)MG高效降解菌株的分離和純化：圖中所示的分離純化細菌的方法是_____，用該方法統計樣品的菌落數目比活菌的實際數目_____（“少”或“多”），原因是_____。實驗室采用此方法，將1mL樣品稀釋1000倍，在3個平板上分別接入0．1mL稀釋液；經正確操作培養后，3個平板上的菌落數分別為150、158和160．據此可得出每升樣品中的活菌數_____（填“至多”或“至少”）為_____個。(3)MG高效降解菌株的鑒定：將純化獲得的菌種接種于含過量MG的固體培養基（其他營養成分等適宜）上，根據培養基是否出現_____就可以鑒別出目的菌株，原因是_____?！敬鸢浮?1)孔雀石綠（MG）

高壓蒸汽滅菌(2)稀釋涂布平板法

少

當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落

至少

1．56×109(3)透明圈

目的菌株通過降解MG生長，使菌落周圍的培養基變透明，出現透明圈【解析】（1）該實驗的目的是篩選出高效的MG降解菌，則培養基中應以MG作為唯一碳源，這樣能夠降解MG的細菌能夠生長，其他微生物的生長會受到抑制，從而達到篩選的目的。配制好的培養基，需用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。（2）稀釋涂布平板法能用于分離和計數，圖中所示的分離純化細菌的方法是稀釋涂布平板法。用該方法（稀釋涂布平板法）統計樣品的菌落數目比活菌的實際數目少，原因是當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。根據計算公式即每ml樣品中的活菌數=平板平均數÷接種稀釋液體積×稀釋倍數，故每升樣品中的活菌數至少為（150+158+160）÷3÷0.1×1000×103=1.56×109個。（3）MG高效降解菌株的鑒定：將純化獲得的菌種接種于含過量MG的固體培養基（其他營養成分等適宜）上，已知MG在水中溶解度低，含過量MG的固體培養基不透明，故可根據培養基是否出現透明圈就可以鑒別出目的菌株，這是因為目的菌株通過降解MG生長，使菌落周圍的培養基變透明，出現透明圈。12．谷氨酸棒狀桿菌是一種好氧菌，它是谷氨酸發酵的常用菌種。細菌內合成的生物素參與細胞膜的合成，不能合成生物素的細菌細胞膜不完整。圖為通過發酵工程生產谷氨酸的生產流程，請回答下列問題：(1)從自然界分離的菌種往往達不到生產要求，從改變微生物遺傳特性的角度出發，培育出優良菌種的育種方法主要有___________（至少答出一點）。(2)擴大培養時所用的培養基，從物理性質來看是___________（填“固體”或“液體”）培養基，從用途來看是___________（填“鑒別”或“選擇”）培養基，擴大培養的目的是___________。(3)對谷氨酸代謝的控制，除了改變微生物的遺傳特性外，還需要控制生產過程中的發酵條件，比如_________（至少答出兩點）。為了從發酵液中分離提純谷氨酸，可將發酵液滅菌后進行萃取→過濾→___________，然后用一定手段進行結晶，可得到純凈的谷氨酸晶體。(4)谷氨酸棒狀桿菌在合成谷氨酸的過程中，當細胞中谷氨酸積累過多時會抑制谷氨酸脫氫酶的活性，從而降低谷氨酸的合成，這是一種___________調節機制。在生產上一般選用___________缺陷型菌作為菌種可以解除谷氨酸合成過量對谷氨酸脫氫酶活性的抑制，從而大量生產谷氨酸?！敬鸢浮?1)誘變育種、基因工程育種、細胞工程育種(2)液體

選擇

增大菌種濃度(3)溫度、氧氣、pH

濃縮(4)（負）反饋

生物素（或細胞膜）【解析】(1)培育優良菌種的育種方法主要有誘變育種、基因工程育種、細胞工程育種。(2)發酵罐中的培養基屬于液體培養基，這種培養基有助于所選擇的細菌種類的生長，從用途來看這種培養基是選擇培養基，擴大培養的目的是增大菌種濃度。(3)谷氨酸棒狀桿菌是生產谷氨酸的過程中，當發酵罐溶氧不足時，進行無氧呼吸，生成的代謝產物是乳酸或琥珀酸。隨著發酵的進行，培養基中營養成分的消耗和代謝產物的積累，會導致發酵罐中pH值下降，所以需要控制生產過程中溫度、氧氣、pH等條件。為了從發酵液中分離提純谷氨酸，可將發酵液滅菌后進行萃取→過濾→濃縮，然后用一定手段進行結晶，可得到純凈的谷氨酸晶體。(4)谷氨酸脫氫酶能促進谷氨酸的生成，在谷氨酸的濃度超過一定程度時，會抑制谷氨酸脫氫酶的活性，從而使谷氨酸維持在一定的含量，這種調節方式是通過調節酶活性而實現的負反饋調節機制。在生產上一般選用生物素（或細胞膜）缺陷型菌作為菌種可以解除谷氨酸合成過量對谷氨酸脫氫酶活性的抑制，從而大量生產谷氨酸。13.中國科學家運用合成生物學方法構建了一株嗜鹽單胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的廢棄液，含較多蔗糖）為原料，在實驗室發酵生產PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整體利用價值。工藝流程如圖?；卮鹣铝袉栴}：（1）為提高菌株H對蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液體培養基中將蔗糖作為，并不斷提高其濃度，經多次傳代培養（指培養一段時間后，將部分培養物轉入新配的培養基中繼續培養）以獲得目標菌株。培養過程中定期取樣并用的方法進行菌落計數，評估菌株增殖狀況。此外，選育優良菌株的方法還有等。（答出兩種方法即可）（2）基于菌株H嗜鹽、酸堿耐受能力強等特性，研究人員設計了一種不需要滅菌的發酵系統，其培養基鹽濃度設為60g/L，pH為10，菌株H可正常持續發酵60d以上。該系統不需要滅菌的原因是。（答出兩點即可）（3）研究人員在工廠進行擴大培養，在適宜的營養物濃度、溫度、pH條件下發酵，結果發現發酵液中菌株H細胞增殖和PHA產量均未達到預期，并產生了少量乙醇等物質，說明發酵條件中可能是高密度培養的限制因素。（4）菌株H還能通過分解餐廚垃圾（主要含蛋白質、淀粉、油脂等）來生產PHA，說明其能分泌?！敬鸢浮浚?）唯一碳源血球計數板計數誘變育種、基因工程育種（2）鹽濃度為60g/L的條件下，其他雜菌因失水過多而死亡；pH為10的條件下，其他雜菌的酶變性失活，生長繁殖受抑制（3）氧氣（O2或溶解氧）（4）蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等【解析】（1）由題干信息分析可知，為提高甘蔗的整體利用價值，需提高嗜鹽單胞菌H對蔗糖的耐受能力和利用效率，故在液體培養基中將蔗糖作為唯一碳源，并不斷提高其濃度，經多次傳代培養（指培養一段時間后，將部分培養物轉入新配的培養基中繼續培養）以獲得目標菌株。培養過程中定期取樣并用血球計數板計數的方法進行菌落計數，評估菌株增殖狀況。此外，選育優良菌株的方法還有誘變育種和基因工程育種等。（2）由題干信息分析可知，嗜鹽單胞菌H具有嗜鹽、酸堿耐受能力強等特性，因此當培養基鹽濃度為60g/L，pH為10時，菌株H可正常持續發酵6Qd以上，在鹽濃度為60g/L的條件下，其他雜菌會因失水過多，導致雜菌無法繁殖甚至死亡；且pH值為10時，其他雜菌的體內的酶會變性失活，從而使雜菌的生長繁殖受抑制，故該系統不需要滅菌。（3）由題干信息分析可知，在工廠進行擴大培養時，營養物的濃度、溫度、pH等條件均在適宜情況下進行發酵，而發酵液中菌株H細胞增殖和PHA產量均未達到預期，同時還產生了少量乙醇等物質，這說明發酵條件中氧氣不足，使菌種進行無氧呼吸產生了乙醇。據此推測可知，氧氣（O2或溶解氧）是限制高密度培養的重要因素。（4）由題干信息“菌株H還能通過分解餐廚垃圾（主要含蛋白質、淀粉、油脂等）來生產PHA”分析可知，菌株H能通過分解主要含蛋白質、淀粉、油脂等的餐廚垃圾來生產PHA，這說明菌株H能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。14．某環保公司從淤泥中分離到一種高效降解富營養化污水污染物的細菌菌株，制備了固定化菌株。（1）從淤泥中分離細菌時常用劃線分離法或法，兩種方法均能在固體培養基上形成。對分離的菌株進行誘變、和鑒定，從而獲得能高效降解富營養化污水污染物的菌株。該菌株只能在添加了特定成分X的培養基上繁殖。（2）固定化菌株的制備流程如下：①將菌株與該公司研制的特定介質結合；②用蒸餾水去除；③檢驗固定化菌株的。菌株與特定介質的結合不宜直接采用交聯法和共價偶聯法，可以采用的2種方法是。（3）對外，只提供固定化菌株有利于保護該公司的知識產權，推測其原因是?！敬鸢浮浚?）涂布分離單菌落篩選（2）未固定的細菌降解富營養化污水污染物的能力包埋法和吸附法（3）特定介質能為菌株繁殖提供X【解析】（1）分離純化細菌最常用的方法是劃線分離法或涂布分離法，兩種方法均能在固體培養基上形成單菌落。為了獲得能高效降解富營養化污水污染物的菌株，還需對分離的菌株進行誘變處理，再經篩選和鑒定。（2）固定化的方法有吸附法、共價偶聯法、交聯法和包埋法等。由于菌株與特定介質的結合不宜直接采用交聯法和共價偶聯法，故可以采用的2種方法是包埋法和吸附法。（3）由于該菌株只能在添加了特定成分X的培養基上繁殖，可推測特定介質能為菌株繁殖提供X，故該公司對外只提供固定化菌株，有利于保護該公司的知識產權。15.產脂肪酶酵母可用于含油廢水處理。為篩選產脂肪酶酵母菌株，科研人員開展了相關研究。請回答下列問題：（1）常規微生物實驗中，下列物品及其滅菌方法錯誤的是（填編號）。編號①②③④物品培養基接種環培養皿涂布器滅菌方法高壓蒸汽火焰灼燒干熱臭氧（2）稱取1.0g某土壤樣品，轉入99mL無菌水中，制備成菌懸液，經后，獲得細胞密度不同的菌懸液。分別取0.1mL菌懸液涂布在固體培養基上，其中10倍稀釋的菌懸液培養后平均長出了46個酵母菌落，則該樣本中每克土壤約含酵母菌個。（3）為了進一步提高酵母菌產酶能力，對分離所得的菌株，采用射線輻照進行育種。將輻照處理后的酵母菌涂布在以為唯一碳源的固體培養基上，培養一段時間后，按照菌落直徑大小進行初篩，選擇直徑的菌落，純化后獲得A、B兩突變菌株。（4）在處理含油廢水的同時，可獲得單細胞蛋白，實現污染物資源化。為評價A、B兩菌株的相關性能，進行了培養研究，結果如圖。據圖分析，應選擇菌株進行后續相關研究，理由是。【答案】（1）④（2）梯度稀釋4.6×105（3）誘變脂肪（或油脂）較大（4）B該菌株增殖速度快，單細胞蛋白產量高；降解脂肪能力強，凈化效果好【解析】（1）培養基常用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌；接種環常用火焰灼燒法進行滅菌；培養皿常用干熱滅菌法進行滅菌；涂布器常用灼燒滅菌法進行滅菌。答案：④。（2）稱取1.0g某土壤樣品，轉入99mL無菌水中，制備成菌懸液（該過程中已經稀釋了100倍），經梯度稀釋后，獲得細胞密度不同的菌懸液。分別取0.1mL菌懸液涂布在固體培養基上，其中10倍稀釋的菌懸液培養后平均長出了46個酵母菌落，則該樣本中每克土壤約含酵母菌46×100×10÷0.1＝4.6×105個。（3）對分離所得的菌株采用射線輻照進行的是誘變育種。為篩選產脂肪酶酵母菌株，需要用以脂肪為唯一碳源的固體培養基；培養一段時間后，按照菌落直徑大小進行初篩，選擇直徑較大的菌落，純化后獲得A、B兩突變菌株。（4）根據曲線圖可知，菌株B的增殖速度快，則其單細胞蛋白產量高，而且其降解脂肪能力強，則凈化效果好，因此應選擇菌株B進行后續相關研究。16．回答與柑橘加工與再利用有關的問題：（1）柑橘果實經擠壓獲得果汁后，需用果膠酶處理，主要目的是提高果汁的。為確定果膠酶的處理效果，對分別加入不同濃度果膠酶的果汁樣品，可采用3種方法進行實驗：①取各處理樣品，添加相同體積的，沉淀生成量較少的處理效果好。②對不同處理進行離心，用比色計對上清液進行測定，OD值的處理效果好。③對不同處理進行，記錄相同體積果汁通過的時間，時間較短的處理效果好。（2）加工后的柑橘殘渣含有抑菌作用的香精油及較多的果膠等。為篩選生長不被香精油抑制且能高效利用果膠的細菌，從腐爛殘渣中分離得到若干菌株，分別用無菌水配制成，再均勻涂布在LB固體培養基上。配制適宜濃度的香精油，浸潤大小適宜并已的圓形濾紙片若干，再貼在上述培養基上。培養一段時間后，測量濾紙片周圍抑制菌體生長形成的透明圈的直徑大小。從直徑的菌株中取菌接種到含有適量果膠的液體培養基試管中培養，若有果膠酶產生，搖晃試管并觀察，與接種前相比，液體培養基的下降?！敬鸢浮浚?）澄清度95%乙醇較小抽濾（2）細菌懸液滅菌較小粘性【解析】（1）由于植物細胞壁和植物細胞間果膠的存在時，果汁的澄清度受到一定的影響，因此可以加入果膠酶使果膠降解為可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判斷果膠酶的處理效果，可采用三種方法，①看果膠的剩余量，果膠不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果膠的剩余量少，處理效果好，②進行離心處理，取上清液測OD值，OD值越小，說明降解越充分，果膠酶的處理效果越好，③對不同處理進行抽濾，記錄相同體積果汁的通過時間，固形物含量越少，時間越短，處理效果越好。（2）為篩選不被香精油抑制且能高效利用果膠的細菌，需從腐爛殘渣中分離菌株，用無菌水配制成細菌懸液，再涂布在LB固體培養基上待篩選。由于目標是篩選不被香精油抑制的細菌，因此還需準備香精油，并將其制作成濾紙片貼在培養基上，香精油需滅菌處理。觀察濾紙片周圍的抑菌圈，直徑越小說明該菌株越不易被香精油抑制，因而成為初步待選的菌株。再進一步接種到含果膠的液體培養基中培養，果膠使植物細胞粘連，若果膠被降解，則液體培養基的粘性下降。17．水果可以用來加工制作果汁、果酒和果醋等?；卮鹣铝袉栴}：（1）制作果汁時，可以使用果膠酶、纖維素酶等提高水果的出汁率和澄清度。果膠酶是分解果膠的一類酶的總稱，包括多聚半乳糖醛酸酶、（答出2種即可）。纖維素酶可以分解植物（填“細胞膜”或“細胞壁”）中的纖維素。（2）用果膠酶處理果泥時，為了提高出汁率，需要控制反應的溫度，原因是。（3）現有甲乙丙三種不同來