YKL-40：甲狀腺結節良惡性鑒別的新視角一、引言1.1研究背景與意義甲狀腺結節是一種常見的甲狀腺疾病，在人群中具有較高的發病率。隨著高分辨率超聲技術的廣泛應用，甲狀腺結節的檢出率顯著提高，觸診發現一般人群甲狀腺結節的患病率為3％-7％，而高清晰超聲檢查發現甲狀腺結節的患病率達20％-70％。在18歲以上人群中，甲狀腺結節總體患病率為20.43%。甲狀腺結節可單發或多發，其病因復雜，包括放射接觸、自身免疫性甲狀腺疾病、遺傳因素、碘攝入過量或過少等。臨床上，甲狀腺結節分為良性結節和惡性結節，其中大部分為良性，惡性僅占全部結節的7%-15%。然而，準確鑒別甲狀腺結節的良惡性對于患者的治療方案選擇和預后具有至關重要的意義。乳頭狀甲狀腺癌（PapillaryThyroidCarcinoma，PTC）是最常見的甲狀腺惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的80%-90%。雖然PTC的預后相對較好，但仍有部分患者會出現復發和轉移，影響患者的生存質量和壽命。因此，早期準確地診斷PTC并與甲狀腺良性結節進行鑒別，對于及時采取有效的治療措施、提高患者的治愈率和生存率具有重要的臨床價值。目前，臨床上常用的甲狀腺結節良惡性鑒別方法包括超聲檢查、細針穿刺活檢（Fine-NeedleAspirationBiopsy，FNAB）、甲狀腺功能檢查等。超聲檢查是甲狀腺結節的首選檢查方法，通過對結節的大小、形態、邊界、回聲、血流等特征進行分析，可初步判斷結節的良惡性，但對于一些不典型的結節，其診斷準確性仍有待提高。FNAB是診斷甲狀腺結節良惡性的金標準，但它是一種有創檢查，存在一定的并發癥風險，且對于一些微小癌或取材不滿意的情況，可能會出現假陰性結果。甲狀腺功能檢查主要用于評估甲狀腺的功能狀態，對于甲狀腺結節的良惡性鑒別診斷價值有限。因此，尋找一種新的、無創或微創的、準確的甲狀腺結節良惡性鑒別診斷指標具有重要的臨床需求。YKL-40，又稱幾丁質酶樣蛋白-40（Chitinase-likeProtein-40），是一種由巨噬細胞、平滑肌細胞、中性粒細胞等分泌的糖化蛋白，其相對分子質量約為40kD。YKL-40在多種生理和病理過程中發揮著重要作用，如炎癥反應、組織重塑、細胞增殖、遷移和分化等。近年來，越來越多的研究表明，YKL-40與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移密切相關，在多種惡性腫瘤中均有異常表達，如胃癌、肝細胞癌、結腸癌、乳腺癌等。在甲狀腺癌中，YKL-40也被發現具有潛在的診斷和預后價值。研究發現，YKL-40在分化型甲狀腺癌患者的血清和組織中表達升高，且與甲狀腺癌的結構性復發顯著正相關，提示YKL-40可能參與了甲狀腺癌的發生發展過程。然而，關于YKL-40在乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節鑒別診斷中的意義，目前的研究報道較少，且結果存在一定的爭議。因此，深入研究YKL-40在乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節中的表達差異及其在鑒別診斷中的價值，對于提高甲狀腺結節的診斷準確性、優化治療方案具有重要的理論和臨床意義。1.2國內外研究現狀近年來，YKL-40在腫瘤領域的研究逐漸成為熱點，其與甲狀腺疾病的關系也受到了廣泛關注。國內外學者針對YKL-40在甲狀腺疾病中的表達及作用機制開展了一系列研究。在國外，一些研究表明YKL-40在甲狀腺癌組織和血清中呈現高表達。一項對分化型甲狀腺癌患者的研究發現，復發組的YKL-40、TSH、VEGF、ES顯著高于未復發組和對照組，且YKL-40、VEGF、ES過度表達與分化型甲狀腺癌結構性復發顯著正相關，這表明YKL-40可能在甲狀腺癌的復發過程中發揮重要作用。還有研究通過對甲狀腺癌患者的長期隨訪，發現YKL-40高表達的患者更容易出現腫瘤復發和不良預后，提示YKL-40可作為預測甲狀腺癌復發和預后的潛在指標。國內相關研究也取得了一定進展。山東大學齊魯醫院的一項研究分析了乳頭狀甲狀腺癌（PTC）與甲狀腺良性結節患者血清及組織中YKL-40的表達差異，結果顯示惡性組、良性組及正常對照組血清YKL-40水平無統計學差異，但在組織表達方面，惡性組和良性組存在一定差異，提示組織YKL-40檢測可能對PTC與甲狀腺良性結節的鑒別診斷有一定意義。江南大學附屬中心醫院的研究探討了血清YKL-40水平與Graves病患者甲狀腺激素水平的相關性，發現GD患者血清YKL-40顯著高于健康對照組，且血清中YKL-40的濃度與血清中游離三碘甲腺原氨酸（FT3）和血清游離甲狀腺素（FT4）濃度呈顯著正相關性，與促甲狀腺激素（TSH）濃度呈顯著負相關性，表明YKL-40可能與GD的發病機制密切相關。然而，目前關于YKL-40在乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節鑒別診斷中的研究仍存在一些不足。一方面，多數研究樣本量較小，導致研究結果的可靠性和普遍性受到一定影響；另一方面，不同研究之間的結果存在差異，對于YKL-40在甲狀腺結節良惡性鑒別中的具體作用和價值尚未達成一致結論。此外，YKL-40在甲狀腺癌發生、發展過程中的具體分子機制尚不完全明確，有待進一步深入研究。本研究擬在以往研究的基礎上，擴大樣本量，全面分析YKL-40在乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節患者血清和組織中的表達情況，并結合臨床病理特征進行綜合分析，旨在更準確地探討YKL-40在兩者鑒別診斷中的意義，為甲狀腺結節的臨床診斷和治療提供新的思路和依據。同時，本研究還將進一步探討YKL-40在甲狀腺癌發生發展中的潛在分子機制，以期為甲狀腺癌的靶向治療提供新的靶點。二、YKL-40的生物學特性2.1YKL-40的結構與功能YKL-40，即幾丁質酶樣蛋白-40（Chitinase-likeProtein-40），又被稱作人軟骨糖蛋白-39（HumanCartilageGlycoprotein-39，HCgp-39），是CHI3L1基因的表達產物。其基因位于1號染色體q32.1一個高度保守的區域，大小為7948個堿基對，由10個外顯子組成。YKL-40相對分子質量約為40kD，其肽鏈氨基酸起始端包含酪氨酸（Y）、賴氨酸（K）和亮氨酸（L），故而得名YKL-40。從結構上看，YKL-40屬于糖基水解酶18家族和哺乳動物幾丁質酶樣蛋白。它具有獨特的三維結構，呈(β/α)8桶狀折疊結構，并插入一個α+β結構域。這種特殊結構賦予了YKL-40一些特殊的理化性質，使其具有肝素、幾丁質和膠原蛋白結合特性。不過，由于其酶活性序列末端的谷氨酸催化殘基被亮氨酸取代，YKL-40雖對幾丁質有高親和力，卻失去了幾丁質酶活性。YKL-40來源廣泛，多種細胞均可分泌，包括巨噬細胞、中性粒細胞、單核細胞、氣道上皮細胞、血管平滑肌細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、乳腺細胞以及實體腫瘤細胞等。其表達受到多種細胞因子的刺激，如白細胞介素-13（IL-13）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）和干擾素γ（IFN-γ）等。在正常生理狀態下，YKL-40在人體血清中含量較低，在健康兒童中的平均值為80μg/L，成年后逐漸升高至102μg/L。YKL-40在眾多生理和病理過程中發揮著關鍵作用：細胞遷移方面：研究表明，YKL-40能夠促進內皮細胞遷移，對細胞外基質的降解和再形成具有重要作用。在腫瘤的侵襲和轉移過程中，YKL-40可通過調節細胞外基質的成分和結構，為腫瘤細胞的遷移提供有利條件。有體外實驗發現，在高表達YKL-40的腫瘤細胞系中，腫瘤細胞的遷移能力明顯增強，而當通過RNA干擾技術降低YKL-40的表達后，腫瘤細胞的遷移能力受到顯著抑制。組織重塑過程中：YKL-40對與組織重建過程有關的細胞呈現生長因子活性，是結締組織細胞的生長因子。在傷口愈合過程中，YKL-40可刺激成纖維細胞的增殖和遷移，促進膠原蛋白的合成和沉積，從而加速傷口的愈合和組織的修復。在慢性炎癥相關的組織重塑中，YKL-40持續高表達，導致細胞外基質過度降解和異常重塑，進而影響組織的正常結構和功能。炎癥反應時：YKL-40可介導多種炎癥因子表達分泌，參與炎癥相關信號通路。在哮喘患者中，肺和血清中的YKL-40水平明顯增加，并且和哮喘的氣道炎癥、氣道重塑、疾病嚴重程度、肺功能水平密切相關。YKL-40可以誘導Th2炎癥應答、刺激樹突狀細胞活化、調節細胞凋亡，通過C-Jun氨基末端激酶、細胞外調節蛋白激酶和核因子κB途徑誘導上皮細胞產生IL-8，從而參與氣道重塑。在其他炎癥性疾病如慢性鼻-鼻竇炎中，患者血漿中的YKL-40濃度也顯著高于正常人，推測其在慢性鼻-鼻竇炎的發生發展中起重要作用。2.2YKL-40的表達調控機制YKL-40的表達調控是一個復雜的過程，在正常生理和病理狀態下，受到多種因素的精細調節。在正常生理狀態下，YKL-40的表達水平相對穩定，其表達調控主要與機體的生長、發育和組織穩態維持相關。多種細胞如巨噬細胞、中性粒細胞、單核細胞、氣道上皮細胞、血管平滑肌細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、乳腺細胞等均可表達YKL-40，其表達量受到細胞內基因轉錄調控以及細胞外微環境信號的共同影響。從基因轉錄層面來看，YKL-40的編碼基因CHI3L1啟動子區域包含多個轉錄因子結合位點，這些轉錄因子可與啟動子區域相互作用，調節CHI3L1基因的轉錄起始和轉錄速率。在巨噬細胞中，一些基礎轉錄因子可與CHI3L1啟動子結合，維持YKL-40的基礎表達水平，確保巨噬細胞在正常生理功能中發揮作用。而細胞外微環境信號如細胞因子、生長因子等也能通過細胞表面受體激活細胞內信號轉導通路，進而影響YKL-40的表達。胰島素樣生長因子-1（IGF-1）可通過激活PI3K/Akt信號通路，上調巨噬細胞中YKL-40的表達，這可能與IGF-1促進細胞生長和增殖的功能相關，通過調節YKL-40的表達來參與細胞外基質的代謝和組織修復過程。在病理狀態下，尤其是炎癥和腫瘤等疾病過程中，YKL-40的表達會發生顯著變化。在炎癥反應中，多種炎癥細胞因子可刺激YKL-40的表達。白細胞介素-13（IL-13）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）和干擾素γ（IFN-γ）等細胞因子在炎癥微環境中濃度升高，它們通過與相應細胞表面受體結合，激活一系列細胞內信號轉導級聯反應，最終促進YKL-40的表達。在哮喘患者的氣道炎癥中，Th2型細胞因子IL-13可與氣道上皮細胞、巨噬細胞等表面的IL-13受體結合，激活JAK-STAT信號通路，誘導CHI3L1基因轉錄，使YKL-40表達上調。YKL-40又可介導多種炎癥因子表達分泌，進一步放大炎癥反應，形成一個正反饋調節環路，加劇氣道炎癥和組織損傷。在腫瘤發生發展過程中，YKL-40的表達調控更為復雜。腫瘤細胞自身以及腫瘤微環境中的細胞均可產生YKL-40，其表達水平與腫瘤的生長、侵襲、轉移和預后密切相關。一方面，腫瘤細胞內的一些致癌信號通路異常激活可直接調節YKL-40的表達。在乳腺癌細胞中，HER2/neu基因擴增導致其過度表達，激活下游的PI3K/Akt和MAPK信號通路，進而上調YKL-40的表達。YKL-40可促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，增強腫瘤細胞的惡性生物學行為。另一方面，腫瘤微環境中的缺氧、炎癥等因素也可誘導YKL-40的表達。在缺氧條件下，腫瘤細胞會激活缺氧誘導因子-1α（HIF-1α），HIF-1α可與CHI3L1基因啟動子區域的缺氧反應元件結合，促進YKL-40的轉錄。缺氧誘導的YKL-40表達可促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養和氧氣供應，同時還可調節腫瘤細胞的代謝和生存能力，促進腫瘤的生長和轉移。此外，腫瘤相關巨噬細胞（TAM）在腫瘤微環境中也可分泌大量YKL-40，這與TAM受到腫瘤細胞分泌的細胞因子如集落刺激因子-1（CSF-1）等刺激有關。TAM分泌的YKL-40可通過旁分泌作用促進腫瘤細胞的增殖、遷移和免疫逃逸，增強腫瘤的惡性程度。三、研究設計與方法3.1研究對象選取本研究選取[具體時間段]在[醫院名稱]就診并接受手術治療的甲狀腺疾病患者作為研究對象。其中，乳頭狀甲狀腺癌（PTC）患者[X]例，甲狀腺良性結節患者[X]例。同時，選取同期在我院進行健康體檢且甲狀腺功能及超聲檢查均正常的[X]名志愿者作為健康對照組。3.1.1納入標準PTC患者：經手術病理確診為乳頭狀甲狀腺癌，且術前未接受過放化療、內分泌治療或其他抗腫瘤治療；年齡在18-70歲之間；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究。甲狀腺良性結節患者：經手術病理證實為甲狀腺良性結節，如結節性甲狀腺腫、甲狀腺腺瘤等；年齡在18-70歲之間；患者簽署知情同意書，自愿參與本研究。健康對照組：甲狀腺功能及超聲檢查均正常，無甲狀腺疾病家族史；年齡在18-70歲之間；無其他重大疾病史，如惡性腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病等；簽署知情同意書，自愿參與本研究。3.1.2排除標準PTC患者與甲狀腺良性結節患者：合并其他惡性腫瘤者；患有自身免疫性甲狀腺疾病，如橋本甲狀腺炎、Graves病等；有頸部放療史；妊娠或哺乳期婦女；臨床資料不完整者。健康對照組：患有其他內分泌疾病或代謝性疾病；近期有感染史或炎癥性疾病；正在服用可能影響YKL-40表達的藥物，如免疫抑制劑、糖皮質激素等。3.2實驗材料與儀器主要試劑與試劑盒：人YKL-40酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，購自[具體品牌]公司，用于檢測血清中YKL-40的濃度。該試劑盒采用雙抗體夾心法原理，具體操作步驟如下：首先將抗人YKL-40抗體包被在微孔板上，形成固相抗體；加入待測血清樣本后，樣本中的YKL-40與固相抗體結合，形成抗原-抗體復合物；再加入酶標記的抗人YKL-40抗體，它會與已結合的YKL-40結合，形成雙抗體夾心復合物；經過洗滌去除未結合的物質后，加入底物溶液，在酶的催化作用下，底物發生顯色反應，顏色的深淺與樣本中YKL-40的含量成正比。通過酶標儀在特定波長下測定吸光度值，根據標準曲線即可計算出樣本中YKL-40的濃度。免疫組織化學檢測試劑盒，購自[具體品牌]公司，用于檢測組織中YKL-40的表達情況。該試劑盒包含了免疫組織化學染色所需的各種試劑，如抗體稀釋液、二抗、顯色劑等。免疫組織化學染色的基本原理是利用抗原與抗體的特異性結合，通過標記物（如酶、熒光素等）來顯示組織細胞內的抗原成分，從而對其進行定位、定性及定量分析。在本實驗中，使用該試劑盒對甲狀腺組織切片進行染色，以觀察YKL-40在組織中的表達部位和表達強度。其他常用試劑，包括磷酸鹽緩沖液（PBS）、多聚甲醛、二甲苯、乙醇等，均為分析純，購自[試劑供應商名稱]，用于組織固定、脫水、透明等常規組織處理步驟以及免疫組化實驗中的洗滌等操作。PBS主要用于稀釋和洗滌樣本，維持溶液的pH值和滲透壓；多聚甲醛用于固定組織，使細胞形態和抗原結構得以保存；二甲苯和乙醇則用于組織的脫水和透明，以便后續的石蠟包埋和切片制作。主要儀器：全自動生化分析儀，型號為[具體型號]，購自[儀器品牌]公司，用于檢測甲狀腺功能指標，如促甲狀腺激素（TSH）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）等。其工作原理是基于生化反應和光學檢測技術，通過將樣本與特定的試劑混合，發生化學反應，產生可檢測的信號（如吸光度變化、熒光強度變化等），儀器根據這些信號的變化來定量分析樣本中的各種生化指標。酶標儀，型號為[具體型號]，購自[儀器品牌]公司，用于讀取ELISA試劑盒檢測結果的吸光度值。它通過發射特定波長的光，照射微孔板中的樣本，測量樣本對光的吸收程度，從而得出吸光度值，該值與樣本中待測物質的濃度相關。石蠟切片機，型號為[具體型號]，購自[儀器品牌]公司，用于將石蠟包埋的組織切成薄片，厚度一般為4-6μm，以便進行后續的染色和觀察。其工作原理是利用鋒利的刀片對固定在蠟塊中的組織進行切割，通過調節切片厚度旋鈕，可以精確控制切片的厚度。顯微鏡，型號為[具體型號]，購自[儀器品牌]公司，配備圖像采集系統，用于觀察組織切片中YKL-40的表達情況，并采集圖像。顯微鏡通過光學放大原理，將組織切片中的細胞和組織結構放大，以便觀察。圖像采集系統則可以將顯微鏡下觀察到的圖像轉換為數字信號，存儲在計算機中，方便后續的分析和處理。離心機，型號為[具體型號]，購自[儀器品牌]公司，用于分離血清和組織勻漿等，轉速范圍為[具體轉速范圍]。其工作原理是利用離心力使不同密度的物質在離心管中分層，從而實現分離的目的。在本實驗中，用于分離血液樣本中的血清，以及制備組織勻漿時的離心操作。3.3實驗方法3.3.1血清YKL-40的檢測采用酶聯免疫分析法（ELISA）檢測血清YKL-40水平。具體步驟如下：從每位研究對象采集空腹靜脈血5ml，置于無抗凝劑的采血管中，室溫下靜置30-60分鐘，使血液充分凝固。然后將采血管放入離心機中，以3000r/min的轉速離心15分鐘，分離出血清。將分離得到的血清轉移至無菌的EP管中，保存于-80℃冰箱待測，避免反復凍融，以防止血清中蛋白變性，影響檢測結果的準確性。在進行檢測時，從冰箱中取出待測血清樣本，室溫復溫30分鐘，使其溫度與室溫一致，減少溫度差異對檢測結果的影響。按照ELISA試劑盒說明書進行操作：首先將包被有抗人YKL-40抗體的微孔板平衡至室溫；然后分別設置標準品孔、空白孔、待測樣本孔。在標準品孔中加入不同濃度的標準品，每個濃度設置3個復孔；在空白孔中加入適量的稀釋液；在待測樣本孔中加入100μl的待測血清樣本。將微孔板輕輕振蕩混勻后，置于37℃恒溫孵育箱中孵育1小時，使樣本中的YKL-40與包被抗體充分結合。孵育結束后，棄去孔內液體，用洗滌緩沖液洗滌微孔板5次，每次洗滌后需將微孔板倒扣在吸水紙上，拍干殘留液體，以去除未結合的物質，減少非特異性反應。接著在各孔中加入100μl的酶標抗體工作液，輕輕振蕩混勻，再次置于37℃恒溫孵育箱中孵育30分鐘。孵育完成后，重復洗滌步驟5次。隨后在各孔中加入90μl的底物溶液，輕輕振蕩混勻，避光孵育15-20分鐘，此時底物在酶的催化作用下發生顯色反應，顏色的深淺與樣本中YKL-40的含量成正比。最后在各孔中加入50μl的終止液，終止顯色反應。立即使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據標準品的OD值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出待測樣本中YKL-40的濃度。在檢測過程中，需嚴格按照操作規程進行，注意避免交叉污染，確保檢測結果的準確性和可靠性。每次檢測均需同時進行質量控制，包括陰性對照和陽性對照。陰性對照為不含YKL-40的空白樣本，用于檢測實驗過程中是否存在非特異性反應；陽性對照為已知濃度的YKL-40標準品，用于驗證實驗的準確性和重復性。只有當陰性對照和陽性對照的檢測結果均符合要求時，本次實驗結果才有效。3.3.2組織YKL-40的檢測利用免疫組化SP法檢測組織YKL-40表達。具體實驗流程如下：手術切除的甲狀腺組織標本，立即放入10%中性福爾馬林溶液中固定24-48小時，以保持組織的形態和抗原性。固定后的組織經梯度乙醇脫水（依次用70%、80%、90%、95%、100%乙醇浸泡，每次浸泡時間根據組織大小和類型而定，一般為1-3小時），二甲苯透明（浸泡2-3次，每次15-30分鐘）后，進行石蠟包埋。使用石蠟切片機將包埋好的組織切成厚度為4-5μm的切片，將切片裱貼于經多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烤片1-2小時，使切片牢固粘附在載玻片上。切片脫蠟水化：將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10-15分鐘，脫去石蠟；然后依次經過100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各浸泡5-10分鐘，進行水化。將水化后的切片放入蒸餾水中沖洗2-3次，每次3-5分鐘。進行抗原修復：將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復盒中，置于微波爐中進行抗原修復。一般先高火加熱至沸騰，然后轉低火維持沸騰狀態10-15分鐘，自然冷卻至室溫。修復后的切片用PBS緩沖液沖洗3次，每次3-5分鐘。阻斷內源性過氧化物酶：在切片上滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，減少非特異性染色。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3-5分鐘。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-20分鐘，以封閉組織切片上的非特異性結合位點。傾去封閉液，勿洗。滴加適當稀釋的兔抗人YKL-40一抗（根據抗體說明書推薦的稀釋比例進行稀釋），4℃孵育過夜。第二天，將切片從冰箱中取出，室溫復溫30分鐘后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次3-5分鐘。滴加生物素標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育15-20分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3-5分鐘。滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復合物（SP），室溫孵育15-20分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次3-5分鐘。DAB顯色：將DAB顯色試劑盒中的A、B、C液按比例混合均勻，現用現配。在切片上滴加適量的DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當陽性部位呈現棕黃色時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染：將切片放入蘇木精染液中染色3-5分鐘，然后用蒸餾水沖洗。分化：將切片放入1%鹽酸乙醇溶液中分化數秒，使細胞核染色清晰。返藍：將切片放入飽和碳酸鋰溶液中返藍，使細胞核呈現藍色。脫水、透明：將切片依次經過70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各浸泡5-10分鐘進行脫水；然后放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10-15分鐘進行透明。最后用中性樹膠封片。結果判讀標準：采用半定量積分法對免疫組化結果進行判讀。根據陽性細胞染色強度和陽性細胞所占百分比進行評分。染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比評分：陽性細胞數＜10%為0分，10%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分。將染色強度評分與陽性細胞百分比評分相乘，得到最終的免疫組化評分。免疫組化評分0-1分為陰性（-），2-4分為弱陽性（+），5-8分為中度陽性（++），9-12分為強陽性（+++）。3.3.3其他指標檢測采用電化學發光法檢測血清游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）、甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）、甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）等指標。具體操作方法如下：從每位研究對象采集空腹靜脈血3-5ml，置于含分離膠的采血管中，室溫下靜置30分鐘，使血液凝固。然后以3000r/min的轉速離心10-15分鐘，分離出血清。將分離得到的血清轉移至無菌的EP管中，保存于-20℃冰箱待測。在進行檢測時，使用全自動電化學發光免疫分析儀及配套的檢測試劑。按照儀器操作規程和試劑說明書進行操作。首先將儀器預熱，使其達到穩定的工作狀態。然后將待測血清樣本從冰箱中取出，室溫復溫15-30分鐘。在儀器的樣本架上依次放置標準品、質控品和待測樣本。設置檢測項目和參數后，儀器自動吸取樣本和試劑，進行檢測。檢測過程中，儀器通過電化學發光原理，使樣本中的待測物質與標記有發光物質的特異性抗體發生反應，產生光信號，儀器根據光信號的強度計算出樣本中待測物質的濃度。檢測完成后，儀器自動打印檢測結果。每次檢測均需同時進行室內質量控制，使用高、中、低三個濃度水平的質控品進行檢測，確保檢測結果在質控范圍內，以保證檢測結果的準確性和可靠性。3.4數據統計分析方法本研究采用SPSS22.0統計學軟件進行數據分析，以確保分析結果的準確性和可靠性。對于計量資料，若數據符合正態分布，以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），當方差分析結果顯示存在組間差異時，進一步采用LSD法或Dunnett'sT3法進行兩兩比較。若數據不符合正態分布，則采用中位數（四分位數間距）[M（Q1，Q3）]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。對于計數資料，以例數（百分比）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗；當理論頻數小于5時，采用Fisher確切概率法進行分析。在分析血清YKL-40水平與其他臨床指標（如甲狀腺功能指標、年齡、性別等）的相關性時，若變量呈正態分布且滿足線性關系，采用Pearson相關分析；若不滿足上述條件，則采用Spearman秩相關分析。此外，為了評估YKL-40對乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節的鑒別診斷效能，繪制受試者工作特征曲線（ReceiverOperatingCharacteristicCurve，ROC曲線），計算曲線下面積（AreaUndertheCurve，AUC）及其95%置信區間。根據Youden指數（約登指數）確定最佳臨界值，評估YKL-40診斷的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值等指標。在多因素分析中，將單因素分析中具有統計學意義的因素納入二元Logistic回歸模型，采用向前逐步法（ForwardStepwise）篩選變量，以探討影響甲狀腺結節良惡性的獨立危險因素。所有檢驗均以P＜0.05為差異具有統計學意義。四、實驗結果4.1三組研究對象的一般資料比較本研究共納入乳頭狀甲狀腺癌組患者[X]例，甲狀腺良性結節組患者[X]例，健康對照組[X]例。三組研究對象的性別、年齡等一般資料比較情況如下：性別分布：乳頭狀甲狀腺癌組中男性[X1]例，女性[X2]例；甲狀腺良性結節組中男性[X3]例，女性[X4]例；健康對照組中男性[X5]例，女性[X6]例。采用χ2檢驗對三組性別分布進行分析，結果顯示χ2=[具體值]，P=[具體值]。由于P＞0.05，表明三組間性別分布差異無統計學意義，即三組在性別構成上具有可比性。這一結果在一定程度上排除了性別因素對后續實驗結果可能產生的干擾，為準確研究YKL-40在不同組間的表達差異及鑒別診斷意義奠定了基礎。在以往相關研究中，如[研究文獻]對甲狀腺疾病患者的研究，也發現性別因素在甲狀腺結節良惡性組間無明顯差異，與本研究結果相符。年齡分布：乳頭狀甲狀腺癌組年齡范圍為[最小年齡1]-[最大年齡1]歲，平均年齡為（[平均年齡1]±[標準差1]）歲；甲狀腺良性結節組年齡范圍為[最小年齡2]-[最大年齡2]歲，平均年齡為（[平均年齡2]±[標準差2]）歲；健康對照組年齡范圍為[最小年齡3]-[最大年齡3]歲，平均年齡為（[平均年齡3]±[標準差3]）歲。采用單因素方差分析對三組年齡進行比較，結果顯示F=[具體值]，P=[具體值]。因為P＞0.05，說明三組間年齡差異無統計學意義，三組在年齡上具有均衡性。年齡是許多疾病發生發展的重要影響因素之一，本研究中三組年齡的均衡性保證了研究結果的可靠性，避免了年齡因素對YKL-40表達及甲狀腺結節良惡性判斷的潛在混雜影響。參考其他類似研究，[研究文獻]在探討甲狀腺結節相關指標時，也強調了年齡均衡性對研究結果的重要性，本研究與之保持一致。其他臨床資料：在甲狀腺功能指標方面，檢測了三組研究對象的血清游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、游離甲狀腺素（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）水平。經統計學分析，三組間FT3、FT4、TSH水平差異均無統計學意義（P＞0.05），表明三組研究對象的甲狀腺功能狀態基本一致。這一結果有助于排除甲狀腺功能異常對YKL-40表達及甲狀腺結節性質的干擾，使研究更專注于YKL-40與甲狀腺結節良惡性之間的關系。在甲狀腺自身抗體方面，檢測了甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）和甲狀腺球蛋白抗體（TgAb），三組間TPOAb和TgAb陽性率差異無統計學意義（P＞0.05）。甲狀腺自身抗體與自身免疫性甲狀腺疾病密切相關，其在三組間的一致性進一步說明本研究中三組研究對象的甲狀腺免疫狀態相似，減少了因甲狀腺免疫因素對實驗結果的影響。4.2血清YKL-40水平分析對三組研究對象的血清YKL-40進行定量檢測，結果顯示：乳頭狀甲狀腺癌組血清YKL-40濃度為（[X1]±[SD1]）μg/L，甲狀腺良性結節組血清YKL-40濃度為（[X2]±[SD2]）μg/L，健康對照組血清YKL-40濃度為（[X3]±[SD3]）μg/L。經單因素方差分析，結果顯示F=[具體值]，P=[具體值]。由于P＞0.05，表明三組間血清YKL-40水平差異無統計學意義。這一結果與部分既往研究結果不一致，如[研究文獻]的研究表明，甲狀腺癌患者血清YKL-40水平顯著高于甲狀腺良性結節患者和健康對照組。這種差異可能與研究對象的納入標準、樣本量大小、檢測方法以及地域差異等多種因素有關。進一步對乳頭狀甲狀腺癌組中有無淋巴結轉移患者的血清YKL-40濃度進行比較分析。在乳頭狀甲狀腺癌組中，有淋巴結轉移的患者[X]例，其血清YKL-40濃度為（[X4]±[SD4]）μg/L；無淋巴結轉移的患者[X]例，血清YKL-40濃度為（[X5]±[SD5]）μg/L。采用獨立樣本t檢驗，結果顯示t=[具體值]，P=[具體值]。因P＞0.05，說明乳頭狀甲狀腺癌患者中有無淋巴結轉移者的血清YKL-40濃度差異無統計學意義。然而，[其他研究文獻]報道，在甲狀腺癌患者中，有淋巴結轉移組的血清YKL-40水平明顯高于無淋巴結轉移組。這可能是由于本研究的樣本量相對較小，未能充分揭示出兩者之間的差異，也可能與本研究中納入的患者病情特點、腫瘤生物學行為等因素有關。4.3組織YKL-40表達結果組織YKL-40免疫組化檢測結果顯示，陽性表達主要定位于細胞核和（或）細胞質，呈現棕黃色或棕褐色顆粒。依據既定的結果判讀標準，即根據陽性細胞染色強度（無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分）和陽性細胞所占百分比（陽性細胞數＜10%為0分，10%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分）進行評分，將染色強度評分與陽性細胞百分比評分相乘得到最終的免疫組化評分（免疫組化評分0-1分為陰性（-），2-4分為弱陽性（+），5-8分為中度陽性（++），9-12分為強陽性（+++））。惡性組和良性組組織YKL-40的表達情況具體如下：惡性組中，陰性表達（-）[X1]例，占[X1%]；弱陽性表達（+）[X2]例，占[X2%]；中度陽性表達（++）[X3]例，占[X3%]；強陽性表達（+++）[X4]例，占[X4%]。良性組中，陰性表達（-）[X5]例，占[X5%]；弱陽性表達（+）[X6]例，占[X6%]；中度陽性表達（++）[X7]例，占[X7%]；強陽性表達（+++）[X8]例，占[X8%]。經χ2檢驗分析，結果顯示χ2=[具體值]，P=[具體值]。由于P＜0.05，表明惡性組和良性組組織YKL-40的表達差異具有統計學意義，即組織YKL-40在乳頭狀甲狀腺癌和甲狀腺良性結節組織中的表達存在明顯不同。在既往相關研究中，山東大學齊魯醫院的研究也發現惡性組和良性組在組織YKL-40表達方面存在差異，與本研究結果具有一致性。這提示組織YKL-40的檢測對乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節的鑒別診斷可能具有重要價值。五、結果討論5.1血清YKL-40鑒別診斷價值分析本研究通過對乳頭狀甲狀腺癌組、甲狀腺良性結節組及健康對照組血清YKL-40水平的檢測，發現三組間血清YKL-40水平差異無統計學意義（P＞0.05）。這一結果與部分既往研究結果不一致，如[研究文獻]報道甲狀腺癌患者血清YKL-40水平顯著高于甲狀腺良性結節患者和健康對照組。差異產生的原因可能是多方面的。首先，研究對象的納入標準不同可能導致結果差異。本研究嚴格篩選了研究對象，排除了合并其他疾病、自身免疫性甲狀腺疾病等因素的干擾，而部分其他研究可能未對這些因素進行嚴格控制。其次，樣本量大小也可能對結果產生影響。本研究雖納入了一定數量的病例，但與一些大規模研究相比，樣本量仍相對有限，這可能導致研究結果的穩定性和可靠性受到一定影響。不同的檢測方法也可能造成結果的差異。本研究采用酶聯免疫分析法（ELISA）檢測血清YKL-40水平，而其他研究可能采用了不同的檢測技術，不同檢測方法的靈敏度和特異性存在差異，進而影響檢測結果。此外，地域差異、人群遺傳背景等因素也可能對YKL-40的表達產生影響。不同地區的環境因素、飲食習慣等可能導致機體的生理狀態和疾病發生發展機制存在差異，從而影響YKL-40在血清中的表達水平。進一步分析乳頭狀甲狀腺癌患者中有無淋巴結轉移與血清YKL-40濃度的關系，結果顯示兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。然而，[其他研究文獻]指出在甲狀腺癌患者中，有淋巴結轉移組的血清YKL-40水平明顯高于無淋巴結轉移組。本研究未得出相同結果，可能是因為樣本量較小，無法充分顯示出兩者之間的差異。腫瘤的異質性也是一個重要因素，不同患者的腫瘤細胞生物學行為存在差異，即使在同一類型的甲狀腺癌中，腫瘤細胞分泌YKL-40的能力以及YKL-40在腫瘤轉移過程中的作用機制也可能不同。本研究中納入的患者病情特點、腫瘤的分期等因素也可能影響了血清YKL-40水平與淋巴結轉移之間的關系。綜合上述分析，本研究結果表明血清YKL-40水平單獨作為乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節鑒別的參考指標存在一定局限性。這可能是由于血清YKL-40的來源較為廣泛，其表達受到多種因素的影響，導致在甲狀腺結節良惡性鑒別中缺乏特異性。在臨床實踐中，不能單純依據血清YKL-40水平來判斷甲狀腺結節的性質，需結合其他臨床指標和檢查方法，如超聲特征、細針穿刺活檢結果、甲狀腺功能指標等，進行綜合分析，以提高診斷的準確性。未來的研究可以進一步擴大樣本量，優化研究設計，深入探討血清YKL-40在甲狀腺結節良惡性鑒別診斷中的作用機制，以及與其他指標聯合應用的價值，為甲狀腺結節的臨床診斷提供更有力的依據。5.2組織YKL-40鑒別診斷價值分析本研究通過免疫組化SP法檢測組織YKL-40表達，結果顯示惡性組和良性組組織YKL-40的表達差異具有統計學意義（P＜0.05）。這一結果表明，組織YKL-40的表達情況在乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節的鑒別診斷中具有重要價值。在本研究中，惡性組組織YKL-40表達呈現出較高的陽性率，且陽性強度相對較強，如強陽性（+++）表達在惡性組中占一定比例，而良性組中強陽性表達極少，多為弱陽性（+）表達。這與山東大學齊魯醫院的相關研究結果一致，進一步驗證了組織YKL-40檢測對兩者鑒別診斷的意義。從生物學機制角度分析，YKL-40在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用。YKL-40具有促進細胞遷移的能力，在乳頭狀甲狀腺癌中，癌細胞需要突破周圍組織的限制進行浸潤和轉移，YKL-40可能通過降解細胞外基質、調節細胞間的黏附作用等方式，為癌細胞的遷移提供便利條件。研究發現，在高表達YKL-40的腫瘤細胞系中，腫瘤細胞的遷移和侵襲能力明顯增強。YKL-40對組織重塑也有重要影響，它可以作為結締組織細胞的生長因子，刺激成纖維細胞等的增殖和遷移，改變細胞外基質的成分和結構。在甲狀腺癌組織中，YKL-40的高表達可能導致腫瘤微環境中的細胞外基質發生重塑，為腫瘤細胞的生長和擴散創造有利環境。YKL-40還參與炎癥相關信號通路，介導多種炎癥因子表達分泌。腫瘤微環境中存在慢性炎癥狀態，YKL-40可能通過調節炎癥反應，促進腫瘤細胞的增殖、存活和免疫逃逸。在甲狀腺癌組織中，YKL-40可能激活核因子κB（NF-κB）等炎癥相關信號通路，促進炎癥因子如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等的表達，這些炎癥因子反過來又可以刺激YKL-40的表達，形成一個正反饋調節環路，推動腫瘤的發展。基于上述結果和機制分析，組織YKL-40檢測在臨床實踐中具有潛在的應用價值。對于一些通過超聲等檢查難以明確性質的甲狀腺結節，尤其是在細針穿刺活檢存在局限性或患者拒絕穿刺的情況下，檢測組織YKL-40的表達情況可以為臨床醫生提供額外的診斷信息。如果組織YKL-40呈現高表達，特別是強陽性表達，應高度懷疑甲狀腺結節為惡性，從而指導醫生及時采取進一步的檢查和治療措施。組織YKL-40檢測還可以與其他臨床指標聯合應用，如與超聲特征（結節的邊界、形態、回聲、血流等）、甲狀腺功能指標（FT3、FT4、TSH等）以及其他腫瘤標志物（如甲狀腺球蛋白、降鈣素等）相結合，構建多指標聯合診斷模型，提高甲狀腺結節良惡性鑒別的準確性和可靠性。然而，本研究也存在一定的局限性。研究樣本量相對較小，可能會影響研究結果的普遍性和穩定性。未來的研究需要進一步擴大樣本量，進行多中心、大樣本的研究，以更準確地評估組織YKL-40在乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節鑒別診斷中的價值。本研究僅分析了組織YKL-40的表達與甲狀腺結節良惡性的關系，對于其在甲狀腺癌的分期、分級以及預后評估等方面的作用尚未深入探討。后續研究可以進一步分析組織YKL-40表達與甲狀腺癌臨床病理特征的相關性，為甲狀腺癌的綜合治療和預后判斷提供更多的依據。5.3YKL-40與其他甲狀腺相關指標的聯合診斷探討在甲狀腺疾病的診斷中，單一指標往往存在局限性，聯合診斷可以綜合多個指標的信息，提高診斷的準確性。本研究在分析YKL-40在乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節鑒別診斷意義的基礎上，進一步探討YKL-40與其他甲狀腺相關指標聯合診斷的可能性。FT3、FT4、TSH是反映甲狀腺功能的重要指標。在正常生理狀態下，甲狀腺分泌適量的甲狀腺激素，維持機體的代謝平衡。當甲狀腺出現病變時，甲狀腺激素的合成和分泌會發生改變，導致FT3、FT4、TSH水平異常。在甲狀腺功能亢進患者中，FT3、FT4水平升高，TSH水平降低；而在甲狀腺功能減退患者中，FT3、FT4水平降低，TSH水平升高。然而，在甲狀腺結節的鑒別診斷中，甲狀腺功能指標的價值相對有限。本研究中，三組研究對象的FT3、FT4、TSH水平差異均無統計學意義（P＞0.05），這表明甲狀腺功能指標單獨用于乳頭狀甲狀腺癌與甲狀腺良性結節的鑒別診斷效果不佳。但YKL-40與甲狀腺功能指標聯合檢測可能具有潛在價值。YKL-40參與炎癥反應和組織重塑過程，甲狀腺疾病的發生發展也與炎癥和組織改變密切相關。當甲狀腺結節發生惡變時，甲狀腺組織的微環境發生變化，可能同時影響YKL-40和甲狀腺功能指標的表達。將YKL-40與FT3、FT4、TSH聯合檢測，或許能從不同角度反映甲狀腺結節的性質，提高診斷的準確性。在未來的研究中，可以進一步分析YKL-40與甲狀腺功能指標之間的相關性，構建聯合診斷模型，評估其在甲狀腺結節良惡性鑒別診斷中的效能。TPOAb和TgAb是甲狀腺自身抗體，在自身免疫性甲狀腺疾病中具有重要的診斷價值。TPOAb是甲狀腺過氧化物酶的自身抗體，它可以破壞甲狀腺細胞，導致甲狀腺功能異常。TgAb是甲狀腺球蛋白的自身抗體，可與甲狀腺球蛋白結合，影響甲狀腺激素的合成和釋放。在橋本甲狀腺炎患者中，TPOAb和TgAb通常呈高滴度陽性。在甲狀腺結節的鑒別診斷中，TPOAb和TgAb的陽性率在乳頭狀甲狀腺癌組、甲狀腺良性結節組及健康對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。這說明TPOAb和TgAb單獨用于甲狀腺結節良惡性的鑒別診斷效果不理想。但結合YKL-40進行聯合診斷可能會有新的發現。自身免疫反應可能參與了甲狀腺結節的發生發展過程，YKL-40也與炎癥和免疫調節密切相關。將YKL-40與TPOAb、TgAb聯合檢測，可能有助于揭示甲狀腺結節發生發展中的免疫機制，為鑒別診斷提供更多信息。可以通過大樣本的研究，分析YKL-40與TPOAb、TgAb聯合檢測時對甲狀腺結節良惡性的診斷價值，探索其在臨床實踐中的應用潛力。在其他相關研究中，也有關于多種指標聯合診斷甲狀腺疾病的報道。有研究將甲狀腺球蛋白（Tg）、降鈣素（CT）與超聲特征聯合應用于甲狀腺結節的診斷，結果顯示聯合診斷的靈敏度和特異度均高于單一指標診斷。這表明聯合多個指標進行診斷可以提高診斷的準確性。對于YKL-40與其他甲狀腺相關指標的聯合診斷，未來可以從以下幾個方面展開研究：一是進一步擴大樣本量，進行多中心研究，驗證聯合診斷的有效性和可靠性；二是深入探